CN107648182B - 超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)及制备方法及用途 - Google Patents

超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)及制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了超稳定纳米药物载体mPEG‑PGlu(D)‑VE(D)及制备方法及用途，超稳定纳米药物载体mPEG‑PGlu(D)‑VE(D)，用式I表示：

Description

超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)及制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)及制备方法及用途。
背景技术
纳米科学领域的快速发展为生物医药的进步带来了新的机遇，高分子轭合物胶束就是一类具有优异药物传输性能的新型纳米载体。胶束特有的双亲性壳核结构能够将难溶性药物包裹在其疏水内核，避免药物在血液循环过程中发生聚集。在胶束设计过程中，提高胶束载药量，延长胶束的体循环时间是改善药效及药物生物利用度必不可少的考虑因素。
胶束进入血液后，若浓度被血液稀释到临界胶束浓度(CMC)以下则会发生胶束结构裂解的现象，药物提前释放，导致进入靶标组织的药物含量减少，影响药效。胶束只有在体内保持较高的稳定性才能达到延长体循环时间，避免过早释放或突释，从而在目标部位聚集和释放的效果。提高胶束稳定性对延长胶束体循环时间，改善药物生物利用度具有实际意义。
已有的研究大多专注于嵌段聚合物链的化学改性，通过引入疏水基团，极性基团，调控亲疏水嵌段比例或采取交联的方式提高整个载体的稳定性。极少有研究注意到手性结构能够影响纳米药物载体的稳定性。
自然存在的具有其他材料不可比拟的优良生物相容性的生物大分子多肽能够通过二级结构的有序排列和组装形成特定的空间结构，如α螺旋，β折叠或更高级的结构，这种独特的空间结构赋予其复杂而优异的生物学功能。基于多肽构建的嵌段共聚物胶束同样具备自组装成特定二级结构的能力，且胶束的亲水外壳能够包裹多肽避免蛋白酶的水解，应用最广泛的则是聚乙二醇(PEG)多肽胶束。已有研究表明Lu H,Wang J,Bai Y,et al.Ionicpolypeptides with unusual helical stability[J].Nature communications,2011,2:206.含有手性结构且能够组装成α螺旋这种二级结构的胶束稳定性优于无规卷曲结构的胶束，而氨基酸自身具有的L型和D型手性特征使多肽的螺旋结构存在左旋和右旋之分，螺旋方向不同是否能导致胶束稳定性差异迄今为止还未见有报道。
通过化学反应使氨基酸聚合形成的多肽含有多个羧基或氨基基团，当这些基团以离子形式存在时，静电相互作用作为主要驱动力使其结构呈无规卷曲；以分子状态存在时，氢键作用占主导使其结构呈α螺旋。多肽侧链上多个活性基团位置(羧基/氨基)能够共价轭合药物或其他功能分子，这种多价轭合方式往往具有较高的载药量。多肽的侧链被修饰后，静电作用减弱，氢键或疏水相互作用占据主导位置，有利于二级结构趋向螺旋形式并提高螺旋含量。
因此，选择具有手性和无旋光性异构体的药物或功能分子与多肽链共价轭合，赋予多肽纳米胶束生物活性的同时，可以进一步探究侧链手性结构对多肽主链乃至整个胶束二级结构的影响进而对胶束稳定性的调控。设计这样一类主链与侧链具有不同手性结构的多肽轭合物胶束，并筛选得到稳定性最优的胶束，能够为今后多肽类纳米药物载体的设计与构建提供思路与方向，具有深远的指导意义与参考价值。制备得到的这种超稳定性多肽类胶束本身具有优异的生物相容性且能够作为药物载体包载功能性药物递送到体内，在体循环中保持结构稳定，防止药物突释，大大改善药物生物利用度，提高疗效。
发明内容
本发明的目的是以手性结构为出发点，将具有手性结构的聚谷氨酸多肽链与具有手性结构和优异生物活性的超疏水性维生素E共价轭合，经过筛选不同手性组合提供一种超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)。
本发明的第二个目的是提供一种超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)制备超稳定的高分子纳米胶束的应用。
本发明的技术方案概述如下：
超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)，用式I表示：
Figure BDA0001060256270000021
其中m＝113-273，n＝5-50；
所述mPEG-PGlu(D)-VE(D)为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E的简写。
超稳定药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将D-谷氨酸-5苄酯(II)和三光气溶解在第一种有机溶剂中反应，反应结束后，降至室温，用第二种有机溶剂沉淀，重结晶，得到D-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(III)；
