CN107613962B - 血清稳定组合物和用于光触发的材料释放的方法 - Google Patents

Abstract

提供了包括卟啉‑磷脂缀合物的血清稳定的纳米颗粒。还提供了包括纳米颗粒的组合物。纳米颗粒可以包括诸如治疗剂和/或诊断剂(例如成像剂)的货物，并且可以用于基于NIR刺激的货物释放的药物递送方法中。

Description

血清稳定组合物和用于光触发的材料释放的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月2日提交的申请号为62/142,105的美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本公开是根据由美国国立卫生研究院授予的编号为EB017270和OD017898的合同在政府的支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。

技术领域

本公开大体上涉及递送组合物，更具体地涉及卟啉磷脂缀合物组合物。

背景技术

递送药物至靶组织与被递送的药物同等重要。已经研制出几种临床批准的纳米载体，以增强某些药物的生物学分布和功效。然而，这种递送受到生理屏障和释放动力学的阻碍，使得生物学分布和生物利用度几乎不可避免地都未实现最理想状态。另外，纳米载体在生理环境下的稳定性也很重要。目前，最有效的外部触发的从纳米载体释放货物的方法包括当通过直接或间接加热将周围温度升高到高于体温几度时释放其内容物的系统。然而，这种机制不易于触发侧的释放调节，并且热操作窗口较窄而阻止了在生理温度和生理环境下的高载体稳定性。

公开内容

本公开提供了包括卟啉-磷脂(PoP)缀合物的自组装纳米颗粒。包括本文公开的卟啉-磷脂缀合物、胆固醇和其它脂质的纳米囊泡，在本文中也称为卟啉-磷脂脂质体(“PoP-脂质体”)-被配制以提供以下的高效率：1)装载货物、2)在没有近红外(NIR)照射(650-1000nm)的情况下的稳定的血清货物保留、和3)在暴露于近红外照射时受控的货物释放。

一方面，本公开提供了具有双分子层的纳米囊泡，所述双分子层包括卟啉-磷脂缀合物。在一个实施方案中，纳米囊泡的双分子层包括卟啉-磷脂缀合物、磷脂、胆固醇或其类似物。在一个实施方案中，双分子层包括卟啉-磷脂缀合物、磷脂、胆固醇和聚乙二醇-脂质。在一个实施方案中，本公开提供了组合物，其包括纳米囊泡，该纳米囊泡在合适的介质如缓冲液或盐溶液中。在一个实施方案中，本公开提供了纳米囊泡，其中纳米囊泡的双分子层包括卟啉-脂质、磷脂、胆固醇或其类似物，以及任选的聚乙二醇。纳米囊泡可以存在于缓冲液或盐水溶液中，并且纳米囊泡可以包括货物(例如治疗剂、靶向剂或诊断剂或任何其它药剂)。

一方面，本公开提供了用所需的货物装载纳米囊泡的方法和用于以空间和时间控制的方式在体外或体内递送货物的方法。

在本公开中使用以下缩写：

DSPC：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

Dox：阿霉素(多柔比星)

IRT：伊立替康(irinotecan)

PoP：卟啉-磷脂缀合物(本文也称卟啉-磷脂)

Pyro-磷脂缀合物(本文也称为pyro-磷脂)：可以通过溶血磷脂酰胆碱和焦脱镁叶绿酸之间的酯化反应产生的一种卟啉-磷脂缀合物。

PoP-脂质体：卟啉-磷脂(PoP)-掺杂的脂质体(本文也称为纳米囊泡)

PEG2K-脂质：PEG-脂质，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]

DMPC：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱

DOPC：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

DPPC：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

HSPC：L-α-磷脂酰胆碱，氢化的(大豆)

DSPE：1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺

DPPA：1,2-二-十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)

DOTAP：1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)

DSPG：1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋甘油)(钠盐)

附图说明

图1、胆固醇使Dox能够装载进PoP脂质体中。A)Dox与脂质装载摩尔比为1:8的PoP脂质体的Dox主动装载效率。包括5mol％PEG-脂质在内与指定量的胆固醇和Pyro-磷脂以及DSPC一起完成制剂。B)含有或不含有2摩尔％pyro-磷脂的脂质体的Dox主动装载效率。Dox与脂质的装载摩尔比为1:5。数值显示为n＝3的平均值+/-S.D.。C)以摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:PEG-脂质:PoP且1:5的Dox与脂质装载比所形成的Dox-PoP脂质体的冷冻电子显微图像。采用-7至-8微米散焦之间范围的散焦采集图像。箭头指向脂质体内的Dox沉淀物。显示100纳米的比例尺。D)Pyro脂质体的装载效率在药物与脂质装载比为0.2时急剧下降，而无pyro的脂质体的装载效率逐渐降低。

图2、PoP浓度对光触发的Dox释放速率的影响。A)在665nm激光照射期间从掺入不同量的Pyro-磷脂的PoP脂质体的实时Dox释放。没有激光照射时没有可检测的释放出现。B)PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间。C)光诱导的PoP脂质体释放Dox的速率。D)归一化至Pyro-磷脂的量的光诱导的Dox释放速率。数据显示为n＝3的平均值+/-标准偏差(S.D.)。记录37℃下50％牛血清中的所有测量值。

图3、胆固醇和DSPE-PEG-2K减缓了光触发的从PoP脂质体的释放。A)在665nm激光照射期间从含有2摩尔％Pyro-磷脂和不同量胆固醇的PoP脂质体的实时Dox释放。PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间相对于掺入的B)胆固醇或C)DSPE-PEG-2K的函数。记录37℃下50％牛血清中的光触发的释放的测量值。D)以不同量的DSPE-PEG-2K并采用1:5的Dox与脂质摩尔比制成的脂质体中的Dox主动装载效率。所有数据显示为n＝3的平均值±S.D.。

图4、Dox与脂质装载比不影响隐形(stealth)PoP脂质体的光触发的释放速率或体外血清稳定性。采用摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:DSPE-PEG-2K:PoP形成隐形PoP脂质体。A)含有或不含有2摩尔％Pyro-磷脂的脂质体在不同药物与脂质摩尔比下的Dox主动装载效率。B)隐形PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间相对于Dox与脂质摩尔比的函数。C)在50％牛血清中以指定的Dox与脂质摩尔比装载的隐形PoP脂质体在37℃下孵育4小时的血清稳定性。平均值±S.D.，n＝3。

图5、装载有Dox的隐形PoP脂质体的储存稳定性。脂质体储存在4℃下。A)Dox保留；B)脂质体尺寸；和C)脂质体多分散性。D)37℃下在50％牛血清中孵育6小时后，所装载的Dox的体外血清稳定性。E)37℃下在50％牛血清中释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间。数据显示为n＝3份不同批次制备的脂质体的平均值±S.D.。

图6、装载在隐形PoP脂质体中的Dox的长效血液循环。装载在指定的脂质体中并通过静脉施用于CD-1小鼠的Dox血清浓度。数值显示为每组n＝4-5只小鼠的平均值±S.D.。

图7、在对侧Mia Paca-2双侧肿瘤模型中激光诱导的从隐形PoP脂质体的Dox沉积增强。静脉注射装载有Dox的隐形PoP脂质体后1小时，用665nm激光仅照射小鼠一侧胁腹上的肿瘤。照射后立即处死小鼠，并测定经过处理和未经处理的肿瘤中的Dox浓度。A)5mg/kg或10mg/kgDox的注射剂量对隐形PoP脂质体的影响。用665nm的照射以350mW/cm²处理肿瘤30分钟。B)15或30分钟的不同照射时间的影响。以装载有10mg/kg Dox的隐形PoP脂质体注射小鼠，并用665nm的照射以350mW/cm²处理肿瘤。在肿瘤Dox摄取方面，15和30分钟照射时间之间没有显著差异。通过Bonferroni后检验、双因素方差分析进行统计学分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每组n＝4个肿瘤的平均值±S.D.。

图8、施用隐形PoP脂质体并进行光处理期间的肿瘤表面温度和血液流量。A)以指定的Dox剂量静脉内施用PoP脂质体后1小时，在以指示的功率的665nm激光二极管处理期间MIA Paca-2异种移植物的表面温度。B)由激光处理本身引起的肿瘤血液流量的相对变化。如图所示，以指示的注量率开启激光。C，D)在指示的激光注量率下，静脉内施用隐形PoP脂质体后1小时，小鼠肿瘤血液流量的相对变化相对于时间(C)或累积注量(D)的函数。数值表示为每组n＝3-4只小鼠的平均值和S.D.(血液流动数据是在单一竖直方向上)。

图9、施用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理的功效。当肿瘤直径达到4-5mm时，对MIA Paca-2肿瘤荷瘤裸鼠进行处理，当肿瘤体积增加至10倍时处死裸鼠。激光处理包括施用300J/cm²的665nm的光照(在16.7分钟内300mW/cm²)。A)施用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行激光处理的协同功效。以7mg/kgDox施用隐形PoP脂质体或者给对照组施用等效剂量的。B)光处理下装载有Dox的隐形PoP脂质体的剂量反应。被检测的3、5、7mg/kg剂量比未经处理的对照组显著更加有效(P<0.05)。C)施用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理的小鼠的体重。D)施用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理比常规抗肿瘤治疗(包括最大耐受剂量(MTD)的SSL Dox和最大耐受剂量(MTD)的游离Dox)或采用HPPH进行相同的光处理(连同等效剂量的光敏剂)的常规PDT显著更加有效(P<0.05)。E)各指示出的处理组的肿瘤体积增长。每组n＝5-6只小鼠的平均值±S.E.。

图10、空PoP脂质体的结构。采用摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:PEG-脂质:PoP形成的Dox-PoP脂质体的冷冻电子显微照片。比例尺表示100nm。

图11、Pyro-磷脂能够实现良好的血清稳定性和快速的光触发的药物释放，而HPPH-脂质不能。由含有2％HPPH-脂质和35％胆固醇、2％HPPH-脂质和40％胆固醇、或者2％Pyro-磷脂和40％胆固醇的脂质体制成的PoP脂质体释放Dox的代表性实时图。将所有脂质体在50％成熟牛血清中孵育1小时，并在1小时开始激光照射。所有脂质体均含有5mol％的DSPE-PEG-2K，并以摩尔比为1:5的药物与脂质进行装载。

图12、2％HPPH-脂质对于快速释放所装载的Dox是最佳的。所有制剂均采用35mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG-2K(1:8的药物与脂质比)。A)在激光照射时，含有可变量的HPPH并装载有阿霉素的HPPH脂质体的释放曲线。B)含有可变量的HPPH-脂质的HPPH脂质体达到释放50％阿霉素所需的时间。平均值±S.D.，n＝3。

图13、采用装载有Dox的隐形PoP脂质体进行的NIR光触发的血清中快速释放。A)NIR激光诱导的新型(2％Pyro-磷脂)PoP脂质体制剂的释放速率和先前报道的(10％HPPH-脂质)的PoP脂质体制剂的释放速率的比较。B)先前报道的PoP脂质制剂(10％HPPH脂质)和隐形PoP脂质体制剂(2％Pyro-磷脂)达到释放50％Dox所需的时间。先前的制剂采用10％HPPH-脂质、35％胆固醇以及1:8的药物与脂质装载比，而隐形PoP脂质体制剂由2％Pyro-磷脂、40％胆固醇、1:5的药物与脂质装载比组成。平均值±S.D.，n＝3。

图14、5％PEG-脂质保持快速释放速率和高装载效率。37℃下在50％经滤过的成熟牛血清中含有3％、5％和8％PEG-脂质的2％Pyro-磷脂、45％胆固醇的脂质体释放50％所需的时间(A)；由0％、1％、3％、5％和8％PEG-脂质、45％胆固醇(B)制成的脂质体的装载效率。平均值±S.D.，n＝3。

图15、包括DSPC、DPPC、HSPC和DOPC的各种磷脂酰胆碱(PC)脂质可用于Pyro脂质体释放，同时保持血清稳定性。在PBS中测试由53摩尔％DSPC、DPPC、HSPC和DOPC制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由53摩尔％的DSPC、DPPC、HSPC和DOPC制成的Pyro脂质体的Zeta电位(ζ电位)(B)；由53摩尔％的DSPC、DPPC、HSPC或DOPC制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。所有制剂均由53摩尔％的DSPC、DPPC或HSPC或DOPC、5摩尔％PEG2k，40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。

图16、阳离子脂质DOTAP和磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)脂质也可用于Pyro脂质体而用于光触发释放。在PBS中测试由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。含有DSPE或DPPA的脂质体由53摩尔DSPE或DPPA、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。含有阳离子脂质DOTAP的脂质体由43摩尔％DSPC、20摩尔％DOTAP、35摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂制成。

图17、PC、磷脂酰甘油(PG)、PA和PE脂质可用于Pyro脂质体进行光触发释放。在PBS中测试由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的装载有伊立替康(IRT)的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。所有制剂均由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的伊立替康与脂质的装载比制成。

图18、胆固醇、胆甾烷醇、谷甾醇和豆甾醇可用于形成Pyro脂质体。在PBS中测试由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。所有制剂均由53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇、胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。

图19、阿霉素、伊立替康和柔红霉素可以被主动装载到Pyro脂质体中，并且在激光照射下被释放出来。在PBS中测试装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试装载有阿霉素、伊立替康和柔红霉素的Pyro脂质体的Zeta电位(B)；装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4h的稳定性(D)。装载有Dox的Pyro脂质体的制剂是53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比。装载有伊立替康的Pyro脂质体的制剂为50摩尔％鞘磷脂、45摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂。装载有柔红霉素的Pyro脂质体的制剂是43摩尔％DSPC、5摩尔％的PEG2k、50摩尔％胆固醇和2％Pyro-磷脂。所有药物与脂质的摩尔装载比为1:8。

图20、可以使用具有可变长度的酰基链的Pyro脂质来形成pyro脂质体。在PBS中测试由具有长度为14、16或18碳的链的Pyro脂质制成的装载有伊立替康(IRT)的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试了由具有不同长度14、16或18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)；(C)由具有长度为14、16或18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放。(D)由具有长度为16和18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体(Dox与脂质的装载比为1:8)在50％经滤过的成熟牛血清中的光触发释放。所有制剂均由53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的伊立替康或阿霉素与脂质的摩尔装载比制成。

