CN107629041B

CN107629041B - 查尔酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用

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Publication number: CN107629041B
Application number: CN201710580105.2A
Authority: CN
Inventors: 尤启冬; 胡文渊; 姜正羽; 郭小可; 徐晓莉; 张晓进
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Current assignee: Tianjin Hengrui Pharmaceutical Co ltd; Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2037-07-17
Also published as: CN107629041A

Abstract

本发明涉及查尔酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用。具体而言，本发明涉及一类通式(I)所示的含α,β‑不饱和酮结构的查尔酮类衍生物、其制备方法以及含有该类衍生物的药物组合物以及其作为Nrf2‑Keap1‑ARE信号通路激动剂的用途，其中通式(I)中的各取代基的定义与说明书中的定义相同。

Description

查尔酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用

技术领域

本发明涉及一类通式(I)所示的含α,β-不饱和酮结构的查尔酮类衍生物、其制备方法以及含有该类衍生物的药物组合物以及其作为Nrf2-Keap1-ARE信号通路激动剂的用途。

背景技术

目前，Keap1-Nrf2-ARE信号通路已成为预防和治疗氧化应激相关的疾病以及包括癌症、神经变性、心血管、代谢和炎性疾病相当有吸引力的靶标。氧化或亲电应激等产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)会对细胞内的大分子物质如蛋白质、核酸、脂质等的生理功能造成损害，为癌症、糖尿病、炎症、神经退行性疾病等众多疾病发起的重要病理因子。

当机体受到活性氧(ROS)损害时，自身可诱导产生一系列保护性蛋白，以阻止细胞受损。该缓解细胞损害的过程是由这些保护性基因上游调节区的抗氧化应答原件(antioxidant responsive element，ARE)来调控的。研究表明，核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)为氧化亲电刺激与外源性毒性物质的感受器，可介导并激活ARE信号通路，在缓解与修复细胞损伤的防御机制中有着至关重要的作用。

在生理状态下，Nrf2与Keap1蛋白(Kelch-like ECH2associated protein 1，keap1)结合，使得Nrf2泛素化后被降解，导致细胞内的Nrf2低水平表达。在受到ROS或者亲电刺激时，Keap1蛋白的构象改变，Nr2因而与之解偶联并在胞浆内累积，且转移至细胞核内，随后Nrf2与Maf、cJun等蛋白形成二聚体，结合至ARE序列，启动下游基因的表达，从而表达抗氧化酶与II相解毒酶等保护性蛋白，发挥细胞保护作用。因此，激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路在抗炎、抗凋亡、抗癌等领域中有着重大作用。

目前，激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路，主要分以下两种途径，一是亲电类物质共价修饰Keap1蛋白上的半胱氨酸残基，使其构象发生变化，Nrf2被解离出来，进而累积入核发挥保护性调控作用；二是直接干扰Keap1与Nrf2的蛋白相互作用。

最为经典的亲电类Nrf2激活剂为富马酸二甲酯(dimethyl fumarate)与CDDO-Me。富马酸二甲酯由Biogen Idec研发，用于治疗多发性多发性硬化症，

此外，期刊J.Med.Chem.2011,54,4147–4159公开了一类具有潜在Nrf2激活剂活性的查尔酮结构的衍生物，结构中R₁-R₈如原文定义。

期刊Eur.J.Med.Chem 66(2013)364-371公开了一类α-吡喃酮衍生物作为潜在Nrf2/ARE通路的激活剂的生物活性研究，

结构式中的X及R如原文定义，通过荧光素酶基因评价的方法，初步讨论了该类结构的构效关系。

为了更好的达到预防或者治疗炎症等相关疾病的目的，满足市场及患者的需求，新的高效低毒的Nrf2激动剂类化合物仍需被开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一类如通式(I)所示的含α,β-不饱和酮结构的查尔酮衍生物，及其药学上可接受的盐，

其特征在于：R¹选自烷基、烯基、羟基、巯基、烷氧基、羟烷基、氨基，m选自2、3，优选2，任选R¹相同或不同，R¹优选自羟基、烷基；

X选自氧、硫，优选氧；

M连接在母体结构上，其中M选自：

(1)(R²)_n取代的苯基，R²选自氟、氯、溴、碘、氨基，n选自1、2、3、4、5，且当n不为1时，R²不相同；

(2)芳基，所述芳基稠合于五元环杂芳基，与母体结构连接在一起的环为芳基环，杂原子为氧、氮、硫，杂原子的数目选自1、2、3、4，M任选被(R³)_p取代，R³优选烷基、氨基、烷氧基、氰基、硝基、卤代烷基、羟烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧羰基、卤素、苯基、苄基，p选自0、1、2；

