CN107648607A - 嘌呤2y12受体拮抗剂在制备糖尿病神经病理损伤疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备糖尿病神经病理损伤疾病药物中的应用，实验证实嘌呤2Y12受体拮抗剂可降低背根神经节卫星胶质细胞嘌呤2Y12受体的表达，减少炎性介质释放，提示其可抑制背根神经节呤2Y12受体介导的伤害性信息传递，减轻糖尿病大鼠神经损伤及其相关疾病(包括神经病理痛等疾病)，可应用于制备糖尿病神经损伤相关疾病及神经病理痛的药物。

Description

嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备糖尿病神经病理损伤疾病药物中 的应用

技术领域

本发明涉及糖尿病神经病理损伤疾病、神经病理痛药物用途发明领域，尤其是涉及嘌呤2Y12(P2Y12)受体拮抗剂用于在制备降低糖尿病损伤所致的神经病理损伤疾病、神经病理痛的药物中的应用，其作用机理涉及抑制背根神经节嘌呤2Y(P2Y)12受体介导的糖尿病神经病理痛信息传递。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，其致死率被列为大多数高收入国家疾病致死率的第五甚至第四位，成为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病。糖尿病分为1型(胰岛素依赖性)和2型(非胰岛素依赖性)糖尿病。据估计，全球六个人里面就有一个人处于患糖尿病并发症的危险中。国际糖尿病联盟(IDF)的最新数据显示：截止到2015年，全球已有4.15亿糖尿病患者，预计2040年这一数据将会增长到6.42亿。我国糖尿病人群的构成以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上，严重影响着人民健康和社会发展。糖尿病患者主要表现为机体血糖的升高以及系列急慢性并发症。糖尿病神经病变是常见的糖尿病并发症之一，其最常见的神经病变类型是周围神经损伤，如手，足。糖尿病是低度炎性疾病，炎性物质可加重糖尿病并发神经损伤。糖尿病并发的周围神经病变以感觉异常为主，其中以疼痛最痛苦、最显著。临床多见于血糖控制不佳的患者，常表现为远端肢体自发性疼痛、痛觉过敏、异常性疼痛(如烧灼感、蚁走感或针刺感)等，对于这些异常性感觉的治疗方法很局限，严重时导致终身残疾。因此，对于糖尿病神经病理痛的防治工作已成为糖尿病研究领域的热点和重点。

初级感觉神经节由中间的神经元胞体以及紧密围绕神经元胞体的卫星胶质细胞组成。新近的研究指出：切断轴突、炎症等损伤可激活初级感觉神经节卫星胶质细胞，使卫星胶质细胞标志物谷氨酰氨合成酶明显增加，同时，其释放的信号分子或炎性细胞因子含量增加，而这些信号分子或炎性细胞因子可加强神经元的异常放电，从而使卫星胶质细胞成为疼痛信号传递通路中的重要部位。嘌呤信号转导(Purinergic signalling)主要是兴奋嘌呤受体(Purinergic receptor)产生效应。P受体包含P1和P2受体，腺苷及其类似物作用于P1受体，三磷酸腺苷(ATP)及其类似物作用于P2受体。P2受体又分为配体门控非选择性离子通道型受体(P2X受体)和促代谢型G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。研究表明嘌呤2Y12受体介导了胶质细胞功能活动的调节,也为神经病理痛的靶点防治提供了新思路。

本项目通过高糖高脂卫星胶质细胞模型实验，探索背根神经节卫星胶质细胞嘌呤2Y12受体介导在糖尿病神经损伤疾病中的作用；研究嘌呤2Y12受体拮抗剂对糖尿病神经病理损伤的作用，旨在为糖尿病神经病理损伤疾病的防治措施探索新的实验依据。

本实验通过2型糖尿病大鼠模型及高糖高脂卫星胶质细胞模型，观察嘌呤2Y12受体拮抗剂PSB0739处理后背根神经节卫星胶质细胞嘌呤2Y12受体表达的变化，为嘌呤2Y12受体拮抗剂用于糖尿病并发神经病理损伤的预防和治疗提供帮助。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供嘌呤2Y12受体拮抗剂的第一个新用途，即嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备防治糖尿病并发神经病理损伤疾病药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供嘌呤2Y12受体拮抗剂的第二个新用途，即嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备糖尿病并发神经损伤诱发神经病理痛疾病的药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供嘌呤2Y12受体拮抗剂的第三个新用途，即嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备治疗糖尿病并发感觉神经炎性相关疾病防治药物中的应用。