图21、在含有少量DOPC和PoP的脂质体中光触发的快速Dox释放。(A)37℃下在50％牛血清中以310mW/cm²进行照射，Dox从含有不同量的DOPC的PoP脂质体(0.3mol％PoP)中的释放。(B)含有不同量的DOPC的PoP脂质体(0.3mol％PoP)达到释放50％Dox所需的时间。(C)37℃下在50％牛血清中孵育4h(h＝小时)后血清诱导的Dox释放。(D)37℃下在50％牛血清中进行激光照射(310mW/cm²)，含有不同量PoP(0.05-1mol％)的PoP脂质体的Dox释放。(E)含有不同量的PoP的PoP脂质体在60s时所释放出的Dox量。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图22、增强的光触发释放是与单线态氧相关的。(A)在对PBS中的PoP脂质体进行照射(310mW/cm²)期间单线态氧的产生，其中PBS含有5mM抗坏血酸钠或25mM亚硫酸钠。单线态氧按SOSG相对荧光单位(RFU)记录。(B)室温下在含有5mM抗坏血酸钠的PBS中抑制了照射(250mW/cm³，持续3min(min＝分钟))触发的Dox释放。(C)室温下在含有25mM亚硫酸钠的PBS中抑制了照射(310mW/cm³，持续3分钟(min＝分钟))触发的Dox释放。(D)37℃下对在50％牛血清中的含有18:1(顺式)PC、18:2(顺式)PC或18:0-18:2PC的PoP脂质体(0.1％PoP、5mol％不饱和脂质、40mol％胆固醇和54.9mol％DSPC含有)进行照射(310mW/cm²)时的Dox释放曲线。(E)PoP脂质体(0.1％Pyro-磷脂，5mol％不饱和脂质，40mol％胆固醇和54.9mol％DSPC)达到释放50％Dox所需要的时间。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图23、对PoP脂质体进行光照射导致DOPC的氧化。(A)以310mW/cm²照射4分钟之前和之后，PoP脂质体中的DOPC含量。(B)照射后产生的新型脂质种类(m/z：850.5806)。(C)当以310mW/cm²照射时，DOPC的氧化动力学(与未经照射样品相比，存在的DOPC％)。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。(D)DOPC的结构和氧化态DOPC产物的可能结构(精确质量850.5804，与检测到的具有m/z：850.5806的氧化态物质相匹配)。(E)通过单线态氧导致Dox释放的PoP脂质体中DOPC氧化的示意图。

图24、抗坏血酸盐抑制光触发的脂质氧化。在存在或不存在5mM抗坏血酸钠的情况下，用665nm激光二极管以310mW/cm²对PoP脂质体照射4分钟。没有抗坏血酸钠并且无激光处理的信号被归一化为100％。(A)抗坏血酸钠抑制了由光处理引起的DOPC氧化。抗坏血酸钠抑制了照射时DOPC相关(B)的氧化态物质和胆固醇相关(C)的氧化态物质的产生。数据表示为平均值±S.D.，n＝3-6。

图25、含有DOPC的PoP脂质体在NIR照射时的瞬时透化。(A)在PBS中测量的进行或不进行激光照射(250mW/cm³，持续3分钟)的PoP脂质体的尺寸。(B)在PBS中测量的进行或不进行激光照射(250mW/cm³，持续3分钟)的PoP脂质体的多分散性指数(PDI)。PDI略有增加但不显著(单尾t检验)。(C)经过照射(250mW/cm²，持续3分钟)，钙黄绿素加入前或加入后钙黄绿素的被动装载(表示为钙绿素/PoP排放比(emission ratio))。(D)将钙黄绿素被动装载至经过预照射的空PoP脂质体(250mW/cm³，持续3分钟)。在照射后所指示的时间加入钙黄绿素，并在室温下孵育。(E)将钙黄绿素被动装载进经过预照射(250mW/cm³，持续3分钟)的空PoP脂质体中。在照射后立即将钙黄绿素加入到空PoP脂质体中，并在室温下孵育不同时间。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图26、对装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体进行体内评价。(A)静脉注射含DOPC的Dox-PoP脂质体(10mg/kg Dox)后，Dox在血清中的药代动力学。数据显示平均值±S.D.，n＝4。(B)静脉内施用Dox-PoP脂质体(6mg/kg Dox)并进行或不进行激光照射(250mW/cm²持续40分钟)的光处理后即刻的Dox肿瘤摄取。采用双侧肿瘤模型，其中对一侧胁腹上的肿瘤进行照射，另一侧胁腹上未经照射的肿瘤作为无激光的对照。根据非配对的t检验，经过照射的肿瘤具有统计学意义上更多的Dox摄取(***P<0.001)。数据表示为平均值±S.D.，n＝4。(C)Mia Paca-2异种移植物荷瘤裸鼠的Kaplan-Merier存活曲线。对小鼠静脉内施用Dox-PoP脂质体(6mg/kg Dox，0.25mg/kg PoP)、空PoP脂质体(0.25mg/kg PoP)或盐水。注射后10分钟，按照所指示的对小鼠进行光照射(250mW/cm²，持续40分钟，600J/cm²)。当肿瘤达到初始体积的10倍时，处死小鼠。(D)Mia Paca-2异种移植物荷瘤裸鼠的肿瘤体积。对小鼠静脉内注射Dox剂量为2、4或6mg/kg的Dox-PoP脂质体或盐水。注射后10分钟，以250mW/cm²照射肿瘤40分钟。数据表示为平均值±S.D.，n＝5-6。

图27、DOPC有助于PoP脂质体装载Dox。DOPC有助于将Dox装载到不含PEG-脂质的PoP脂质体(2mol％PoP)中。数据表示为平均值±S.D.，n＝2-3。

图28、PEG-脂质阻止含有DOPC的PoP脂质体的光触发释放速率。(A)含有或不含有PEG的PoP脂质体(0.1mol％PoP)光触发的Dox释放曲线。(B)含有或不含有PEG-脂质的PoP脂质体(0.1mol％PoP)达到释放50％Dox所需的时间。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图29、Dox释放所需的总能量取决于施加的注量率。(A)在50％牛血清中以各种注量率进行照射的Dox释放。(B)达到释放90％Dox所需的时间相对于注量率的函数。(C)达到释放90％Dox所需的总注量相对于注量率的函数。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图30、DOPC的顺式构型是增强光释放所需要的。(A)37℃下，在50％牛血清中的PoP脂质体(0.3mol％PoP、5mol％18:1(反式)PC、18:1(顺式)PC)在照射(310mW/cm²)期间的Dox释放曲线。(B)含有18:1(反式)PC或18:1(顺式)PC的PoP脂质体(0.3mol％PoP)达到释放50％Dox所需的时间。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图31、照射时新物质的产生。(A)在照射(310mW/cm²)过程中随时间产生与DOPC相关的氧化态物质。将最高信号(经过4分钟照射)归一化为100％。(B)在照射(310mW/cm²)过程中随时间产生与胆固醇相关的氧化态物质。将最高信号(经过4分钟照射)归一化为100％。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图32、胆固醇的氧化导致货物从无DOPC的PoP脂质体中释放出来。(A)两种脂质体分别含有5mol％PEG-脂质、5mol％PoP、0％胆固醇和90mol％DSPC或5mol％PEG-脂质、5mol％PoP、40％胆固醇和50mol％DSPC。室温下，在PBS中以250mW/cm²对装载有磺酰罗丹明(SRB)的PoP脂质体进行光触发的释放。(B)亚硫酸盐对透化的抑制作用。脂质体含有5mol％PEG-脂质、5mol％PoP、40％胆固醇和50mol％DSPC。室温下，以250mW/cm²在PBS或含有25mM亚硫酸钠的PBS中进行光触发的释放。

图33、经过预照射的PoP脂质体的无效Dox装载。在250mM硫酸铵溶液中，以310mW/cm²对经过预照射的空PoP脂质体(2mg/ml脂质)照射4分钟。将经过预照射的PoP脂质体在室温下保持30分钟，然后进行透析以除去游离的硫酸铵。以1:8的药物与脂质装载比进行Dox装载。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。

图34、装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体的物理表征和稳定性。(A)装载有Dox的脂质体的负染TEM图像。示出了200nm比例尺。(B)在PBS中测试的装载有Dox的脂质体的尺寸分布。(C)在4℃下储存3个月的PoP脂质体(0.3mol％PoP)中的Dox％保留量。(D)在PBS中测试的装载有Dox的PoP脂质体在3个月内的尺寸。(E)在PBS中测试的装载有Dox的PoP脂质体在3个月内的多分散性指数(PDI)。数据表示为平均值±S.D.，3份不同批次制备的脂质体。

图35、光处理后的体内参数。(A)激光处理后即刻的装载有Dox的PoP脂质体的生物学分布。图6A中(B)和图6B中(C)小鼠在四周内的体重。数据表示为平均值±S.D.，n＝5-6。

图36、多颜色多通道PoP脂质体的研制。a)pyro-PoP和红紫素-PoP的结构。b)所指示的PoP脂质体在水中的吸收光谱。示出了实验室激光激发的波长。c)在665或695nm激光下，pyro-PoP或红紫素-PoP的Dox释放。

图37、a)将不同量的Pyro-磷脂到脂质体中增加了被动装载的货物(亲水性染料SRB)的释放。b)归一化到所存在的pyro-磷脂的量的释放速率。

图38、PoP脂质体(2摩尔％PoP)同时装载有Gd-DTPA、SRB和奥沙利铂。去除游离货物并将脂质体瘤内注射到B16F10黑素瘤荷瘤小鼠中。利用SRB荧光1)引导注射并2)显示在肿瘤内分布以及3)监测释放。Gd-DTPA旨在用于MR对比，并且奥沙利铂具有治疗作用。a)由665nm激光照射触发的Gd、PT和SRB的释放相对于时间的函数。b)在没有NIR光的情况下SRB的释放。c)注射前的小鼠、注射后即刻的小鼠、注射后1小时的小鼠和激光处理后1小时的小鼠的图像。

图39、药物装载和释放。A)将Pyro-磷脂PoP滴定到由DSPC:DSPE-PEG2000:Chol(60:5:35摩尔比)组成的脂质体中来代替DSPC，以比较pyro-磷脂含量对Dox和IRT装载的影响。B)在665nm激光照射下由2％pyro-磷脂组成的脂质体释放的Dox和IRT。

图40、药物对脂质体形态的影响。由DSPC:DSPE-PEG2000:Pyro-磷脂:Chol(58:5:2:35)组成的分别装载有IRT(A)和Dox(B)的PoP-脂质体的冷冻TEM(Cryo-TEM)图像。

具体实施方式

在本公开中，提供了具有高装载效率的血清稳定的光控释放的卟啉-磷脂纳米囊泡(PoP-脂质体)。货物从PoP-脂质体的释放可以通过近红外(NIR)光直接触发，近红外光是临床适用的刺激，具有在“关闭状态”下可忽略不计的作用和对周围生物组织最小的干扰。

本公开是基于通过在纳米囊泡的制剂中包括胆固醇而可以使这些囊泡的装载效率得以提高并使血清稳定性得以改善的令人惊讶且意想不到的观察结果。本公开的纳米囊泡包括卟啉-脂质、磷脂、胆固醇和任选的PEG-脂质。本公开的纳米囊泡表现出货物的稳定装载、高装载效率、血清稳定性和控制释放。

在具体的实施方案中，本公开的PoP-脂质体的双分子层包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：卟啉缀合物、磷脂、胆固醇和任选的PEG-脂质。在一个实施方案中，本公开的PoP脂质体的双分子层包括卟啉缀合物和脂质，其中仅有的脂质-无论是否缀合至卟或作为额外的脂质存在-是磷脂和固醇。

一方面，本公开提供了包括卟啉-磷脂和胆固醇以及其它脂质组分的脂质体制剂，该脂质体制剂能够1)响应于对近红外(NIR)光的暴露而快速释放内容物；2)主动将药物装载进脂质体；3)在没有暴露于激光的情况下，在血清中稳定(例如持续6小时药物泄漏小于20％)。本公开制剂的特征在于，它最大限度地减少了装载有货物的PoP脂质体(货物-PoP-脂质体)中的PoP量，同时保持血清稳定性和快速释放的性能。这是有利的，因为增加光敏组分的量会对患者具有潜在的副作用(例如阳光敏感性)。

在一个方面，本公开提供纳米囊泡和包括纳米囊泡的组合物。纳米囊泡的双分子层包括卟啉缀合物。构成纳米囊泡的部分或全部双分子层的卟啉缀合物包括卟啉、卟啉衍生物、卟啉类似物或其组合。示例性的卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素A、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、维尔丁(verdins)、罗丁(rhodins)、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、托尼卟啉和苯并细菌二氢卟酚。示例性的卟啉类似物包括扩展的卟啉家族成员(例如得克萨卟啉(texaphyrins)、sapphyrins和六卟啉(hexaphyrins))和卟啉异构体(例如类卟吩(porphycenes)、错位卟啉(inverted porphyrins)、酞菁和萘酞菁)。

在某些实施方案中，卟啉缀合物包括螯合在其中的金属，优选地二价金属如Zn、Cu、Ni、Co、Pd或Mn，以及任选地金属的放射性同位素，如Cu-64。

如本文所用，“磷脂”是具有亲水性头基的脂质，亲水性头基具有通过甘油主链连接至疏水脂质尾部的磷酸基团。磷脂包括6-22个碳原子(包括其间的所有整数个碳原子和之间的范围)的酰基侧链。在某些实施方案中，卟啉缀合物中的磷脂是1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。卟啉缀合物中的磷脂可以包括以下、或基本上由以下组成：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanoloamine)、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇组成。

在某些实施方案中，自组装的纳米囊泡的双分子层还包括PEG-脂质。PEG-脂质可以是DSPE-PEG，例如DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000或其它尺寸的DSPE-PEG。PEG-脂质以0.5至8mol％(包括其间至小数点后第十位的所有百分比的量)的量存在。在一个实施方案中，PEG-脂质以4-6mol％存在。在一个实施方案中，PEG-脂质以约5％(4.8至5.2mol％)存在。PEG部分的平均分子量可以在500至5000道尔顿以及其间的所有整数值和之间的范围。在一个实施方案中，PEG部分的分子量为2000道尔顿。

在多种实施方案中，除了本文公开的卟啉缀合物之外，纳米囊泡的双分子层还包括其它极性脂质。本公开组合物的磷脂的脂肪酸链可含有合适数目的碳原子以形成双分子层。例如，脂肪酸链可以含有12、14、16、18、20或22个碳原子。在不同的实施方案中，双分子层可以包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanoloamine)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或阳离子脂质。合适的脂质的示例包括但不限于，DSPC、DPPC、DMPC、HSPC、DSPG、DPPA、DSPE、DOTAP、鞘磷脂等。

本公开的纳米囊泡的双分子层还包括固醇。固醇可以是动物固醇或植物固醇。固醇的示例包括胆固醇、谷甾醇、豆甾醇和胆甾烷醇。例如，胆固醇可以大于30mol％。在一个实施方案中，胆固醇为35至50mol％以及其间所有的整数。在一个实施方案中，胆固醇为约45％(43-47mol％)。在一个实施方案中，胆固醇为40、41、42、43、44或45mol％。使用本公开的PoP-脂质体单体使得能够有效地将货物装载到纳米泡囊中，并且使用温和的NIR导致货物的快速且高达100％的释放。

本公开提供了包括具有以下结构的卟啉-磷脂缀合物的组合物：

在一个实施方案中，本公开的纳米囊泡的卟啉-磷脂缀合物化合物的摩尔百分比为0.1至5。在一个实施方案中，PoP-脂质体双分子层由0.5至8mol％组成。在一个实施方案中，PoP-脂质体双分子层包括1、2、3、4、5、6、7或8mol％。在一个实施方案中，PoP-脂质体包括在0.1至8.0之间的所有至小数点后第十位的摩尔百分数。

在一个实施方案中，本公开的组合物包括纳米囊泡，其中纳米囊泡包含双分子层，其中双分子层包括45至61.5mol％的磷脂、0.5至8％的卟啉缀合物、35至45％的固醇，以及任选地1至6mol％PEG-脂质。在一个实施方案中，以所需量加入卟啉缀合物、固醇以及任选地PEG-脂质PEG，然后其余部分由磷脂组成。在一个实施方案中，双分子层包括0.5至8％的pyro-磷脂、35至45％的胆固醇，以及任选地，1至6mol％的PEG-脂质，其余部分由磷脂(例如DSPC)组成。

