CN107635563A - 抗菌化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有效靶向细菌生长的水杨酰胺化合物及其组合物。本发明的化合物和组合物可特别用于例如预防或治疗细菌感染以及预防、减少或消除生物膜形成。

Description

抗菌化合物
技术领域
本发明涉及有效预防或治疗由革兰氏阳性细菌引起的细菌感染的水杨酰胺化合物及其组合物。本发明进一步涉及有效预防或治疗由革兰氏阴性细菌引起的细菌感染的与外排泵抑制剂组合的水杨酰胺化合物，以及其组合物。
背景技术
普遍预期多重抗性菌的兴起将是21世纪人类面临的最大的健康问题(Boucher,H.W.,Talbot,G.H.,Bradley,J.S.,Edwards,J.E.,Gilbert,D.,Rice,L.B.,Scheld,M.,Spellberg,B.和Bartlett,J.(2009).Bad Bugs,No Drugs:No ESKAPE！An Update fromthe Infectious Diseases Society of America.Clinical Infectious Diseases 48(1):1-12；Piddock,L.J.(2012).The crisis of no new antibiotics--what is the wayforward？Lancet Infect Dis.12(3):249-53)。临床医生已经常面对抗生素抗性的病例，以前简单治疗的感染变得更加困难，并且在某些情况下是无法治疗的。几乎所有类别的抗生素都在1970年之前被发现，并且在过去30年中，未开发出新的主要类别的抗生素。最近，通过开发针对已知抗生素的类似物，大多数进展已在抗生素类别内。然而，抗性机制已发展到使得现在整个类别的抗生素对某些细菌是无效的。
为了降低抗生素抗性率，正在采取更多的措施来限制起初感染的传播和发病率，连同关于正确使用抗生素的教育，并且限制其以促进感染发展的方式使用。然而，仍然需要新的抗生素，特别是针对革兰氏阴性病原体有效的抗生素，其代表显著比例的传染病负担。
氯硝柳胺(N-(2'-氯-4'-硝基苯基)-5-氯水杨酰胺)是水杨酰苯胺化合物。在20世纪50年代，在针对蜗牛光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)筛选20,000种化合物和结构优化后，将水杨酰苯胺鉴定为可用于杀死蜗牛(R.(1961).Results oflaboratory and field trials with the molluscicide Bayer 73.)。Sun和Zhang(Sun,Z.和Zhang,Y.(1999).Antituberculosis activity of certain antifungal andantihelmintic drugs.Tubercle and Lung Disease 79(5):319-320.)调查了用于抗真菌药和驱虫药针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的活性，所述结核分枝杆菌被广泛分类为作为革兰氏阳性细菌，尽管它具有革兰氏阳性细菌和阴性细菌两者的“抗酸”细胞壁特征。他们发现氯硝柳胺针对结核分枝杆菌非常活跃，其MIC为0.5-1μg·mL-1。氯硝柳胺对于在低氧条件下生长的非复制型结核分枝杆菌有活性，其目前负责结核分枝杆菌感染的长期治疗。这些作者确实观察到针对在组织培养中生长的巨噬细胞的毒性。已筛选了氯硝柳胺的水杨酰苯胺类似物，以进一步调查其在结核分枝杆菌治疗中的用途(M.,J.,Buchta,V.,Horvati,K.,S.和J.(2010).New aminoacid esters of salicylanilides active against MDR-TB and othermicrobes.European journal of medicinal chemistry 45(12):6106-6113；M.,J.,Novotná,E.,Mandíková,J.,Wsól,V.,Trejtnar,F.,Ulmann,V.,J.,Fernandes,S.和Bhat,S.(2012).salicylanilide derivatives block Mycobacteriumtuberculosis through inhibition of isocitrate lyase and methionineaminopeptidase.Tuberculosis 92(5):434-439.)。
de Carvalho等人还调查了氯硝柳胺和硝唑尼特的结构类似物针对结核分枝杆菌的功效(de Carvalho,L.P.S.,Darby,C.M.,Rhee,K.Y.和Nathan,C.(2011).Nitazoxanidedisrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasis ofMycobacterium tuberculosis.ACS medicinal chemistry letters 2(11):849-854.)。他们显示氯硝柳胺和硝唑尼特钠使结核分枝杆菌的膜电位解偶联，而对照利福平则不能。
Imperi等人最近研究了氯硝柳胺作为革兰氏阴性致病机制的间接抑制剂的潜力，他们筛选了FDA批准的药物，以鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的群体感应系统的任何抑制剂(Imperi,F.,Massai,F.,Ramachandran Pillai,C.,Longo,F.,Zennaro,E.,Rampioni,G.,Visca,P.和Leoni,L.(2013).New life for an old drug:theanthelmintic drug niclosamide inhibits Pseudomonas aeruginosa quorumsensing.Antimicrob Agents Chemother 57(2):996-1005.)。在所测试的药物中，氯硝柳胺显示出最高的反群体感测活性。进一步分析确定氯硝柳胺能够抑制对群体感应信号的响应，而不是信号分子的合成。然而，作者并未考虑氯硝柳胺的直接毒性作用，也没有考虑针对氯硝柳胺的防御细胞中的药物外排的可能作用，并且根据作者的数据，氯硝柳胺看起来仅在微摩尔浓度或更高浓度下有效抑制群体感应，提示药物确实被运出细胞。
多药物外排泵可以赋予针对整个抗生素家族的抗性。外排泵在革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌两者中均表达，但在革兰氏阴性细菌中是更有效的抗性机制。这是由于双细胞膜降低药物进入细胞质内的穿透性，并且因为药物在到达细胞质之前立即从周质中泵出细胞外。存在五个已知的多药物流出转运蛋白质家族：小多药物抗性蛋白质家族、多药物和有毒化合物外排蛋白质家族、主要协助转运蛋白家族、ATP结合盒家族和抗性节结化细胞分化家族(Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.和Saier Jr,M.H.(2001).Comparativegenomics of microbial drug efflux systems.Journal of molecular microbiologyand biotechnology 3(2):145-150.)。最后三个家庭通常位于革兰氏阴性的内膜中，并且连同外膜外排蛋白(如TolC)以及允许内膜和外膜转运蛋白之间的相互作用的周质外排蛋白一起工作(Johnson,J.M.和Church,G.M.(1999).Alignment and structure predictionof divergent protein families:periplasmic and outer membrane proteins ofbacterial efflux pumps.Journal of Molecular Biology 287(3):695-715.)。
已知将外排泵抑制剂连同抗生素一起递送可以增加抗生素甚至针对已被鉴定为抗性的菌株的效力。苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺(PAβN)是具有广泛的宿主和抗生素范围的外排泵抑制剂。Lomovskaya等人(Lomovskaya,O.,Warren,M.S.,Lee,A.,Galazzo,J.,Fronko,R.,Lee,M.,Blais,J.,Cho,D.,Chamberland,S.,Renau,T.,Leger,R.,Hecker,S.,Watkins,W.,Hoshino,K.,Ishida,H.和Lee,V.J.(2001).Identification andCharacterization of Inhibitors of Multidrug Resistance Efflux Pumps inPseudomonas aeruginosa:Novel Agents for Combination Therapy.AntimicrobialAgents and Chemotherapy 45(1):105-116.)生成了过表达三种外排泵的铜绿假单胞菌菌株，所述外排泵已知在临床分离物中赋予氟喹诺酮类的抗性。他们通过在抗生素左氧氟沙星的存在下测量生长抑制来筛选合成和天然化合物的文库。PAβN针对每种外排泵均有活性，并且针对大肠杆菌(E.coli)中的AcrAB-TolC也有活性。这些作者证实外排泵抑制剂的包含增加了对氟喹诺酮类的敏感性，逆转对氟喹诺酮类的抗性，并且降低了抗性发展的频率。
鉴于抗生素抗性对人类和动物健康的重大风险，需要开发新型药物/抗菌方法来治疗和预防感染。本发明寻求通过提供包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合产品，或至少提供现有抗细菌剂的有用替代物来满足这一需求。
在本说明书中对现有技术文献的任何提及均不应视为承认这种现有技术是广为人知的或构成本领域普通知识的一部分。
发明内容
在一个方面，本发明提供了水杨酰胺化合物，其用于治疗或预防患者中的细菌感染，其中引起感染的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在另一个方面，本发明提供了水杨酰胺化合物，其用于预防、减少或消除细菌生物膜形成，其中引起生物膜形成的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在一个进一步的方面，本发明提供了药物或生物组合物，其包含水杨酰胺化合物，连同可接受的赋形剂、载体或盐，用于治疗患者中的细菌感染或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成，其中引起感染或生物膜形成的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的方法，其包括向需要治疗的患者施用足以治疗或预防患者中的细菌感染的量的至少一种水杨酰胺化合物。
在再进一步的方面，本发明提供了用于减少或消除包含革兰氏阳性细菌的细菌生物膜形成的方法，其包括施用足以减少或消除生物膜形成的量的至少一种水杨酰胺化合物。
在另一个方面，本发明提供了水杨酰胺化合物在治疗患者中的细菌感染或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的用途，其中引起感染或生物膜形成的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在一个进一步的方面，本发明提供了水杨酰胺化合物在制备用于治疗患者中的细菌感染或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的药剂中的用途，其中引起感染或生物膜形成的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在根据本发明的上述方面的一个实例中，水杨酰胺化合物是氯硝柳胺或其类似物、硝唑尼特或其类似物、或其任何组合。
在根据本发明的上述方面的另一个实例中，革兰氏阳性细菌选自由葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)和芽孢杆菌属(Bacillus)组成的属中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合产品。
在又一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的协同组合。
在另一个方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合物。在一个实例中，组合物包含协同有效量的水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，连同可接受的赋形剂、载体或盐的药物或生物组合物。
根据本发明的组合产品或组合物可以用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者可以用于预防、减少或消除细菌生物膜形成，其中感染或生物膜包含革兰氏阴性细菌。根据本发明的组合产品或组合物可以进一步包含一种或多种杀菌剂或抑菌剂。
相应地，在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合作为药剂的用途，或者包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合物作为药剂的用途。
在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合，其用于制备药物组合物。
在又一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合用于治疗或预防患者中的细菌感染的用途。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物用于治疗或预防患者中的细菌感染的用途，所述药物组合物包含药学有效量的至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其中所述感染包含革兰氏阴性细菌。
在一个进一步的方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的抗细菌剂。抗细菌剂可以用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者它可以用于预防、减少或消除其中存在革兰氏阴性细菌的细菌生物膜的形成。
在一个实例中，生物膜引起伤口和/或烧伤中的感染，或者引起在留置医疗装置中或在留置医疗装置上的感染，或者在食物工业的制备机器内、在由食品工业使用的包装上、在用于水或其他液体的储罐内、或在水处理厂的机器内的生物膜形成。
在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物在制备药剂中的用途。
在又一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合，其用于制备药剂。
在又一个方面，本发明提供了成套试剂盒(a kit of parts)，其包含以分开的单位剂型的至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物、连同使用说明书。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其用于治疗或预防患者中的细菌感染，其中所述感染包含革兰氏阴性细菌。
在又一个方面，本发明提供至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物在制备用于治疗或预防患者中的细菌感染的药剂中的用途，其中所述感染包含革兰氏阴性细菌。