附图说明

图1为各组大鼠背根神经节的嘌呤2Y12受体实时定量PCR检测结果图。嘌呤2Y12受体拮抗剂PSB0739处理后可降低高糖高脂培养的急性分离大鼠背根神经节卫星胶质细胞上调的嘌呤2Y12受体信使核糖核酸水平。实验分组：对照组；高糖高脂模型组；高糖高脂模型+嘌呤2Y12受体拮抗剂处理组。其中***p<0.001表示和对照组比较，^###p<0.001表示与高糖高脂模型组比较。

图2为各组大鼠背根神经节的嘌呤2Y12受体蛋白印迹检测结果图。嘌呤2Y12受体拮抗剂PSB0739处理后可降低糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节上调的嘌呤2Y12受体蛋白水平。实验分组：对照组；高糖高脂模型组；高糖高脂模型+嘌呤2Y12受体拮抗剂处理组。图2(A)为蛋白印迹实验结果图，图2(B)为实验数据分析比较柱状图，其中***p<0.001表示和对照组比较，^###p<0.001表示与高糖高脂模型组比较。

图3为各组大鼠背根神经节分离培养卫星胶质细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α释放变化图。通过博士德Elisa试剂盒检测各组原代卫星胶质细胞培养上清液中炎性因子TNF-α表达变化。结果如下：高糖高脂组卫星胶质细胞上清液中TNF-α表达量(pg/ml)明显高于对照组(p<0.001)；P2Y12拮抗剂处理后的高糖高脂模型组细胞较高糖高脂组TNF-α表达量(pg/ml)显著下降(p<0.001)。其中***p<0.001表示和对照组比较，^###p<0.001表示与高糖高脂模型组比较。

图4为各组大鼠背根神经节分离培养卫星胶质细胞三磷酸腺苷(ATP)释放变化图。通过ATP测定试剂盒检测各组卫星胶质细胞ATP的释放量(pM)。实验结果显示：高糖高脂组细胞ATP释放量显著高于对照组(p<0.001)；高糖高脂+P2Y12拮抗剂组明显低于高糖高脂组(p<0.01)。其中***p<0.001表示和对照组比较，^##p<0.01表示与高糖高脂模型组比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病神经病理痛治疗的口服或注射的嘌呤2Y12受体拮抗剂制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病神经损伤相关疾病治疗的口服或注射的嘌呤2Y12受体拮抗剂制剂。

实施例3。

用本技术领域公知的方法，制成适用于糖尿病感觉神经炎性相关疾病治疗的口服或注射的嘌呤2Y12受体拮抗剂制剂。

总之，嘌呤2Y12受体拮抗剂以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以嘌呤2Y12受体拮抗剂对嘌呤2Y12受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明嘌呤2Y12受体拮抗剂的用途。

一、材料和方法。

1.高糖高脂细胞模型制作和分组。

根据文献报道及预实验结果，本实验选用葡萄糖浓度30mM、游离脂肪酸浓度1mM对原代卫星胶质细胞进行高糖高脂处理。待原代卫星胶质细胞生长1-2天细胞贴壁后(细胞量在70％-80％左右)，在培养基中加入适量葡萄糖及游离脂肪酸原液，混匀后将其作为细胞培养基轻轻加入贴壁的原代卫星胶质细胞中(高糖高脂的处理时间为48小时)。

细胞实验分组为：对照组卫星胶质细胞(对照组)、高糖高脂细胞模型组(高糖高脂组)和高糖高脂细胞模型+P2Y12拮抗剂组(高糖高脂+P2Y12拮抗剂组)。

细胞实验采取先进行高糖高脂处理，48h后再使用10μM的嘌呤2Y12拮抗剂(PSB0739)对高糖高脂细胞模型进行作用，作用时间为24h。

3.药物与试剂。

PSB0739(Tocris Bioscience公司)。兔源性P2Y12抗体(Abcam公司)。鼠源性谷氨酰氨合成酶抗体(Abcam公司)。FITC和TRITC标记的荧光二抗(北京中杉金桥公司)，小鼠抗β-actin一抗(北京中杉金桥公司)。

