CN107603982B - 诊断Piwil1基因突变导致的男性不育的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断Piwil1基因突变导致的男性不育的方法及试剂盒。本发明揭示了一种与男性不育如无精症相关的基因，即Piwil1基因。并且，鉴定了Piwil1基因多处突变可导致男性不育的发生。因此，Piwil1基因可作为诊断男性不育的靶基因，并且可被应用于开发对于上述疾病有效的治疗药物。本发明还首次对PIWIL1参与鱼精蛋白取代组蛋白的机制给出了解释。

Description

诊断Piwil1基因突变导致的男性不育的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于诊断基因突变的领域，更具体地，本发明涉及诊断Piwil1基因突变导致的男性不育的方法及试剂盒，以及可治疗男性不育的多肽。

背景技术

基因组DNA在真核细胞中多被以八聚体形式存在的组蛋白结合，然而在许多动物的成熟精子中组蛋白将被鱼精蛋白取代。鱼精蛋白是一类小的、高碱性的蛋白分子，其与DNA结合可以形成更为紧密的结构，从而将基因组DNA压缩存储在的精子头部，这对于形成功能性的精子至关重要。鱼精蛋白取代组蛋白是一个复杂的过程，其发生于减数分裂后的变形期，此时雄性生殖细胞自球型精子细胞经由变形期形成成熟精子。尽管鱼精蛋白发现至今已过百年，人们也已经认识到组蛋白替换缺陷与男性不育存在关联，但是其中的致病机制至今尚未得到很好的阐述。

进化保守的PIWI蛋白属于Argonaute蛋白家族的PIWI亚家族成员，其特异性的在生殖细胞中表达。多种PIWI蛋白可以与生殖细胞特异性的PIWI相互作用RNA(piRNAs)相结合，从而维持基因组的稳定性与完整性。大量研究表明，PIWI蛋白在线虫、果蝇、鱼、小鼠的配子发生过程中发挥了重要的作用。例如，果蝇中的PIWI蛋白家族包括Argonaute 3，Aubergine与PIWI三个家族成员，其对于雄性及雌性果蝇生殖细胞的形成及生殖干细胞的维持都是必需的。小鼠包含三个PIWI家族成员，MIWI、MILI、以及MIWI2，这三者均在睾丸中高表达，且对雄性个体的可育性十分重要。

PIWI蛋白包括四个功能域：N端、PAZ、MID以及PIWI。其中，PAZ与MID功能域可以结合piRNA，PIWI功能域可以发挥RNase H的活性，但是对于N端的功能现在还未得到很好的阐释。

人的PIWI家族包括HIWI(PIWIL1)、HILI(PIWIL2)、HIWI2(PIWIL4)和PIWIL3四个成员，其均主要在睾丸中表达，但其在生精细胞发育过程中的作用机制并不清楚。尽管Gu及其同事在2010年报道了在Hiwi中的几个SNP，但是目前尚无相关功能方面的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供诊断人Piwil1基因突变导致的男性不育的方法及试剂盒，以及可治疗男性不育的多肽。

在本发明的第一方面，提供一种突变型人Piwil1基因或其编码的多肽，相应于野生型人Piwil1基因或多肽，该突变型人Piwil1基因的核苷酸序列第649-672位碱基中存在碱基突变；或相应于野生型人Piwil1基因编码的多肽，该突变型人Piwil1基因编码的多肽的氨基酸序列第217-224位中存在氨基酸突变。

在一个优选例中，所述的第649-672位碱基中存在碱基突变包括：第649-651位的AGG突变为GCG；或第658-660位的TTG突变为GCG，GGG，CGG；或第670-672位的AAT突变为CAT；或所述的第217-224位中存在氨基酸突变包括：第217位由R突变为A；或第220位由L突变为A、G或R；或第224位由N突变为H。

在本发明的另一方面，提供人Piwil1基因或其编码的蛋白在制备诊断男性不育(如无精症)的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的另一方面，提供特异性识别所述的突变型基因或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备诊断男性不育的试剂或试剂盒。

在一个优选例中，所述的试剂包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位碱基中是否发生突变的引物、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的第649-672位碱基中发生突变，包括：第649-651位的AGG突变为GCG；或第658-660位的TTG突变为GCG，GGG，CGG；或第670-672位的AAT突变为CAT。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断男性不育的试剂盒，它包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位是否发生突变的引物、探针或芯片。