在又一个方面，本发明提供了治疗或预防细菌感染的方法，其包括向需要治疗的患者施用至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其量足以治疗或预防患者中的细菌感染，其中所述感染包含革兰氏阴性细菌。
在又一个方面，本发明提供了用于保护细菌细胞免受至少一种水杨酰胺化合物的毒性的方法，其中水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，该方法包括增加至少一种硝基还原酶在细胞中的表达和/或活性，其量足以使免受水杨酰胺化合物的毒性。
在又一个方面，本发明提供了用于治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗抗性，所述方法包括向患者施用足以治疗或预防感染的量的至少一种水杨酰胺化合物，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。任选地，该方法进一步包括施用至少一种外排泵抑制剂。
在又一个方面，本发明提供了用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗抗性，所述方法包括施用足以预防、减少或消除生物膜形成的量的至少一种水杨酰胺化合物，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。任选地，该方法进一步包括施用至少一种外排泵抑制剂。
在又一个方面，本发明提供了用于治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物或者至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合治疗抗性，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括向患者施用足以治疗或预防感染的量的硝基前药抗生素。
在又一个方面，本发明提供了用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物或者至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合治疗抗性，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括施用足以预防、减少或消除生物膜形成的量的硝基前药抗生素。
本发明还考虑了硝基前药和氯硝柳胺的共同施用，以同时靶向前药抗性细菌以及前药敏感性细菌。
相应地，在又一个方面，本发明提供了用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括施用足以治疗或预防感染，或者预防、减少或消除生物膜形成的量的硝基前药抗生素和氯硝柳胺。
在一个实例中，硝基前药抗生素选自呋喃妥因、呋喃西林、甲硝哒唑、替硝唑、呋喃唑酮、米索硝唑、依他硝唑、硝呋莫司、奥硝唑、苄硝唑、二甲硝咪唑、罗硝唑、RSU-1069、RB-6145、CB1954、EF3、EF5、HX4和氟化米索硝唑。
在又一个方面，本发明提供了鉴定新型硝基还原酶的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)进行现有硝基还原酶基因的靶向或随机诱变，从而产生硝基还原酶变体基因文库；和
(ii)将变体基因文库转化到其中tolC基因已被缺失或tolC表达产物已被抑制的革兰氏阴性细菌内，并且培养细胞使得基因变体被表达；和
(iii)向经转化的细菌细胞施用至少一种水杨酰胺化合物；和
(iv)筛选对水杨酰胺毒性缺乏敏感性的细胞，从而鉴定表达新型形式的硝基还原酶的细胞；和
(v)任选地纯化硝基还原酶。
在一个实例中，革兰氏阴性细菌的内源性硝基还原酶基因已被敲除，或者革兰氏阴性细菌中的硝基还原酶活性已被减少或消除。
在又一个方面，本发明提供了从环境来源的DNA制备物中鉴定新型硝基还原酶的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)从该环境来源的DNA生成细菌基因文库；和
(ii)将基因文库转化到其中tolC基因已被缺失或tolC表达产物已被抑制的革兰氏阴性细菌内，并且培养细胞使得基因文库被表达；和
(iii)向经转化的细菌细胞施用至少一种水杨酰胺化合物；和
(iv)筛选对水杨酰胺缺乏敏感性的细胞，从而鉴定表达新型形式的硝基还原酶的细胞；和
(v)任选地纯化硝基还原酶。
在一个实例中，革兰氏阴性细菌的内源性硝基还原酶基因已被敲除，或者革兰氏阴性细菌中的硝基还原酶活性已被减少或消除。
在另一个实例中，环境来源的DNA源自土壤。
在又一个方面，本发明提供了鉴定新型TolC抑制剂的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)在至少一种水杨酰胺化合物和候选TolC抑制剂的存在下，培养表达TolC的革兰氏阴性细菌；和
(ii)筛选对水杨酰胺毒性敏感的细胞，
从而鉴定新型TolC抑制剂。
在一个实例中，水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物提供协同的抗菌效应。
在另一个方面，本发明提供了包含抗生有效量(antibiotically effectiveamount)的下述的组合物：
(i)水杨酰胺化合物或其药学可接受的盐；和
(ii)外排泵抑制剂化合物或其药学可接受的盐；
其中化合物(i)和(ii)以足以产生协同抗生效应(antibiotic effect)的比例采用。
在一个实例中，细菌感染是由一种或多种革兰氏阴性细菌引起的细菌感染。
在另一个实例中，细菌感染是由铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)、丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)(Psa-V)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、志贺氏菌属(Shigella)菌种、沙门氏菌属(Salmonella)菌种或肠杆菌属(Enterobacter)菌种。
在一个进一步的实例中，水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。
在一个实例中，水杨酰胺化合物是水杨酰苯胺化合物，并且可以被一个或多个硝基取代。
在另一个实例中，水杨酰苯胺化合物是式(I)的化合物：
其中：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢、羟基和卤素，条件是R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个是卤素，并且R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个是羟基；
R6、R7、R8、R9和R10各自独立地选自氢、硝基和卤素，条件是R6、R7、R8、R9和R10中的至少一个是卤素，并且R6、R7、R8、R9和R10中的至少一个是硝基；
或其药学可接受的盐。
在某些实例中，式(I)中的任何卤素选自氯、氟和溴。更优选地，式(I)中的至少一个卤素是氯。
在一个实例中，式(I)中的R8为硝基。可替代地，R9是硝基。可替代地，R10是硝基。可替代地，R7是硝基。
在相关实例中，水杨酰苯胺化合物是选自下表1的化合物。
在一个进一步的相关实例中，水杨酰苯胺化合物是具有以下结构的氯硝柳胺：
或其药学可接受的盐。
在一个实例中，药学可接受的盐是乙醇胺盐或哌嗪盐。
可替代地，水杨酰胺化合物选自下述：
具有下述结构的氯氰碘柳胺
具有下述结构的羟氯扎胺(oxyclonazide)
具有下述结构的氯苯碘柳胺
具有下述结构的氟沙仑
具有下述结构的三溴沙仑
具有下述结构的雷琐太尔
具有下述结构的氯碘沙尼
和
具有下述结构的溴替尼特
或其酯形式或其药学可接受的盐。
可替代地，水杨酰苯胺化合物是硝唑尼特(2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺)或其药学可接受的盐。
在一个实例中，外排泵抑制剂化合物是革兰氏阴性细菌外排泵，例如大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵的同系物的抑制剂。
在一个实例中，外排泵抑制剂是苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺(PAβN)或2-3二溴马来酰亚胺。
在另一个实例中，水杨酰胺化合物与外排泵抑制剂化合物的摩尔比为约1:500至约1:7。
附图说明
图1显示了tolC基因的缺失使大肠杆菌对氯硝柳胺非常敏感。大肠杆菌7KO或tolC菌株的过夜培养物用于接种LB培养基的新鲜等分试样，然后使其在30℃、200rpm下温育2.5小时。随后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微板中的40μL含有2×所需的最终氯硝柳胺浓度的LB培养基(即，导致从5μM降至20nM的最终2倍稀释系列)或0μM对照中。使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照的生长百分比。数据是至少两次独立实验的平均值±SEM。
图2显示了TolC抑制剂PaβN能够使大肠杆菌对氯硝柳胺敏感。大肠杆菌7KO的过夜培养物用于接种LB培养基的新鲜等分试样，然后使其在30℃、200rpm下温育2.5小时。随后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微板中的40μL含有2×所需的最终氯硝柳胺浓度的LB培养基(即，导致从10μM降至160nM的最终2倍稀释系列)或0μM对照，以及0μM、25μM或50μM PaβN中。以相同的方式处理7KOΔtolC的过夜培养物，但不加入PaβN。使384孔板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度来监测培养物浊度，以便计算每个系列相对于0μM氯硝柳胺对照的生长百分比。数据是三次重复的平均值±1标准差。
图3显示了大肠杆菌菌株7KO和DH5α对氯硝柳胺攻击的相对敏感性。大肠杆菌7KO或DH5α的过夜培养物用于接种LB培养基的新鲜等分试样，其在30℃、200rpm下温育2.5小时。随后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微板中的40μL含有2×所需的最终氯硝柳胺浓度的LB培养基(即，导致从40μM降至20nM的最终2倍稀释系列)或0μM对照中。使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照的生长百分比。数据是至少两次独立实验的平均值±SEM。
图4显示了过表达不同的天然硝基还原酶候选物的大肠杆菌7KOΔtolC菌株的氯硝柳胺生长抑制。如所示的过表达不同的硝基还原酶候选基因的大肠杆菌7KOΔtolC菌株的过夜培养物用于接种LB培养基的新鲜等分试样，其在30℃、200rpm下温育2.5小时。随后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微板中的40μL含有2×所需的最终氯硝柳胺浓度的LB培养基(即，导致从4μM降至16nM的最终2倍稀释系列)或0μM对照中。使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照的生长百分比。数据是至少三次独立实验的平均值±SEM。
图5显示了不同的硝基还原酶候选物防御用2.5μM氯硝柳胺攻击的能力。过表达大肠杆菌7KOΔtolC菌株的氧化还原酶的过夜培养物(如WO2012/008860以及Prosser,G.A.,Copp,J.N.,Mowday,A.M.,Guise,C.P.,Syddall,S.P.,Williams,E.M.,Horvat,C.N.,Swe,P.S.,Ashoorzadeh,A.,Denny,W.A.,Smaill,J.B.,Patterson,A.V.和Ackerley,D.F.(2013).Creation and screening of a multi-family bacterial oxidoreductaselibrary to discover novel nitroreductases that efficiently activate thebioreductive prodrugs CB1954and PR-104A.Biochemical Pharmacology 85:1091–1103.中描述的每种氧化还原酶的起源和命名)用于接种测定培养基的新鲜等分试样(补充有100μg.mL-1氨苄青霉素、0.4％w/v葡萄糖和50μM IPTG的LB培养基)，其随后在30℃、200rpm下温育2.5小时。然后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微板中的40μL含有2×所需的最终氯硝柳胺浓度的LB培养基(5μM)或仅培养基的对照中。然后使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照(即100％生长)的生长抑制百分比。数据是三次独立实验的平均值±SEM。
图6显示了氯硝柳胺预选择强大地丰富了能够生物还原性激活硝基前药抗生素甲硝哒唑的功能性硝基还原酶。通过在七个活性位点密码子位置处的密码子随机化产生用于大肠杆菌nfsA的变体基因文库，克隆到质粒pUCX中，并且转化到大肠杆菌SOS-R4细胞内。从A.LB琼脂；或B.含有500nM氯硝柳胺的LB琼脂中随机选择57个克隆。然后在50μM甲硝哒唑(结构插图)的存在下，测试57个所选择的克隆各自(根据在标准96孔板上的位置命名)的生长抑制，其中较大的值指示较高水平的生长抑制，和因此通过该克隆的较高水平的甲硝哒唑活化。每块板上还包括的是野生型nfsA(nfsA_Ec)、空质粒(pUCX)和仅培养基对照(仅用于参考的目的)。氯硝柳胺预选择的群组中存在基本上更大数目的甲硝哒唑活性克隆。生长抑制数据是三次独立实验的平均值±SEM。
图7显示了氯硝柳胺预选择强大地丰富了能够生物还原性激活硝基前药抗生素替硝唑的功能性硝基还原酶。通过在七个活性位点密码子位置处的密码子随机化产生用于大肠杆菌nfsA的变体基因文库，克隆到质粒pUCX中，并且转化到大肠杆菌SOS-R4细胞内。从A.LB琼脂；或B.含有500nM氯硝柳胺的LB琼脂中随机选择57个克隆。然后在50μM替硝唑(结构插图)的存在下，测试57个所选择的克隆各自(根据在标准96孔板上的位置命名)的生长抑制，其中较大的值指示较高水平的生长抑制，和因此通过该克隆的较高水平的替硝唑活化。每块板上还包括的是野生型nfsA(nfsA_Ec)、空质粒(pUCX)和仅培养基对照(仅用于参考的目的)。氯硝柳胺预选择的群组中存在基本上更大数目的替硝唑活性克隆。生长抑制数据是三次独立实验的平均值±SEM。