本公开的纳米囊泡可以具有0.1至5mol％的pyro-磷脂、30至50％的固醇，任选地PEG-脂质，和其余的磷脂(其不是pyro-磷脂)。例如，纳米囊泡可具有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mol％pyro-磷脂、30-50mol％胆固醇，任选地，1-6mol％PEG-脂质和其余的磷脂。磷脂可以是任何磷脂。例如，磷脂可以是DSPC。磷脂可以是DOPC和DSPC。在一个示例中，DSPC和DOPC都存在，并且DOPC以1至10mol％存在。例如，纳米囊泡可以具有0.1至5mol％的pyro-磷脂、30至50％的胆固醇，任选地1-6mol％的PEG-脂质、0.1至10mol％的DOPC和其余的DSPC。部分的DSPC可以被其它磷脂(例如饱和的、不饱和的、或部分不饱和的磷脂)或脂质(例如鞘磷脂)替代。当用NIR光照射制剂时，发现制剂展现出所需的货物释放(例如，用350mW/cm²激光照射2分钟后释放90％或更多)。为了在生理温度下实现血清稳定性的提高，DOPC可以小于7mol％。例如，DOPC可以为0.1至6.5mol％，例如0.1至6.0mol％，或0.1至5mol％。

磷脂(即，未与卟啉缀合的游离磷脂)可以具有两个饱和的烷基链(例如，饱和磷脂诸如，例如，DSPC)或两个不饱和的烷基链(例如，不饱和磷脂诸如，例如DOPC和DLPC)或一个饱和的烷基链和一个不饱和的烷基链(例如，部分不饱和磷脂)。不饱和磷脂可以具有至少一个或全部顺式碳-碳双键。磷脂可以是饱和磷脂、不饱和磷脂和/或部分不饱和磷脂的混合物。不饱和磷脂可以占纳米囊泡的0.1mol％至10mol％。例如，不饱和磷脂可以占纳米囊泡的0.1mol％至6.5mol％。在一个示例中，纳米囊泡包括占x mol％的不饱和磷脂，占y-xmol％的饱和磷脂(其中y＝45至61mol％，诸如，例如59至60mol％以及其间至小数点第十位的所有数值)，占30至50mol％的固醇，和占0.1至5mol％(诸如，例如，0.1至1.0mol％)的卟啉缀合物。在一个示例中，纳米囊泡包含占x mol％的DOPC，占y-x mol％的DSPC(其中y＝45至61mol％，诸如，例如，45至60、59至61或59至60mol％，以及其间至小数点第十位的所有数值)，占30至50mol％的胆固醇，和占0.1至5mol％的pyro-磷酯(诸如，例如，0.1至1.0mol％)。例如，纳米囊泡可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：0.1至1.0mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、0.1至5mol％的DOPC、其余的为DSPC。

在货物(例如药物)装载之前，纳米泡囊基本上是球形的。在货物(例如药物)装载之后，纳米泡囊可以是非球形的。纳米囊泡(装载的或未装载的)可以具有直径为50nm至250nm(以及其间nm级别的所有整数和之间的范围)的尺寸(例如，最长尺寸)。在一个实施方案中，纳米囊泡的尺寸为75-175nm。在一个实施方案中，组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的纳米囊泡具有50至250nm、75至175nm、或80-100nm的尺寸。在一个实施方案中，在PBS中进行观察这些尺寸。

组合物可以包括载体中的一个或多个纳米囊泡。例如，组合物还包括载体。载体可以是适合用于施用给包括人的个体的水性载体。载体可以是无菌的。载体可以是生理缓冲液。合适的载体的示例包括蔗糖、葡萄糖、生理盐水和/或pH缓冲因子(例如缓冲至例如pH5-9、pH 6至8，(诸如6.5)的pH的缓冲因子)，例如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。

一方面，本公开提供了组合物，其包括本公开的纳米囊泡和用于施用给包括人的个体的合适的无菌载体-例如生理缓冲剂如蔗糖、葡萄糖、生理盐水、pH缓冲(例如pH 5至9，pH7至8，pH 7.2至7.6(例如7.4))因子，例如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。在一个实施方案中，组合物包括至少0.1％(w/v)的本公开的PoP-脂质体。在多个实施方案中，组合物包括0.1至100％的PoP-脂质体。部分的药物分子(货物)可以嵌入双分子层中。

一方面，可以将本公开的PoP脂质体提供在基于血清的介质或载体中。因此，例如，PoP脂质体可存在于经过稀释的、经过浓缩的或未经稀释的血清中。

PoP脂质体制剂可以在生理温度(例如37℃)下在缓冲液(包括生理缓冲液或含血清的介质)中孵育4至24小时的时间段，而不释放其中大部分的货物。在多个示例中，PoP脂质体制剂可以在生理缓冲液或含血清的介质中在生理温度(例如37℃)下孵育4至24小时的时间段，而不会释放60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多其中的货物。

纳米泡囊在经过稀释的(例如，50重量％的血清和50重量％的水性缓冲液)或未稀释的血清中是稳定的。在多个示例中，在生理温度(例如37℃)下保存6小时至24小时后，纳米泡囊释放20％或更少、15％或更少、或者10％或更少的其中的货物。

可以将各种各样的货物装载到本公开的纳米囊泡中，并利用近红外光将其递送到所需的位置。例如，生物活性或治疗剂、诊断剂、靶向剂、药用物质和/或药物可以被封装在PoP-脂质体内部。这包括水溶性药物以及可以通过化学梯度而被装载并浓缩在纳米囊泡的水性核心中的弱酸或弱碱的药物。因此，在多个实施方案中，纳米囊泡包括封装在其中的活性剂，例如治疗剂或诊断剂，所述活性剂可以是化疗剂如阿霉素。在一个实施方案中，化学治疗剂阿霉素和/或伊立替康可以被主动装载并通过NIR照射并释放出来，从而利用PoP纳米囊泡提供强效且直接的光触发的释放。

货物可以是被动装载的，并且可以是，包括但不限于，亲水性成像和治疗性化合物例如钆螯合物、例如Gd-DTPA，荧光成像染料如ICG、SRB或荧光素，以及被动装载的药物例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、甲氨蝶呤、磷酸泼尼松龙、庆大霉素或治疗性蛋白质和治疗性核酸。货物可以是主动装载的货物，如弱两亲性药物，其中弱碱性部分或弱酸性部分在脂质体内形成沉淀物，并且包括但不限于布比卡因、表阿霉素(表柔比星)、柔红霉素、长春花碱、氢吗啡酮、长春新碱、丝裂霉素C、多巴胺、血清素、肾上腺素、可待因、哌替啶、美沙酮、吗啡、阿托品、丙咪嗪、阿米替林、多塞平、地昔帕明、奎尼丁、吖啶橙。

在一个实施方案中，脂质与药物(或任何其它货物药剂)的比例为10:1至5:1(以摩尔为单位)。在多个实施方案中，脂质与药物/货物的比例为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1或5:1。在一个实施方案中，用于这些测定的脂质值考虑了所有脂质-包括与卟啉缀合的脂质、另外的磷脂、固醇和与PEG(如果存在)缀合的脂质。

术语“治疗剂”是指作为生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。也称为“药物”的治疗剂的示例在公知的文献参考例如Merck Index，Physicians DeskReference和Pharmacological Basis of Therapeutics中有所描述，并且它们包括但不限于：药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或感染(illness)的物质；影响机体结构或功能的物质；或前药，它们在被放置于生理环境中后变得具有生物活性或更有活性。可以使用各种形式的治疗剂，它们能够在施用于受试者时从目标组合物被释放到相邻组织或液体中。已知通过主动梯度被装载的药物包括阿霉素、伊立替康、吉西他滨、表阿霉素、拓扑替康、长春新碱、米托蒽醌、环丙沙星、顺铂和柔红霉素。这些药物可以被装载到PoP脂质体中并从PoP脂质体中释放出来。治疗性货物还包括各种抗生素(如庆大霉素)或其它有效抵抗由细菌、真菌、寄生虫或其它生物引起的感染的药剂、抗炎剂或抗病毒剂。

“诊断”或“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如，诊断剂包括成像剂，例如含有放射性同位素诸如铟或锝的成像剂；含有碘或钆螯合物的造影剂。

在某些实施方案中，纳米囊泡还包括靶向分子，例如抗体、肽、适配体或叶酸。“靶向分子”是可以将纳米囊泡导向特定靶标的任何分子，例如通过结合至被靶向细胞表面上的受体或其它分子。靶向分子可以是蛋白质、肽、核酸分子、糖或多糖、受体配体或其它小分子。通过选择靶向分子可以调节特异性程度。例如，抗体通常表现出高特异性。这些可以是多克隆、单克隆、片段、重组体或单链，其中许多是可商购获得的或使用标准技术容易地获得的。

一方面，本公开提供了制备纳米囊泡的方法，其包括在缓冲液中混合卟啉-磷脂缀合物，其中卟啉-磷脂缀合物如本文所述，并且挤出混合物以产生包括所需量的卟啉-磷脂缀合物的双分子层的卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡。除了卟啉-磷脂(例如2mol％)之外，混合物中还可以包括其它磷脂或脂质以制备PoP-脂质体。例如，在一个实施方案中，可以使用DSPE-PEG-2K(例如，5mol％)；胆固醇(例如，40mol％)和脂质(例如，DSPC 53mol％)。卟啉-磷脂缀合物可以通过将含羧酸的四吡咯酯化成溶血磷脂来制备。例如，Pyro-磷脂可以在室温下利用EDC和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Fisher#AC14827-0250)与1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(溶血-C16-PC，Avanti#855675P)在氯仿中以摩尔比为1:1:2:2的溶血C16-PC:Pyro:EDC:DMAP酯化。

在一个实施方案中，PoP-脂质体通过卟啉-脂质、胆固醇和其它脂质以及任选地PEG-脂质组分的分散体形成。例如，在一个实施方案中，Pyro-磷脂脂质体可以通过将DSPC、DSPE-PEG2K、Pyro-磷脂和胆固醇溶解在溶剂中并加热(例如到60至70℃)来制备。然后可以将缓冲的硫酸铵或柠檬酸钠加入到反应混合物中同时保持温度。形成脂质体时，可以将脂质体在高压下(例如利用依次层叠的聚碳酸酯膜)挤出以获得所需尺寸的脂质体。可以除去(如通过透析)残留的原料，例如硫酸铵或柠檬酸钠。将货物装载进纳米囊泡可以通过加入所需比例的货物然后孵育来进行。如果需要，可以通过光散射技术测定脂质体尺寸和Zeta电位。通过使脂质体溶液流过柱子可以确定装载效率，并定量药物在含有脂质体的洗脱液(fraction)中的百分比。利用荧光光谱法可以测量药物的量。通过利用激光二极管可以实现光触发的释放。如果需要，通过测量暴露于激光之前和之后的释放可以评估货物释放。

一方面，本公开提供了将作为货物含有在纳米囊泡中的药剂递送到所需位置的方法。虽然在本公开中货物有时被描述为药物，但是该描述同样适用于用于治疗和/或递送到所需位置所含有的任何药剂，术语“药物”旨在表示任何药剂。所述试剂的整体或部分可以含有在PoP-脂质体内或PoP-脂质体中，无论是存在于水性隔室、双分子层或二者中。因此，另一方面，本公开提供了用于递送纳米囊泡的货物的方法，包括以下步骤：1)提供包括本公开纳米囊泡的组合物，该纳米囊泡包括货物(例如活性剂)；2)使纳米囊泡到达选定的或所需的目的地；3)在使得至少一部分货物从纳米囊泡中释放出来的条件下，用具有近红外波长的照射对纳米囊泡进行照射。

可以在体外或体内进行本公开的方法。当在体内进行该方法时，在一个实施方案中，采用近红外照射的照射使得周围组织的温度升高不超过10℃。在多个实施方案中，周围组织的温度升高不超过5、6、7、8、9和10、11和12℃。在其它实施方案中，周围组织的温度升高小于5℃。本公开的方法可以用于包括动物和人的任何年龄的任何个体。

利用功率为5至1000mW/cm²(包括其间mW/cm²级别的所有整数数值和之间的范围)的激光在650至1000nm(包括其间nm级别的所有整数数值和之间的范围)的波长的近红外光照射纳米囊泡。在一个示例中，功率为10至350mW/cm²。例如，激光的功率可以是250-350mW/cm²，激光的波长可以是650至800nm、或655至675、或660到670nm，包括其间nm级别的所有整数数值和之间的所有范围。

货物的释放取决于激光功率。在一个实施方案中，在生理温度(约37℃)下，在生理缓冲液或基于血清的培养基中的本公开的制剂在没有光触发的情况下表现出不可检测到的货物释放。然而，当来自300mW/cm²激光在660-670nm波长的光照射在纳米囊泡上时，观察到立即释放出货物。在37℃下，在基于血清的培养基中暴露于约665nm波长的300mW/cm²的激光的5分钟之内，至少90％、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的货物可以从PoP脂质体中释放出来。这种释放可以在1、2、3或4分钟内观察到。如果使用具有较高功率的激光，则可以更快地实现货物的释放。然而，300mW/cm²可以认为是临床可接受的。

货物的释放程度也取决于暴露时间。一般来说，长达30分钟或更短的时间就足够了。可以在体外或体内对纳米囊泡照射0.5至30分钟和其间至小数点后第十位的所有数值。例如，可以用665nm激光二极管照射纳米囊泡长达10分钟。通过改变激光功率和/或激光时间，实现对从纳米囊泡中释放出多少药物的控制。此外，控制照射以实现可以导致更低的全身药物释放并且不会损害具有广泛脉管系统的器官(例如胰腺)中的重要血管的“仅小血管”的光释放策略。通过在所需区域上照射激光可以将红外照射直接递送到该区域，或者可以利用光纤探针。在肿瘤的情况下，可以将光纤探针插入肿瘤(即，通过导管或内窥镜装置)以向局部区域提供照射。暴露于激光后，可以重新封闭纳米泡囊。以这种方式，纳米泡囊的打开和关闭可以是可逆的。

该方法可以利用装载有成像剂和治疗剂进入脂质体的纳米囊泡。这些脂质体可以施用于个体(例如，注射到肿瘤中)，并且成像剂用于验证纳米囊泡的位置和/或肿瘤的分布，并且被照射的纳米囊泡引发药剂的释放。

所述方法可以通过照射具有至少一种不同卟啉缀合物的两种或更多种类型的纳米囊泡，来选择递送/顺序递送两种或更多种货物。选择递送/顺序递送的示例在示例4中进行了描述。例如，如果所施用的纳米囊泡中的各个卟啉缀合物的最大吸收值允许从一种类型的纳米泡囊中触发释放、而没有从其它纳米囊泡的可检测的触发释放。例如，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发超过20％的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种不同纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种不同的纳米囊泡(具有相差10nm或更大的吸收最大值)。在多个示例中，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发超过10、5、4、3、2、1或0.5％的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种纳米囊泡(具有相差15、20、25或50nm或更大的吸收最大值)。在一个示例中，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发任何可检测的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种纳米囊泡(具有相差10、15、20、25或50nm或更大的吸收最大值)。可以通过本领域已知的方法和本文公开的方法检测货物的释放。