(2)将式(III)化合物、氨基化聚乙二醇单甲醚(Ⅳ)溶解在第三种有机溶剂中反应，反应结束后，加入冰乙醚中沉淀，抽滤取沉淀，得到：氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(V)；
(3)将化合物(V)溶解在三氟乙酸中，滴加33wt％溴化氢-乙酸溶液,反应，减压旋转蒸发除去三氟乙酸、溴化氢和乙酸，加入二氯甲烷重新溶解，加入到冰乙醚中沉淀，抽滤取沉淀，得到：脱去苄基保护基的氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(Ⅵ)；
(4)将氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(Ⅵ)、D-α-维生素E、催化剂和脱水剂溶解在第四种有机溶剂中反应，反应结束后，加入冰乙醚沉淀除去未反应的维生素E，抽滤得沉淀，向沉淀中加入第五种有机溶剂，溶解后的溶液装入截留分子量为1,000Da的透析袋用蒸馏水透析12-48h，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液冷冻干燥得到的固体即为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E(I)；
反应式如下：
Figure BDA0001060256270000031
其中：m＝113-273，n＝5-50；
HBr为溴化氢的简写；
AcOH为乙酸的简写；
TFA为三氟乙酸的简写。
第一种有机溶剂优选：四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯或氯仿。
第二种有机溶剂优选：正己烷或石油醚。
第三种有机溶剂优选：氯仿、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或氯仿与N，N’-二甲基甲酰胺混合溶剂。
催化剂优选：4-二甲氨基吡啶或1-羟基苯并三唑。
脱水剂优选：N,N’-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二异丙基碳二亚胺。
第四种有机溶剂优选：氯仿、N，N’-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
第五种有机溶剂优选：N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)制备超稳定的高分子纳米胶束的应用，包括如下步骤：将权利要求1的超稳定药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)加入有机溶剂溶解，采用截留分子量为1,000Da-7,000Da的透析袋透析，透析介质为蒸馏水，透析12-48h，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液超声,得到超稳定的高分子纳米胶束水溶液；所述有机溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
本发明的优点：
(1)本发明突破了传统的对嵌段聚合物链化学改性，通过引入疏水基团，极性基团，调控亲疏水嵌段比例或采取交联的方式提高整个胶束稳定性的方法，创新性地提出以手性结构/二级结构角度改善胶束稳定性。
(2)本发明经过全面调查与衡量，选择了一种较为恰当的侧链分子，即维生素E，考察侧链分子的引入及其结构对胶束稳定性的影响。VE具有优良的抗氧化性和生物活性，生物相容性极好，其本身超强的疏水性利于胶束疏水片段紧密聚集增强胶束的稳定性，又具有手性和无手性两种结构，是判断侧链分子及其结构差异对多肽螺旋结构影响的典型模型分子。
(3)本发明的设计思路全面，涵盖主链结构差异及侧链结构不同，旋光性、消旋和物理混合多种结构设计，思路严谨，多角度全面剖析与验证得到一种最稳定的高分子纳米胶束用于药物递送载体，提高胶束在体循环的稳定性，改善药物生物利用度和药效。
(4)本发明选择的聚合物材料如甲氧基聚乙二醇，谷氨酸和维生素E均为人体可代谢或对人体有益和必需的材料，是一种具有优良生物相容性的药物递送载体，还可稳定包载并递送多种药物分子，实现协同治疗。
(5)本发明表征手段系统而全面，通过核磁及紫外分光光度法验证聚合物结构。通过临界胶束浓度测试(CMC)、圆二色光谱(CD)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、激光共聚焦显微镜等表征手段及盐溶液耐受度测试系统地比较与分析，各项实验结果互相佐证并有力支撑实验结果。
附图说明
图1是D-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(BDG-NCA)的1H-NMR(CDCl3)图谱。
图2是聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(mPEG-PBDG)的1H-NMR(TFA-d6)图谱。