图8显示了针对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯氏菌的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的β-内酰胺抗性肺炎克雷伯氏菌(NZ分离株NIL 05/26)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图9显示了针对β-内酰胺抗性大肠杆菌的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的β-内酰胺抗性大肠杆菌(NZ分离株ARL06/624)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图10显示了针对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(NZ分离株AR 00/537)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图11显示了针对头孢他啶/环丙沙星/粘菌素/美罗培南/哌拉西林/妥布霉素抗性多噬伯克霍尔德氏菌的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的头孢他啶/环丙沙星/粘菌素/美罗培南/哌拉西林/妥布霉素抗性多噬伯克霍尔德氏菌(NZ分离株ARL03/452)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图12显示了针对大肠杆菌实验室菌株W3110的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未挑战的对照(其中数据来自左起第二列的7KOΔtolC仅氯硝柳胺对照)，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的大肠杆菌实验室菌株W3110的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图13显示了对铜绿假单胞菌实验室菌株PAO1的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的铜绿假单胞菌实验室菌株PAO1的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图14显示了针对剧毒丁香假单胞猕猴桃致病变种(Psa-V)的野生分离株的氯硝柳胺/PAβN协同作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的Psa-V(Landcare分离物ICMP 18800)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图15显示了大肠杆菌菌株7KOΔtolC对氯硝柳胺和2-氯-4-硝基苯胺的相对敏感性。大肠杆菌7KOΔtolC的过夜培养物用于接种LB培养基的新鲜等分试样，其在30℃、200rpm下温育2.5小时。然后将每个培养物的40μL等分试样加入384孔微孔板中的40μL LB培养基的等分试样中，所述384孔微孔板含有2×所需最终浓度的氯硝柳胺或2-氯-4-硝基苯胺(即，导致对于每种化合物从10μM降至160nM的最终2倍稀释系列)、或仅对照的0μM培养基。使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照的生长百分比。数据是至少两次独立实验的平均值±SEM。
图16显示了过表达不同的天然硝基还原酶候选物的大肠杆菌7KOΔtolC菌株的硝唑尼特生长抑制。过表达大肠杆菌NfsA(NfsA_Ec)、大肠杆菌NfsB(NfsB_Ec)或仅含质粒(pET28)对照的大肠杆菌7KOΔtolC(DE3)菌株的过夜培养物用于接种测定培养基的新鲜等分试样(补充有50μg.mL-1卡那霉素和50μM IPTG的LB培养基)，其在30℃、200rpm下温育2.5小时。然后将每个培养物的40μL等分试样加入含有2×所需最终浓度的硝唑尼特的40μL测定培养基的等分试样(即，导致从20降至2.5μM的最终2倍稀释系列)、或仅对照的0μM培养基中。然后使板在30℃、200rpm下温育4小时。通过在600nm处的光密度监测培养物浊度，以便计算每个菌株相对于0μM对照的生长百分比。数据是至少两次独立实验的平均值±SEM。硝唑尼特的结构是插图。
图17显示了用于来自大肠杆菌染色体的候选硝基还原酶基因和tolC基因的框内缺失的引物。基因敲除通过使用Red重组酶的框内缺失进行(Datsenko，KA和Wanner,B.L.(2000).One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645.)。简言之，使用质粒pKD4作为模板，以通过flp重组酶识别位点PCR扩增任一侧侧接的卡那霉素抗性基因。用于扩增的引物在3'末端处含有15-20bp的序列，用于从pKD4引发和扩增。在引物的5'末端处的剩余～40bp与靶向缺失的基因组区域的任一末端同源。为了改善在某些情况下的敲除效率，在PCR扩增的卡那霉素盒的每个末端处的基因组同源区域经由二次PCR加长，使用第一次PCR产物作为模板和敲除延伸引物用于扩增。引物根据待敲除(KO)的基因命名，其中后缀FW指示正向引物，RV指示反向引物，并且EXT指示延伸引物(例如，NFSA_KO_FW是用于敲除基因nfsA的正向引物)。
图18显示了以一式四份、跨越一系列氯硝柳胺和PAβN浓度的生长抑制的“热图”测量的384孔板形式。显示每个孔的最终氯硝柳胺和PAβN浓度。在这个实例中，行H、第1列和第3列的培养基将含有40μM氯硝柳胺和150μM PAβN，以允许随后用细菌培养物的1/2稀释。
图19显示了组合或个别的氯硝柳胺和PAβN处理对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的作用的热图。该图显示了相对于未经挑战的对照，如所示的用0.1M MgSO4以及氯硝柳胺和PAβN改良的LB中的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA；ATCC43300)的生长百分比。数据是三次独立重复的平均值。
图20显示了革兰氏阳性细菌对尼克苏胺是直接敏感的，而无需TolC抑制剂的共施用。显示的是相对于每个菌株的未经挑战的对照，跨越一系列氯硝柳胺浓度的革兰氏阳性细菌株金黄色葡萄球菌ATCC 43300、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)ATCC 35897和苏云金芽孢杆菌P.1.IPS-80血清变型以色列(B.thuringiensis P.1.IPS-80serovarisraelensis)的％生长抑制曲线。数据是两次独立重复的平均值(对于每个独立实验使用一式两份技术重复)，并且误差条指示平均值的标准误。由这些曲线计算的IC50值呈现于表1中。
图21显示了革兰氏阳性细菌对硝唑尼特是直接敏感的，而无需TolC抑制剂的共施用。显示的是相对于每个菌株的未经挑战的对照，跨越一系列硝唑尼特浓度的革兰氏阳性细菌株金黄色葡萄球菌ATCC 43300、威尔斯李斯特菌ATCC 35897和苏云金芽孢杆菌P.1.IPS-80血清变型以色列的％生长抑制曲线。数据是两次技术重复的平均值。由这些曲线计算的IC50值呈现于表1中。
具体实施方式
本发明基于令人惊讶和出乎意料的发现：水杨酰胺化合物展示革兰氏阳性细菌的直接生长抑制。相应地，本发明涉及关于水杨酰胺化合物的有效预防或治疗细菌感染，和/或预防、减少或消除生物膜形成的组合物和方法。
测试了革兰氏阳性细菌甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA；ATCC43300)的临床分离株。参考图19。令人惊讶的是，该菌株对微摩尔水平的PaβN敏感，并且对以纳摩尔浓度的氯硝柳胺敏感。与缺乏TolC外排机制的革兰氏阳性细菌一致，似乎氯硝柳胺在不存在PaβN的情况下是有效的；并且氯硝柳胺和PaβN处理的组合效应是累加的而不是协同的(图19)。
这些数据促使申请人进一步调查水杨酰胺化合物对革兰氏阳性细菌的直接生长抑制作用。参考图20和21，当结合表2中呈现的数据(参见下文的实施例)阅读时，氯硝柳胺和硝唑尼特证实针对金黄色葡萄球菌、威尔斯李斯特菌和苏云金芽孢杆菌的直接生长抑制活性，其中IC50值在nM范围内。这代表了重大的发现，并且证实了水杨酰胺化合物对负责细菌感染和/或形成细菌生物膜(部分)的革兰氏阳性细菌的生长抑制的效用。
相应地，在本发明的一个方面，提供了水杨酰胺化合物，其用于治疗患者中的细菌感染，其中引起感染的细菌包含革兰氏阳性细菌。
在另一个方面，本发明提供了水杨酰胺化合物，其用于预防、减少或消除细菌生物膜形成，其中引起生物膜形成的细菌包含革兰氏阳性细菌。
水杨酰胺化合物可以连同可接受的赋形剂或载体一起配制为药物或生物组合物。水杨酰胺化合物也可以配制为药物盐。
本发明进一步提供了用于治疗或预防包含革兰氏阳性细菌的细菌感染，或者用于预防、减少或消除生物膜形成的包含根据本发明的水杨酰胺化合物方法和用途，其中所述生物膜包含革兰氏阳性细菌。
在本说明书中，术语“患者”可以包括例如患有感染或易感染风险的患者，以及向患有感染或易感染风险的患者施用用于治疗的一种或多种活性物质的医学从业者。例如，本发明可以提供包含任选与外排泵抑制剂结合的水杨酰胺化合物的生物组合物，其被配制为在手术前由外科医生使用的手部消毒剂。另外或可替代地，例如，本发明可以提供包含任选与外排泵抑制剂结合的水杨酰胺化合物的药物组合物，其用于在手术期间施用于患者，以治疗患有感染的患者或预防患者在手术期间获得通过一种或多种细菌的感染。
本发明还基于令人惊讶和出乎意料的发现：可以使用与外排泵抑制剂组合的水杨酰胺化合物来实现革兰氏阴性细菌的生长抑制。
本发明的组合和组合物因此可用于治疗或预防特别是人中的感染，以及用于预防、减少或消除生物膜形成以及其他应用。
在一些实例中，水杨酰胺化合物与外排泵抑制剂化合物的摩尔比为约1:500至约1:7，例如约1:400至约1:7，例如约1:350至约1:7，例如约1:300至约1:7，例如约1:250至约1:7，例如约1:200至约1:7，例如约1:150至约1:7，例如约1:100至约1:7，例如约1:50至约1:7，例如约1:20至约1:7，例如约1:10至约1:7。
申请人已惊讶地发现，氯硝柳胺对并非过表达活性硝基还原酶的大肠杆菌SOS-R2细胞是有毒的，而活性硝基还原酶被发现增强了在氯硝柳胺的存在下的SOS-R2生长。然而，在不同的大肠杆菌宿主菌株(“6KO”，具有六个内源性硝基还原酶候选基因敲除的大肠杆菌W3110的衍生物)中，不再发现氯硝柳胺是毒性的，即使该菌株没有过表达活性硝基还原酶。不希望受到理论的约束，申请人假设氯硝柳胺敏感的SOS-R2和氯硝柳胺抗性6KO菌株之间的关键差异在于，前者携带tolC基因的缺失，所述tolC基因编码能够输出众多异型生物质(xenobiotic)和其他化合物直接穿过革兰氏阴性细菌细胞的两个细胞膜的外排泵。
图1显示了tolC基因的缺失使大肠杆菌对氯硝柳胺敏感。该实验测量了两种否则同基因的大肠杆菌菌株对氯硝柳胺的相对敏感性，一种菌株具有完整的tolC基因，并且另一种具有tolC的框内缺失。为了避免由于硝基还原酶活性的任何潜在的混杂效应，选择用于本研究的基础菌株是7KO-大肠杆菌W3110，其携带五个经验证的硝基还原酶基因(nfsA、nfsB、azoR、nemA、mdaB)和两个疑似的硝基还原酶(yieF、ycaK)。使用Datsenko和Warner的Red重组酶法(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(2000).One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci USA 97:6640-6645.)，从该菌株中框内缺失内源性tolC基因，以得到菌株7KOΔtolC。
当重复的7KO和7KOΔtolC培养物的生长在跨越氯硝柳胺的2倍稀释系列(从5μM降至20nM)进行比较时，显而易见的是tolC突变赋予对氯硝柳胺的极度敏感性(图1)。根据这些数据，对于7KOΔtolC，氯硝柳胺IC50(氯硝柳胺浓度，在此浓度下受氯硝柳胺攻击的重复的生长预测为未受攻击对照的50％)计算为120nM，但对于7KO，无法计算IC50(即，基本上大于5μM)。
由于tolC基因缺失是在框内构建的，所以不太可能氯硝柳胺敏感性表型是极性效应的结果(即由于缺失的DNA区域对相邻基因的影响，而不是tolC突变本身)。这通过图2所示的实验确认，所述实验证实TolC外排泵的化学抑制也使大肠杆菌对氯硝柳胺敏感。在0μM、25μM或50μM苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺(PAβN)的存在下，大肠杆菌7KO的重复培养物跨越2倍稀释系列的氯硝柳胺(从10μM降至156nM)生长，所述PAβN是TolC外排泵的化学抑制剂(Lomovskaya,O.,Warren,M.S.,Lee,A.,Galazzo,J.,Fronko,R.,Lee,M.,Blais,J.,Cho,D.,Chamberland,S.,Renau,T.,Leger,R.,Hecker,S.,Watkins,W.,Hoshino,K.,Ishida,H.和Lee,V.J.(2001).Identification and Characterization of Inhibitors ofMultidrug Resistance Efflux Pumps in Pseudomonas aeruginosa:Novel Agents forCombination Therapy.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(1):105-116.)。发现PAβN的添加可以以剂量依赖的方式促进7KO菌株中的氯硝柳胺敏感性，尽管在所测试的浓度下，效应小于对于其中完全消除了TolC活性的7KOΔtolC所观察到的。
因此，申请人通过遗传和化学手段两者证实TolC能够保护大肠杆菌免受氯硝柳胺。图3所示的实验通过检查内源性硝基还原酶(即，从天然存在于大肠杆菌中的天然染色体硝基还原酶基因表达的)的效应，比较了硝基还原酶防御氯硝柳胺的能力，以保护含有功能性tolC基因的细胞免受高水平的氯硝柳胺攻击。申请人比较了7KO菌株(携带候选硝基还原酶基因nfsA、nfsB、azoR、nemA、mdaB、yieF、ycaK的缺失)与其中所有七种候选硝基还原酶基因都是完整的商购可得的克隆株DH5α的生长。当重复培养物的生长跨越2倍稀释系列的氯硝柳胺(从40μM降至20nM)进行比较时，明显DH5α比7KO菌株对氯硝柳胺更有抗性(图3)。
图4显示了过表达的硝基还原酶基因可以提供针对烟草酰胺攻击的高水平防御。该实验检查了在多拷贝质粒上在强启动子控制下的硝基还原酶基因的高水平表达是否提供了对大肠杆菌7KOΔtolC(即，由于它们不具有TolC介导的防御系统，而对氯硝柳胺预敏感的细胞)的高水平防御。当来自质粒pUCX(Prosser,G.A.,Copp,J.N.,Syddall,S.P.,Williams,E.M.,Smaill,J.B.,Wilson,W.R.,Patterson,A.V.和Ackerley,D.F.(2010).Discovery and evaluation of Escherichia coli nitroreductases that activatethe anti-cancer prodrug CB1954.Biochemical Pharmacology 79:678-687.)的过表达每个硝基还原酶候选物的重复培养物的生长在跨越2倍稀释系列的氯硝柳胺(从4μM降至16nM)下进行比较时，可以看出硝基还原酶NfsA、NfsB和AzoR能够提供针对氯硝柳胺的高水平保护(过表达对于氯硝柳胺具有低微摩尔IC50值的那些酶的菌株)，而NemA提供了水平低得多的保护(IC50＝300nM)(图4)。另一种先前经验证的大肠杆菌硝基还原酶MdaB具有83nM的MdaB过表达菌株的IC50，其基本上不大于空质粒对照的那种(IC50＝47nM)。