(3)杂芳基，所述杂芳基为稠合于芳基的五元环杂芳基，与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，杂芳基的杂原子为氧、硫，杂原子的数目选自1、2、3、4，M任选被(R⁴)_q取代，R⁴优选烷基、卤素、苯基、苄基、氨基、烷氧基、氰基、硝基、卤代烷基、羟烷基、炔基、环烷基、烷氧羰基，q选自0、1、2；

(4)环烷基。

本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐，具体而言结构如通式(Ⅱ)所示，

R¹、M、X定义如上所述。

本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述芳基选自苯基、萘基，优选苯基。

本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐，当M为环烷基时，优选含碳原子数为3‐6的环烷基。

本发明的典型化合物包括但不限于：

本发明涉及一种制备如上所述的通式(Ⅱ)所示的化合物或其可药用盐的方法，该方法包括以下步骤：

化合物(Ⅱ-A)与化合物(Ⅱ-B)在碱性介质作用下，惰性气体保护，发生缩合反应，R¹、X、M的定义如上所述。

本发明中所述的惰性气体为氮气或者氩气，优选氮气。

本发明中所述的碱性介质选自吡啶、哌啶、三乙胺、N，N‐二异丙基乙胺，优选哌啶；该方法的反应溶剂优选氯仿、乙腈。

本发明涉及的通式(Ⅱ)所示的化合物或其可药用盐的方法，可以采用微波反应的方法制备。

本发明所述的微波反应是指化合物(Ⅱ‐A)与化合物(Ⅱ‐B)在碱性介质、中性氧化铝存在的条件下，发生缩合反应，R¹、X、M的定义如上所述。

本发明中公开的微波反应中的碱性介质选自吡啶、哌啶、三乙胺、N，N‐二异丙基乙胺、乙酸铵，优选吡啶、哌啶、乙酸铵，微波反应结束后使用氯仿提取，蒸干得粗品。

本发明还提供一种通式(Ⅱ)所示的化合物的纯化方法，选用乙醇、二氯甲烷、石油醚做重结晶溶剂。

进一步，本发明还提供了一类药物组合物，其含有治疗有效剂量的如通式(Ⅰ)所示的化合物或其可药用盐和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用药用辅料。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。

本发明的化合物临床所用剂量为0.01mg‐1000mg/天，也可根据病情的轻重或剂型的不同偏离此范围。

本领域技术人员熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并不限定于以下因素，所用特定化合物的活性、病人的年龄、体重、健康状况、饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的结合等，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物(Ⅰ)的日用量或者可药用的盐的种类可以根据传统的方案来验证。

本发明进一步涉及通式(Ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物在制备激活Nrf2的药物中的用途。

本发明进一步涉及通式(Ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物在制备预防或治疗炎症及癌症药物中的用途。

本发明中所述的炎症相关的疾病包括急性炎症与慢性炎症但不限于此。

本发明所述的癌症主要是指：肝癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头部或颈部癌症、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、食道癌、小肠癌、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、前列腺癌、膀肤癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤等。

除非有相反陈述，否则下列用在说明书和权利要求书中的术语具有以下含义。

术语“烷基”指饱和的脂族烃基团，包括1至10个碳原子的直链和支链基团。优选含有1至6个碳原子的烷基(可表述为C1-6烷基)。非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等，烷基可以是取代或者未取代的。

术语“环烷基”指饱和或者部分不饱和的单环或者多环环状烃取代基，其中包括3-20个碳原子，优选3-12个碳原子，更有选环烷基包括3-10个碳原子，最优选环烷基包括3-6个碳原子，最优为环丙基、环丁基。单环环烷基的非限制性实施例包含环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的4元至14元全碳单环或者稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6元至10元，更优选苯基和萘基，最优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，非限制性实施例包含：

术语“杂芳基”指包含1-4个杂原子，5-14个杂原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元至6元，例如噻二唑基、吡唑基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，非限制性实施例包含：

术语“烯基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上定义的烷基，优选C2-6烯基，更优选C2-4烯基。例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等，烯基可以是取代的或非取代的。