在一个优选例中，所述的引物是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：PCR扩增缓冲液，DNA聚合酶和/或说明试剂盒使用方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种筛选治疗男性不育的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理PIWIL1与RNF8相互作用的体系；和(2)检测所述PIWIL1与RNF8相互作用的体系中PIWIL1与RNF8相互作用情况；若所述候选物质在统计学上抑制(优选显著抑制，如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)PIWIL1与RNF8相互作用，则表明该候选物质是治疗男性不育的潜在物质；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到PIWIL1与RNF8相互作用的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中PIWIL1与RNF8相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的PIWIL1与RNF8相互作用的体系；如果测试组中PIWIL1与RNF8相互作用显著弱于(如弱20％以上，较佳的弱50％以上；更佳的弱80％以上)对照组，就表明该候选物质是治疗男性不育的潜在物质。

在另一优选例中，所述的PIWIL1与RNF8相互作用的体系是：细胞(细胞培养物)体系，亚细胞体系，动物模型体系等。

在另一优选例中，所述的候选物质是针对PIWIL1或RNF8特别设计的促进剂或抑制剂，干扰分子等。

在另一优选例中，通过观察RNF8的进入细胞核的情况或进入细胞核的量来确定PIWIL1与RNF8相互作用的强度。若是RNF8进入细胞核的量显著增加，则表明两者的相互作用减弱；若是若是RNF8进入细胞核的量显著减少，则表明两者的相互作用增强。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗男性不育的多肽，该多肽是具有RNF8中第1-210位氨基酸序列的多肽(RNF8-N)；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备治疗男性不育的药物组合物或药盒；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗男性不育的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的多肽；以及药学上可接受的载体；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在本发明的另一方面，提供一种筛选治疗男性不育的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理包含突变型人Piwil1基因或其编码的多肽的体系；(2)鉴定人Piwil1基因或其编码的多肽突变是否被回复；若是被回复，那么该候选物质为治疗男性不育的潜在物质；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在一个优选例中，所述的包含突变型人Piwil1基因或其编码的多肽的体系是：细胞(细胞培养物)体系，亚细胞体系，动物模型体系等。

在另一优选例中，所述的候选物质是针对人Piwil1基因或其编码的多肽特别设计的促进剂或抑制剂，干扰分子等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、无精症患者HIWI蛋白D-box元件突变。

(A)无精、少弱精症患者HIWI蛋白D-box元件突变情况统计。

(B)无精症患者Hiwi基因中D-box元件所对应的DNA序列示意图。D-box元件对应Hiwi基因中第6、7外显子中的部分区域(红色)，#1、#2及#3号患者其Hiwi基因中D-box元件对应区域发生核苷酸遗传突变。

(C)无精症患者HIWI蛋白D-box元件氨基酸序列示意图。#1、#2及#3号患者其HIWI蛋白D-box元件中保守氨基酸发生遗传突变。

(D)#1、#2号患者遗传系谱图。其中，正方形白框表示不携带突变男性，正方形黑框表示携带突变男性，圆形白框表示不携带突变女性，圆形黑框表示携带突变女性。

图2、MIWI D-box突变小鼠雄性不育。

(A)条件性点突变的打靶载体主要包括以下功能元件：5’端和3’端loxP位点分别插入在intron 5和intron 8中；Miwi基因exon 6-22cDNA序列与3×stop位于5’端和3’端loxP之间。

(B)与野生型母鼠交配，Miwi^+/DB-Cre小鼠没有后代产生，与其同窝Miwi^+/DB小鼠均有后代产生。

(C)苏木精伊红染色12周龄小鼠睾丸石蜡切片，依据小鼠精子生成将发育阶段分为I-XII共十二个阶段。

(D)Miwi^+/DB-Cre小鼠后期精子细胞的14-16期剧烈减少。

(E)免疫荧光检测Miwi^+/DB-Cre及Miwi^+/DB小鼠睾丸后期精子细胞中MIWI蛋白表达情况。

(F)MIWI条件性点突变的打靶载体的结构示意图。

图3、Miwi^+/DB-Cre小鼠精子存在缺陷。

(A-B)Miwi^+/DB-Cre小鼠精子大量减少。

(C)Miwi^+/DB-Cre小鼠精子活力严重下降。

(D)Miwi^+/DB-Cre小鼠大部分精子头部反向弯曲。其中，左图为精子照片，右图为头部反向弯曲的精子的统计。

(E-F)Miwi^+/DB-Cre小鼠精子染色质压缩不紧密。

图4、Miwi^+/DB-Cre小鼠精子鱼精蛋白替换组蛋白进程发生障碍。

(A)免疫荧光检测成熟精子中组蛋白H2A、H2B、H3、H4。(B)Western blotting检测成熟精子中组蛋白及鱼精蛋白的表达情况。(C)Western blotting检测转换蛋白、鱼精蛋白在可溶组分及其染色质结合组分中的分布情况。