图5显示了在单个浓度的氯硝柳胺(2.5μM)下，在7KOΔtolC细胞中来自筛选含有11个不同氧化还原酶家族成员的58个成员的氧化还原酶pUCX文库的结果(WO 2012/008860；Prosser,G.A.,Copp,J.N.,Mowday,A.M.,Guise,C.P.,Syddall,S.P.,Williams,E.M.,Horvat,C.N.,Swe,P.S.,Ashoorzadeh,A.,Denny,W.A.,Smaill,J.B.,Patterson,A.V.和Ackerley,D.F.(2013).Creation and screening of a multi-family bacterialoxidoreductase library to discover novel nitroreductases that efficientlyactivate the bioreductive prodrugs CB1954and PR-104A.Biochemical Pharmacology85:1091–1103.)，以鉴定可以保护宿主细胞免受高水平氯硝柳胺攻击的硝基还原酶。NfsA、NfsB和AzoR家族的成员是一致活性的，而任何其他八个氧化还原酶家族中的成员都不允许在该浓度的氯硝柳胺下的7KOΔtolC细胞生长。
图6和7显示了氯硝柳胺可以用于预选择在tolC突变型宿主细胞中表达的突变基因文库的功能性硝基还原酶。硝基还原酶具有在生物技术中的广泛范围的潜在应用。对于环境应用特别有利的是硝基还原酶催化有毒的异型生物质污染物转换成毒性较小的形式的能力(Roldán,M.D.,Pérez-Reinado,E.,Castillo,F.和Moreno-Vivián,C.(2008).Reduction of polynitroaromatic compounds:the bacterial nitroreductases.FEMSMicrobiol Rev 32(3):474-500.)。相反，前药转换成高度细胞毒性的形式具有在医学(例如抗癌策略基因定向酶前药治疗(Schellmann,N.,Deckert,P.M.,Bachran,D.,Fuchs,H.和Bachran C.(2010).Targeted enzyme prodrug therapies.Mini Rev Med Chem.10:887-904.)或细胞生物学(例如转基因模型生物中的靶向组织消融)(Curado Rosenthal,V.D.,Maki,D.G.,Jamulitrat,S.,Medeiros,E.A.,Todi,S.K.,Gomez,D.Y.,Leblebicioglu,H.,Abu Khader,I.,Miranda Novales,M.G.,Berba,R.,Ramírez Wong,F.M.,Barkat,A.,Pino,O.R.,L.,Mitrev,Z.,Bijie,H.,Gurskis,V.,Kanj,S.S.,Mapp,T.,Hidalgo,R.F.,Ben Jaballah,N.,Raka,L.,Gikas,A.,Ahmed,A.,Thu,L.T.A.和Guzmán Siritt,M.E.(2010).International Nosocomial Infection Control Consortium(INICC)report,data summary for 2003-2008,issued June 2009.American Journal of InfectionControl 38(2):95-104)中的应用。硝基还原酶也对于生物催化有利，即在化学合成例如药品制造过程中硝基的还原。在所有这些情况下，硝基还原酶一般应用于还原非生理底物，依赖于其典型的底物混杂性(Roldán等人，2008)。因此，可能天然硝基还原酶对于所需的底物不是特别有效的，并且它们的混杂活性的起始水平可能能够通过工程策略例如定向进化而显著改善。
通常在定向进化中，靶基因突变越多，它变得失活的可能性越大。因此，实现含有大量突变的进化酶通常需要筛选非常大量的克隆以为了改善的活性。然而，许多关于所需活性的筛选不具有非常高的通量能力。
不希望受到理论的约束，申请人假设基本上突变的硝基还原酶文库的氯硝柳胺预选择将极大地富集功能性硝基还原酶，允许低通量筛选方法，例如生长抑制测定以回收具有增强的特定底物活性的变体。基于大肠杆菌nfsA合成突变型基因文库(通过GenScript)，其中七个活性位点残基的密码子部分(NDT密码子组)或完全(NNK密码子组)随机化。总之，该文库含有～95,000,000个基因变体，其中绝大多数预期编码无活性的硝基还原酶。该文库被转化到大肠杆菌SOS-R4细胞(其含有nfsA、nfsB、azoR、nemA和tolC基因的敲除，以及质粒携带的SOS调节的GFP基因)(Copp,J.N.,Williams,E.M.,Rich,M.H.,Patterson,A.V.,Smaill,J.B.和Ackerley,D.F.(2014).Toward a high-throughput screening platformfor directed evolution of enzymes that activate genotoxic prodrugs.ProteinEng Des Sel.27(10):399-403.)内，并且将一系列稀释物在未经改良或用500nM氯硝柳胺改良的重复LB琼脂平板上铺平板。从未经改良的LB琼脂平板中随机选择57个菌落，并且连同空质粒和野生型NfsA对照菌落以及无细胞对照一起接种到96孔板的60个最内孔中的LB内。使用随机选自经氯硝柳胺改良的LB琼脂平板的57个菌落(加上相同的三个对照)，将该方法重复到不同的96孔板内。这之后，生长抑制测定用于测量每板内多少孔含有表达酶变体的克隆，所述酶变体对于硝基前药抗生素甲硝哒唑(图6A、6B)或替硝唑(图7A、7B)有活性。
在不存在氯硝柳胺预选择的情况下，仅发现57个随机选择的克隆中的一个表达硝酸还原酶变体，其对于甲硝哒唑(图6A)或替硝唑(图7A)比野生型NfsA更有活性。然而，在氯硝柳胺预选择后，57个克隆中的50个对于甲硝哒唑比野生型NfsA更有活性(图6B)，并且57个克隆中的52个对于替硝唑比野生型NfsA更有活性(图7B)。这些数据指示氯硝柳胺预选择可以提供关于来自突变型基因文库的编码功能性硝基还原酶变体的基因的有力富集。
因此，在一个方面，本发明提供了鉴定新型硝基还原酶的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)进行现有硝基还原酶基因的靶向或随机诱变，从而产生硝基还原酶变体基因文库；和
(ii)将变体基因文库转化到其中tolC基因已被缺失或tolC表达产物已被抑制的革兰氏阴性细菌内，并且培养细胞使得基因变体被表达；和
(iii)向经转化的细菌细胞施用至少一种水杨酰胺化合物；和
(iv)筛选对水杨酰胺毒性缺乏敏感性的细胞，从而鉴定表达新型形式的硝基还原酶的细胞；和
(v)任选地纯化硝基还原酶。
在一个实例中，革兰氏阴性细菌的内源性硝基还原酶基因已被敲除，或者革兰氏阴性细菌中的硝基还原酶活性已被减少或消除。
在又一个方面，本发明提供了从环境来源的DNA制备物中鉴定新型硝基还原酶的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)从该环境来源的DNA生成细菌基因文库；和
(ii)将基因文库转化到其中tolC基因已被缺失或tolC表达产物已被抑制的革兰氏阴性细菌内，并且培养细胞使得基因文库被表达；和
(iii)向经转化的细菌细胞施用至少一种水杨酰胺化合物；和
(iv)筛选对水杨酰胺缺乏敏感性的细胞，从而鉴定表达新型形式的硝基还原酶的细胞；和
(v)任选地纯化硝基还原酶。
在一个实例中，革兰氏阴性细菌的内源性硝基还原酶基因已被敲除，或者革兰氏阴性细菌中的硝基还原酶活性已被减少或消除。
在另一个实例中，环境来源的DNA源自土壤。
本发明还考虑了基于涉及对水杨酰胺毒性例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物敏感的细菌的筛选测定，来筛选新型TolC抑制剂的方法。
相应地，在又一个方面，本发明提供了鉴定新型TolC抑制剂的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(i)在至少一种水杨酰胺化合物和候选TolC抑制剂的存在下，培养表达TolC的革兰氏阴性细菌；和
(ii)筛选对水杨酰胺毒性敏感的细胞，
从而鉴定新型TolC抑制剂。
申请人还已显示氯硝柳胺和TolC的化学抑制剂令人惊讶地提供了有效针对广泛范围的革兰氏阴性细菌(包括多药物抗性临床分离株)的协同抗菌组合。有利地，已知氯硝柳胺在高剂量下在人体中是耐受的，并且申请人的工作还证实它是针对革兰氏阴性细菌的有效抗生素，与化学抑制剂如PaβN组合应用，所述PaβN具有针对革兰氏阴性TolC外排泵的广谱活性。申请人的工作使用生长抑制测定来测试氯沙洛胺和PaβN治疗对从ESR培养物保藏中心(http://www.esr.cri.nz/competencies/Health/Pages/nzrcc.aspx)获得的一系列药物抗性临床分离株的细菌病原体，以及猕猴桃病原体丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa-V)的高毒力野外分离株(Landcare分离株ICMP 18800)和来自申请人的现有原种的大肠杆菌W3110和铜绿假单胞菌PAO1的实验室菌株的组合作用。
相应地，在一个方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂的组合产品。
在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的协同组合。
在另一个方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合物。在一个实例中，组合物包含协同有效量的水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物。
在一个进一步的方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，连同药学可接受的赋形剂或盐的药物组合物。
在根据本发明的一个实例中，水杨酰胺化合物是氯硝柳胺或氯硝柳胺类似物。下文列出了氯硝柳胺类似物的实例。
在本发明的组合产品和组合物中使用的合适外排泵的实例在下文列出。在本发明的某些实施方案中，外排泵抑制剂是TolC外排泵抑制剂。TolC外排泵抑制剂的实例包括但不限于：PaβN和2,3-二溴马来酰亚胺。
测试形式是二维384孔板测定，其中每个测试菌株的重复培养物在水平轴上用渐增浓度的PaβN进行攻击，并且在垂直轴上用渐增浓度的氯硝柳胺进行攻击(各自制备为两倍稀释系列，从右到左为PaβN，并且从底部到顶部为氯硝柳胺)。每块384孔板分为四个象限，使得每个象限中的左上孔既不含有PaβN也不含有氯硝柳胺，而每个象限中的右下孔含有最高浓度的PaβN和氯硝柳胺中的每一种。然后在每块板上一式四份地评估每个测试菌株。
以此形式测试的革兰氏阴性细菌包括：
●β-内酰胺抗性肺炎克雷伯氏菌(NZ分离株NIL 05/26)(图8)
●β-内酰胺抗性大肠杆菌(NZ分离株ARL06/624)(图9)
●头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(NZ分离株AR 00/537)(图10)
●头孢他啶/环丙沙星/粘菌素/美罗培南/哌拉西林/妥布霉素抗性多噬伯克霍尔德氏菌(NZ分离株ARL03/452)(图11)
●大肠杆菌W3110(野生型)(图12)
●铜绿假单胞菌PAO1(野生型)(图13)
●Psa-V(Landcare分离株ICMP 18800)(图14)
在每种情况下，所测试的菌株对于作为协同组合的PaβN和氯硝柳胺敏感。然而，临床分离株中无一对分离的氯硝柳胺特别敏感(不存在PaβN的情况下IC50>20μM；图8-11)。
根据本发明的组合产品或组合物因此可以用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者可以用于减少或消除细菌生物膜的形成，其中引起感染或生物膜形成的细菌包含革兰氏阴性细菌。
相应地，在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合，或者包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合物作为药剂的用途。
在另一个方面，本发明提供至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合，其用于制备药物组合物。
在又一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合用于治疗或预防患者中的细菌感染的用途，其中引起感染的细菌包含革兰氏阴性细菌。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物用于治疗或预防患者中的细菌感染的用途，所述药物组合物包含药学有效量的至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其中引起感染的细菌包含革兰氏阴性细。
在一个进一步的方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的抗细菌剂。抗细菌剂可以用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者它可以用于减少或消除细菌生物膜的形成，其中引起感染或生物膜形成的细菌包含革兰氏阴性细菌。
生物膜具有引起在伤口和/或烧伤中的感染，或者引起在留置医疗装置中或在留置医疗装置上的感染的潜力。可替代地，细菌生物膜的形成在食物工业的制备机器内、在由食品工业使用的包装上、在用于水或其他液体的储罐内、或在水处理厂的机器内发生，所有这些都具有增加起于人或动物接触消耗品的感染风险的潜力。此外，经由在表面例如医院病床、浴室和连接病房的门等上的生物膜形成的细菌累积也具有使人暴露于感染风险的能力。
相应地，不仅治疗或预防人(和动物)中的细菌感染，而且减少或消除细菌生物膜的形成的能力，对于使用本发明的组合产品和组合物是同样重要的考虑。
本发明的组合和组合物也可以用于治疗或预防植物中的感染，例如猕猴桃属(Actinidia)的猕猴桃植物中由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa-V)引起的细菌感染。在一个实例中，本发明的组合和组合物显示出关于细菌感染治疗或预防的协同效应。
在某些实施方案中，根据本发明的组合产品或组合物可以进一步包含一种或多种杀菌剂或抑菌剂。杀菌剂的实例包括但不限于β-内酰胺类抗生素(例如青霉素衍生物、头孢菌素、单胺菌素、碳青霉烯类)、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝哒唑、呋喃妥因、复方新诺明或泰利霉素。抑菌剂的实例包括但不限于：四环素类、大环内酯类、磺胺类、林可酰胺类、噁唑烷酮、替加环素、新生霉素、呋喃妥因、壮观霉素、甲氧苄啶、氯霉素、乙胺丁醇或克林霉素。
抗生素抗性的上升对卫生保健行业产生了深远的影响，而且提供替代医学来对抗细菌感染(即治疗或预防感染)的需求变得日益重要。相应地，在另一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物在制备药剂中的用途，或者至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合用于制备药剂的用途。
在另一个方面，本发明提供了包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的药物组合物，其用于治疗或预防患者中的细菌感染，其中引起感染的细菌包含革兰氏阴性细菌。
在又一个方面，本发明提供了至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物在制备用于治疗或预防患者中的细菌感染的药剂中的用途，其中引起感染的细菌包含革兰氏阴性细菌。
在又一个方面，本发明提供了成套试剂盒，其包含以分开的单位剂型的至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物、连同使用说明书。根据本发明的试剂盒可以由医疗保健从业者开处方和/或施用作为对抗感染的新方法。