图3是聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(mPEG-PGlu(D))的1H-NMR(TFA-d6)图谱。
图4是聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E(mPEG-PGlu(D)-VE(D))的1H-NMR(DMSO-d6)图谱。
图5是紫外分光光度计检测到的紫外图谱。
图6是透射电子显微镜(TEM)观察到的胶束形貌图。
图7是圆二色光谱仪测得的样品二级结构图。
图8是动态光散射(DLS)测得样品水力学直径图。
图9是根据CMC和CD结果筛选出的三种代表性胶束在150mM与2M浓度NaCl水溶液中保持1天和15天时的粒径变化图。
图10是激光共聚焦显微镜下三种代表性胶束被HepG2细胞摄取后在不同时间间隔的胞内胶束结构裂解图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)，用式I表示：
Figure BDA0001060256270000051
其中m＝227，n＝25；
所述mPEG-PGlu(D)-VE(D)为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E的简写。
m还可以是113-273中任意一个，n还可以是5-50中任意一个。
实施例2
超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)(m＝227，n＝25)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g D-谷氨酸-5苄酯(BDG)(II)和0.31g三光气溶解在无水四氢呋喃中，55℃反应90min，反应结束后，降至室温，旋蒸浓缩溶液至2mL，在-20℃低温搅拌反应浴下，将溶液逐滴滴入10mL冰正己烷中，产生白色沉淀。抽滤得到白色沉淀置于50mL烧杯，用2mL四氢呋喃加热溶解，并向其中逐滴加入正己烷，直到产生浑浊且不消失，薄膜封口放入冰箱冷冻层，烧杯中立即产生结晶，呈白色粉状。抽滤得到得到D-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(BDG-NCA)(III)；见图1；
实验证明用1,4-二氧六环、氯仿或乙酸乙酯替代本步骤的无水四氢呋喃作为反应溶剂；沉淀与重结晶所用溶剂用石油醚替代正己烷；反应温度也可设为45℃或50℃，反应时间也可为2h或1h，制备BDG-NCA。
(2)将0.23g D-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(BDG-NCA)(III)，0.30g氨基化聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2)(Ⅳ)(m＝227)溶解在无水氯仿中，抽真空，氩气保护，30℃下搅拌反应，反应3天后结束，在-20℃低温搅拌反应浴下将溶液滴入80mL冰乙醚中，立即产生白色沉淀。抽滤得到白色沉淀，真空干燥后呈白色粉末状固体即为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(mPEG-PBDG)(V)(m＝227,n＝25)；
见图2；
实验证明用无水N，N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或氯仿与N，N’-二甲基甲酰胺按体积比10：1的混合溶液替代无水氯仿作为反应溶剂完成此步骤；反应温度也可设为室温；反应时间也可为4天。
(3)将0.31g步骤(2)获得的氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(mPEG-PBDG)(V)溶解在3.6mL三氟乙酸中，溶液呈浅黄色，用橡胶塞密封烧瓶后抽真空，氩气保护，再用针管吸取0.36mL 33wt％溴化氢-乙酸(HBr-AcOH)溶液，排尽针管中气泡后缓慢滴入密封的圆底烧瓶中，溶液颜色逐渐变深呈橘黄色。反应在室温条件下搅拌90min后停止，将反应液减压旋蒸除去溶剂。再加入5mL二氯甲烷溶解样品，并将其逐滴滴入80mL冰乙醚中，产生淡橘黄色沉淀，抽滤，沉淀即为脱去苄基保护基的氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(mPEG-PGlu(D))(Ⅵ)；
见图3。
(4)将0.1g氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(mPEG-PGlu(D))(Ⅵ)用10mL二氯甲烷溶解并依次加入1.09g脱水剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.69g催化剂4-二甲氨基吡啶。在室温下搅拌1h。再称取2.45g D-α-维生素E于100mL圆底烧瓶，用10mL二氯甲烷溶解，并将活化1h后的溶液缓慢逐滴加入其中，橡胶塞密封，抽真空，氮气保护，30℃油浴恒温下搅拌反应。24h后停止反应。旋蒸浓缩后将样品逐滴滴入100mL冰乙醚中，产生白色沉淀，(未反应的维生素E溶于乙醚)，沉淀操作三遍。抽滤得到白色沉淀再用10mL N，N’-二甲基甲酰胺重新溶解，装入截留分子量为1,000Da的透析袋用蒸馏水透析。透析24h，每隔12h换一次水。透析结束后，离心，上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液冷冻干燥得到淡黄色固体即为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E(mPEG-PGlu(D)-VE(D))(I)；