图5、Miwi在后期精子细胞中通过抑制RNF8入核从而阻碍了组蛋白的泛素化。

(A-B)Western blotting及免疫荧光检测后期精子细胞中组蛋白、ub-H2A、ub-H2B及其H4K16ac的表达水平。(C)敲低MIWI后检测ub-H2B的表达情况。(D)分离球型精子细胞和后期精子细胞检查MIWI与RNF8的表达及定位情况。(E)敲低MIWI后检测RNF8与ub-H2B的表达及定位情况。(F)体外泛素化实验验证MIWI、D-box mutant MIWI及MILI对RNF8 E3活性的影响。

图6、RNF8通过位于N端的⁶⁸QNPEG⁷²结构域与MIWI相互作用。

(A)筛选MIWI与RNF8相互作用位点的示意图。(B)RNF8的N端与MIWI存在相互用。(C)RNF8-N可以与RNF8竞争结合MIWI。(D)RNF8-N可以回复MIWI对RNF8 E3活性的抑制。

图7、RNF8-N可以回复Miwi^+/DB-Cre小鼠缺陷的精子形成过程。

(A-B)转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测RNF8在后期精子细胞的定位情况。(B)转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测ub-H2B在后期精子细胞的表达情况。(C)转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测H2B在成熟精子的表达情况。(D)MIWI通过扣押RNF8调控后期精子细胞中鱼精蛋白替换组蛋白过程。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种与男性不育如无精症相关的基因，即人Piwil1基因。并且，鉴定了人Piwil1基因多处突变可导致男性不育的发生。因此，人Piwil1基因可作为诊断男性不育的靶基因，并且可被应用于开发对于上述疾病有效的治疗药物。本发明首次鉴定了人Piwil1基因突变可以直接导致不育的发生，并首次对PIWIL1参与鱼精蛋白取代组蛋白的机制给出了解释。

如本文所用，人类Piwil1基因又称为Hiwi基因，两者可以互换使用。

如本文所用，小鼠Piwil1基因又称为Miwi基因，两者可以互换使用。

突变位点及其应用

本发明人通过对数百例无精症患者在基因水平上的研究分析，首次发现了人Piwil1基因上的多个突变位点与男性不育密切相关。进一步地，本发明人构建了该基因突变的条件型基因敲入小鼠，论证了该基因突变可以直接导致雄性不育，并且在发生机制上给出了解释。

基于本发明的新发现，人Piwil1基因的突变位点有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：研发检测人Piwil1基因的突变位点的检测试剂，如测序引物，探针，基因芯片。

基于本发明人的上述新发现，可以将人Piwil1基因第649-672位范围内的突变作为标志，从而：作为男性不育的鉴别诊断、和/或易感性分析的工具，早期评估检测对象是否存在男性不育，以期及时治疗。

在检测相关位点的变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA，或针对mRNA。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。

可采用各种技术来检测人Piwil1基因第649-672位范围内是否存在突变，这些技术均包含在本发明中。例如，基于相关位点制备基因芯片。此外，可用相关位点特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)来进行体外鉴定；或者可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行体外鉴定；或者可利用特异性的限制性内切酶来进行体外鉴定。

作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，并且该引物的3’端距离变异位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，只有当加入的ddNTP与变异位点碱基互补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断变异的类型。

检测试剂或试剂盒

本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点(人Piwil1基因第649-672位范围内)的试剂。所述的试剂例如是：对相关突变位点特异的引物；对相关突变位点特异的探针；或对相关突变位点特异的限制性内切酶。

作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其扩增出的扩增产物含有对应于人Piwil1基因第649-672位范围内的碱基。更优选的，所述的引物具SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的序列。上述引物扩增获得的扩增产物特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性，特别适合用于分析所述的突变。