4.主要仪器。

PCR仪。DYCZ-24D型垂直板电泳槽，DYCZ-40D型转移槽(北京六一仪器厂)。

5、实时定量荧光PCR(Quantitative Real-time PCR)。

(1)总RNA的提取(因RNA易降解，全程尽量保证无核酶操作)。

(a)将取出的大鼠背根神经节(DRG)置于经无核酶处理的(首先泡酸过夜，捞出洗干净干燥后泡DEPC水过夜，捞出并进行高压处理)玻璃匀浆器中，按比例(每30-50mg组织加入1mlTRNzol，一般一个DRG加1mlTRNzol裂解)加入一定量TRNzol后，在冰上反复研磨至裂解液浑浊且无明显颗粒组织，最后常温放置15min，使核酸与蛋白复合物彻底分离；

(b)将上述浑浊液体转移到无核酶EP管中，然后加入0.2ml三氯甲烷，将该EP管置于漩涡混匀器上剧烈震荡15s，室温放置3min；

(c)4℃，12000rpm离心15min，此时裂解液出现明显分层：总RNA主要存在于上层水相中，将水相转移到新的无核酶EP管中(为保证RNA纯度，在转移时应尽可能的不要吸取中间层及下层物质)；

(d)加入与水相等体积异丙醇，反复上下颠倒混匀，室温下放置20-30min；

(e)4℃，12000rpm离心10min，轻轻倒掉管内溶液；

(f)加入1ml 75％乙醇(使用无核酶水配制)并上下来回颠倒洗涤RNA沉淀；

(g)4℃，5000rpm离心3min，轻轻倒出管内液体，并打开管盖在室温下进行短暂晾干；

(h)加入一定量无核酶水溶解RNA，通过轻轻吹打的方式使RNA完全溶解。

(2)逆转录。

通过微量蛋白核酸定量分析仪测定各组RNA浓度，选用赛默飞逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并保存于-20℃备用。

(3)引物设计。

基因名称引物序列

ACTB TGTCACCAACTGGGACGATA

GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

P2Y12CTTCGTTCCCTTCCACTTTG

AGGGTGCTCTCCTTCACGTA

(4)Real-time PCR体系。

(5)Real-time PCR反应条件。

共40个热循环

6、蛋白印迹。

(1)蛋白提取。

(a)在匀浆器(提前泡酸过夜并高压灭菌)中加入适量裂解液(RIPA:蛋白酶抑制剂:蛋白磷酸酶抑制剂＝100:1:1，一般2-3个DRG加入500μl裂解液)，取2-3个背根神经节(DRG)放入匀浆器中，在冰上反复研磨至无明显可见固体；

(b)将充分研磨的组织裂解液转移到预冷的EP管中，4℃，15000rpm离心10-15min；

(c)将上清转移至另一提前预冷的干净EP管中，并根据上清的体积加入适量蛋白上样缓冲液(该缓冲液一般为6×，用时将其稀释为1×)，用移液枪轻轻吹打混匀；

(d)将EP管用封口膜包好后置于沸水中煮沸3-5min；

(e)待该蛋白样品冷却后进行分装，保存于-20℃/-80℃备用。

(2)制备SDS-PAGE凝胶

(3)上样。

待SDS-PAGE凝胶完全凝固后，先往电泳架中加入适量1×电泳缓冲液，再慢慢拔掉梳子暴露上样孔，用微量上样针加入每孔15μl的蛋白样品，在紧挨样品孔的两侧各加入3-5μl蛋白Marker，其余上样孔均加入15μl 1×蛋白上样缓冲液(用蛋白裂解液稀释)进行平衡。

(4)电泳。

将电泳架放入盛有1×电泳缓冲液的电泳槽中，接通电源，开始电泳。压缩胶一般采用60V恒压电泳1h-2h左右，待Marker条带平稳分离后，调高电压进行分离胶电泳(此时电流一般不超过40mA)，直至溴酚蓝电泳到分离胶最底层，电泳结束。