在又一个方面，本发明提供了治疗或预防细菌感染的方法，其包括向需要治疗的患者施用至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其量足以治疗或预防患者中的细菌感染，其中引起感染的细菌包含革兰氏阴性细菌。
预期氯硝柳胺的水解产生5-氯水杨酸和2-氯-4-硝基苯胺。诱变性研究(Espinosa-Aguirre,J.J.,Reyes,R.E.和Cortinas de Nava,C.(1991).Mutagenicactivity of 2-chloro-4-nitroaniline and 5-chlorosalicylic acid in Salmonellatyphimurium:two possible metabolites of niclosamide.Mutation Research Letters264(3):139-145.)提示2-氯-4-硝基苯胺是诱变产物，而5-氯水杨酸是非诱变性的。图15显示了氯硝柳胺和2-氯-4-硝基苯胺抑制大肠杆菌菌株7KOΔtolC生长的相对能力。2-氯-4-硝基苯胺的毒性比氯硝柳胺低至少三个数量级，提示氯硝柳胺的这种水解衍生物不是氯硝柳胺毒性经由其实现的主要抗细菌剂。
硝唑尼特(图16，插图)是可以用于本发明的组合和组合物中的水杨酰苯胺化合物。硝唑尼特是微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialambia)感染的优选治疗方法(Anderson,V.R.和Curran,M.P.(2007).Nitazoxanide:areview of its use in the treatment of gastrointestinal infections.Drugs.67(13):1947-1967)。硝唑尼特在结核分枝杆菌中破坏膜电位和pH稳态，并且抑制螺杆菌属(Helicobacter)和弯曲杆菌属(Campylobacter)以及其他厌氧细菌和寄生虫中的丙酮酸氧化还原酶(de Carvalho,L.P.S.,Darby,C.M.,Rhee,K.Y.和Nathan,C.(2011).Nitazoxanide disrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasisof Mycobacterium tuberculosis.ACS medicinal chemistry letters 2(11):849-854)。在大肠杆菌7KOΔtolC(DE3)细胞(具有整合的λDE3原噬菌体的菌株7KOΔtolC，以允许在T7RNA聚合酶启动子控制下的诱导表达基因)中，硝唑尼特的毒性比氯硝柳胺低大约2个数量级(IC50＝5.2μM)。然而，与氯硝柳胺类似，大肠杆菌硝基还原酶NfsA和NfsB的过表达(在这种情况下，来自质粒pET28的在7KOΔtolC(DE3)中的过表达；Novagen)能够保护免受硝唑尼特毒性(图16)。
水杨酰胺化合物
本领域技术人员将理解，具有抗生素活性的任何合适的水杨酰胺化合物都可以用于本发明的组合和组合物中。优选地，水杨酰胺化合物显示出针对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。用于本发明的合适水杨酰胺化合物优选包括下述结构部分：
其中A是芳环或杂芳环，例如苯环，(R)n指示芳环或杂芳环可以任选被一个或多个取代基取代，并且X是氧或另一种杂原子如硫。基团–C(＝x)-NH-可以经由碳或氮原子与环A连接。优选地，水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。
优选地，水杨酰胺化合物是包括两个或更多个芳基，例如两个或更多个苯环的水杨酰苯胺化合物，所述芳基各自可以任选地被取代，例如如下式(I)所示。可替代地，水杨酰胺化合物可以包括一个或多个杂芳基。水杨酰胺化合物可以包括杂原子，例如硫，代替酰胺基团的氧。术语“水杨酰胺化合物”预期包括所有这些类似物。
优选的水杨酰胺化合物是水杨酰苯胺化合物氯硝柳胺(N-(2'-氯-4'-硝基苯基)-5-氯水杨酰胺)，其结构显示于下文。
氯硝柳胺的盐形式是已知的，包括乙醇胺盐和哌嗪盐。此外，氯硝柳胺的一水合物形式也是已知的。任何合适的药学可接受的盐或水合物都可以用于本发明的组合物和组合中。
其他优选的水杨酰胺化合物包括氯硝柳胺的类似物。这些类似物也是已知的，例如在引入本文作为参考的US2011/0183889中描述的那些。用于本发明的组合和组合物中的合适氯硝柳胺类似物包括但不限于由通式(I)所述的那些，其中R1-R10如本文所定义，包括下表1中列出的那些。用于本发明的其他合适的氯硝柳胺类似物包括经批准的氯硝柳胺的药物类似物。
式(I)
表1
适用于本发明的组合和组合物中的其他水杨酰胺化合物包括但不限于羟氯扎胺(2,3,5-三氯-N-(3,5-二氯-2-羟基苯基)-6-羟基苯甲酰胺)、氯氰碘柳胺(N-[5-氯-4-[(4-氯苯基)-氰基甲基]-2-甲基苯基]-2-羟基-3,5-二碘苯甲酰胺)、氯苯碘柳胺(N-[3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-2-羟基-3,5-二碘苯甲酰胺)、氟沙仑(3,5-二溴-2-羟基-N-[3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)、三溴沙仑(3,5-二溴-N-(4-溴苯基)-2-羟基苯甲酰胺)、二溴沙仑(5-溴-N-(4-溴苯基)-2-羟基苯甲酰胺)、雷琐太尔(N-(4-溴苯基)-2,6-二羟基苯甲酰胺)、氯碘沙尼(乙酸2-(4-氯-苯基氨基甲酰基)-4,6-二碘-苯基酯)、4'-氯-5-硝基水杨酰苯胺、2'-氯-5'-甲氧基-3-硝基水杨酰苯胺、2'-甲氧基-3,4'-二硝基水杨酰苯胺、2',4'-二甲基-3-硝基水杨酰苯胺、4',5'-二溴-3-硝基水杨酰苯胺、2'-氯-3,4'-二硝基水杨酰苯胺、2'-乙基-3-硝基水杨酰苯胺、2'-溴-3-硝基水杨酰苯胺。
本发明还包括其他水杨酰胺化合物，例如含有一个或多个杂芳环的那些的使用。杂芳环可以具有一个或多个取代基。这些化合物的一个实例是下文显示的硝唑尼特(2-乙酰氧基-N-(5-硝基2-噻唑基)苯甲酰胺)。
硝唑尼特
本发明进一步包括其他水杨酰胺化合物，例如其中酰胺基团的氧被另一个杂原子替代的那些的使用。这些化合物的一个实例是溴替尼特(3,4'-二溴-5-氯代硫代水杨酰苯胺)(下文显示)。
溴替尼特
上述水杨酰胺化合物中的一些是商购可得的。其他可以容易地通过本领域技术人员已知的方法制备。例如，引入本文作为参考的WO 2004/006906描述了制备氯硝柳胺类似物的方法。
本领域技术人员将理解，水杨酰胺化合物与硝基前药抗生素不同，即使两类化合物在其化学结构内都可以包括硝基。如本文使用的，术语“硝基前药抗生素”意指前药化合物，其最初在施用时对细菌无毒或基本上无毒，但经历由一种或多种细菌硝基还原酶的还原，从而将其转化为对细菌有毒的药物。另一方面，如申请人惊讶地发现的，本发明的水杨酰胺化合物(例如氯硝柳胺)是对细菌有毒，但由一种或多种硝酸还原酶转换成对细菌无毒种类的化合物。
优选地，可以用于本发明中的硝基前药抗生素化合物是硝基咪唑衍生物，尽管本领域技术人员将理解，其他类型的化合物也可以是硝基前药抗生素。合适的硝基前药抗生素的实例包括但不限于呋喃妥因、呋喃西林、甲硝哒唑、替硝唑、呋喃唑酮、米索硝唑、依他硝唑、硝呋莫司、奥硝唑、苄硝唑、二甲硝咪唑、罗硝唑、RSU-1069(1-(1-氮丙啶基)-3-(2-硝基-1-咪唑基)-2-丙醇)、RB-6145(1H-咪唑-1-乙醇，α-(((2-溴乙基)氨基)甲基)-2-硝基-，单氢溴酸盐)、CB1954(5-(氮丙啶-1-基)-2,4-二硝基苯甲酰胺)、EF3(2-(2-硝基咪唑-1H-基)-N-(3,3,3-三氟丙基)乙酰胺)、EF5(2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)-N-(2,2,3,3,3-五氟丙基)乙酰胺)、HX4(3-氟-2-(4-((2-硝基-1H-咪唑-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-丙-1-醇)或氟化的米索硝唑。
外排泵抑制剂化合物
外排泵在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者中均表达，但其是革兰氏阴性细菌中更有效的抗性机制。大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵的同系物被视为革兰氏阴性细菌的主要外排泵。
外排泵抑制剂化合物是干扰外排泵从细胞输出另一种化合物例如抗生素的能力的化合物。已知将外排泵抑制剂化合物连同抗生素一起递送可以增加抗生素的效力，即使是已被鉴定为抗性的菌株。这种外排抑制剂化合物可以是外排泵的竞争性抑制剂。例如，PAβN(苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺)是AcrAB-TolC的竞争性抑制剂，意指它优先从细胞输出，从而降低抗生素输出率，并且允许抗生素累积到有毒水平。
本领域技术人员将认识到，在本发明的组合和组合物中可以使用任何合适的外排泵抑制剂化合物。优选的外排泵抑制剂化合物是在广泛范围的细菌菌株中有活性的那些，特别是针对革兰氏阴性细菌的外排泵例如大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵的同系物有活性的那些。引入本文作为参考的WO 96/33285描述了用于筛选微生物外排泵抑制剂的抑制剂的方法。本领域技术人员将认识到，这种筛选方法可以用于鉴定可以用于本发明中的外排泵抑制剂。
用于本发明的组合和组合物中的合适的外排泵抑制剂化合物包括但不限于引入本文作为参考的US 6,399,629中所述的那些。这些外排泵抑制剂化合物包括但不限于(2R,4S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R-)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-苯基)丙基氨基甲酰基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基丙酰氨基]-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(氨基丙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-[3-(氨基丙酰氨基])-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(氨基-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(3-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4S-4-(2-氨基-N-甲基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-3-甲基-1-(6-甲氧基-8-甲基-3-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6,7-二甲基-3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-2-(4-甲氧基苯基)-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-甲基-1-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-甲基-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-甲基-1-(6-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-2-(4-氟苯基)-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-2-(4-氟苯基)-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-1-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6-甲氧基-8-甲基-3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-2-(4-羟基苯基)-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4S)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-2-(4-羟基苯基)-1-(6-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(5-氯-2-羟基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(4,5-二甲基-2-羟基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(2-羟基-5-甲基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(8-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-2-(4-氟苯基)-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[3-喹啉甲基)氨基甲酰基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-甲基-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-甲基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(6-氟-3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-4-甲基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)戊基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(5-氟-2-羟基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(2-羟基-5-甲基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(5-氯-2-羟基苯基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-甲基-N-[(1R)-3-甲基-1-(6-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(2-苯乙基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-(2-苯乙基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(2-苯乙基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(2-甲基丙基)-N-(7-乙基-3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-(2-苯乙基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(2-苯乙基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