针对变异位点的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与发生突变区域发生特异性结合，而不可与未发生突变区域特异性结合，且所述探针带有可检测信号。

本发明还提供了用于在分析物中检测是否含有所述变异位点的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位范围内是否发生突变的引物、探针、芯片。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

与PIWIL1相互作用的蛋白及其应用

本发明人发现，PIWIL1蛋白与泛素连接酶RNF8相结合，将其扣押在后期精子细胞的细胞质中，使RNF8无法进入细胞核发挥自身的E3活性，泛素化H2B，进而无法起始鱼精蛋白替换组蛋白的细胞进程。因此，PIWIL1在后期精子细胞中通过抑制RNF8入核从而阻碍了组蛋白的泛素化。异常的精子细胞存在组蛋白异常积累，由此发育来的成熟精子无法使卵细胞受精。

因此，本发明人设计了一系列RNF8片段，筛选出RNF8可以特异性与PIWIL1相互作用的区段(RNF8-N)。RNF8-N可以与RNF8竞争结合PIWIL1。该结果提示，RNF8-N是一种可用于治疗无精症的多肽。其它可以与RNF8竞争结合PIWIL1的、来源于RNF8的多肽，或者RNF8-N的功能性(即保持RNF8-N功能不变)变体或衍生物(保守性变异多肽)也可被应用于治疗无精症。

编码RNF8-N多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列(编码序列)、表达RNF8-N的表达载体或细胞也可以应用到本发明中。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的RNF8-N多肽或其保守性变异多肽，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于改善或治疗男性不育。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在得知了RNF8-N多肽的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的RNF8-N多肽、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明所述的RNF8-N多肽的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的RNF8-N多肽的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

筛药方法

在得知了筛选出RNF8可以特异性与PIWIL1相互作用之后，可以基于该特征来筛选潜在的治疗男性不育的物质。可从所述的物质中找到对于改善或治疗男性不育真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选治疗男性不育的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理PIWIL1与RNF8相互作用的体系；和(2)检测所述PIWIL1与RNF8相互作用的体系中PIWIL1与RNF8相互作用情况；若所述候选物质在统计学上抑制(优选显著抑制，如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)PIWIL1与RNF8相互作用，则表明该候选物质是治疗无精症的潜在物质；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到细胞中PIWIL1与RNF8相互作用的变化情况，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的PIWIL1与RNF8相互作用的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于改善或治疗男性不育真正有用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

载体构建

p3×Flag-MIWI与pCMV-Myc-RNF8的构建

通过将小鼠piwil1(即MIWI)的CDS(SEQ ID NO:1)与RNF8(NM_021419)的CDS(SEQID NO:2)分别接入p3×Flag-CMV-14(Sigma)与pCMV-Myc(Clontech)，获得p3×Flag-MIWI与pCMV-Myc-RNF8。

RNF8-N突变体的构建

RNF8的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，长度为488aa。KOD-Plus-mutagenesiskit(GE Healthcare)，基于pCMV-Myc-RNF8获得一系列RNF8突变体。各RNF8片段如下：

RNF8-FL：具有全长RNF8的氨基酸序列；

RNF8-△C：RNA8第1-447位氨基酸序列；

RNF8-△N：RNA8第210-488位氨基酸序列；

RNF8-△FHA：RNA8第111-488位氨基酸序列；

RNF8-△90：RNA8第90-488位氨基酸序列；

RNF8-△60：RNA8第60-488位氨基酸序列；

RNF8-△30：RNA8第30-488位氨基酸序列；

RNF8-N：RNA8第1-210位氨基酸序列；编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:3；

RNF8-N^mut：RNA8第1-210位氨基酸序列，其中第68-72位由QNPEG突变为AAAAA。

质粒构建

针对于小鼠MIWI的shRNAs通过使用慢病毒shRNA载体pSilencer-H1-LV构建完成，原始pSilencer载体(Ambion)在H1启动子启动的shRNA下游插入了CMV启动子启动的GFP。

pLV-Prm-RNF8-N-IRES-Cyto IV-EGFP载体改造自Lenti-oct4-EGFP(SiDanSai)，后者的oct4启动子被0.6kb的protamine1启动子(NM_013637；SEQ ID NO:5)替换，EGFP序列(SEQ ID NO:4)前端融合了Cyto IV的线粒体定位信号(NM_001181052)。鱼精蛋白(prm，NM_013637)启动子插入到该质粒的4234位；RNF8-N插入到该质粒的4971位；Cyto IV(NM_001181052)插入到该质粒的6337位。