本公开的纳米囊泡的有益性质是在37℃下在含有血清的介质中孵育直到将近红外光投射到纳米囊泡时，活性剂的释放最小(即，每小时释放小于5％的内容物)。在一个实施方案中，以足够的激光功率照射靶标组织中的活性剂(货物)，100％的活性剂(货物)从纳米囊泡中释放出来。当活性剂在体内从纳米囊泡中释放出来时，组织周围的温度不会显著增加。通过选择所施加的NIR强度，可以控制在给定位置或给定时间释放出的货物的量。因此，可以在所需的位置和时间从纳米囊泡中释放出1至100％(及其间的所有整数)之间任何值的货物。在一个实施方案中，货物的释放(1至100％之间任何值的货物)是在一个或多个步骤中实现的。例如，可以以所需的时间间隔进行脉冲的NIR暴露以使得货物逐步释放出来。

可以将包括在合适载体中的纳米囊泡的组合物通过任何合适的途径施用于个体。在一个实施方案中，通过静脉内输注来施用组合物，以使得其会进入脉管系统(循环系统)。可以全身施用组合物，或者可以将组合物直接施用到供应给特定器官或组织或肿瘤的血液中。当被NIR照射时，PoP-脂质体的内容物可以在循环系统内释放出来，然后可以进入周围组织。在某些实施方案中，可以将PoP-脂质体直接提供给相关组织。

另外，PoP-脂质体的血清稳定性实现了在更长时间点进行触发释放的选择(稳定性较低的递送系统在施用后一定会被立即触发)。

在一个实施方案中，本公开提供了包括至少0.5mol％至8mol％和其间至小数点第十位的所有百分比的卟啉-磷脂缀合物的双分子层的纳米囊泡。在具体实施方案中，纳米囊泡含有1至8mol％、0.5至5.0mol％、0.5至3mol％、1至3mol％、约2mol％(1.5至2.5mol％)和2mol％的卟啉-磷脂缀合物，其中卟啉-磷脂缀合物可以是Pyro-磷脂的结构。在一个实施方案中，本公开提供了包括在合适的载体中的纳米囊泡的组合物。在另一实施方案中，本公开提供了将药剂递送至所需位置的方法，包括以下步骤：将作为货物的药剂装载到本公开的PoP-脂质体中，将PoP-脂质体施用于个体，并通过当纳米泡囊在所需位置通过脉管系统时使近红外照射向其投射而使货物从纳米囊泡释放出来，从而使得货物(药剂)在所需位置释放出来。在一个实施方案中，进行NIR照射时，当纳米泡囊移动通过小血管(例如毛细血管)时，可以实现货物(药剂)释放。以这种方式，药物释放可以仅限于靶组织中较小的血管，而不会在较大血管的附近。

在下面的附加项(Statements)中，描述了本公开的组合物和方法的各种示例：

1、在一个示例中，组合物包括纳米囊泡(例如，具有双分子层的纳米囊泡)，其中纳米囊泡的双分子层包括0.1至5mol％的卟啉-磷脂、30至50％的固醇、45至61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂，以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质。

2、在另一示例中，组合物是附加项1的组合物，其中卟啉-磷脂具有以下结构(pyro-磷脂)：

3、在另一示例中，组合物是附加项1或2的组合物，其中固醇是胆固醇。

4、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂包括DSPC和DOPC。

5、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中双分子层包括0.1至1.0mol％的卟啉-磷脂、35至45％的胆固醇，其余的由磷脂组成。

6、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡组合物选自由以下组成的组：

i)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：53:5:40:2；

ii)DSPC:DOPC:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：54.7:5:40:0.3；

iii)胆固醇:DSPC:DOPC:PEG-脂质:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：50:32:11:5:2；和

iv)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：60:％:35:2。

7、在另一示例中，组合物是上述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡存在于载体(例如生理缓冲液或含血清的溶液)中。

8、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂包括DSPC和DOPC，其中DOPC以0.1至5mol％存在。

9、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡包括0.1至5mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、DSPC和DOPC，其中DSPC和DOPC一起为59至61mol％，并且其中DOPC为0.1至5mol％。

10、在另一示例中，组合物是前述任何一附加项的组合物，其中货物分子(例如，单一类型的货物，单一类型的货物的混合物，或两种或更多种不同类型的货物的混合物)存在于纳米囊泡中。

11、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中货物是阿霉素、伊立替康、柔红霉素或其组合。

12、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡包括治疗剂和成像剂，并且治疗剂和成像剂是彼此分开的不同的分子。

13、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中货物存在于纳米泡囊的内部水性隔室中。

14、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂与货物药物的比例为10:1至5:1。

15、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡具有至少两种类型，其中每种类型的纳米囊泡含有不同的卟啉-脂质，并且每种不同的卟啉-脂质具有不同的最大吸收值。

16、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡具有两种类型，其中一种类型中的卟啉-磷脂是pyro-磷脂，而第二种类型中的卟啉-磷脂是红紫素-磷脂。

17、在一个示例中，将货物递送到所需位置的方法包括以下步骤：a)向个体施用前述任一附加项所述的组合物以使其进入循环系统；b)使纳米泡囊到达所需位置；和c)将纳米泡囊暴露于波长为650至1000nm的近红外照射以使得货物从纳米泡囊中释放出来。

18、在另一示例中，方法是附加项17的方法，其中纳米囊泡包括成像剂，并且所述方法还包括在施用后和暴露纳米囊泡之前对个体进行成像，和确定纳米囊泡已经到达所需位置。

19、在另一示例中，方法是附加项17或18中任一项的方法，其中个体是人或非人哺乳动物。

20、在另一示例中，方法是附加项17至19中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于658、665、671或695nm的波长。

21、在另一示例中，方法是附加项17至20中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于近红外照射长达30分钟。

22、在另一示例中，方法是附加项17至21中任一项的方法，其中c)进行的是多次暴露于近红外照射。

23、在一个示例中，货物的控制释放的方法包括：a)提供包括在载体中的纳米囊泡的组合物，其中纳米囊泡的双分子层包括0.1至5mol％的卟啉磷脂、30至50％的固醇、45至61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂，以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质，其中在室温至37℃的温度下(例如，在生理缓冲液或基于血清的培养基中)，不存在可检测的货物的释放；b)将组合物暴露于来自具有10至350mW/cm²的功率的激光器的波长为650-1000nm(例如，650-675nm)的光，其中至少90％的货物在暴露于b)中的光1到8分钟内被释放出来。

24、在另一示例中，方法是附加项23的方法，其中未与卟啉缀合的磷脂是DSPC和DOPC，并且其中DOPC以0.1-5mol％存在。

25、在另一示例中，方法是附加项23的方法，其中pyro-磷脂以0.1至1.0mol％存在，并且其中至少50％的货物在1分钟内释放出来。

26、在一个示例中，多个货物的顺序释放方法包括：a)向个体施用至少第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡，其中第一纳米囊泡和第二纳米囊泡的双分子层各自包括0.1至5mol％的卟啉磷脂、30-50％的固醇、45-61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂、以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质，其中第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡含有具有不同最大吸收值的不同的卟啉磷脂，和b)将组合物顺序暴露于至少两种不同波长的光，其中第一波长对应于第一类型纳米囊泡的卟啉-磷脂的最大吸收值，并且第二波长对应于第二类型纳米囊泡的最大吸收值，从而使得第一类型的纳米泡囊中和第二类型的纳米囊泡中的货物顺序释放出来。

27、在另一示例中，方法是附加项26的方法，其中至少两种类型的纳米囊泡存在于相同的组合物中。

28、在另一示例中，方法是附加项26或27中任一项的方法，其中个体是人或非人哺乳动物。

29、在另一示例中，方法是附加项26至28中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于658、665、671、695nm或其组合的波长。

30、在另一示例中，方法是附加项26至29中任一项的方法，其中对于各个单独的暴露，使纳米囊泡依次暴露于近红外照射长达30分钟。

提供以下示例以说明本公开。它们并不意图以任何方式进行限制。

示例1

本示例描述了PoP-脂质体的制备以及货物的装载和释放。

材料和方法。PoP脂质体的制备。除非另有说明，脂质是从Avanti获得的，而其它材料是从Sigma获得的。如前所述合成HPPH-脂质和Pyro-磷脂。各种脂质体制剂均是使用相同的方法制备的。最终获得的隐形PoP脂质体制剂包括53mol％1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC，Avanti#850365P)、40mol％胆固醇(Avanti#700000P)、2mol％Pyro-磷脂和5mol％1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG-2K，Avanti#880120P)。为了产生100mg PoP脂质体(5mL的批次)，将57.1mg DSPC、19.1mgDSPE-PEG-2K、2.76mg Pyro-磷脂和21.1mg胆固醇在60-70℃下完全溶解在1mL乙醇中，然后将4mL 250mM硫酸铵(pH 5.5)缓冲液注射到混合脂质中(注射时将混合脂质和硫酸铵缓冲液二者均保持在60-70℃)。将脂质和缓冲液充分混合。利用高压氮气挤出机(NorthernLipids)使溶液在60-70℃下通过依次堆叠的孔径分别为0.2、0.1和0.08μm的聚碳酸酯膜10次。通过在800mL含有10mM组氨酸(pH 6.5)的10％蔗糖溶液中透析来去除游离的硫酸铵，其中更换至少2次缓冲液。

PoP脂质体的货物装载和释放。通过加入指定比例的药物并在60℃下孵育1小时来装载阿霉素(Dox；LC Labs#D-4000)。通过在PBS中进行动态光散射来测定脂质体的尺寸。通过使稀释在1mL PBS中的25μL脂质体流过(run)Sephadex G-75柱来测定装载效率。收集24份1mL洗脱液(fraction)，并将装载效率确定为药物在含有脂质体的洗脱液(其在前3-10mL中洗脱出来的洗脱液)中的百分比。采用TECAN Safire荧光酶标仪，以480nm的激发和590nm的发射的荧光测量Dox。利用功率可调的665nm激光二极管(RPMC激光器，LDX-3115-665)以约310mW/cm²的注量率进行光触发释放实验，用荧光计(PTI)实时测量Dox释放。37℃下在50％无菌成熟牛血清(Pel-Freez#37218-5)中进行照射。通过将K型热电偶探头直接插入经过照射的溶液中来测量温度。通过测量处理前后的释放来评估Dox释放。利用公式：释放＝(F_最终-F_初始)/(F_X-100-F_初始)×100％计算释放。

冷冻电子显微镜。对于冷冻-EM，利用另外的连续薄碳层(5-10nm)制备多孔碳网格(c-flat CF-2/2-2C-T)，并用5mA的辉光放电对其处理15秒。然后，将3.4μL的装载有阿霉素(溶解在含有10％蔗糖溶液和10mM组氨酸(pH 6.5)的缓冲液中)的脂质体施加到网格上30秒。为了进行试样玻璃化，采用Vitrobot(FEI)，在大约-180℃下对网格进行印迹并使其浸入液体乙烷中，其中将印迹室保持在25℃和100％相对湿度。在JEOL2010F透射电子显微镜中，在200kV下利用Gatan 914冷冻样品传输杆(cryo-holder)在对脂质体进行成像。采用每

约20个电子的总剂量且-7至-11微米之间的散焦范围以×50000的放大倍数采集图像。将图像记录在SO-163胶片中。在Nikon Super Coolscan 9000扫描仪中将显微图像数字化。

脂质体储存稳定性。将装载有Dox的隐形PoP脂质体(药物与脂质摩尔比为1:5)在4℃下储存在密闭的琥珀色小瓶中，无需任何其它预防措施，并定期取出脂质体用于常规分析。在3个月内，每两周对3份不同批次制备的脂质体的装载稳定性、尺寸、多分散性、血清稳定性和光触发的释放速率进行评估。通过进行动态光散射在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测定脂质体尺寸。对于血清稳定性的测量，将脂质体在含有50％成熟牛血清(Pel-Freez#37218-5)的PBS中稀释200倍(至13.5μg/mL Dox)。取初始读数，并将样品在37℃下孵育6小时。加入0.5％X-100以裂解脂质体，并读取最终荧光值。根据公式％释放＝(F_最终-F_初始)/(F_X-100-F_初始)×100％计算Dox释放。如上所述测定装载稳定性和光触发的释放速率。

药代动力学。对小鼠上进行的这项工作的所有程序都已经被布法罗大学动物保护和使用委员会批准。通过尾静脉以10mg/kg Dox的剂量向雌性小鼠(雌性CD-1，18-20g，CharlesRiver)静脉内注射Dox-PoP脂质体、空间稳定的脂质体Dox或10％HPPH脂质体(10mol％HPPH-脂质、35mol％胆固醇、5mol％DSPE-PEG-2K和50mol％DSPC)(每组N＝4)。在指定的时间点，在下颌位置和眼球后位置采集少量血液。将血液在2000×g下离心15分钟。将10μL血清加入990μL提取缓冲液(0.075N HCl，90％异丙醇)中，并在-20℃下保存20分钟。取出样品并温热至室温，并在10000×g下离心15分钟。收集上清液并通过荧光进行分析。从标准曲线上确定Dox浓度。通过PKsolver分析非房室药代动力学参数。

肿瘤药物摄取。在5周龄雌性裸鼠(Jackson Labs，#007850)的两侧胁腹上接种5×10⁶个MIA Paca-2细胞，并且当肿瘤尺寸达到6-8mm(n＝4)时将裸鼠随机分组。静脉注射5mg/kg或10mg/kg Dox-PoP隐形脂质体后1小时，用665nm激光二极管(RPMC激光，LDX-3115-665)以350mW/cm²对小鼠的一侧胁腹进行处理15分钟或30分钟。处理后立即处死小鼠，收集肿瘤。为了测定肿瘤药物沉积，将肿瘤在核裂解缓冲液[0.25mol/L蔗糖、5mmol/L Tris-HCl、1mmol/l MgSO₄、1mmol/L CaCl₂(pH 7.6)]中进行匀浆，并在0.075N HCl90％异丙醇中过夜提取。通过荧光测量确定Dox和Pyro-磷脂。

肿瘤温度和血液流量。将MIA Paca-2肿瘤荷瘤小鼠分为4组：Dox-PoP并进行激光照射(350mW/cm²)，Dox-PoP并进行激光照射(250mW/cm²)，只进行激光照射(350mW/cm²)和不进行激光照射对照(n＝3-4)。对前两组的小鼠静脉注射7mg/kg Dox-PoP。注射后1小时，将小鼠麻醉并放置在加热垫上以将体温维持在约35℃。通过激光多普勒(moorLDI2-IR)在单点模式下测量肿瘤血液流量。在血液流动稳定后5分钟开始665nm激光照射进行光处理。照射30分钟后，将小鼠再监测10分钟。将数据分析为与第一个5分钟相比的流速百分比。由红外摄像机(FLIR ix系列)记录处理过程中的肿瘤温度。