(5)转膜。

根据目的条带的分子量并结合Marker的指示切取相应位置的SDS-PAGE凝胶，浸没在电转液中备用。再剪取与该SDS-PAGE凝胶同等大小的PVDF膜并在该PVDF膜的右上角剪掉一个角作为标记，示右上角有缺口面为蛋白正面，将PVDF膜浸泡于甲醇中活化3-5min。将转膜夹清洗干净后也置于电转液中，其中电转夹分为黑白两面，两面分别应包含1-2层海绵垫加三层滤纸，事先尽量赶走在海绵垫与滤纸之间的气泡，将活化好的PVDF膜铺平放在白面的滤纸上，然后把切好的SDS-PAGE凝胶置于PVDF膜上，两者重合，并保证胶与膜之间无气泡，将转膜夹的黑面轻轻扣在白面上，最后将该转膜夹置于转膜架中并让转膜液浸没该转膜夹，接通电源，在冰上以300mA恒流进行转膜，转膜时间约为1h45min(转膜时间可根据目的蛋白分子量的大小进行调整)。

(6)免疫反应。

(a)封闭：5％脱脂奶粉或5％BSA(溶剂为1×TBST),室温，水平摇床(低速)上孵育至少2h。

(b)一抗孵育：一抗用1×TBST配制，稀释比例如下：兔源性P2Y12为1:1000，兔源性p-P38为1:500，兔源性TNFR1为1:800，小鼠来源GFAP为1:1000，小鼠来源β-actin为1:1000，一抗孵育，4℃过夜。

(c)洗膜：1×TBST，室温，10min/次，共三次。

(d)二抗孵育：二抗用1×TBST配制，稀释比例如下：IgG-HRP标记的山羊抗兔1：2000，IgG-HRP标记的山羊抗小鼠1:2000，室温，水平摇床(低速)上孵育1h。

(e)洗膜：1×TBST，室温，10min/次，三次。

(f)免疫复合物检测：将膜置于凝胶成像系统中，蛋白面朝上，并在目的条带位置均匀滴上适量ECL发光剂(1:1配制，混匀后使用，现配现用)，关上仪器门，根据实际情况设定曝光时间，开始曝光，曝光完成后保存图像待分析。

7、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)测定细胞上清液中炎性因子

(1)样品的准备与保存：用移液枪吸取各组细胞培养液至EP管中，离心(4℃，15000rpm，5min)后取上清，将该上清分装后－20℃保存或立即用于分析(注意该上清应避免反复冻融)。

(2)标准品的稀释：首先配制10000pg/ml标准品，然后配制1000pg/ml标准品，并用移液枪轻轻吹打混匀；最后将1000pg/ml标准品依次进行对半稀释，配制500pg/ml-15.6pg/ml标准品，切记充分混匀不同浓度的标准品溶液。

(3)稀释TNF-α抗体工作液：100μl/孔，原液与抗体稀释液比例为1:100。

(4)稀释ABC工作液：100μl/孔，原液与ABC稀释液比例为1:100，稀释好的ABC工作液在使用前应预先在37℃中平衡至少30min。

(5)本实验不同组别都设有三个副孔进行实验，其中还包含只加样品稀释液的零孔组和TMB空白显色组，剩下的孔板需包装好后保存于-20℃。

(6)将各组细胞培养上清液及不同浓度的标准品溶液加入酶标板中，100μl

/孔，贴上封板膜，37℃水浴90min。

(7)首先手动甩去酶标板内液体，然后对着吸水纸用力拍打酶标板底部。

(8)往各孔里分别加入100μl生物素标记的抗大鼠TNF-α抗体工作液，其中TMB空白显色孔不加，加上封板膜，37℃水浴60min。

(9)1×洗涤缓冲液洗涤孔板，3次，每次1min，每孔至少加入300μl的1×洗涤缓冲液。

(10)甩板后在除去TMB空白显色孔外的每孔中加入100μl事先平衡好的ABC工作液，贴上封板膜，37℃水浴30min。

(11)使用1×洗涤缓冲液洗涤孔板，5次，每次1-2min左右，每孔至少加入300μl1×洗涤缓冲液。

(12)甩板后加入事先已经在37℃平衡好的TMB显色液，90μl/孔，37℃水浴中避光反应25-30min(显色时间可视不同次实验进行调整)。

(13)加入TMB终止液，100μl/孔。

(14)将酶标板置于酶标仪检测波长为450nm时各孔的OD值。

(15)绘制标准曲线，并通过标曲计算不同组细胞上清液中TNF-α浓度。

8、细胞培养液中ATP的测定

ATP能够维持细胞的活力，它存在于所有新陈代谢旺盛的细胞中，并且其浓度随着细胞的死亡与凋亡显著下降。因此本实验检测正常培养状态下各组细胞培养液中细胞释放的ATP含量。ATP的测定原理及步骤如下：