GST-RNF8表达载体的构建通过将小鼠RNF8(NM_021419)的CDS接入pGEX-KG(GEHealthcare)的MCS(多克隆位点)区段获得。

细胞培养与转染

HEK293T(293T)来自于American Type Culture Collection(ATCC)。细胞培养所需培养基与血清均按照ATCC要求购买配制。转染试剂为Lipofectamine2000(Invitrogen)，转染过程依据产品说明书执行。对于6孔板而言，转染RNA剂量为100nM piRNA或者scrambled siR。转染DNA剂量为4ug质粒。

抗体

Anti-Myc(M4439)，anti-Flag(F3165)，anti-β-actin(A3854)小鼠单克隆抗体购买于Sigma。

Anti-Ub(sc-8017)抗体购买于Santa-Cruz。

anti-Prm1，anti-Prm2抗体购买于Briar Patch Bioscience。

anti-H2A，anti-H2B，anti-H3，anti-H4，anti-ub-H2B，anti-H3K37me3兔多克隆抗体购买于Cell Signaling Technology。

anti-RNF8，anti-TNP1抗体购买于Proteintech。

anti-α-tubulin抗体购买于Bioworld。

anti-HIWI抗体购买于Santa-Cruz。

免疫沉淀

免疫沉淀实验中，将小鼠生精细胞裂解，裂解液配方为50mMTris-HCl(pH 7.4)，1％Triton X-100，150mM NaCl，5mM EDTA，1×Complete Mini，proteinase Inhibitorcocktail(Roche)。离心并去除沉淀后，加入一抗孵育过的Protein A/G磁珠。4℃环境中将细胞裂解液与磁珠孵育4-6小时。孵育完成后，使用洗涤液清洗磁珠，洗涤液配方为50mMTris-HCl(pH 7.4)，0.1％Triton X-100，500mM NaCl，5mM EDTA，proteinase inhibitorcocktail。免疫沉淀组分与细胞裂解液组分同时使用SDS上样缓冲液稀释一倍完成样品制备。

通过SDS-PAGE与免疫印迹标准流程对样品进行分析。跑胶条带通过LAS4000成像分析仪进行定量分析。

免疫染色与免疫组化

睾丸切片或者分离的生精细胞涂片通过4％多聚甲醛进行固定，于0.5％的TritonX-100中进行透膜，孵育一抗后与和Alexa Fluor 488or Cy3偶联的二抗进行孵育，细胞核通过DAPI进行染色。激光共聚焦扫描成像通过Leica TCS SP5完成。免疫染色通过Image J软件完成定量分析。

睾丸或附睾石蜡切片通过HE(Hematoxylin and Eosin)染色，生精小管所处时期与生精细胞所处阶段划分参考前人工作(Russell et al.，1990)。

在扫描电镜实验中，将附睾尾部切开后，精子游离到0.1M的磷酸缓冲液(pH7.4)中。通过2.5％戊二醛将精子固定于载玻片上。样品使用四氧化锇处理后，梯度乙醇进行脱水，然后进行喷金处理。最终样品通过SEM(FEI Quanta250)进行检测。

在透射电镜实验中，附睾尾部切块通过0.05％戊二醛固定后，使用1％四氧化锇进行处理。梯度乙醇脱水后，使用Epon812进行包被。获得的超薄切片依次进行乙酸双氧铀与柠檬酸铅染色后通过TEM(FEI Tecnai G2 Spirit)进行观察。

酸性苯胺染色

酸性苯胺(AS)染色依据前人工作进行(Roux et al.，2004)用于考察精子细胞核染色质压缩情况。流程如下：将收集于附睾尾部的精子涂布在载玻片上风干，使用4％PFA固定30分钟后用PBS清洗，然后使用0.2％Triton X-100处理15分钟。将样品使用酸性苯胺染色后观察。

慢病毒包装与睾丸转导

表达RNF8-N-IRES-Cyto IV-EGFP的慢病毒载体(pLV-Prm-RNF8-N-IRES-Cyto IV-EGFP载体)包含约0.6kb的protamine1启动子序列，目的蛋白RNF8-N序列及融合了Cyto IV定位信号的EGFP。病毒上清在4℃、50000g离心90分钟后获得高滴度病毒(10⁸转导单位/ml)。