见图4；
用1-羟基苯并三唑替代本步骤的4-二甲氨基吡啶作催化剂；
用N,N’-二环己基碳二亚胺或N,N'-二异丙基碳二亚胺替代本步骤1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作脱水剂；
用氯仿或N，N’-二甲基甲酰胺替代本步骤的二氯甲烷；
用二甲基亚砜或四氢呋喃替代本步骤的N,N’-二甲基甲酰胺；
透析时间用12h或48h替代24h，其它同本步骤，制备出超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)(I)。
按本实施例的方法，制备m是113-273中任意一个，n是5-50中任意一个的超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)(I)
实施例3
超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)(实施例2制备，其中m＝227,n＝25)及其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)的结构验证。(上述对照品的制备参照实施例2的方法制备)
分别配制浓度为12.5μg/mL D-α-维生素E和DL-α-维生素E，0.2mg/mL三种不同结构的多肽主链mPEG-PGlu(D)、mPEG-PGlu(L)和mPEG-PGlu(DL)及0.25mg/mLmPEG-PGlu(D)-VE(D)及上述5种不同手性结构组合和不含手性结构的多肽维生素E轭合物对照品的甲醇溶液。扫描各个样品溶液的紫外波长；
见图5；
图中，两种维生素E的最大紫外吸收峰在292nm，三种未接上维生素E多肽主链的最大紫外吸收峰在210nm附近。而观察六种接有维生素E的多肽维生素E轭合物的紫外图谱发现，属于维生素E的最大吸收峰均出现了蓝移，出现在288nm处。引起蓝移或红移是由于取代基发生变化或溶剂极性，由于使用同一溶剂故排除后者因素，正是由于VE的羟基与多肽主链发生酯化后分子结构发生改变导致了最大紫外吸收峰发生蓝移。这一数据一定程度上证实了超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)的成功合成。
实施例4
一种超稳定的高分子纳米胶束的制备
称取0.1g实施例2制备的mPEG-PGlu(D)-VE(D)溶于10mL N，N’-二甲基甲酰胺中，装入截留分子量为1,000Da的透析袋中，用蒸馏水透析24h，每6小时换一次蒸馏水。透析结束后，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液超声20min使其均匀即得超稳定的高分子纳米胶束水溶液；
用二甲基亚砜或四氢呋喃替代N，N’-二甲基甲酰胺；透析袋的截留分子量为1,000Da-7,000Da中任意一种，制备超稳定的高分子纳米胶束水溶液。
实施例5
胶束稳定性对比测试。
1、胶束的透射电子显微镜(TEM)测试。
分别称取4mg mPEG-PGlu(D)-VE(D)及其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)，加入4mL超纯水溶解，配制成1mg/mL的水溶液，超声20min使胶束分散均匀后用0.45μm微孔滤膜过滤除去溶液中聚集的纳米粒子，尽可能保证胶束粒径大小均一，分散均匀。最后将得到的溶液用针管滴于碳支持膜上，滤纸吸干多余溶液并室温干燥，制备的样品利用透射电子显微镜(TEM)观察胶束形貌。
见图6。a：mPEG-PGlu(D)-VE(D)；b：mPEG-PGlu(L)-VE(D)；c：mPEG-PGlu(DL)-VE(D)；d：mPEG-PGlu(D)-VE(DL)；e：mPEG-PGlu(L)-VE(DL)；f：mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)，标尺大小200μm。
2、胶束的临界胶束浓度(CMC)测试。
分别称取5mg mPEG-PGlu(D)-VE(D)及其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)，实验为了全面考察手性结构对胶束稳定性的重要影响，又增加两组物理混合的对照品，即用mPEG-PGlu(L)-VE(D)与mPEG-PGlu(D)-VE(D)等摩尔混合得到mPEG-PGlu(D,L)-VE(D)，用mPEG-PGlu(L)-VE(DL)与mPEG-PGlu(D)-VE(DL)等摩尔混合得到mPEG-PGlu(D,L)-VE(DL)。分别用超纯水溶解后转移至5mL容量瓶，加超纯水定容，配成1000μg/mL的母液，再分别2000μL，1000μL，500μL，250μL，125μL，80μL，50μL，40μL，25μL，15μL，10μL，5μL，3μL，2μL母液至5mL容量瓶中定容稀释成400μg/mL，200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，16μg/mL，10μg/mL，8μg/mL，5μg/mL，3μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.6μg/mL，0.4μg/mL的溶液，每种样品平行三组。