存活研究。将5×10⁶个MIA Paca-2细胞(从ATTC获得)注射到雌性裸鼠小鼠(5周，Jackson Labs，#007850)的右侧胁腹。当肿瘤体积达到4-6mm直径时，将MIA Paca-2肿瘤荷瘤小鼠分组如下：1)生理盐水对照；2)Dox-PoP不进行激光照射；3)空PoP并进行激光照射；4)Dox-PoP并进行激光照射。N＝5-6。Dox-PoP的剂量为7mg/kg的Dox，并且将PoP的剂量调整为与Dox-PoP的剂量7mg/kg(Dox与脂质的装载比为1:5)相当，即为1.225mg/kg(1.21μmol/kg Pyro-磷脂)。对于不同的剂量实验，研究了另外两组Dox-PoP并进行激光照射(基于Dox的3mg/kg)和Dox-PoP并进行激光照射(基于Dox的5mg/kg)。采用21mg/kg空间稳定的脂质体Dox(HSPC:CHOL:DSPE-PEG-2K＝56.3:38.4:5.3％摩尔)进行

的标准处理。采用游离的Dox 7mg/kg作为游离药物对照。静脉注射后1小时，对需要激光处理的肿瘤全部以300W/cm²的注量率照射16分40秒(总注量300J/cm²)。将HPPH稀释在含有2％乙醇和0.2％吐温80的PBS中，并以1.21μmol/kg的剂量注射。注射后24小时进行光处理。通过利用卡尺测量肿瘤的三维，每周监测肿瘤尺寸2-3次，并利用椭圆体公式来估算肿瘤体积：体积＝π·L·W·H/6，其中L、W和H分别为肿瘤的长度、宽度和高度。每周监测小鼠的体重。当肿瘤体积超过其初始体积的10倍时，处死MIA PaCa-2肿瘤荷瘤小鼠。

统计分析。所有数据通过Graphpad prism(5.01版本)软件进行分析，如图所示。对于Kaplan-Meier存活曲线，每一对组通过对数秩(Log-rank)(Mantel-Cox)检验进行比较。Bonferroni方法用于调整多重比较。差异在p<0.05时被认为是显著的。将中位存活期定义为阶梯存活曲线跨越50％存活的时间。

结果。据报道，当脂质体由95摩尔％的PoP形成时PoP HPPH-脂质能够包载(entrap)货物，但是Pyro-磷脂不能，继而采用10摩尔％HPPH-脂质PoP制备装载有Dox的脂质体。由于Pyro-磷脂非常易于合成并且不具有立体中心，因此对其进行复查。用二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇(CHOL)、DSPE-PEG-2K和Pyro-磷脂制备脂质体。5摩尔％DSPE-PEG-2K被包括在内，其余的脂质含量变化如图1A所示。Pyro-磷脂量的增加阻止了脂质体在60℃下利用内部硫酸铵梯度来主动装载Dox，这是用于脂质体药物装载的成熟方法。然而，这种效应可以通过增加胆固醇浓度来抵消。通过包括较高的胆固醇浓度可以装载具有较高pyro-磷脂浓度的脂质体。含有30摩尔％胆固醇的脂质体可以有效地装载Dox，但是当制剂中包括低至1摩尔％的量的Pyro-磷脂时则不能。当含有35摩尔％胆固醇时，Dox只能被装载到含有少量Pyro-磷脂(0-2摩尔％)的脂质体中。当制剂中分别包括40和45摩尔％的胆固醇时，可掺入到装载有Dox的脂质体中的pyro-磷脂的最大量分别增加到5和8摩尔％。这种变化相对骤然的装载行为的现象是令人惊讶且意想不到的，并且在没有Pyro-磷脂的常规脂质体中没有观察到。如图1B所示，以相对高的药物与脂质的比例(1:5)来装载Dox也受胆固醇含量的影响。不同于在所有条件下装载Dox的常规脂质体，由2摩尔％pyro-磷脂形成的PoP脂质体只有当包括超过35％胆固醇时，才能被装载。含有45摩尔％胆固醇的Pyro-磷脂PoP脂质体能够强劲主动装载Dox。

为了表征Dox-PoP脂质体的形态，采用冷冻电子显微镜。以摩尔比为[53:40:5:2]的[DSPC:CHOL:PEG-脂质:Pyro-磷脂]且1:5的Dox与脂质装载比来形成脂质体。电子显微照片显示出意想不到的非对称结构(图1C)。每个装载有Dox的脂质体都封闭有明显的电子致密物体(箭头所示)，这种电子致密物体在没有装载Dox的相同脂质体中不存在(图10)。这些可能是Dox-硫酸盐沉淀物，并且通常位于偏离中心的位置。Dox沉淀物附近的双分子层部分具有减小的曲率。

图1D显示Pyro脂质体的装载受药物与脂质的比例的影响。对于含有2摩尔％pyro-磷脂和40摩尔％胆固醇的Pyro脂质体可以被装载的阿霉素的最大量为1:5(Dox与脂质摩尔比)，高于此值能够被装载的阿霉素少于10％。然而，对于不含Pyro-磷脂的脂质体，情况不是这样的，装载效率随着Dox与脂质摩尔比的增加而逐渐降低。

37℃下在50％牛血清中Dox-PoP脂质体的光触发的释放进行体外评估。如图2A所示，增加PoP的量导致NIR光诱导的释放速率更快，对于大多数制剂在几分钟内达到完全释放。以最快时间达到50％释放发生在含有2-8摩尔％之间PoP的脂质体(图2B，C)中。然而，当将释放速率归一化至膜中pyro-磷脂的量时，发现基于单位pyro量的2％pyro-磷脂是最佳的(图2D)。换句话说，如果要注射设定剂量的光敏剂，使其以2摩尔％PoP脂质体的形式存在，则会导致最大量的光触发的Dox释放。由于除了提供基于单位PoP的最快释放之外，减少的PoP浓度还降低了潜在的临床上光敏剂相关副作用例如皮肤光毒性，因此选择2％PoP用于进一步的实验。

尽管增加胆固醇使Dox能够装载进PoP脂质体中(图1)，但它也减缓了光触发的Dox释放速率。如图3A所示，当暴露于NIR激光时，含有35％胆固醇的PoP脂质体释放Dox最快，而含有50％胆固醇的PoP脂质体的释放Dox最慢。由于需要将Dox装载到脂质体中，所以使用较少的胆固醇来增加释放速率是不可行的。诱导50％Dox从PoP脂质体中释放出来所需的照射时间显示出随着胆固醇升高而出现的更慢释放的明显趋势(图3B)，其中含有50摩尔％胆固醇时观察到显著的减缓。40摩尔％胆固醇提供了Dox装载效率和光触发的快速Dox释放之间的最佳平衡。

研究了DSPE-PEG-2K对Dox装载和触发释放的影响。用不同量的DSPE-PEG-2K形成掺入45摩尔％胆固醇(为了促进有效主动装载而选择)和2摩尔％pyro-磷脂的PoP脂质体。如图3C所示，当采用8摩尔％的DSPE-PEG-2K代替3％的DSPE-PEG-2K时，50％Dox释放所需的时间从1.2分钟增加到2.8分钟。然而，DSPE-PEG-2K也在Dox装载中发挥作用，观察到以5摩尔％时装载效率最佳(图3D)，这是保持合理快速触发释放的量(图3C)。因此，在考虑了每种脂质成分后，将含有摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:PEG-脂质:PoP的PoP脂质体最终确定为推定的隐形PoP脂质体以用于进一步评估。

基于钙黄绿素的最佳释放，先前研制了含有10摩尔％HPPH-脂质的制剂。然而，发现用于释放被主动装载的阿霉素的HPPH-脂质的最佳量为2摩尔％(图11)。虽然HPPH-脂质赋予常规隐形脂质体具有光诱导释放特性，但它也导致脂质体泄漏。与Pyro-磷脂不同，由HPPH-脂质形成的PoP脂质体无法达到可接受的血清稳定性与快速NIR激光触发的释放之间的平衡(图12)。所研制出的含有2摩尔％Pyro-磷脂的制剂释放内容物比先前报道的制剂快得多(图13)。

接下来研究了药物与脂质装载比对隐形PoP脂质体在37℃下的封装效率、触发释放速率和血清稳定性的影响。图4A显示，随着药物与脂质装载比的增加，PoP脂质体(含有2摩尔％的Pyro-磷脂)中的Dox封装效率显示出急剧的转折点，超过该转折点药物装载无效。这与不含pyro-磷脂的相同脂质体(随着药物与脂质装载比的增加显示出逐渐降低的药物封装效率)形成对比。可以被有效装载的最高的药物与脂质装载比为1:5(在图上显示为0.2:1)，超过该比例(1:5)少于10％的Dox可以被装载。对于Pyro-磷脂PoP脂质体，药物装载比和光触发的药物释放速率之间没有关系，并且释放速率在所有样品之间是高度一致的(图4B)。图4C显示含有可变装载比的所有PoP脂质体在体外都表现出优异的血清稳定性。选择1:5的药物与脂质的比例用于进一步使用，因为它最小化了被注射的Pyro-磷脂的量以避免潜在的光敏剂诱发的副作用。

评估了隐形PoP脂质体的长期储存稳定性(图1C)。将脂质体在4℃下储存在密闭的琥珀色小瓶中，无需任何其它预防措施，并定期取出脂质体进行常规分析。在3个月内，每两周对3份不同批次制备的脂质体的装载稳定性、尺寸、多分散性、血清稳定性和光触发释放速率进行评估。如图5A所示，超过95％的Dox仍然稳定地包载在隐形PoP脂质体内。图5B和5C显示，对于所有不同批次制备的隐形PoP脂质体，尺寸保持在接近100nm，同时多分散性指数低至接近0.05，表明了纳米颗粒是小而单分散的群体。在储存期的持续时间内一致的是，37℃下在50％牛血清中体外培养6小时后，少于10％所装载的Dox从脂质体中泄漏出来(图5D)。因此，对于在静脉内施用脂质体后不久发生的光处理，可以预测发生非常少的血清诱导的泄漏。NIR光触发的隐形PoP脂质体的Dox释放速率在储存期间保持相对稳定，需要接近两分钟的照射才能达到50％Dox释放(图5E)。因此，尽管1:5的较高药物与脂质装载比(这引起了异常和非对称的脂质体形态(图1C))，装载有Dox的隐形PoP脂质体通过检查所有指标而显示出优异的储存稳定性。它们在功能测定中表现一致，在没有NIR光的情况下在血清中是稳定，但在暴露于NIR光时快速释放内容物。

对CD-1小鼠静脉内施用装载有Dox的隐形PoP脂质体后，研究了装载有Dox的隐形PoP脂质体的药代动力学行为。如图6所示，所封装的Dox表现出长效循环的药代动力学特征。隐形PoP脂质体中Dox的血液清除时间和半衰期接近于常规隐形脂质体(不含Pyro-磷脂；相当于空间稳定的脂质体Dox或SSL Dox)。装载有Dox的隐形PoP脂质体显示出循环半衰期为21.9小时，其中曲线下面积(AUC)为4837μg/(ml*h)。SSL Dox脂质体的半衰期为16.9小时，其中曲线下面积为5695μg/(ml*h)。这些制剂表现出比先前报道的包括10摩尔％HPPH-脂质和35摩尔％胆固醇的PoP脂质体更长的循环半衰期和更大的AUC。表1列出了装载有Dox的隐形PoP脂质体和其它装载有Dox的脂质体制剂的药代动力学参数。

表1：脂质体中Dox的非房室药代动力学分析

MRT；中位保留时间。AUC；c·t乘积下相对于时间t从0到无穷大的面积。Cl，清除率。Vss，稳态分布体积。

用人胰腺MIA Paca-2癌细胞对裸鼠两侧胁腹进行对侧接种以产生用于光触发的Dox摄取研究的双侧肿瘤模型。该方法包括用NIR光处理一个肿瘤，而另一个肿瘤用作对照。通过在NIR激光处理后立即测量Dox肿瘤摄取来研究处理时间和注射剂量。用5mg/kg或10mg/kg Dox(总静脉注射的Dox剂量，封装在隐形PoP脂质体中)静脉注射后1小时，对肿瘤激光照射15或30分钟。在激光照射组中肿瘤对Dox的摄取是不接受激光处理的肿瘤的6-7倍(图7A)。药物在肿瘤中的沉积取决于注射剂量，其中10mg/kg的注射剂量导致每克肿瘤(对于经受激光治疗的肿瘤)中的13.8μg Dox，其大约是5mg/kg的注射剂量(激光处理的肿瘤中Dox浓度为每克肿瘤7.0μg Dox)的肿瘤浓度的两倍。

虽然注射剂量直接影响肿瘤中光触发的Dox摄取，但不同的光剂量(采用15和30分钟的不同照射时间施加)没有显著的效果。注射剂量为10mg/kg并照射15或30分钟处理的小鼠在激光处理的肿瘤组织中分别得到9.6和13.2μg Dox/g，并没有统计学显著差异(图7B)。需要进一步的研究来更好地了解不同光剂量的影响，但激光处理可能会导致部分血管淤滞，从而阻止更多的脂质体流入肿瘤。

检查了激光处理对肿瘤温度的影响(图8A)。在7mg/kg Dox给药后1小时，以350mW/cm²施加激光照射，并且在照射的30分钟内使肿瘤的表面温度升高至45℃。当将注量率降低到250mW/cm²时，温度升高到低于40℃。当施加350mW/cm²而没有预先注射PoP脂质体时，这种温度上升与观察到的肿瘤表面加热相似。使用激光多普勒分析评估肿瘤血液流量，这种技术可以非侵入性地探查被检查组织中的浅表性灌注量。如图8B所示，在不存在PoP-脂质体的情况下，350mW/cm²激光处理没有抑制肿瘤血液流量，并且随着时间的推移增加约50％，可能是由于热加热效应。当隐形PoP脂质体在血液中循环时，经照射肿瘤显示出显著不同的血液流动力学(图8C)。肿瘤血液流量首先急剧下降，随后上升，然后又下降。在250mW/cm²和350mW/cm²注量率下都观察到了这一趋势。照射30分钟后关闭激光后，肿瘤血液流量继续降低。激光照射期间血液流量的降低不是由于肿瘤加热造成的，因为250mW/cm²的处理与无药物的350mW/cm²的处理产生相似的加热，无药物的350mW/cm²的处理没有表现出任何的肿瘤血液流量降低(vascular shutdown)(图8B)。已经报道了进行高注量光动力学治疗(PDT)的小鼠中出现的肿瘤流量立即减少的、随后增加的现象。当绘制为相对于累积注量的函数时，250mW/cm²和350mW/cm²的处理显示出相似的肿瘤血液流量动力学模式(图8D)。

在单个MIA Paca-2皮下肿瘤荷瘤裸鼠中评估装载有Dox的隐形PoP脂质体的抗肿瘤功效。如图9A所示，在7mg/kg的Dox(或等效)的剂量下，单独使用装载有Dox的隐形PoP脂质体(无激光处理)和采用无装载的隐形PoP脂质体进行激光处理都通过与未处理的对照小鼠相比延长中位存活时间(两组均从21天延长到30.5天)而提供了一些治疗益处。然而，对于采用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行激光处理，观察到强烈的治疗协同作用，因为该方法导致所有小鼠完全存活下来，并且比上述两种对照处理显著更加有效(P<0.05)。采用其中Dox的剂量为7mg/kg的隐形PoP脂质体，所有经过光处理的肿瘤在处理的两周内有效地回缩至小于20mm³，并且所有小鼠在研究持续期间(60天)都存活下来，其中6个肿瘤中的3个被永久治愈。检查了装载有Dox的隐形PoP脂质体在较低剂量下的光治疗功效(图9B)。3mg/kg和5mg/kg Dox均能高效延缓肿瘤生长。对于经过激光处理的小鼠，Dox剂量为3mg/kg的Dox-PoP脂质体处理使得其中位存活时间为43.5天，Dox剂量为5mg/kg的Dox-PoP脂质体处理使得其中位存活时间为57天。对于用5mg/kg Dox处理的小鼠，6只小鼠中只有3只发现肿瘤再生长。在所有情况下，装载有Dox的隐形PoP脂质体对光处理是耐受性良好的，正如由所有经过处理的小鼠的健康体重所证明的(图9C)。