术语“炔基”指至少由两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的如上所定义的烷基，优选C2-6炔基，更优选C2-4炔基。例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等，炔基可以是取代的或非取代的。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(未取代的环烷基)，其中烷基、环烷基的定义如上所述。非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等，烷氧基可以是任选取代的或未取代的。

术语“羟烷基”指-(烷基)-OH，其中烷基的定义如上所述。

术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基的定义如上所述。

术语“烷氧羰基”指-(C＝O)烷基，烷基的定义如上所述。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“氨基”指-NH2。

术语“氰基”指-CN。

术语“硝基”指-NO2。

术语“巯基”指-SH。

术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但是这些实施例并非限制本发明的范围。

本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照原料或者商品制造厂商所建议的条件，原料脱氢乙酸(DHA)(规格100g，纯度98％)购自于阿拉丁试剂公司，实验中所用的芳香醛均购自于安耐吉化学试剂公司。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或者质谱(MS)来确认的，核磁共振谱图(NMR)使用Bruker Avance 300MHz核磁共振仪测定，TMS作为内标，CDCl3或者DMSO-d6作为溶剂，化学位移以10^-6(ppm)作为单位给出。质谱数据(MS)来源于岛津GC-MS 2010型质谱仪(EI-MS)、Agilent 1946A-MSD型质谱仪(ESIMS)以及Q-Tofmicro四级杆飞行时间串联质谱仪(HRMS)。

人结肠癌HCT116细胞株从中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞库中购买，HepG2-ARE-C8细胞由罗格斯大学的A.N.托尼.孔教授友好赠予，细胞毒性评价实验的OD值采用Elx800 Absorbance Micropalte Reader(BioTek,Vermont,USA)，荧光素酶诱导实验数据由luminoskan ascent(Thermo scientific,USA)测定，理化性质测试使用GeminiProfile理化性质测试仪测定。

实施例1

(E)-3-(3-(1H-吲哚-5-基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)和4-吲哚甲醛(431.64mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。减压蒸馏除去溶剂CHCl₃，乙醇重结晶，得黄色固体508mg(收率：57.85％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.50(s,1H),8.25-8.04(m,2H),7.98(s,1H),7.59-7.40(m,3H),6.56(d,J＝3.1,1.9Hz,1H),6.29(d,J＝1.0Hz,1H),2.27(s,3H)；HRMS(ESI):[M+H]⁺296.0917.

实施例2

(E)-3-(3-(1H-吲哚-4-基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)和4-吲哚甲醛(431.64mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。采用同实施例1相同的后处理步骤，得黄色固体514mg(收率：57.85％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.60(s,1H),8.46(d,J＝15.8Hz,1H),8.22(d,J＝15.9Hz,1H),7.68-7.54(m,2H),7.44(d,J＝7.3Hz,1H),7.20(t,J＝7.7Hz,1H),6.91(s,1H),6.31(s,1H),2.28(s,3H)；HRMS(ESI):[M+H]⁺296.0917.

实施例3

(E)-3-(3-(1H-吲哚-6-基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)、6-吲哚甲醛(431.64mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。后处理操作同实施例1，得黄色固体,512mg(收率：58.31％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.49(s,1H),8.21(d,J＝15.6Hz,1H),8.09(d,J＝15.5Hz,1H),7.81(s,1H),7.68-7.50(m,2H),7.45-7.34(m,1H),6.51(s,1H),6.26(s,1H),2.26(s,3H)；HRMS(ESI):[M+H]⁺296.0917.

实施例4

(E)-3-(3-(苯并[b]噻吩-3-基)丙烯酰基)-6-甲基-2H-吡喃-2,4(3H)-二酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)、3-甲醛苯并噻吩(482.34mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。后处理操作同实施例1，得黄色固体,507mg(收率54.59％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.54(s,1H),8.33(d,J＝15.9Hz,1H),8.25–8.07(m,3H),7.60–7.46(m,2H),6.34(s,1H),2.28(s,3H)；HRMS(ESI):[M+H]⁺313.0529.

实施例5

(E)-3-(3-(环己-3-烯-1-基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)、3-环己烯甲醛(327.55mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。减压蒸馏除去溶剂CHCl₃，DCM与PE的混合溶剂重结晶，得白色固体429mg(收率：55.43％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ6.27(s,1H),5.66(s,2H),4.59(s,1H),2.73(s,1H),2.21(s,3H),2.02(s,1H),1.93(s,5H),1.22(s,1H)；HRMS(ESI):[M+H]⁺261.1121.