称取10mg芘于25mL容量瓶中，加入丙酮溶液溶解芘并定容，再从中吸取0.625mL置于另一25mL容量瓶中，加入丙酮溶液定容，配制成芘溶液。
分别取40μL，5×10-5mol/L的芘溶液置于10mL EP管中，共14个EP管，室温下，待EP管中丙酮自然挥发后分别向其中加入4mL配置的14种不同浓度的mPEG-PGlu(D)-VE(D)溶液，超声15min，65℃水浴振荡2h。上述7种对照品按同样操作配置。常温静置使样品平衡后测每个样品荧光强度(荧光测定条件：λex＝333nm，λem＝350-420nm，狭缝宽度为5nm，样品池厚度1cm)，记录样品在373nm和384nm处的荧光吸光度值。分别计算每个样品的I384/I373值。以I384/I373值与浓度的对数线性回归并计算得到八种胶束样品的CMC值；
见表1；
表1是超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)形成的胶束与其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)、mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)、mPEG-PGlu(D,L)-VE(D)和mPEG-PGlu(D,L)-VE(DL)的临界胶束浓度(CMC)值。
表1：
Figure BDA0001060256270000081
根据表1数据分析，mPEG-PGlu(D)-VE(D)的CMC值最低，按照稀释稳定性理论，胶束CMC越低，进入血液稀释后胶束结构越不易解体，从CMC这一角度，基本可以得到mPEG-PGlu(D)-VE(D)最稳定的结论。
3、胶束二级结构即圆二色光谱(CD)测定。
称取35.83g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)用100mL蒸馏水超声溶解后定容至500mL容量瓶配制成浓度为0.2mol/L的Na2HPO4水溶液。称取10.51g柠檬酸(C4H2O7·H2O)用100mL蒸馏水超声溶解并定容至至500mL容量瓶，配制成浓度为0.1mol/L的C4H2O7水溶液。取0.2mLNa2HPO4溶液和10.6mL C4H2O7溶液混合均匀后再用pH计精确调节溶液pH值至2。取16.47mLNa2HPO4溶液和3.53mL C4H2O7溶液混合均匀后再用pH计精确溶液调节溶液pH值至7。用调节好pH的两种溶液分别溶解mPEG-PGlu(D)-VE(D)胶束及其7种对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)、mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)、mPEG-PGlu(D,L)-VE(D)和mPEG-PGlu(D,L)-VE(DL)和四种未连接维生素E的多肽主链聚合物mPEG-PGlu(D)、mPEG-PGlu(L)、mPEG-PGlu(DL)和mPEG-PGlu(D,L)，使其浓度为0.01mM。配制好的溶液使用圆二色光谱仪测定其二级结构；(扫描速率：100nm/min，扫描间隔：0.5nm，石英池光程：1cm，测试温度：37℃，记录190-250nm波长下的数值。)
见图7；
当溶液pH在羧基pKa(pKa＝4)以下，具有手性的聚谷氨酸能够以α螺旋的二级结构形态存在。因此实验设计测试样品在两种不同pH条件下的二级结构。分析图7：当pH＝7时，L型及D型聚谷氨酸主链在198nm处有一个明显的单峰，代表多肽处于无规卷曲构象。而共价连接维生素E后，在208nm和222nm处显现出微弱的双峰，这种双峰代表多肽处于α螺旋的构象，仔细观察数据可以发现mPEG-PGlu(D)-VE(D)胶束的α螺旋含量更多。当pH＝2时，溶液pH低于羧基的pKa，主链具有手性的聚合物胶束都以α螺旋结构存在，且208nm和222nm处显示的双峰强度明显比pH＝7时更高。同样地，mPEG-PGlu(D)-VE(D)胶束的α螺旋含量最多，与pH＝7时的趋势一致。从图7数据可以得到mPEG-PGlu(D)-VE(D)具有较高稳定性的结论。
4、胶束的水力学直径(DLS)测试。
称取mPEG-PGlu(D)-VE(D)胶束样品及其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)、mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)、mPEG-PGlu(D,L)-VE(D)和mPEG-PGlu(D,L)-VE(DL)各4mg，用4mL超纯水溶解后超声处理20min，使之形成胶束。再使用0.45μm微孔滤膜过滤除去溶液中聚集的大颗粒，平行设置三组实验，溶液于室温25℃下，利用马尔文粒度仪测定四个样品的DLS值；