如图9D所示，采用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理比常规化疗或PDT的单剂量治疗显著更加有效。游离Dox在其7mg/kg的最大耐受剂量下对MIA Paca-2肿瘤为无效治疗，与对照小鼠相比没有明显的肿瘤生长延迟(中位存活期为19天相对于21天)。与游离药物相比，空间稳定的Dox(SSL Dox)可以以三倍于最大耐受剂量施用，并且与对照相比改善了存活期(中位存活期为40天相对于21天，P<0.05)。当用等效光剂量和等效注射剂量的HPPH施用常规PDT时，常规PDT显示出相似的肿瘤生长抑制作用(中位存活期为38天)，HPPH是一种具有与Pyro-磷脂相似的光谱性质的光敏剂并且目前处于临床试验中。采用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行激光处理比已经全部在临床中使用的这三种抗癌模式显著更加有效。以高剂量(21mg/kg)SSL Dox进行标准治疗后使得小鼠脚上出现皮疹，这是高剂量装载有阿霉素的隐形脂质体引起的手掌红斑感觉障碍(PPE)的典型症状。肿瘤体积显示，所有采用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理比最大耐受剂量的游离Dox和SSLDox更有效(图9E)。采用Dox剂量为3mg/kg的隐形PoP脂质体并进行光处理比21mg/kg的SSLDox稍微更加有效。即使假定更低注射剂量的脂质体观察到更快的血液清除速率，可以以至少1/7的剂量使用PoP脂质体而达到优于常规SSL Dox的治疗功效。这些结果由于以最小的副作用实现肿瘤消融而令人鼓舞。

讨论。在本研究中，我们系统地检查了PoP脂质体的所有脂质成分，以成功研制了制剂，该制剂能够1)高效地以高装载比主动装载Dox；2)在体外储存期间和血清中稳定；3)在体内具有长效循环时间；和4)可以在暴露于近红外光时快速释放Dox。增加胆固醇的量能够使得主动装载更多量的PoP，这本身往往会使双分子层不稳定并阻碍Dox的装载。虽然已知胆固醇可增强脂质体的稳定性，但需要进一步的研究才能更好地确定胆固醇在PoP脂质体功能和结构中的作用。与DSPE-PEG-2K一样，增加胆固醇的量也减缓了光触发的Dox释放。然而，对于有效Dox装载，这两个组分都是需要的。Dox与脂质的高装载比(1:5)是可行的，并产生了如图1C所示的不寻常的脂质体形态。胆固醇和DSPE-PEG-2K如何减缓光触发的药物释放是令人关注的，需要进一步阐明机制方面。

增加Pyro-磷脂的量抑制了将Dox装载到PoP脂质体中，这种作用需要通过增加胆固醇含量来抵消。Pyro-磷脂的增加也提高了光触发的释放速率。选择最佳的Pyro量为2摩尔％，因为当归一化至双分子层中的Pyro-磷脂的量时，所选择的最佳Pyro量提供了最快速的释放速率。虽然已经证明小鼠对高达1g/kg静脉内剂量的Pyro-磷脂具有良好的耐受性，但优选施用较低剂量的作为光敏剂的分子，以避免不期望的阳光毒性或如在PDT治疗中观察到的照射区域形成水肿。使用研制出的装载有Dox的隐形PoP脂质体制剂，以对人类而言较低的剂量5mg/m²给药Dox将对应于大致1mg/m²或0.03mg/kg的PoP给药，光敏剂剂量比临床批准的Photofrin剂量(通常以2mg/kg剂量施用)要低几个数量级。

激光处理后立即观察到肿瘤摄取的阿霉素增加6-7倍。肿瘤内药物浓度的显著增加可能是这种处理有效性的重要因素。增强的药物积累可能是由于药物释放、高热介导的血管透化和PDT诱导的血管通透性效应的组合。触发的释放和PDT二者均可用作增强药物递送的手段。需要进一步研究以彻底确定每种机制对增强药物摄取和提高生物利用度的贡献。当350mW/cm²照射的处理时间从15分钟增加到30分钟时，肿瘤药物摄取增加，但不具有统计学显著性。如图8C所示，经过20分钟的照射后，肿瘤中的血液流量减少，限制了可以沉积的药物的量。PDT诱导的微血管淤滞可能发生并抑制脂质体进一步供应给被照射的体积。对于肿瘤生长抑制的研究，以中间注量率为300mW/cm²进行16.7分钟的处理，使得肿瘤加热不超过43℃，并且使得在处理过程中血液流量降低最小化。将来的研究方向包括将这种处理与抗凝剂结合起来，抗凝剂可能会降低PDT诱导的血管淤滞并进一步改善肿瘤药物摄取。

结论。研制了强效、空间稳定且长效循环的隐形PoP脂质体制剂，该制剂可以通过NIR光触发以释放出被封装药物。装载有Dox的隐形PoP脂质体显示出长期的储存稳定性。PoP脂质体化学光疗法的抗肿瘤功效优于常规PDT(采用HPPH)也优于游离或在长效循环脂质体中施用的最大耐受的单剂量Dox。

示例2

该示例进一步描述了PoP-脂质体的制备以及货物的装载和释放。

由不同量的PEG制成含有45％胆固醇和2％pyro-磷脂的样品(图14)。发现脂质体的PEG-脂质含量对阿霉素的装载和释放具有影响，其中PEG-脂质含量为5％时具有最佳装载并且PEG-脂质含量为3％时释放更快。5％PEG-脂质被证明是最佳的，因为它提供了最大药物装载和良好的释放速率。

为了证明pyro-磷脂诱导的释放适用于广泛的制剂，我们针对包括多种PC脂质的DSPC替换物(图15)和其它类型的脂质(包括磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)脂质)(图16)测试了阿霉素装载和释放。图17显示了另一种药物-伊立替康可以采用各种DSPC替代物被加载并释放出来，DSPC替代物包括阳离子脂质DOTAP、PA、PE和磷脂酰甘油(PG)脂质。胆固醇也可以被包括β-胆甾烷醇、谷甾醇和豆甾醇的胆固醇类似物替代(图18)。我们另外测试其它药物(伊立替康和柔红霉素)的装载和释放。在伊立替康的情况下，所使用的制剂是由鞘磷脂、Pyro-磷脂和胆固醇组成的不含PEG的制剂。用于柔红霉素的DSPC/PEG-脂质/pyro-磷脂/胆固醇制剂采用了50％胆固醇(图19)，因为采用较低浓度的胆固醇时，无法装载柔红霉素。还测试了具有修饰结构的Pyro-磷脂，其中含有14、16(正常)或18个酰基侧链的脂质用于缀合(图20)。结果表明，伊立替康可以被装载进具有14、16和18个碳的侧链的脂质体中并从中释放出来，并且阿霉素可以被装载进具有16、18个碳的侧链的脂质体中装载并从中释放出来。

因此，本文所述的PoP-脂质体形成强效系统，该系统在暴露于临床相关剂量的NIR照射时实现了耐热性货物保留以及有效释放。通过改变卟啉掺杂、激光照射时间和激光照射功率可以调节释放。这与依赖于加热至高于体温几度并在生理温度下可能具有稳定性问题的外部触发的释放系统不同。响应于近红外照射，本公开的PoP-脂质体释放其中装载的货物时对空间和时序具有强效控制，并且当装载有适当的药剂时提供有效的治疗和诊断选择。

示例3

该示例进一步描述了不含有PEG-脂质的PoP-脂质体的制备、货物的装载和释放。

我们选择表征不含有PEG-脂质的PoP脂质体，以观察在PoP脂质体中是否存在增强的光触发释放。此外，PEG-脂质的免疫原性已经被确定为患者可能关注的问题。PoP脂质体由DSPC、DOPC、胆固醇和Pyro-磷脂(摩尔比为59.7-x:x:40:0.3，x＝mol％DOPC)制成。DSPC被替换为在0-10mol％范围内的DOPC，并且评估了在采用近红外(NIR)665nm光照射下对光触发释放的影响(图21A，21B)。包括仅仅2mol％DOPC加速了光触发释放，导致释放50％Dox所需的时间减少至1/11.6(713秒相对于61秒)。增加DOPC的量(大于3mol％)进一步提高了释放速率，而含有5mol％DOPC的脂质体在43秒内释放出50％所装载的Dox。具有不同量的DOPC的装载有Dox的PoP脂质体的血清稳定性显示：37℃下在50％牛血清中孵育4小时后，DOPC含量高于5mol％的PoP脂质体不稳定，导致含有7mol％和10mol％DOPC的PoP脂质体分别泄露22％和42％的Dox(图21C)。因此，选择5mol％的DOPC，因为它能够使得同时具有光触发的快速释放和在没有NIR照射的情况下的良好的血清稳定性(4小时内在50％牛血清中仅释放出约10％的Dox)。我们之前已经证明，对于含有2mol％Pyro-磷脂而不包括PEG-脂质的脂质体，Dox装载效率仅为约50％。有趣的是，DOPC的掺入允许在不含有PEG-脂质的PoP脂质体中约95％的Dox装载效率(图27)。然而，当pyro-磷脂的量降低到小于0.5mol％时，在没有DOPC的情况下实现了Dox的高装载效率(图21A中含有0mol％DOPC的制剂的装载效率为97.3％)。包括5mol％PEG-脂质降低了含有DOPC的PoP脂质体中的光触发释放速率(释放50％Dox的时间为336s相对于46s，图28)。

通过采用少量的DOPC(5mol％)，采用少于1mol％的PoP实现了Dox的快速释放(图21D)。对于含有0.5-1mol％PoP的脂质体达到释放50％Dox所需的照射时间小于30s。对于含有0.3mol％或更多PoP的脂质体，可以在60秒内释放出约90％的Dox(图21E)。增加PoP的量增强了光触发的货物释放，然而将光敏剂施用给患者也增加了潜在的光毒副作用的风险。因此，选择0.3mol％的PoP用于进一步的研究，因为它提供了所使用的最少量的PoP并且在60秒内快速释放内容物。除非另有说明，用于后续研究的最终制剂是[DSPC:DOPC:胆固醇:PoP]为[54.7:5:40:0.3，mol％]，药物与脂质的摩尔比为1:8。

37℃下在50％牛血清中评估在较低注量率(25mW/cm²至250mW/cm²)下的Dox释放(图29A)。在低注量率(25mW/cm²)下，NIR照射2分钟内观察到57％的Dox释放。达到释放90％Dox所需的时间不是线性的(图29B)，所以达到释放90％Dox所需的总能量不是恒定的。这与我们以前的观察结果形成对比，即不含DOPC的脂质体以恒定的能量释放货物，而与注量率无关。90％的释放所需的注量与注量率呈线性关系，在较低的注量率下所需的总能量较低(图29C)。这表明在含有DOPC的PoP脂质体中存在另一种机制。由于单线态氧的产生在较高的注量率下效率较低(由于氧的耗尽)，所以我们假设释放机制可能与照射期间的单线态氧产生有关。

增强的光触发的释放是与单线态氧相关的。在氧存在下进行光照射时，光敏剂(在这种情况下为PoP)可以产生反应性单氧。已知细胞膜是光动力学治疗中的单线态氧的靶标。假设观察到的光触发的快速释放与单线态氧的产生有关。为了测试这一点，在脂质体照射期间采用报告荧光基团单线态氧传感器绿(reporter fluorophore singlet oxygensensor green，SOSG)来检测单线态氧的存在。采用抗氧化抗坏血酸钠和分子氧清除剂亚硫酸钠来抑制单线态氧的产生。在NIR照射下，PoP脂质体产生单线态氧，但是这被抗坏血酸盐和亚硫酸盐抑制(图22A)。在5mM抗坏血酸盐的存在下，Dox从PoP脂质体的释放被抑制(图22B)。在不进行光照处理的情况下，具有或不具有抗坏血酸钠，都没有观察到Dox的释放。对装载有Dox的PoP脂质体进行光处理，在3分钟内诱导释放出95％Dox，但包括5mM抗坏血酸钠导致Dox的释放降低81％。类似地，在25mM亚硫酸钠存在下的光触发的Dox释放减少了80％(图22C)。

测试了含有不同不饱和磷脂的装载有Dox的PoP脂质体的光触发的释放，包括18:1(顺式)PC(DOPC)、18:2(顺式)PC和18:0-18:2PC(图22D)。其它的不饱和磷脂还可以增强照射时Dox从PoP脂质体中释放出来。具有较高不饱和度的脂质引起更快的释放(图22E)。在NIR光下，18:2(顺式)PC(4个不饱和键)的脂质体在31秒内释放出50％的Dox，而对于含有18:1(顺式)PC(2个不饱和键)的脂质体释放50％Dox的时间增加至46秒。尽管与18:1(顺式)PC相比，18:2(顺式)PC导致更快的释放，但含有18:2(顺式)PC的PoP脂质体显示出更低的装载效率(75％装载效率，表2)。有趣的是，18:0-18:2PC具有与18:1(顺式)PC相同的不饱和度，但光触发的释放速度较慢，116秒内达到释放50％Dox。这可能是由于单线态氧接触到同一链上18:0-18:2PC的不饱和键的概率较低。进一步的研究表明，不饱和脂质的化学构型是重要的，因为18:1(反式)PC在光触发的释放中没有显示明显的增强(图30A)。需要照射505秒才能在18:1(反式)PC中达到释放50％Dox，相比而言18:1(顺式)PC需要照射31秒(图30B)。在此过程中可能发生局部缺陷或不稳定，并最终有助于被18:1(顺式)PC而不是18:1(反式)PC破坏脂质双分子层。

表2：含有不饱和脂质的PoP脂质体的表征

数据显示为平均值±S.D.，n＝3

在光触发的释放期间的DOPC的氧化。单线态氧会引起不饱和磷脂和胆固醇的氧化。通过液相色谱和质谱(LC-MS)评估了近红外照射(310mW/cm²，持续4分钟)前后PoP脂质体的DOPC含量。照射后96％的DOPC被除去(图23A)，并且鉴定出三种DOPC相关的氧化态物质(m/z：832.5814、834.5927和850.5806；被证实是磷脂头基，图23B和图31A)。除了这些DOPC相关物质外，还鉴定出2种胆固醇相关的氧化态物质(m/z：367.3388、383.3298，图31B)。NIR照射下的DOPC氧化动力学显示85％的DOPC在1分钟后被氧化，在这个时间点上约90％所装载的Dox被释放出来(图23C)。延长的NIR照射使得DOPC被进一步氧化，其中在4分钟后99％的DOPC被氧化。DSPC的量在整个照射过程中保持不变(数据未显示)。图23D示出了可能的具有9-氢过氧化物的脂质结构，其与所观察到的DOPC氧化态物质的正确质量(m/z 850.5806)相匹配。单线态氧通过协同加成(或“烯”反应)在双键的任何一端与碳反应，并产生反式构型的烯丙基氢过氧化物。DOPC的两个侧链很可能被氧化，形成9-和10-氢过氧化物的混合物。脂质氢过氧化物不是稳定的物质，容易发生二次氧化。检测到的DOPC氧化态物质的变化相对较高(图25A)，而胆固醇氧化态物质(图31B)相对一致。