将5周龄雄性小鼠使用戊巴比妥钠麻醉后，将小鼠睾丸取出，于实体镜下注射20微升高滴度病毒进入小鼠睾丸生精小管。将睾丸归位后将小鼠腹腔缝合。

Miwi D-box突变条件型敲入小鼠的制备

Miwi D-box突变条件型敲入小鼠由北京百奥赛图公司协助制备。流程如下，打靶载体将两侧包含loxP的部分Miwi cDNA(6-22号外显子)置于6号外显子上游。进行Southernblot检测打靶的ES细胞，挑选阳性克隆注射C57/BL6系小鼠囊胚。检测由囊胚发育来的小鼠是否成功打靶。

将携带打靶载体的小鼠与TNAP-Cre小鼠进行交配获得Miwi D-box突变条件型敲入小鼠。

实施例1、无精症患者中Hiwi D-box突变的鉴定

人类Piwil1基因又称为Hiwi基因。野生型的Hiwi mRNA的序列如SEQ ID NO:10；氨基酸序列如SEQ ID NO:11。

本发明人对人类基因组序列进行了大量的分析工作，确定了无精症患者Hiwi基因的D-box元件编码的横跨第6和第7位外显子序列(在全长45kb中约1kb左右)。本发明人筛查了300例正常人与413例非梗阻性无精症患者，发现其中在无精症患者中的三例存在D-box元件的突变，位于HIWI氨基酸序列的第217，220或224位上，如图1A～C。

这些突变位于D-box序列元件范围内，即人类PIWIL1(HIWI)的第217-224个氨基酸(包含217与224)以内，正常序列为：RRLLKIMN。从基因水平而言，为第649-672位碱基(正常序列为AGGAGGCTTTTGAAAATCATGAAT(SEQ ID NO:9))范围内发生突变，包括：第649-651位的AGG突变为GCG；第658-660位的TTG突变为GCG，GGG，CGG；第670-672位的AAT突变为CAT。

本发明人进一步检查了患者直系亲属基因组中相关的位点，发现其中有1位患者(称为“1号患者(#1)”)的突变来自于其母亲，如图1D。

这些发现有力地证明，通过雌性遗传到后代的Hiwi突变可以导致雄性不育。

为了鉴定相关位点是否发生突变，本发明人设计了特异性鉴定突变位点的引物如下：正向引物G-F：TTGCCTTATTAAGCAAGCAGTATGTG(SEQ ID NO:7)；反向引物G-R：ACATAATGTGATGGGCGGCATTAAC(SEQ ID NO:8)。

实施例2、条件型基因敲入D-box突变的小鼠模型的构建及表型鉴定

本发明人依据1号患者的突变情况，利用小鼠，构建了条件型基因敲入D-box突变的小鼠模型(MIWI D-box突变小鼠)，构建策略如图2A。

分析了MIWI基因的结构后，发现点突变R218A(对应于Hiwi氨基酸序列的第217位R)位于exon 7(ENSMUSE00000313528)上，点突变L221A(对应于Hiwi氨基酸序列的第220位L)位于exon 8(ENSMUSE00000313519)上。

MIWI条件性点突变的打靶载体主要包括以下功能元件：5’端和3’端loxP位点分别插入在intron5和intron8中；Piwil1基因exon 6-22cDNA序列与3×stop位于5’端和3’端loxP之间；正筛选标记Neo cassette，两侧是Frt位点；5’端和3’端的同源臂分别为6.6kb和4.2kb；负筛选标记DTA，可以减少非同源重组的ES细胞克隆，提高ES细胞筛选效率。该打靶载体示意图见图2F。

打靶载体线性化后，电转ES细胞，经过G418筛选，共挑选出400个克隆。经5’Probe和3’Probe的Southern筛选后，筛选到正确重组的ES细胞克隆。将正确重组的ES克隆显微注射小鼠，获得F1代杂合子小鼠，即MIWI^+/DB。

将杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠(南京大学模式动物研究所，编号为J008569)交配，实现目的基因组织特异性点突变，获得条件性基因点突变小鼠(Miwi^+/DB-Cre小鼠)。