-(3,3-二甲基丁基)-N-(3-喹啉基氨基甲酰基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(2-喹啉氧基)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(2-萘氧基)甲基]丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(4-氯苯基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-[(1R)-3-苯基-1-[(4-氯苯基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-[(1R)-3-苯基-1-[(4-氯苯基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(3-喹啉基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(2-喹啉氧基)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(2-喹啉基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(苯基硫代甲基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(4-氟苯基硫代)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(2-喹啉氧基)甲基]丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(3-喹啉氧基)甲基]丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(4-氯苯基硫代)甲基]丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-甲基-1-[(4-氯苯基硫代)甲基]丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(2S)-2-(6-甲基-3-喹啉基甲酰氨基)-4-苯基丁基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(6-甲基-3-喹啉基甲酰氨基)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-1-[(RS)-(5,6-二甲基-2-苯并噁唑基)羟基甲基]-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-[(1R)-1-[(RS)-(5,6-二甲基-2-苯并噁唑基)羟基甲基]-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-[(2R)-2-氨基丙酰氨基]-N-[(1R)-1-[(RS)-(5,6-二甲基-2-苯并噁唑基)羟基甲基]-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-1-[5,6-二甲基-2-苯并噁唑基)羟基甲基]-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-1-[(RS)-(5-1,1-二甲基)乙基-2-苯并噁唑基)羟基甲基]-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-2-[((1S)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基)氧基甲基]吡咯烷、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-2-[((1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基)氧基甲基]吡咯烷、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-2-(2-喹啉氧基甲基)吡咯烷、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-2-(6-甲基-3-喹啉基甲酰氨基甲基)吡咯烷、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-2-(5-苄基-2-苯并咪唑基)吡咯烷、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-2-(5-苄基-2-苯并咪唑基)吡咯烷、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-2-(1-(2-苯基)乙基-2-苯并咪唑基)吡咯烷、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-2-(1-(3-氨基丙基)-2-苯并咪唑基)吡咯烷、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-1-(2-苯并噁唑基)-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基-N-[(1S)-1-(2-苯并咪唑基)-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(5-苄基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1-(2-苯基)乙基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(5-1,1-二甲基)乙基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(5-(1-羟基-1-苯基)甲基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1S)-1-(5-苄基-2-苯并咪唑基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1R)-1-(2-苯并噻唑基)-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[(1S)-1-(2-苯并噁唑基)-3-苯基丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(5-苄基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4S)-4-(氨基甲基)-N-[(5-苄基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(5-苯基氧基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(5-苯基-2-苯并咪唑基)甲基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙基硫代)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙基氧基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙基氧基)-N-(6-(1,1-二甲基)乙基-3-喹啉基)-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4RS)-4-(3-氨基丙基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[5-(p-氯苯基)四氢-3-苯硫基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(胍基)-N-[(1R)-3-苯基-1-(3-喹啉基氨基甲酰基)丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[7-乙基-3-喹啉基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[6-(1,1-二甲基)乙基-3-喹啉基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(5-苄基-2-羟基苯基)-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-[4-苄基-2-苯并咪唑基)乙基]-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-(6-乙基-3-喹啉基)-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-(5-苄基-2-苯并咪唑基)-2-吡咯烷甲酰胺、(2S,4R)-4-(2-氨基乙酰氨基)-N-(5-苄基-2-苯并咪唑基)-2-吡咯烷甲酰胺、(2R,4R)-4-(氨基甲基)-N-[(1R)-3-苯基-1-[(3-喹啉基甲酰氨基)甲基]丙基]-2-吡咯烷甲酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-D-脯氨酰基-D-脯氨酸-(6-异丙基)-3-喹啉基酰胺、反式-4-氨基-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、顺式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-D-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-(N-甲基甘氨酰基氨基)-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-((S)-3-氨基-2-羟基丙酰基氨基)-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-氨基甲基-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、4-(2-氨基乙基)-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、1-(N-甲基甘氨酰基)-反式-4-氨基-L-脯氨酰基-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-氨基-L-pipecolinoyl-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、顺式-4-氨基-L-pipecolinoyl-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-pipecolinoyl-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、顺式-4-甘氨酰基氨基-L-pipecolinoyol-反式-4-((R)-2-羟基-4-苯基丁氨基)-L-脯氨酸3-喹啉基酰胺、D-鸟氨酰基-反式-4-(4-苯基丁酰基)氨基-L-脯氨酸-5-茚满基酰胺、L-鸟氨酰基-顺式-4-(4-苯基丁酰基)氨基-L-脯氨酸-5-茚满基酰胺、D-鸟氨酰基-顺式-4-(4-苯基丁酰基)氨基-L-脯氨酸5-茚满基酰胺、4-羟基-L-鸟氨酰基-反式-4-(4-苯基丁酰基)氨基-L-脯氨酸5-茚满基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸3-喹啉基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸5-茚满基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸3,4-二甲基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸3,5-二甲基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-D-高苯丙氨酸4-氯-3-甲基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基甘氨酸4-苄基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苯氧基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-(4'-甲基苯氧基)苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-(4'-氯苯氧基)苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苯基氨基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸3-联苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-D-脯氨酸3-联苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苄基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-叔丁基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苯基苄基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苄基氧基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸3-苄基氧基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-(苯基硫代甲基)苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苄基硫代苯基酰胺、反式-4-((S)-3-氨基-2-羟基丙酰基氨基)-L-脯氨酸4-苯氧基苯基酰胺、反式-4-(2-氨基乙基磺酰基氨基)-L-脯氨酸4-苯氧基苯基酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸4-苯基噻唑-2-yl酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酸3-(6-苄基)喹啉基酰胺、反式-4-氨基-L-pipecolinoyl-(4-苯氧基苯基)酰胺、反式-4-甘氨酰基氨基-L-pipecolinoyl 4-苯氧基苯基酰胺、反式-4-氨基甲基-L-脯氨酸4-苯氧基苯基酰胺、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(3-氯苯基)哌嗪、1-[反式-4-((2S)-3-氨基-2-羟基丙酰基氨基)-D-脯氨酰基]-4-(3-氯-2-甲基苯基)哌嗪、1-(N-反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(4-氯苯基)哌嗪、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(2-氯苯基)哌嗪、1-(反式-4-氨基甲基-L-脯氨酰基)-4-(3-氯-2-甲基苯基)哌嗪、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(4-苯基丁酰基)哌嗪、(2R)-4-苄基-1-(反式-4-甘氨酰基氨基-D-脯氨酰基)-2-苯乙基哌嗪、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(4-苄基氧基苯氧基)哌啶、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基)-4-(3,5-二氯苯氧基)哌啶、1-(反式-4-甘氨酰基氨基-D-脯氨酰基)-4-(3,5-二氯苯氧基)哌啶、反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基-4-(2-氯-5-甲基苯氧基)哌啶、(2S,4R)-4-甘氨酰基氨基-2-(4-联苯基氧基)甲基吡咯烷、(2S,4R)-4-甘氨酰基氨基-2-(3-联苯基氧基)甲基吡咯烷、(2R,4S)-4-甘氨酰基氨基-2-(4-联苯基氧基)甲基吡咯烷、(2R,4S)-4-甘氨酰基氨基-2-(3-联苯基氧基)甲基吡咯烷、反式-4-(3-联苯基氧基)-L-脯氨酸2-氨基乙基酰胺、(2S,4R)-2-(2-氨基-1-羟基乙基)-4-(3-联苯基氧基)吡咯烷、1-(N-反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基氨基)-3-(4-苯基丙酰基氨基)苯、2-(反式-4-甘氨酰基氨基-L-脯氨酰基氨基)-6-(4-苯基丙酰基氨基)吡啶或(2S,4R)-4-甘氨酰基氨基-2-((E和Z)-4-苯基苯乙烯基)吡咯烷。