烯丙基氢过氧化物的形成可以导致维持脂质体完整性的疏水相互作用的减少，并且可能引起Dox的泄漏和释放的加速(图23E)。进一步的研究显示，在无DOPC的脂质体的情况下，PoP脂质体在NIR照射下释放货物的能力取决于胆固醇的氧化。无胆固醇和DOPC二者的PoP脂质体不能有效释放所封装的染料(图32A)，但含有胆固醇能够进行光触发的释放。氧清除剂亚硫酸钠抑制光诱导的染料释放(图32B)。

就如通过LC-MS监测的，在NIR照射下的脂质氧化被抗坏血酸钠(图22B中所示的抑制光触发的释放的抗氧化剂)抑制。在没有抗氧化剂的情况下，只有18％的完整DOPC在照射后被保留下来。NIR触发的DOPC的减少在抗坏血酸盐存在下被抑制，其中72％的DOPC在照射后被保留下来(图24A)。在抗坏血酸钠的存在下，与没有抗坏血酸钠的样品相比，DOPC相关氧化态物质减少到5％(图24B)。在抗坏血酸盐的存在下，胆固醇相关的氧化态物质的产生也降低到只有约10％(图24C)。与增强光触发的释放对DOPC的依赖性结合在一起，这些结果表明，通过单线态氧的DOPC氧化是NIR照射增强Dox释放的原因。

NIR照射使得PoP脂质体瞬时透化。我们以前报道过，基于观察到的暴露于NIR光后外部钙黄绿素可以被装载到脂质体的核心，PoP脂质体膜只是暂时透化。然而，对于含DOPC的PoP脂质体，不饱和脂质组分被不可逆地氧化，因此膜透化的持久性是值得关注的。记录照射前后的尺寸和多分散性指数(PDI)(图25A和25B)。光处理后脂质体尺寸的增加具有统计学显著意义(105nm相对于119nm，P<0.05)，尽管这可以被认为是脂质体直径的适度变化。PDI升高，但变化不具有统计学显著意义(0.046相对于0.096)。因此，在照射期间脂质体中发生的物理尺寸变化是细微的(subtle)。水溶性染料如钙黄绿素可以在NIR照射下被动装载进空PoP脂质体中。这通过利用凝胶过滤色谱除去游离染料后的含有脂质体的洗脱液中0.77的钙黄绿素:PoP荧光比(图25C)体现出来。在这些条件下，未经照射的脂质体具有接近于0的钙黄绿素:PoP荧光比。有趣的是，当在近红外照射后将钙黄绿素加入到空PoP脂质体中(这与之前通常如何进行的测定相反)，钙黄绿素被封装到经过预照射的空PoP脂质体(calcin/PoP比为0.49)中。这表明经过照射的含有DOPC的PoP脂质体在照射后不会立即重新封闭起来，瞬时膜透化持续存在。为了研究经过预照射的脂质体是否完全重新封闭起来，在照射后的不同时间点将钙黄绿素加入到经过预照射的含有DOPC的空PoP脂质体中。如图25D所示，被封装的钙黄绿素的量随时间减少，其中钙黄绿素:PoP荧光比从NIR照射后立即加入钙黄绿素到照射后10分钟时降低了45％，并到照射后60分钟时降低了82％。因此，经过预照射的PoP脂质体似乎随着时间的推移逐渐重新自己封闭起来，这阻碍了对钙黄绿素的封装。在另一个实验中进一步证实了这一点，其中在照射后立即将钙黄绿素添加到空PoP脂质体中，然后在室温下孵育0、1、10、30和60分钟。在钙黄绿素的存在下对经过预照射的空PoP脂质体进行延长时间的孵育导致增强的钙黄绿素封装(图25E)。大多数光触发的装载发生在较早的时间点，并且在30分钟后几乎没有进一步增加，这表明膜重组和重新封闭发生在大约10分钟。由于经过照射的脂质体重新形成了足够完整的膜结构以将钙黄绿素保留在凝胶过滤柱上，我们研究了经过预照射的脂质体是否可以主动装载Dox。在硫酸铵中用NIR预照射的空PoP脂质体对Dox的主动装载效是低效率的(约2％Dox被装载)(图33)，这表明含有氧化态DOPC和胆固醇的PoP脂质体的稳定性不足以维持Dox主动装载所需的内部硫酸铵梯度(在透析期间)。

体内评价。制备的装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体为约120nm，呈球形(图34A和34B)。脂质体在4℃(避免暴露于光)下储存至少3个月是稳定的。没有观察到可辨别的药物泄漏、尺寸或多分散性指数的变化(图34C、34D和34E)。对于药代动力学研究，将Dox剂量为10mg/kg的脂质体静脉内注射到CD-1小鼠(图26A)。观察到该不含PEG的制剂([DSPC:DOPC:胆固醇(Chol):PoP])的摩尔比为[54.7:5:40:0.3])的循环半衰期为8.3小时，这比我们最近报道的聚乙二醇化的隐形PoP-脂质体制剂([DSPC:PEG-脂质:Chol:PoP]的摩尔比为[53:5:40:2])的21.9小时的半衰期短^[6]。采用相同的注射剂量，与聚乙二醇化的隐形PoP脂质体相比，非聚乙二醇化的PoP脂质体在注射后0.5小时仅显示一半的Dox血清峰浓度(119相对于250μg/ml)、三分之一的中位保留时间(MRT，9.6相对于29.3h)和18％的曲线下面积(AUC，851相对于4837μg·h/ml)。不含PEG的PoP脂质体的清除速率是聚乙二醇化的PoP脂质体的6倍(0.012相对于0.002ml/h/g)，稳态分布体积是聚乙二醇化的PoP脂质体的18.8倍。

采用双侧肿瘤模型来评估化学光疗法诱导的Dox在肿瘤中的累积，其中对一侧胁腹上的肿瘤进行照射，另一侧胁腹上的肿瘤用作未经照射的对照。激光处理(250mW/cm²，持续40分钟)后立即检测Dox的肿瘤摄取(图26B)。与未经照射的肿瘤相比，在经过照射的肿瘤中肿瘤内的Dox累积达到了5.6倍的增加。然而，与先前报道的5mg/kg注射剂量的聚乙二醇化的PoP脂质体相比，未经照射的肿瘤中和经过照射的肿瘤中Dox累积量均较低(分别为0.5相对于1.0μg/g，2.6μg/g相对于7.0μg/g)。非聚乙二醇化脂质体所需的较短循环时间可能是减少沉积的重要因素。此外，PoP还可以诱导光动力学介导的血管透化效应，其可以有助于增强纳米级治疗剂的累积。因此，非聚乙二醇化脂质体中较低的PoP剂量(0.3相对于2mol％)和减弱的肿瘤血管损伤作用可能是经过照射的肿瘤中Dox累积相对较低的原因。激光处理后立即测定Dox在主要器官中的分布，并显示出大部分Dox分布在肾脏、脾脏和肝脏中，其中大量装载有Dox的PoP脂质体在光处理后保持在循环中(图35A)。

对含有5mol％DOPC的装载有Dox的PoP(Dox-PoP)脂质体对MIA PaCa-2异种移植物荷瘤小鼠的抗肿瘤功效进行了评估(图26C)。采用6mg/kg的Dox-PoP脂质体并进行光处理比没有进行光处理而单独采用相同剂量的Dox-PoP脂质体(中位存活期80.5天相对于22.5天，***P<0.001)或采用空PoP脂质体并进行光处理(中位存活期80.5天相对于24.5天，***P<0.001)显著更加有效。与生理盐水对照相比，采用6mg/k的Dox-PoP脂质体而不进行光照射稍微延迟了肿瘤生长(中位存活期22.5天相对于19天，*P<0.05)。与生理盐水对照相比，采用等效剂量的空PoP脂质体并进行激光处理在肿瘤生长抑制作用方面也是略有成效(中位存活期24.5天相对于19天，**P<0.01)。与其它两种单一治疗(单独采用Dox-PoP的化学疗法或采用空PoP脂质体并进行等效光动力疗法)相比，采用Dox-PoP脂质体并进行光处理而增强的功效可能是由于药物释放和化学疗法与光动力疗法的协同作用引起的肿瘤内药物累积增多。

基于单次治疗的化学光疗法的有效性，考察了进行光照下Dox-PoP脂质体的剂量反应(图26D)。与生理盐水对照相比，采用Dox剂量仅为2mg/kg Dox-PoP脂质体并进行激光处理抑制了肿瘤生长(中位存活期23.5天相对于19天，*P<0.05)。4mg/kg的Dox-PoP脂质体并没有比2mg/kg的Dox-PoP脂质体更加显著有效(中位存活期28天相对于23.5天)。6mg/kg的Dox-PoP脂质体比4mg/kg的Dox-PoP脂质体显著更加有效(中位存活期80.5天相对于28天，**P<0.01)，其中6只小鼠中有2只被永久治愈(33％治愈率)。根据肿瘤体积数据，光处理后第19天，与生理盐水相比，2mg/kg的Dox-PoP脂质体并没有以统计学上具有显著意义的程度抑制肿瘤生长，而4mg/kg的Dox-PoP脂质体在肿瘤生长控制方面是有效(*P<0.05)。6mg/kg的Dox-PoP脂质体比4mg/kg Dox-PoP脂质体显著更加有效(*P<0.05)。总之，4mg/kg脂质体对抑制肿瘤生长有效，并且6mg/kg的Dox-PoP脂质体更加有效并可达到33％的治愈率。小鼠的体重在治疗过程中没有重量减轻(图35B、35C)。在激光处理期间没有显著的加热，因为基于用热像仪测量的肿瘤表面温度不超过40℃(数据未显示)。

结论。将包括DOPC的不饱和脂质掺入到PoP脂质体中显著加速了NIR光触发的释放。这允许采用非常少量的PoP(0.1-0.3mol％)来触发快速的光释放，同时在没有NIR照射时保持血清稳定性。光释放速率的增强机理与通过单线态氧氧化DOPC有关。在无DOPC的PoP脂质体的情况下，胆固醇氧化导致光触发的货物释放。采用MIA Paca-2异种移植物的肿瘤抑制作用表现出优异的化学光疗法的疗效。将少量不饱和磷脂与稳定的插入双分子层的光敏剂(例如PoP)组合在一起的策略是诱导光触发的血管内快速释放治疗剂的有用策略。

实验

材料：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-顺式)PC或DOPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](MPEG-2000-DSPE、PEG-脂质或PEG)是从Corden Pharma获得的。(1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)PC)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1(反式)PC)是从Avanti PolarLipids获得的。除非另有说明，其它化学品是从Sigma获得的，所用的PoP是pyro-磷脂，是按照以前所报道合成的。

脂质体制备：除非另有说明，脂质体的各种制剂都是通过与本文所述的相同方法制备的。除非另有说明，本研究中最终确定的PoP脂质体制剂为[DSPC:DOPC:胆固醇:PoP]，[54.7:5:40:0.3]，mol％，其中药物与脂质的摩尔比为1:8。为了产生5mL指定配方的PoP脂质体(20mg/mL总脂质)，60℃下将脂质溶解在1mL乙醇中，然后60℃下注射加入4mL的250mM硫酸铵(pH 5.5)缓冲液。然后利用高压氮气挤出机(Northern Lipids)使脂质体溶液在60℃下通过依次堆叠的孔径分别为0.2、0.1、0.08μm的聚碳酸酯膜10次。通过在由10％蔗糖和10mM组氨酸(pH 6.5)组成的800mL溶液中透析来去除游离的硫酸铵，其中更换至少2次缓冲液。对于装载有磺酰罗丹明(SRB)的PoP脂质体，将指定配方中的脂质溶于乙醇中，并与50mMSRB进行水合，45℃下超声处理30分钟。通过凝胶过滤法收集脂质体洗脱液。

货物装载和PoP脂质体的表征：通过硫酸铵梯度法装载阿霉素(Dox，LC Labs#D-4000)。以1:8的药物与脂质摩尔比将Dox加入到脂质溶液中，并在60℃下孵育1小时。通过进行动态光散射在PBS中测定脂质体尺寸和多分散性指数。通过使稀释在1mL PBS中的25μL脂质体流过(run)Sephadex G-75柱来测定Dox装载效率。收集24份1mL洗脱液(fraction)，并利用TECAN Safire荧光酶标仪(激发和发射波长分别为480nm和590nm)测量每份洗脱液中的Dox荧光。将装载效率确定为药物在含有脂质体的洗脱液中的百分比(前3-8份洗脱液)。利用JEM-2010电子显微镜和1％的乙酸铀酰染色进行负染透射电子显微镜(TEM)观察。通过将在50％无菌牛血清(Pel-Freeze)中稀释200倍的PoP脂质体(20mg/mL脂质)在37℃下孵育指定的时间来进行血清稳定性检测。加入0.25％Triton X-100以读取总Dox荧光。通过荧光测量Dox释放，采用以下公式计算：％Dox_释放＝(F_最终-F_初始)/(F_x-100-F_初始)×100％。

光触发的药物释放：利用功率可调的665nm激光二极管(RPMC激光器)以指定的注量率(310mW/cm²或250mW/cm²，如上所述)进行光触发的释放实验。用荧光计(PTI)实时记录Dox释放。在37℃下对在50％无菌牛血清(Pel-Freeze)中稀释600倍的PoP脂质体(20mg/mL脂质)进行照射。通过将K型热电偶探头直接插入经过照射的溶液中来测量温度。激光照射后加入0.25％Triton X-100以读取总荧光。通过测量处理前后的Dox荧光，采用以下公式来评估Dox释放：％Dox_释放＝(F_最终-F_初始)/(F_x-100-F_初始)×100％。在96孔板中检测抗坏血酸钠对Dox释放的抑制作用，其中将2μL PoP脂质体(20mg/mL脂质)在含有5mM抗坏血酸钠的PBS稀释100倍。以250mW/cm²对样品照射3分钟。在比色皿中检测亚硫酸钠对Dox释放的抑制作用，其中将5μL PoP脂质体(20mg/mL脂质)在含有25mM亚硫酸钠的PBS中稀释600倍。以310mW/cm²对样品照射。

单线态氧测定：采用单线态氧传感器绿(SOSG)试剂(Life Technologies#S-36002)对照射期间由pyro-磷脂产生的单线态氧进行检测。在照射期间用荧光计(PTI)记录SOSG荧光(exc./em.504nm/525nm)。对含有500nM SOSG和装载有Dox的PoP(420nM PoP)脂质体的PBS进行光照射。采用含有5mM抗坏血酸钠或25mM亚硫酸钠的PBS抑制单线态氧的产生。