并且，对上述MIWI D-box突变小鼠的表型进行了鉴定。

本发明人发现，与野生型母鼠交配，Miwi^+/DB-Cre小鼠没有后代产生。与其同窝Miwi^+/DB小鼠在于野生型母鼠交配后则均有后代产生，如图2B。

本发明人利用苏木精伊红染色12周龄小鼠睾丸石蜡切片，依据小鼠精子生成将发育阶段分为I-XII共十二个阶段，如图2C。

本发明人发现，Miwi^+/DB-Cre小鼠存在MIWI蛋白异常累积且无法生育，其后期精子细胞在14-16期大量减少，如图2D～E。

与此同时，通过免疫荧光检测，本发明人还发现，Miwi^+/DB-Cre基因型小鼠附睾中成熟精子数量大大减少，且存在形态异常(图3A～B)。Miwi^+/DB-Cre小鼠的精子活力严重下降，如图3C。Miwi^+/DB-Cre小鼠大部分精子头部反向弯曲，如图3D。

此外，携带D-box元件突变的小鼠(Miwi^+/DB-Cre小鼠)的精子的染色质还存在压缩不紧密的问题，如图2E。

实施例3、Miwi^+/DB-Cre小鼠精子鱼精蛋白替换组蛋白进程发生障碍

人类Piwil1基因在小鼠中的同源基因是Miwi基因。

本发明人进一步对Miwi^+/DB-Cre小鼠进行分析，发现该基因型小鼠成熟精子存在组蛋白滞留，推测其鱼精蛋白取代组蛋白进程发生障碍。

如图4A，免疫荧光检测可见，Miwi^+/DB-Cre小鼠成熟精子中组蛋白H2A、H2B、H3、H4相较于Miwi^+/DB小鼠成熟精子均有大量累积。

如图4B，Western blotting检测成熟精子中组蛋白及鱼精蛋白的表达情况可见，Miwi^+/DB-Cre小鼠成熟精子中组蛋白H2A、H2B、H3、H4相较于Miwi^+/DB小鼠成熟精子均有大量累积，Miwi^+/DB-Cre小鼠成熟精子中鱼精蛋白PRM1、PRM2相较于Miwi^+/DB小鼠成熟精子均有大量减少。

如图4C，Western blotting检测转换蛋白、鱼精蛋白在可溶组分及其染色质结合组分中的分布情况可见，Miwi^+/DB-Cre小鼠后期精子中组蛋白H2A、H2B、H3、H4相较于Miwi^+/DB小鼠后期精子均有大量累积，Miwi^+/DB-Cre小鼠后期精子中转换蛋白TNP1、鱼精蛋白PRM1、PRM2相较于Miwi^+/DB小鼠后期精子均有大量减少。

本发明人发现，MIWI蛋白的异常积累扣押了正常应该入核的RNF8，使其无法完成对组蛋白H2B的泛素化，进而无法启动鱼精蛋白取代组蛋白的细胞进程。

Western blotting及免疫荧光检测后期精子细胞中组蛋白、ub-H2A、ub-H2B及其H4K16ac的表达水平的结果如图5A～B，可见，Miwi^+/DB-Cre小鼠后期精子中组蛋白、ub-H2A、ub-H2B及其H4K16ac相较于Miwi^+/DB小鼠后期精子均有大量减少。

敲低MIWI后检测ub-H2B的表达情况如图5C，可见，敲低MIWI后ub-H2B的表达出现显著上升。

分离球型精子细胞和后期精子细胞检查MIWI与RNF8的表达及定位情况如图5D，可见，Miwi^+/DB小鼠后期精子中RNF8在细胞核中分布，MIWI消失；Miwi^+/DB-Cre小鼠后期精子中RNF8在细胞质中分布，MIWI未消失且与RNF8共定位。

敲低MIWI后检测RNF8与ub-H2B的表达及定位情况如图5E，可见，敲低MIWI后RNF8可以重新进入细胞核并且ub-H2B开始表达。

体外泛素化实验验证MIWI、D-box mutant MIWI及MILI对RNF8 E3活性的影响如图5F，可见，MIWI及其D-box mutant MIWI可以抑制RNF8的活性但是MILI不抑制RNF8的活性。