适用于本发明的组合和组合物中的其他外排泵抑制剂化合物包括但不限于：格罗泊霉素(甘氨酸，N-(N-(N-(N-(N-(3-羟基-2-甲基-1-氧代壬基)-N-甲基亮氨酰基)-L-别异亮氨酰基)-L-丝氨酰基)-L-别苏氨酰基)-，rho-内酯)、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、吡啶喹诺酮、MC-04,124((2R，4R)-4-(氨基甲基)-N-[(2R)-1-氧代-4-苯基-1-(喹啉-6-基氨基)丁-2-基]吡咯烷-2-甲酰胺)、或MC-02,595(D-鸟氨酸-D-高苯丙氨酸-3-氨基喹啉)。
适用于本发明的组合和组合物中的外排泵化合物的类别包括但不限于烷氧基喹啉衍生物，例如2,8-二甲基-4-(2'-吡咯烷乙基)-羟喹啉；哌啶和哌啶类似物；吩噻嗪，例如氯丙嗪；单萜衍生物，例如香叶胺；或精氨酸衍生物，例如引入本文作为参考的US 6,251,869中所述的那些。
适用于本发明的组合和组合物中的外排泵抑制剂的另一个实例是2-3二溴马来酰亚胺。
适用于本发明的组合和组合物中的优选外排泵抑制剂是苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺(PAβN)。
其他方面
水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物可以分开、序贯或同时施用。例如，水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物的组合可以一起配制为用于施用于患者的组合物。可替代地，水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物可以各自分开配制用于分开或序贯施用于患者。
水杨酰胺化合物或水杨酰胺化合物和外用泵抑制剂化合物可以通过各种途径施用于患者，包括经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、静脉内、肌内、皮内、皮下或经由植入的储库，优选静脉内。待施用的每种化合物的量将根据患者的性质以及待治疗的病症的性质和程度而广泛变化。对于水杨酰胺化合物，成人的典型剂量将至多约5g，优选至多约2g，并且对于外排泵抑制剂化合物，至多约5g，优选至多约2g。任何特定患者所需的具体剂量将取决于各种因素，包括患者的年龄、体重、一般健康、性别等。
对于分开、序贯或同时经口施用，水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物可以配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液和分散体。这样的制剂是本领域众所周知的，如此处未列出的其他经口剂量方案一样。在片剂形式中，化合物可以与常规片剂基质如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，连同粘合剂、崩解剂和润滑剂一起制成片剂。粘合剂可以是例如玉米淀粉或明胶，崩解剂可以是马铃薯淀粉或海藻酸，并且润滑剂可以是硬脂酸镁。对于以胶囊形式的经口施用，可以采用乳糖和干玉米淀粉等稀释剂。可以添加其他组分，如着色剂、甜味剂或调味剂。
当需要水性悬浮液用于经口使用时，水杨酰胺化合物或水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物可以与载体如水和乙醇组合，并且可以使用乳化剂、悬浮剂和/或表面活性剂。也可以添加着色剂、甜味剂或调味剂。
水杨酰胺化合物或水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物也可以通过在生理可接受的稀释剂如水或盐水中注射而分开、序贯或同时施用。稀释剂可以包含一种或多种其他成分，例如乙醇、丙二醇、油或药学可接受的表面活性剂。在一个实例中，化合物通过静脉内注射分开、序贯或同时施用，其中稀释剂包含蔗糖、L-组氨酸和药学可接受的表面活性剂例如吐温20的水溶液。
水杨酰胺化合物或水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物也可以分开、序贯或同时局部施用。用于化合物的局部施用的载体包括矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。化合物可以作为成分存在于洗剂或乳膏中，用于局部施用于皮肤或粘膜。这种乳膏可以含有悬浮于或溶解于一种或多种药学可接受的载体中的活性化合物。合适的载体包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
水杨酰胺化合物或水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物还可以借助于持续释放系统分开、序贯或同时施用。例如，它们可以掺入缓慢溶解的片剂或胶囊内。
对于植物中的感染的处理，例如猕猴桃属的猕猴桃植物中由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa-V)引起的细菌感染，水杨酰胺化合物和外排泵抑制剂化合物可以任选地与一种或多种载体一起配制，例如作为应用于植物的喷雾剂。化合物可以分开、序贯或同时应用。对于应用于植物，本发明的组合和组合物可以进一步包含一种或多种佐剂，例如适用于植物的乳化剂、分散剂、矿物油和植物油或其混合物。组合和组合物也可以用作野外设备(例如修枝剪)的灭菌剂，以预防在果园之间的细菌感染传播。
本发明还涉及用于治疗或预防细菌感染的装置和试剂盒。合适的试剂盒包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其足以用于至少一种细菌感染的至少一次治疗，用于分开、序贯或同时使用，连同进行治疗/预防的说明书。
试剂盒和治疗/预防细菌感染的使用说明书可以是标签的形式，所述标签指在其制造、运输、销售或使用期间的任何时间附着或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录的材料。例如，术语“标签”包括广告传单和小册子、包装材料、说明书、盒式录音磁带或录像带、计算机光盘、以及直接印刷在试剂盒上的书写。
本文呈现的申请人的结果提供了细菌如何代谢某些药物(包括硝基前药抗生素，以及含有一个或多个硝基的水杨酰胺，例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)的分子基础的令人惊讶地有趣的洞察。不希望受到理论的约束，申请人提出，由于内源性硝基还原酶基因中的自发突变，已变得对用硝基前药抗生素的治疗抗性的细菌随后将易受用一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物的治疗影响。一方面，与野生型相比，内源性硝基还原酶活性的丧失或减少意味着细菌细胞对硝基前药抗生素抗性，因为一旦在细菌细胞内，前药就无法被切割以产生毒性抗生素。另一方面，内源性硝基还原酶活性的丧失或减少意味着细菌细胞易受一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物(例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)影响，因为在不存在硝基还原酶活性的情况下，细菌细胞不再能够将毒性氯硝柳胺转换为无毒形式。外排泵抑制剂可以任选与一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物一起包括，以增强对药物的敏感性。
相应地，在又一个方面，本发明提供了用于治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗抗性，所述方法包括向患者施用足以治疗或预防感染的量的至少一种水杨酰胺化合物，其中水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。任选地，该方法进一步包括施用至少一种外排泵抑制剂。
在又一个方面，本发明提供了用于减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗抗性，所述方法包括施用足以减少或消除生物膜形成的量的至少一种水杨酰胺化合物，其中水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基。任选地，该方法进一步包括施用至少一种外排泵抑制剂。
相反，在有或没有外排泵抑制剂的存在下，已变得对用含一个或多个硝基的水杨酰胺化合物治疗抗性的细菌可以经由内源性硝基还原酶基因中的突变来完成，所述内源性硝基还原酶基因引起硝基还原酶活性中的增加。一方面，与野生型相比，内源性硝基还原酶活性的增加意味着细菌细胞对含硝基的水杨酰胺化合物(在不存在外排泵抑制剂的情况下)抗性，因为细菌细胞不再能够将毒性含硝基的水杨酰胺化合物(例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)转换为无毒形式。另一方面，内源性硝基还原酶活性的增加意味着细菌细胞更易受一个或多个硝基前体药物抗生素影响，因为它将切割前药以形成抗生素的活性形式。
相应地，在又一个方面，本发明提供了用于治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排抑制剂化合物的治疗抗性，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括向患者施用足以治疗或预防感染的量的硝基前药抗生素。
在又一个方面，本发明提供了用于减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物或至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合的治疗抗性，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括施用足以减少或消除生物膜形成的量的硝基前药抗生素。
在某些实施方案中，硝基前药抗生素选自呋喃妥因、呋喃西林、甲硝哒唑、替硝唑、呋喃唑酮、米索硝唑、依他硝唑、硝呋莫司、奥硝唑、苄硝唑、二甲硝咪唑、罗硝唑、RSU-1069、RB-6145、CB1954、EF3、EF5、HX4和氟化米索硝唑。
定义
术语“患者”包括人和非人动物。非人动物包括但不限于鸟类和哺乳动物，特别是小鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、母牛、马和负鼠。术语“患者”和“对象”在本说明书中可互换使用，并且在预防或治疗细菌感染的背景中包括医疗保健从业者以及接受治疗的患者。
“治疗”和类似术语指预防、治愈或改善医学疾病、病症或状况，和/或至少减少这种疾病或病症的症状的方法和组合物。特别地，这包括预防或延迟医学疾病、病症或状况发作；治愈、纠正、减轻、减缓或改善医学疾病、病症或状况的身体或发育效应；和/或预防、终结、减少或改善由医学疾病、病症或状况引起的疼痛或痛苦的方法和组合物。
术语“预防”意指整体或部分预防、或改善或控制、或减少或停止事物或事件例如待预防的细菌感染的产生或发生。
术语“芳基”意指具有4至18个碳原子的芳族原子团。实例包括单环基团，以及稠合基团例如二环基团和三环基团。实例包括苯基、茚基、1-萘基、2-萘基、薁基、庚烯基、联苯基、indacenyl、苊基、芴基、萉基(phenalenyl)、菲基、蒽基、环戊二烯环辛烯基和苯并环辛烯基。
术语“杂芳基”意指具有4至18个碳原子并且包含一个或多个杂原子的芳族原子团。实例包括单环基团，以及稠合基团例如二环基团和三环基团。实例包括吡啶基、吡咯基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹唑啉基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、苯硫基、苄基苯硫基、咪唑基、苯并咪唑基、嘌呤基、吡唑基、吲唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑、苯并异噁唑基、三唑基、噻唑基、苯并噻唑基和四唑基。
术语“药学可接受的盐”预期应用于衍生自无机酸或有机酸的无毒盐，包括例如下述酸式盐：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、palmoate、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐和十一酸盐。
如本说明书中使用的，单词“包括(comprises)”、“包括(comprising)”和类似单词不以排他性或详尽含义解释。换言之，它们预期意指“包括但不限于。
为了本发明的目的，对所公开的化合物的任何提及都包括所有可能的制剂、构型和构象，例如以游离形式(例如作为游离酸或碱)，以盐或水合物的形式，以异构体(例如顺式/反式异构体)、立体异构体(例如对映体、非对映体和差向异构体)的形式，以对映体或非对映体混合物的形式，以外消旋体或外消旋混合物的形式，或以各个对映体或非对映体的形式。化合物的具体形式在本文中详细描述。
应了解，本文例如关于R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10公开的任何子范围，可以与本文公开的任何其他子范围组合，以产生进一步的子范围。
还应了解，对本文公开的数目范围(例如1至100)的任何提及都预期包括该范围内的所有有理数(例如，1.1、20.5、55.6、70、90)以及在该范围内的任何有理数范围(例如1.1至3.5)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围在此明确公开。这些仅仅是具体预期的实例，并且列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都视为在本文中明确公开。
实施例
参考下述实施例进一步描述本发明。应了解，如请求保护的本发明不以任何方式受这些实施例的限制。
大肠杆菌菌株的生成