液相色谱-质谱(LC-MS)：将装载有Dox的PoP脂质体(20mg/mL脂质，[DSPC:DOPC:胆固醇:PoP]，[54.7:5:40:0.3]，mol％)在PBS中稀释100倍，然后对其照射(310mW/cm²)0.5、1、2、4分钟以进行氧化动力学评估。对于氧化抑制作用的检测，将样品在含有5mM抗坏血酸钠的PBS中以310mW/cm²照射4分钟。然后用1:2(v/v)的甲醇:氯仿溶液对1mL经过处理的脂质体进行萃取。收集有机层，并对水层进行再次萃取。将有机层合并，真空干燥并储存在-80℃。将脂质重悬于氯仿中用于LC-MS。采用LC-ESI-QTOF[Agilent 1260HPLC联用Agilent6530精确质量四极杆飞行时间仪器(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)]以正电喷雾电离模式进行LC-MS数据采集。采用带有C5反相保护筒的Luna C5反相柱(5μm，4.6mm×50mm，Phenomenex)实现了色谱分离。流动相A和B分别为95:5水:甲醇(v/v)和60:35:5异丙醇:甲醇:水。每个流动相补充有0.1％(v/v)甲酸和5mM甲酸铵。梯度变化在用0％的流动相B进行3分钟后开始，然后在10分钟内升至100％的流动相B，然后以100％的流动相B持续7分钟，然后用0％的流动相B平衡8分钟。流速为0.5mL/min。利用DualJSI拟合的电喷雾电离(ESI)源。将毛细管电压和碎裂器电压设定为3500V和175V。干燥气体温度为350℃，流速为12L/min。在扩展动态范围内采用m/z为50-1700的范围收集数据。

对于目标分析，用MassHunter Qualitative Analysis(版本B.06.00,AgilentTechnologies)提取每个离子的相应m/z(DOPC m/z＝786.6007，[M+H]⁺，DSPC m/z＝790.6320，[M+H]⁺)。对提取离子色谱中每个离子的峰面积进行手动积分，并以离子计数表示。通过其MS/MS碎片模式确认DOPC和DSPC。以类似的方式进行MS/MS实验。利用不同的碰撞能量来获得最佳电离。观察15V、35V和55V电离时碎片模式。为了鉴定照射后出现的物质，将获得的原始数据导入MassHunter Profinder(版本B.06.00，Agilent Technologies)进行峰比对。用Mass Profiler Professional(MPP，版本12.6.1，Agilent Technologies)进行统计分析并对新鉴定出的物质进行过滤。

光诱导的钙黄绿素的封装：在微孔板中将10μL空PoP脂质体(20mg/mL脂质)在PBS中稀释20倍。在室温下，在665nm下以250mW/cm²进行3分钟激光照射。如所指出的，在照射前或照射后加入钙黄绿素(50mM)。处理后立即将脂质体样品装载到Sephadex G-75柱上(图25C)。为了评估将钙黄绿素封装进经过预照射的空PoP脂质体中的动力学，在照射后的1分钟、10分钟、30分钟或60分钟后立即加入钙黄绿素。然后将样品在室温下孵育3分钟后添加到G-75柱中(图25D)。替代地，在照射(250mW/cm²持续3分钟)前加入钙黄绿素，并在室温下孵育0分钟、1分钟、10分钟、30分钟和60分钟(图25E)。通过利用Sephadex G-75柱进行凝胶过滤来测定钙黄绿素的封装效率。收集16份0.5mL洗脱液，用TECAN Safire荧光酶标仪读取钙黄绿素(485nm/525nm)和PoP(420nm/670nm)荧光。通过简单的除法来计算含有脂质体的洗脱液(第6-9份洗脱液)中的钙黄绿素/PoP的比例。

药代动力学和生物学分布：通过尾静脉向雌性小鼠(雌性CD-1，18-20g，CharlesRiver)静脉内注射装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体(10mg/kg Dox)，n＝4。在注射后0.5、2、4、10、24和28小时，在下颌位置和眼球后位置采集少量血液。将血液在1500×g下离心15分钟。收集10μL血清，并在萃取缓冲液(0.075N HCl，90％异丙醇)中稀释100倍。将样品在-20℃下过夜保存。取出样品并以在10000×g下离心15分钟。收集上清液并通过荧光进行分析。通过标准曲线确定Dox浓度。通过PKsolver分析非房室药代动力学参数。

为了研究生物学分布，在雌性裸鼠(Jackson labs，#007850)的双侧胁腹上接种5×10⁶个MIA Paca-2细胞(n＝4)。静脉注射装载有6mg/kg Dox的含DOPC的PoP脂质体后10min，通过吸入异氟烷而使小鼠麻醉，以250mW/cm²对一侧胁腹上的肿瘤(8-10mm)照射40min，另一侧胁腹上的肿瘤用作未经照射的对照。照射后立即处死小鼠。收集肿瘤和主要器官并在PBS中洗涤，称重，并在核裂解缓冲液[0.25mol/L蔗糖，5mmol/L Tris-HCl，1mmol/L MgSO₄，1mmol/L，CaCl₂(pH 7.6)]中进行匀浆。将Dox在0.075N HCl和90％异丙醇中过夜提取，并如上所述进行定量。

肿瘤生长抑制作用：在5周龄雌性裸鼠(Jackson Labs，#007805)的一侧胁腹上接种5×10⁶个MIA Paca-2细胞。当肿瘤尺寸达到6-8mm时将小鼠随机分为4组，每组5-6只小鼠：(1)Dox-PoP并进行激光照射；(2)空PoP并进行激光照射；(3)Dox-PoP不进行激光照射；(4)生理盐水。经由尾静脉将200μL Dox-PoP(6mg/kg Dox，0.25mg/kg PoP)或空PoP脂质体(0.25mg/kg PoP)进行尾静脉注射。对于剂量反应实验，包括另外两组Dox-PoP(2mg/kgDox)并进行激光处理或Dox-PoP(4mg/kg Dox)并进行激光处理。在静脉注射后10分钟，通过吸入异氟烷使小鼠麻醉。用665nm激光以250mW/cm²处理照射肿瘤40分钟(600J/cm²)。用热像仪监测激光处理过程中的肿瘤温度。通过利用卡尺测量肿瘤的三维，每周记录肿瘤尺寸2-3次。利用椭圆体公式计算肿瘤体积：体积＝π·L·W²/6，其中L和W分别是肿瘤的长度和宽度。小鼠的体重持续监测四周。当肿瘤体积超过初始体积的10倍或在研究结束(90天)时处死小鼠。

统计分析。采用GraphPad Prism(版本5.01)分析数据。用对数秩(Mantel-Cox)检验分析Kaplan-Merier存活曲线(cures)。将中位存活期定义为阶梯存活曲线跨越50％存活的时间。通过单因素方差检验然后进行Tukey多重比较检验分析肿瘤体积曲线。在P<0.05(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)时认为差异具有显著性。

示例4

该示例进一步描述了具有不同PoP的PoP-脂质体的制备、PoP-脂质体的装载以及货物从PoP-脂质体的选择性释放/顺序释放。

针对光激活PoP脂质体，对不同类型的PoP进行了研制。研制出一种基于红紫素-18的新型PoP，其结构与基于环外环的pyro-磷脂不同(图36a)。红紫素-18可商购获得并容易地酯化成溶血脂质。红紫素-PoP纯度超过95％，其身份(identity)通过质谱得到确认。pyro-PoP脂质体和红紫素-PoP脂质体均可以以摩尔比为2:5:40:53的PoP:PEG-脂质:CHOL:DSPC形成，并显示出光谱可分辨的吸收。如图36b所示，激光二极管(665nm和695nm)提供了分离程度良好的两种颜色的PoP脂质体。

接下来，这两种类型的PoP脂质体通过硫酸盐梯度成功地装载阿霉素，并用标准665nm激光器(用于该方案中的所有其它数据)或695nm激光二极管进行激光照射。如图36c所示，665nm激光器为pyro-磷脂PoP脂质体提供了一定程度的选择性透化，而695nm激光更有效地透化了红紫素-脂质PoP脂质体。尽管在这两种情况下两种类型的脂质体最终确实发生了释放，但是通过在仅几分钟后停止激光照射在该系统中实现了选择性释放。

示例5

该示例描述了从血清稳定的PoP脂质体释放出被动装载的货物。

以摩尔比为[50:5:2:32:11]的[CHOL:PEG2K-DSPE:Pyro-磷脂:DSPC:DOPC]形成PoP脂质体，并用50mM磺酰罗丹明B(亲水性染料)进行水合。分离出游离染料后，对脂质体进行激光照射。如图37所示，PoP释放出被动装载货物，并确定2％PoP是最佳的。38

示例6

本示例描述了主动装载的伊立替康从PoP脂质体中释放出来。

采用Doxil样的脂质体制剂并用pyro-磷脂替代一些DSPC可以产生能稳定地装载Dox并具有与无pyro-磷脂的脂质体相似的药代动力学的脂质体。然而，在Dox装载变得不可能之前，存在可以被添加到脂质体中的最大量的pyro-磷脂。发现这个量是胆固醇含量的函数。当胆固醇含量为35mol％时，Dox只能被装载到含有2mol％或更少的pyro-磷脂的脂质体中。在胆固醇含量为45mol％时，Dox可以被装载到含有8mol％的pyro-磷脂的脂质体中。这被怀疑是由于在脂质体中形成了Dox晶体，这导致它们拉伸双分子层并破坏双分子层的稳定性。当含有pyro-磷脂的脂质体装载有IRT(伊立替康)时，没有发现存在这种趋势。采用DSPC:DSPE-PEG2000:胆固醇(摩尔比为60:5:35)制备脂质体，并将pyro-磷脂滴定到脂质体中以代替DSPC。我们发现，尽管Dox不能被装载到含有超过2mol％的pyro-磷脂的脂质体中，但是IRT没有显示出这样的限制，并且可以被装载到含有多达15mol％的pyro-磷脂的脂质体中。(图39A)。还测试了光触发的从这些脂质体中释放IRT。使用先前发现的对于Dox释放是最佳的2mol％pyro，比较了在50％血清中IRT的释放与Dox的释放。结果表明，从PoP-脂质体释放IRT的速度比释放Dox的速度更快(图39B)。为了帮助了解IRT和Dox之间的这些差异，分别拍摄了装载有IRT和Dox的包括DSPC:DSPE-PEG2000Pyro-磷脂:胆固醇(摩尔比为58:5:2:35)的脂质体的冷冻-TEM图像。图像显示装载有IRT的脂质体不像装载有Dox的脂质体那样形成大的晶体，对脂质体的形状也没有影响。相反，IRT形成了占据整个脂质体核心的晶体。(图40)。这表明IRT不改变脂质体的形态，这表明在含pyro-磷脂的脂质体中的Dox的不良装载可能是由于由形成Dox晶体引起的拉伸而导致的双分子层不稳定性。另外还表明更快的释放IRT的速度可能是由于更多散布的晶体，当脂质体双分子层透化时这些晶体比为更为致密的晶体的Dox可以更容易地溶解。

虽然已经参考具体实施方案和示例描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离如本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (25)

1.一种组合物，所述组合物包含纳米囊泡，所述纳米囊泡具有双分子层，其中所述纳米囊泡的所述双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂、和任选的1至6mol％的聚乙二醇-脂质。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述pyro-磷脂具有以下结构：

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱DSPC和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱DOPC。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述双分子层包括0.5至1.0mol％的pyro-磷脂、35至45％的胆固醇，其余由所述未与pyro缀合的磷脂组成。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物选自由以下组成的组：

i)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP： 53:5:40:2；

ii)DSPC:DOPC:胆固醇:PoP： 55:5:40:0.5；

iii)胆固醇:DSPC:DOPC:PEG-脂质:PoP： 45:35:13:5:2；和

iv)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP： 60:5:35:2。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述纳米囊泡存在于载体中，其中所述载体是生理缓冲液。

7.如权利要求1、2或4中任一项所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括DSPC和DOPC，其中所述DOPC以0.1至5mol％存在。

8.如权利要求2所述的组合物，其中所述纳米囊泡包含0.5至5mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、DSPC和DOPC，其中DSPC和DOPC一起为45至61mol％，并且其中DOPC为0.1至5mol％。

9.如权利要求1所述的组合物，其中货物分子存在于所述纳米囊泡中。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述货物是阿霉素、伊立替康、柔红霉素或其组合。

11.如权利要求9所述的组合物，其中所述纳米囊泡包括治疗剂和成像剂，所述治疗剂和所述成像剂是不同的分子。

12.如权利要求9所述的组合物，其中所述货物存在于所述纳米囊泡的内部水性隔室中。

13.如权利要求9所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂与货物药物的摩尔比为10:1至5:1。

14.如权利要求1所述的组合物，还包含另一种类型的纳米囊泡，其中所述另一种类型的纳米囊泡包含0.5至8mol％的红紫素-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与红紫素缀合的磷脂、和任选的1至6mol％的聚乙二醇-脂质，其中所述红紫素-磷脂与所述pyro-磷脂具有不同的最大吸收值。

15.权利要求1至14中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于将货物递送到所需位置，包括以下步骤：

a)向个体施用所述组合物以使其进入循环系统；

b)允许纳米泡囊到达所述所需位置；和

c)将所述纳米泡囊暴露于波长为650至1000nm的近红外照射以使得所述货物从所述纳米泡囊中释放出来。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述纳米囊泡包括成像剂，并且还包括以下步骤：在施用后和使所述纳米囊泡暴露之前对所述个体进行成像，并确定所述纳米囊泡已经到达所述所需位置。

17.如权利要求15所述的用途，其中所述个体是人或非人哺乳动物。

18.如权利要求15所述的用途，其中使所述纳米囊泡暴露于658、665或671nm的波长。

19.如权利要求15所述的用途，其中使所述纳米囊泡暴露于近红外照射长达30分钟。

20.如权利要求15所述的用途，其中步骤c)进行的是多次暴露于所述近红外照射。

21.权利要求1至14中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于控制释放货物，包括：

a)提供包含在载体中的纳米囊泡的组合物，其中所述纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，其中在室温至37℃的温度下不存在能够检测的货物的释放；和

b)将所述组合物暴露于来自具有10至350mW/cm²的功率的激光器的波长为650-1000nm的光，

其中至少90％的所述货物在步骤b)中暴露于光后的1至8分钟内被释放出来。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括DSPC和DOPC，并且其中DOPC以0.1-5mol％存在。

23.如权利要求21所述的用途，其中所述pyro-磷脂以0.5至1.0mol％存在，并且其中至少50％的所述货物在1分钟内被释放出来。

24.权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于顺序释放多种货物，包括：

a)向个体施用至少第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡，

其中所述第一类型的纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂、和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，

其中所述第二类型的纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的红紫素-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与红紫素缀合的磷脂、和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，

其中所述第一类型的纳米囊泡和所述第二类型的纳米囊泡分别含有的所述pyro-磷脂与所述红紫素-磷脂具有不同的最大吸收值；和

b)将所述组合物顺序暴露于至少两种不同波长的光，其中第一波长对应于所述第一类型的纳米囊泡含有的所述pyro-磷脂的所述最大吸收值，并且第二波长对应于所述第二类型的纳米囊泡含有的所述红紫素-磷脂的所述最大吸收值；

从而使得所述第一类型的纳米泡囊中和第二类型的纳米泡囊中的货物顺序释放出来。

25.如权利要求24所述的用途，其中至少两种类型的纳米囊泡存在于相同组合物中。

Images