见图8；见表2；
表2：超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)形成的胶束与其对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)、mPEG-PGlu(L)-VE(D)、mPEG-PGlu(L)-VE(DL)、mPEG-PGlu(DL)-VE(D)、mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)、mPEG-PGlu(D,L)-VE(D)和mPEG-PGlu(D,L)-VE(DL)的水力学粒径分布表。
表2
Figure BDA0001060256270000101
通过DLS的测试结果评价胶束的粒径均小于200nm，具备被动靶向性，mPEG-PGlu(D)-VE(D)胶束的粒径最小，为122.7±1.249nm，胶束的α螺旋含量越多代表具有手性结构的聚谷氨酸和维生素E部分越紧密，胶束疏水部分越紧密代表胶束越稳定。
5、胶束的盐浓度耐受度测试。
根据CMC、CD和DLS结果，选择两种具有代表性胶束样品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)作为对照品。称取4mg mPEG-PGlu(D)-VE(D)、mPEG-PGlu(D)-VE(DL)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)分别用4mM、150mM、0.5mM、1mM和2M NaCl水溶液及1mM硫脲水溶液溶解至浓度为1mg/mL，使用马尔文粒度仪测定其在1天及15天后粒径变化；
见图9；
图9选取150mM NaCl和2M两种NaCl水溶液中粒径变化结果为代表，mPEG-PGlu(D)-VE(D)在体液浓度150mM NaCl和高盐浓度2M NaCl中保存15天仍不发生聚集。
6、细胞内胶束结构稳定性测试。
将5mg荧光染料尼罗红用2mL乙醇溶液，超声2min。再称取mPEG-PGlu(D)-VE(D)、mPEG-PGlu(D)-VE(DL)和mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)各50mg，分别用3mL乙醇溶解后与尼罗红混合，超声2min后将混合物在旋转仪上快速旋转5min使两者能够充分混匀。60℃水浴下，旋蒸30min除去乙醇，此时圆底烧瓶内壁出现紫罗兰色的薄膜和部分固体小颗粒，向其中加入6mL超纯水，并在旋转仪上快速旋转2min，超声5min。最后将混悬液体转移至离心管，离心取上清即得包载尼罗红的聚合物胶束。
采用高效液相色谱测定包载尼罗红的含量：在测量含量前，先配制尼罗红甲醇溶液进行紫外-可见光全波长扫描，确定尼罗红的最大吸收波长为553nm。
标准曲线的建立：精确称取1mg NR，置于10mL棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇溶解定容，再经稀释后配制成浓度为0.5、1、2.5、5、8、10、20、25、50μg/mL的NR标准溶液，用高效液相色谱测定各个浓度下的峰面积(色谱条件：流动相：甲醇，进样量：20μL，检测波长：553nm(NR)，流速1mL/min，柱温：30℃，NR出峰时间：约6min)。将各个浓度下NR标准溶液测得的峰面积对其浓度进行线性回归，即得标准曲线方程。
通过薄膜水化法制备的三种包载尼罗红的聚合物胶束冻干后为棉絮状固体。将三种样品重新用色谱甲醇溶解后，以标准曲线同样的色谱条件检测包载尼罗红的含量，每种样品平行三组。
细胞培养：将HepG2细胞贴壁培养至覆盖培养基的80％至90％时，通过四方格计数将细胞悬浮液浓度稀释至10×104个/mL。取9个激光共聚焦培养皿，将稀释后的细胞悬浮液平均分配至9个共聚焦培养皿中，贴壁培养24h。
细胞摄取实验：取出9个共聚焦培养皿吸出其中的培养基，分别加入1mL含胶束样品培养基，孵育2h后，弃去含样品培养基，更换无样品培养基，保证细胞摄取纳米胶束后不再持续摄取，利于观察胶束结构在一定时间内的裂解程度。三种样品更换培养基后分别在细胞培养箱中培养0h、4h、8h。并将一定时间间隔的培养皿用4％多聚甲醛常温避光固定。固定后的细胞用500μL DAPI溶液(1μg/mL)，常温避光染细胞核。最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞内胶束裂解情况(DAPI激发波长：405nm，接收波长：450-540nm；尼罗红激发波长：561nm，接收波长：600-700nm)；
见图10；标尺大小：30μm。