(1)标准品的稀释：首先根据说明配制10mM的标准品原液，然后使用纯水做溶剂将该标准品原液进行等比稀释，浓度为1000pM-7.8pM，共八个浓度梯度，稀释后均充分混匀。

(2)荧光素酶底物液的配制，充分混匀后进行分装，避光保存于－80℃备用。

(3)实验选用与试剂配套的384孔白板进行实验，加样前先进行合理的布板，每组设置三个副孔。

(4)首先往孔板里加入荧光素酶底物液，25μl/孔，加样时尽量不要产生气泡。

(5)然后往已加有底物液的孔板里分别加入不同组细胞培养液及不同浓度的标准品溶液(样品与标准品尽量隔开加样，以避免各孔间挥光值的相互影响)，也是25μl/孔，加样时尽量不要产生气泡。

(6)上机检测(上机程序：先摇匀5min，再让其反应10min，最后测定孔板内的挥光值)。

(7)绘制标准曲线，计算样品孔ATP释放浓度。

9、统计学方法。

应用SPSS统计软件对实验数据进行分析,结果以均数±标准差(x±s)表示，各组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01为极显著差异。

二、结果。

(一)原代卫星胶质细胞P2Y12受体mRNA表达变化。

通过Real-time PCR方法检测各组卫星胶质细胞中P2Y12受体mRNA表达变化。实验结果显示：高糖高脂组P2Y12受体mRNA表达显著高于对照组(p<0.001)；高糖高脂+P2Y12拮抗剂组明显低于高糖高脂组(p<0.001)。见图1。

(二)原代卫星胶质细胞P2Y12受体蛋白表达变化。

通过蛋白印迹方法检测各组原代卫星胶质细胞中P2Y12受体蛋白表达变化。实验结果显示：高糖高脂组卫星胶质细胞P2Y12受体蛋白表达明显高于对照组，具统计学意义(p<0.001)；高糖高脂+P2Y12拮抗剂组P2Y12受体蛋白表达较高糖高脂组显著下降(p<0.001)。见图2。

(三)肿瘤坏死因子(TNF)-α表达变化

通过博士德Elisa试剂盒检测各组原代卫星胶质细胞培养上清液中炎性因子TNF-α表达变化。结果如下：高糖高脂组卫星胶质细胞上清液中TNF-α表达量(pg/ml)明显高于对照组(p<0.001)；P2Y12拮抗剂处理后的高糖高脂模型组细胞较高糖高脂组TNF-α表达量(pg/ml)显著下降(p<0.001)(见图3)。

(四)三磷酸腺苷(ATP)测定

通过ATP测定试剂盒检测各组卫星胶质细胞ATP的释放量(pM)。实验结果显示：高糖高脂组细胞ATP释放量显著高于对照组(p<0.001)；高糖高脂+P2Y12拮抗剂组明显低于高糖高脂组(p<0.01)(见图4)。

发明人研究发现嘌呤2Y12受体拮抗剂PSB0739处理后可能通过降低神经病理痛大鼠背根神经节卫星胶质细胞P2Y12受体的表达、减少炎性介质释放，提示其可抑制背根神经节卫星胶质细胞P2Y12受体介导的痛觉信息传递，减轻糖尿病损伤所致的神经病理性损伤及相关疾病。

Claims (4)

1.嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备糖尿病神经病理损伤疾病的药物中的应用。

2.嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备糖尿病神经病理损伤诱发神经病痛药物中的应用。

3.嘌呤2Y12受体拮抗剂在制备治疗糖尿病并发感觉神经炎性相关疾病防治药物中的应用。

4.嘌呤2Y12受体拮抗剂以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型在药物中的应用。