实施例6

(E)-3-(3-(5-溴-2-氟苯基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(500mg，2.97mmol)、邻溴苯甲醛(603.66mg，2.97mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。后处理同实施例1，得黄色固体,287mg(收率：27.33％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.21(d,J＝16.0Hz,1H),7.97(d,J＝5.6Hz,1H),7.83-7.65(m,2H),7.33(t,J＝9.8Hz,1H),6.33(s,1H),2.27(s,3H)；HRMS(ESI):[M-H]⁺350.9674.

实施例7

(E)-3-(3-(4-氨基苯基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮的合成

步骤1：(E)-4-羟基-6-甲基-3-(3-(4-硝基苯基)丙烯酰基)-2H-吡喃-2-酮的合成

将脱氢乙酸(1g，5.95mmol)、对硝基苯甲醛(898.74mg，5.95mmol)溶于CHCl₃(4ml)中，滴加哌啶(2d)，氮气保护，60℃下反应12h。减压蒸馏除去溶剂CHCl₃，乙醇重结晶，得黄色固体1.23g(收率：68.65％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.55(s,1H),8.41–8.26(m,1H),8.32(s,1H),7.89(dd,J＝9.1,4.2Hz,2H),7.47(dd,J＝16.4,4.3Hz,1H),6.66(d,J＝4.3Hz,1H),2.44(s,3H)；HRMS(ESI):[M-H]⁺300.3054.

步骤2：(E)-3-(3-(4-氨基苯基)丙烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮:

将上述制备的中间体(E)-4-羟基-6-甲基-3-(3-(4-硝基苯基)丙烯酰基)-2H-吡喃-2-酮(500mg，1.66mol)与二氯亚锡二水合物(1.87g)溶于25ml乙酸乙酯中，78℃回流4h，静置，冷却后，反应液用120ml乙酸乙酯稀释后，加入饱和碳酸氢钠水溶液至无絮状物生成，乙酸乙酯萃取，收集有机层，减压蒸馏除去溶剂后，乙醇重结晶，得红色固体376mg(收率：83.51％)。

¹H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.18(d,J＝15.5Hz,1H),7.99(d,J＝15.6Hz,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,2H),6.71(d,J＝8.3Hz,2H),5.97(s,1H),4.14(s,2H),2.30(s,3H)；HRMS(ESI):[M-H]⁺270.0722.

以下是本发明部分化合物的药效学实验及结果：

一、采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，即噻唑蓝(MTT)试验检测细胞毒性

具体实验操作方法：

(1)复苏与培养HCT116细胞；

(2)间隔24h后，给细胞换液，观察细胞生长状态；

(3)间隔48h后，换液传代；

(4)配制化合物浓度；

(5)点板：配制细胞悬浮液，使得细胞浓度为8×104/mL；在96孔板的边缘中加入200ul磷酸缓冲盐溶液(PBS)，设三复孔，每孔加入配制好的细胞悬浮液100uL，37℃孵育24h；给药，37℃孵育24h；取出，每孔加入用PBS配制的5mg/ml MTT溶液20ul，继续培养4h；取出后弃去全部上清，每孔加入DMSO100uL，微型振荡器上震动5min；在全波长酶标仪中检测490nm波长处的OD值，计算化合物对细胞的生长抑制率。

抑制率(％)＝1-(化合物孔OD值-空白孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值)，以仅有细胞和DMSO的孔为阴性对照，以只含培养基的孔为空白对照。采用Graphpad Prism 5软件处理所获数据，计算化合物的IC₅₀。

本发明部分化合物的细胞毒性评价如表1所示：

表1：

化合物编号	细胞毒性IC<sub>50</sub>(μM)
		1	>100
2	72.20±1.31
		3	45.13±1.27
4	61.03±1.24
		5	41.87±2.56
6	55.26±1.98
		7	>100

从表1可看出，本发明大部分代表性化合物IC₅₀>50μM，细胞毒性较弱，且部分化合物的IC₅₀远大于100μM，可安全地应用于抗肿瘤、抗炎等药物开发领域中。

二、评价化合物对ARE的诱导活性

采用ARE荧光素酶报告基因实验评价化合物对Nrf2下游ARE的诱导活性。

实验原理：本实验所用细胞株为HepG2-ARE-C8，这是一个在ARE(Nrf2调节的二相酶启动子处有一段共有的序列ARE)下游稳转入一段荧光素酶报告基因的细胞株，只要化合物对细胞内的ARE有激活作用，那么它也将激活荧光素酶，荧光素酶催化荧光素底物氧化反应产生光能从而被检测器检测到，通过检测光强度来检测化合物的诱导性强弱。