图10中红色荧光表示尼罗红，当胶束结构未裂解时在细胞质中呈明亮的红色点状，一旦结构裂解，尼罗红从胶束内核游离而分散在细胞质中，不再集中使得亮度下降，呈暗淡而弥散的一片。在0h时，即细胞用含胶束培养基孵育2h后刚更换无样品培养基时的状态，由于尼罗红浓度一致，从图中可以看出三种样品均有多处明亮的红点，摄取情况一致。4h后明亮的红点减少，证明部分胶束已解体，但三种样品区别不明显，这一现象说明，连接超疏水性分子维生素E的多肽胶束具有较强的稳定性。8h后可以从共聚焦图中看出明显的差别，无螺旋结构的对照品mPEG-PGlu(DL)-VE(DL)胶束大部分已裂解，而上述实验结果表明的最稳定的胶束mPEG-PGlu(D)-VE(D)确实表现出优异的稳定性，8h仍有大量明亮的红色点状的载尼罗红胶束未发生解体。主链手性结构相同的对照品mPEG-PGlu(D)-VE(DL)与mPEG-PGlu(D)-VE(D)相比，未解体的胶束含量稍少。评价共聚焦显微镜观察得到的细胞摄取实验结果得到设计的多肽维生素E轭合物本身具有较高的稳定性且mPEG-PGlu(D)-VE(D)最稳定的结论。
不应认为本发明局限于本文所述的具体实例，而应理解为本发明覆盖在所附权利要求书中完整地列出的本发明的所有方面。对本发明所属领域的技术人员而言，在阅览本发明后，本发明可适用的各种修改、等同方法、各种结构以及评价标准都是显而易见的。

Claims (5)

1.超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)，其特征是用式I表示：
Figure FDA0002198812940000011
其中m＝113-273，n＝5-50；
所述mPEG-PGlu(D)-VE(D)为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E的简写。
2.权利要求1超稳定药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将D-谷氨酸-5苄酯(II)和三光气溶解在第一种有机溶剂中反应，反应结束后，降至室温，用第二种有机溶剂沉淀，重结晶，得到D-谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(III)；
(2)将式(III)化合物、氨基化聚乙二醇单甲醚(Ⅳ)溶解在第三种有机溶剂中反应，反应结束后，加入冰乙醚中沉淀，抽滤取沉淀，得到：氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(V)；
(3)将化合物(V)溶解在三氟乙酸中，滴加33wt％溴化氢-乙酸溶液,反应，减压旋转蒸发除去三氟乙酸、溴化氢和乙酸，加入二氯甲烷重新溶解，加入到冰乙醚中沉淀，抽滤取沉淀，得到：脱去苄基保护基的氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(Ⅵ)；
(4)将氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸嵌段共聚物(Ⅵ)、D-α-维生素E、催化剂和脱水剂溶解在第四种有机溶剂中反应，反应结束后，加入冰乙醚沉淀除去未反应的维生素E，抽滤得沉淀，向沉淀中加入第五种有机溶剂，溶解后的溶液装入截留分子量为1,000Da的透析袋用蒸馏水透析12-48h，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液冷冻干燥得到的固体即为氨基化聚乙二醇单甲醚-D-聚谷氨酸-D-维生素E(I)；
反应式如下：
Figure FDA0002198812940000021
其中：m＝113-273，n＝5-50；
HBr为溴化氢的简写；
AcOH为乙酸的简写；
TFA为三氟乙酸的简写；
第一种有机溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙酸乙酯或氯仿；
第二种有机溶剂为正己烷或石油醚；
第三种有机溶剂为氯仿、N，N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或氯仿与N，N’-二甲基甲酰胺混合溶剂；
第四种有机溶剂为氯仿、N，N’-二甲基甲酰胺或二氯甲烷；
第五种有机溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述催化剂为4-二甲氨基吡啶或1-羟基苯并三唑。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是脱水剂为N,N’-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N'-二异丙基碳二亚胺。
5.权利要求1的超稳定纳米药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)制备超稳定的高分子纳米胶束的应用，其特征是包括如下步骤：将权利要求1的超稳定药物载体mPEG-PGlu(D)-VE(D)加入有机溶剂溶解，采用截留分子量为1,000Da-7,000Da的透析袋透析，透析介质为蒸馏水，透析12-48h，离心，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液超声,得到超稳定的高分子纳米胶束水溶液；所述有机溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
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