通过Red重组酶法(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(2000).One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645.)，使用PCR扩增的破坏盒通过框内缺失生成缺失菌株。用于破坏盒扩增和重叠PCR的PCR引物在图17中描述。大肠杆菌菌株7KO通过天然nfsA、nfsB、azoR、nemA、yieF、ycaK和mdaB基因的缺失而衍生自大肠杆菌W3110。大肠杆菌菌株7KOΔtolC通过天然tolC基因的缺失而衍生自7KO。具有允许经由T7RNA聚合酶的诱导表达的整合的λDE3原噬菌体的大肠杆菌菌株7KOΔtolC(DE3)使用λDE3溶原化试剂盒(Novagen，Merck，Darmstadt，德国)衍生自7KOΔtolC。氧化还原酶在7KOΔtolC中由质粒pUCX表达，所述质粒pUCX是衍生自pUC19的表达质粒(Prosser,G.A.,Copp,J.N.,Mowday,A.M.,Guise,C.P.,Syddall,S.P.,Williams,E.M.,Horvat,C.N.,Swe,P.S.,Ashoorzadeh,A.,Denny,W.A.,Smaill,J.B.,Patterson,A.V.和Ackerley,D.F.(2013).Creation andscreening of a multi-family bacterial oxidoreductase library to discovernovel nitroreductases that efficiently activate the bioreductive prodrugsCB1954and PR-104A.Biochemical Pharmacology 85:1091–1103.)。氧化还原酶在7KOΔtolC(DE3)中由质粒pET28(Novagen，Merck，Darmstadt，德国)表达。
细胞敏感性测定
该方法适用于所有实验，其得到在氯硝柳胺或2-氯-4-硝基苯胺的存在下生成的革兰氏阴性细菌菌株的生长曲线，除非下文或在各个附图描述中另有说明。将含有100μLLB(补充有100μg mL-1氨苄青霉素和0.4％(w/v)葡萄糖，用于7KOΔtolC氧化还原酶过表达菌株)的96孔微量滴定板的各个孔一式两份接种，并且在30℃下伴随以200rpm的振荡温育过夜。第二天，100μL的过夜培养物用于接种2mL LB(除如上所述的氨苄青霉素和葡萄糖之外，还补充有50μM IPTG，用于氧化还原酶过表达菌株)，并且在30℃、200rpm下温育3.5小时。然后将来自每个培养物的40μL等分试样一式两份加入无菌384孔板的各个孔中，每孔含有稀释系列的氯硝柳胺或2-氯-4-硝基苯胺，包括在40μL LB(补充有IPTG、氨苄青霉素和葡萄糖和抗生素，用于如上所述的氧化还原酶过表达菌株)中的0μM对照。通过在攻击后4小时的600nm处的光密度(OD600)来监测培养物浊度。在减去初始吸光度值(t＝0h)后，通过比较受氯硝柳胺或2-氯-4-硝基苯胺攻击的细胞与未受攻击的0μM对照来计算生长百分比。使用EnSpireTM 2300Multilabel Reader(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量所有微量滴定板吸光度读数。当给出时，使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)中的非线性回归分析计算IC50值(对于给定菌株相对于无未受攻击的对照引起50％生长抑制的药物浓度)。
7KOΔtolC氧化还原酶文库氯硝柳胺生长抑制测定
该方法适用于图5所示的实验。含有100μL LB(补充有100μg mL-1氨苄青霉素和0.4％(w/v)葡萄糖)的96孔微量滴定板的各个孔用7KOΔtolC文库菌株(包括pUCX空质粒对照)一式两份接种，并且在30℃下伴随以200rpm的振荡温育过夜。100μL的每个过夜培养物用于接种补充有100μg mL-1氨苄青霉素和50μM IPTG的2mL LB，并且在30℃、200rpm下温育3.5小时。然后将来自每个培养物的40μL等分试样加入无菌384孔板的各个孔中，所述孔含有补充有100μg mL-1氨苄青霉素、50μM IPTG和2.5μM氯硝柳胺的40μL LB培养基或对照孔含有0μM氯硝柳胺。每个氧化还原酶过表达菌株一式两份地进行测试(独立重复)。通过在攻击后4小时的600nm处的光密度来监测培养物浊度。使用下式，在减去初始吸光度值(t＝0h)后，通过比较受攻击细胞与未受攻击的0μM对照来计算生长抑制百分比：(1-(受攻击的OD600/未受攻击的OD600))*100％。使用EnSpireTM 2300Multilabel Reader(PerkinElmer，Waltham，MA)测量所有微量滴定板吸光度读数。
分析氯硝柳胺从变体基因文库中富集表达活性硝基还原酶的克隆的能力
该方法适用于图6和图7所示的实验。用已连接入pUCX的～95,000,000成员的nfsA变体文库的一部分转化电感受态SOS-R4细胞。在转化后，将细胞在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的琼脂平板上(含有或不含+0.5μM氯硝柳胺和0.1μM IPTG)铺平板。使板在30℃下生长过夜以允许形成菌落。然后从每个培养基条件的板中挑选57个菌落，并且(连同nfsA、空质粒和培养基对照一起)转移到在分开的96孔板的内部60个孔中含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的100μl LB中。在由其制备甘油原种以接种所有后续测定之前允许培养物生长生长。对于生长抑制测定，每块甘油板用于接种新鲜微量滴定板的内部60个孔，每个孔含有150μL的LB+100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL壮观霉素和0.4％葡萄糖。然后使板在30℃、200rpm下温育过夜。第二天，15μL过夜培养物用于接种在新鲜微量滴定板的内部60个孔各自中的含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL壮观霉素、0.2％葡萄糖和50μM IPTG的200μL LB。每块板在30℃、200rpm下温育2.5小时。然后将30μL这些天的培养物各自转移到384孔板的各个孔中，所述孔含有用100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL壮观霉素、0.2％葡萄糖和50μM IPTG改良的30μL LB，以及100μM前药(关于图6为甲硝哒唑，并且关于图7为替硝唑)或等价的仅DMSO载体对照。每个所选择的克隆在每块384孔板上一式两份地进行攻击。然后将384孔板在30℃、200rpm下温育3小时，这之后在读板器中读取每个孔在600nm处的光密度。使用下式，在减去初始吸光度值(t＝0h)后，通过比较受攻击细胞与未受攻击的0μM对照来计算生长抑制百分比：(1-(受攻击的OD600/未受攻击的OD600))*100％。使用EnSpireTM 2300Multilabel Reader(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量所有微量滴定板吸光度读数。
组合或各个氯硝柳胺和PAβN处理对不同细菌菌株的作用的热图分析
该方法适用于图8-15所示的实验。将所需的菌株接种到3mL LB中，并且在30℃下(Psa-V或大肠杆菌实验室菌株7KO或7KOΔtolC)或37℃(大肠杆菌实验室菌株W3110、铜绿假单胞菌实验室菌株PAO1、或所有临床分离物菌株)温育16小时，伴随以200rpm的振荡。测量过夜培养物的OD600，并且细胞在用0.1M MgSO4改良的LB中稀释至0.2的OD600，在用培养基1/2稀释后，其得到0.1的起始OD600。培养基(384孔板的每孔30μL)含有LB、0.1M MgSO4以及两倍最终所需浓度的PAβN，以允许用细菌培养物的1/2稀释。每个PAβN稀释物的培养基(60μL/孔)的等分试样补充有以最高最终浓度两倍的氯硝柳胺，以用于允许用细菌培养物的1/2稀释。对于384孔板的H(或P)行，如图18所示加入60μL各种氯硝柳胺/PAβN培养基组合。对于A-G行，加入30μL培养基(仅PAβN)。通过从H行中去除30μL培养基并且将其转移到G行，混合，然后将30μL的G行转移到F行，等等直到B行，来进行氯硝柳胺的系列稀释。在B行后，最后30μL被丢弃，并且A行留下作为0μM氯硝柳胺。然后将每个孔用30μL细菌培养物OD600＝0.2进行接种，以得到每孔0.1的最终OD600。测量OD600(t＝0)，并且使培养物在30℃或37℃(根据过夜培养物)、200rpm下温育4小时。然后记录最终OD600(t＝4)。为了计算生长抑制，从t＝4值中减去t＝0值。然后相对于代表100％生长的0μM氯硝柳胺和0μM PaβN孔来计算生长百分比。
7KOΔtolC(DE3)细胞敏感性测定
该方法适用于图16所示的实验。含有补充有50μg/mL-1的100μL LB的96孔微量滴定板的各个孔用过表达大肠杆菌nfsA、大肠杆菌nfsB或pET28空质粒对照的7KOΔtolC(DE3)菌株一式两份地进行接种。使菌株在30℃下在Heidolph titramax平台振荡器中以900rpm温育过夜。30μL每个过夜培养物用于接种在96孔深培养板(Axygen)中的补充有50μg mL-1卡那霉素和50μM IPTG的600μL LB的一式两份培养物。培养物在30℃、1200rpm下温育2.5小时。然后将来自每个培养物的40μL等分试样加入无菌384孔板的各个孔中，所述孔含有补充有100μg mL-1卡那霉素、50μM IPTG和系列稀释的硝唑尼特的40μL LB培养基，包括0μM对照。每个硝基还原酶过表达菌株一式两份地进行测试(独立重复)。通过在攻击后4小时的600nm处的光密度来监测培养物浊度。在减去初始吸光度值(t＝0小时)后，通过比较受硝唑尼特攻击的细胞与未受攻击的对照来计算生长百分比值。使用Eon Biotek Reader(BioTekInstruments Inc.)测量微量滴定板吸光度读数。
通过氯硝柳胺或硝唑尼特的革兰氏阳性细菌的生长抑制：IC50测量
该方法适用于图20和21所示的实验。用革兰氏阳性细菌菌株金黄色葡萄球菌ATCC43300(MRSA)、苏云金芽孢杆菌P.1.IPS-80血清变型以色列或威尔斯李斯特菌ATCC 35897接种含有2mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)的15mL试管。使菌株在37℃下伴随以200rpm的振荡温育过夜。第二天，将过夜培养物在新鲜的TSB中稀释，以得到大约0.3的OD600。然后将这些的一式两份40μL等分试样加入无菌384孔板的各个孔中，所述孔含有补充有2×氯硝柳胺或硝唑尼特的系列稀释的40μL TSB培养基，包括0μM对照。在攻击后4小时通过在600nm处的光密度监测培养浊度。在减去初始吸光度值(t＝0h)之后，通过对于每个菌株比较受氯硝柳胺或硝唑尼攻击的细胞与未受攻击的对照来计算生长抑制百分比值。使用EnspireTM2300Multilabel Reader(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量微量滴定板吸光度读数。使用Graphpad Prism 5(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)计算每种菌株对于每种化合物的抑制浓度(IC50；在其下测试菌株的生长达到未受攻击的对照那种的50％浊度水平的化合物浓度)。
对于革兰氏阳性细菌株金黄色葡萄球菌ATCC 43300、威尔斯李斯特菌ATCC 35897和苏云金芽孢杆菌P.1.IPS-80血清型变以色列，跨越一系列浓度的氯硝柳胺或硝唑尼特，源自图20和21中呈现的数据的IC50值如下表1中呈现：
表2：氯硝柳胺和硝唑尼特针对革兰氏阳性细菌的IC50值
菌株 氯硝柳胺(nM) 硝唑尼特(nM)
金黄色葡萄球菌ATCC 43300(MRSA) 132 2902
威尔斯李斯特菌ATCC 35897 284 8785
苏云金芽孢杆菌P.1.IPS-80血清型变以色列 139 8671
虽然已通过示例描述了本发明，但应了解，可以作出变化和修改，而不背离如权利要求中限定的本发明的范围。此外，当存在特定特征的已知等价物时，这种等价物被并入，如同它在本说明书中具体提及一样。

Claims (15)

1.一种用于治疗或预防革兰氏阳性细菌感染的方法，其包括向需要治疗的患者施用足以治疗或预防所述患者中的革兰氏阳性细菌感染的量的水杨酰胺化合物。
2.一种用于减少或消除包含革兰氏阳性细菌的细菌生物膜形成的方法，其包括施用足以预防、减少或消除所述生物膜形成的量的水杨酰胺化合物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺或硝唑尼特。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述革兰氏阳性细菌选自由葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)和芽孢杆菌属(Bacillus)组成的属中的一种或多种。
5.一种水杨酰胺化合物，用于下述：
(i)治疗或预防患者中的细菌感染；或
(ii)预防、减少或消除细菌生物膜的形成，
其中引起感染或生物膜形成的所述细菌包含革兰氏阳性细菌。
6.一种药物或生物组合物，其包含水杨酰胺化合物连同可接受的赋形剂或载体，用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜，其中引起感染或生物膜形成的所述细菌包含革兰氏阳性细菌。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺或其类似物、或者硝唑尼特或其类似物。
8.一种组合产品、协同组合、抗细菌剂、组合物或药物组合物，其包含至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物。
9.至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合或组合物作为药剂的用途。
10.一种用于治疗或预防细菌感染的方法，其包括向需要治疗的患者施用至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物，其量足以治疗或预防所述患者中的细菌感染，其中引起感染的所述细菌包含革兰氏阴性细菌。
11.一种用于保护细菌细胞免受至少一种水杨酰胺化合物的毒性的方法，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括增加所述细胞中至少一种硝基还原酶的表达和/或活性，其量足以保护免受所述水杨酰胺化合物的毒性。
12.一种用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素的治疗有抗性，所述方法包括施用至少一种水杨酰胺化合物，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，其量足以治疗或预防感染或者预防、减少或消除所述生物膜的形成。
13.一种用于治疗或预防患者中的细菌感染，或者用于预防、减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物或至少一种水杨酰胺化合物和至少一种外排泵抑制剂化合物的组合的治疗有抗性，其中所述水杨酰胺化合物包括一个或多个硝基，所述方法包括施用足以治疗或预防感染或者预防、减少或消除所述生物膜形成的量的硝基前药抗生素。
14.一种组合物，其包含抗生有效量的下述：
(i)水杨酰胺化合物或其药学可接受的盐；和
(ii)外排泵抑制剂化合物或其药学可接受的盐；
其中化合物(i)和(ii)以足以产生协同抗生效应的比例应用。
15.根据权利要求8至14中任一项的组合产品、组合、组合物、用途、抗细菌剂或方法，其中所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺或硝唑尼特。
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