具体实验操作方法为：

(1)复苏与培养HepG2-ARE-C8细胞；

(2)定期更换细胞培养液，待细胞生长良好且细胞数目达到实验要求；

(3)配制细胞悬浮液，使得细胞浓度为4×10⁵/mL，48孔板中每孔加入100μL，培养过夜；

(4)配制化合物浓度，本发明中的化合物与阳性对照化合物分别配制相应浓度，每孔加入100μL，设两复孔，孵育12h；

(5)将培养基从待检测细胞中吸出，加入100μL预冷的PBS缓冲液，漂洗细胞，弃去，随后加入1X裂解缓冲液，每孔30μL，冰上裂解15min，吸取20μL上清液放入luminoskanascent(Thermo scientific,USA)中检测。每孔加入100μL荧光素酶检测试剂，立即读数。

本实验中以特丁基对二苯酚(tBHQ)与富马酸二甲酯(SFN)为阳性对照，DMSO组为阴性对照，细胞裂解试剂作为背景值。各组数据减去裂解液的背景值后，与DMSO组(减去裂解液的背景值)相除，得到诱导倍数。本发明中的部分化合物对ARE基因的诱导活性如表2所示：

表2：

化合物编号	20μM时ARE诱导倍数
		1	6.80±2.04
2	3.30±1.22
		3	3.36±0.22
4	2.68±0.79
		5	2.88±0.40
6	4.48±0.39
		7	4.26±0.48
tBHQ	1.98±0.29
		SFN	4.35±0.96

荧光素酶报告基因实验表明，本发明中的化合物可较好诱导与激活Nrf2下游基因ARE的活性，且与阳性药tBHQ和富马酸二甲酯比较，活性有所提高。

三、理化性质测试

采用PAMPA人工膜模型测定化合物的膜透过率，透膜率测定中选择普萘洛尔作为透膜性优的代表药物，选择酮洛芬作为透膜性差的代表药物。依据经典的Avdeef-Bucher电位滴定法，在Gemini Profiler instrument(pION)仪器上测试化合物脂水分布系数(LogD，pH＝7.4)、解离常数(pKa)。溶解度(Solubility，pH＝7.4)使用ACD/Labs软件进行预测。本发明部分化合物理化性质如表3所示：

表3：

从表3可看出化合物6及化合物7均具有较好的透膜性和溶解度，这对于化合物进入机体发挥生理活性具有重大意义。

以上细胞毒性评价与活性检测实验结果及理化性质测试结果表明：本发明化合物可显著激活Nrf2信号通路，细胞毒性弱，理化性质也较佳，对于研究与开发新型的Nrf2激活剂具有重大意义。

Claims

1.一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其特征在于：R¹选自羟基、烷基，m选自2，R¹不同；

X选自氧；

M连接在母体结构上，其中M选自：

1)芳基，所述芳基稠合于五元环杂芳基，与母体结构连接在一起的环为芳基环，杂原子为氮，杂原子的数目选自1；

2)杂芳基，所述杂芳基为稠合于芳基的五元环杂芳基，与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，杂芳基的杂原子为硫，杂原子的数目选自1；

3)环烷基；

其选自如下结构：

2.一种根据权利要求1所述的式(I)所示的化合物的制备方法，其中式(I)所示的化合物为化合物(II)，其特征在于

化合物(II-A)与化合物(II-B)在碱性介质作用下，发生缩合反应，R¹、X、M的定义如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述的反应在惰性气体保护下发生，所述惰性气体为氮气或者氩气。

4.根据权利要求3所述的制备方法，所述的惰性气体为氮气。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的反应为微波反应。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述碱性介质选自：吡啶、哌啶、三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、醋酸铵。

7.根据权利要求6所述的制备方法，所述的碱性物质为吡啶、哌啶、醋酸铵。

8.一种药用组合物，其特征在于含有治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或赋形剂。

9.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求8所述的组合物在制备激活Nrf2活性的药物中的用途。

10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求8所述的药物组合物在制备预防及治疗炎症、癌症药物中的用途。