因此，Miwi在后期精子细胞中通过抑制RNF8入核从而阻碍了组蛋白的泛素化。

实施例4、RNF8-N能够影响MIWI与RNF8的相互作用

本发明人设计了一系列RNF8片段(图6A)，筛选出RNF8可以特异性与MIWI相互作用的区段(RNF8-N)(图6B)，并且发现将其中68-72位的五个氨基酸突变后该相互作用丧失。本发明人用该区段成功地回复了Miwi^+/DB-Cre小鼠异常精子的表型，而使用RNF8-N^mut区段无法回复Miwi^+/DB-Cre小鼠异常精子的表型(筛选方法是体外免疫共沉淀，野生型与突变型MIWI均与RNF8存在相互作用，因为突变位点并不影响相互作用)。

本发明人发现，RNF8-N能够影响MIWI与RNF8的相互作用，RNF8-N(而非RNF8-N^mut)可以与RNF8竞争结合MIWI(图6C)。此外，RNF8-N(而非RNF8-N^mut)可以回复MIWI对RNF8 E3活性的抑制(图6D)。

实施例5、RNF8-N可以回复Miwi^+/DB-Cre小鼠缺陷的精子形成过程

本发明人构建了一个Myc标签标记的RNF8-N-IRES-Cyto IV-EGFP(及RNF8-N^mut-IRES-Cyto IV-EGFP)融合蛋白慢病毒载体。RNF8-N-IRES-Cyto IV-EGFP融合蛋白慢病毒载体由后期精子细胞特异性表达蛋白PRM1的启动子启动，并表达RNF8-N肽段区。通过在GFP上添加一个线粒体锚定信号(Cyto)形成一个能定位在精子细胞线粒体上的Cyto-EGFP来追踪转导后的精子细胞。

在后期精子细胞中转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测RNF8在后期精子细胞的定位如图7A。可见在转导RNF8-N的后期精子细胞中内源性的RNF8被释放，并且能够转位到细胞核内，但在转导了RNF8-N^mut的后期精子细胞中RNF8仍被限制在细胞质中。

在后期精子细胞中转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测ub-H2B在后期精子细胞的表达情况如图7B。可见在转导了RNF8-N的后期精子细胞中，H2B泛素化过程基本得到恢复，而在转导了RNF8-N^mut的细胞中则没有。

在精子中转导RNF8-N后，免疫荧光实验检测H2B在精子的表达情况如7C。可见在转导RNF8-N的精子中，很少能够通过染色观察到H2B，而在转导了RNF8-N^mut精子中则能明显观察到。此外，DIC(微分干涉显微镜)实验结果显示，转导了RNF8-N的精子与野生型的精子形态相似，而与转导了RNF8-N^mut精子形态存在明显有异。

以上研究结果都表明，在突变体后期精子细胞中阻断RNF8-MIWI相互作用能够在回复缺陷型Miwi^+/DB-Cre小鼠的精子发生。MIWI通过扣押RNF8调控后期精子细胞中鱼精蛋白替换组蛋白过程的示意图如图7D。

实施例6、筛药方法

如前所述构建表达MIWI与RNF8的表达载体，转入细胞内，作为筛选试验用的细胞模型，通过免疫共沉淀方法观察MIWI与RNF8的相互作用。

建立对照组，即表达MIWI与RNF8的细胞，其中不加入待筛选的候选物。

建立测试组，即表达MIWI与RNF8的细胞，其中加入待筛选的候选物。

以小分子化合物、RNF8片段、MIWI片段等作为候选物。

将测试组细胞中MIWI与RNF8的相互作用情况与对照组中MIWI与RNF8的相互作用情况进行比较，如果测试组细胞中MIWI与RNF8的相互作用情况在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是治疗男性不育的潜在物质。

讨论

本发明首次在PIWIL1蛋白的N端鉴定了一个保守结构元件D-box(destructionbox)，该元件是APC/C’泛素连接酶识别底物的关键序列。本发明人进一步验证了HIWI在后期精子细胞中可以被APC/C以D-box依赖的方式进行泛素化降解。通过睾丸慢病毒转导实验，本发明人初步证明了HIWI蛋白在后期精子细胞的适时降解对于精子细胞成功发育为成熟精子的必要性。

在本发明中，发明人在无精症患者的Piwil1(Hiwi)中鉴定到了D-box元件的突变。通过构建条件型基因敲入小鼠模型，发现这些突变能够直接导致雄性不育。更重要的是，本发明人进一步研究表明后期精子细胞形成过程中MIWI泛素化/降解与组蛋白泛素化是偶联在一起的，后期精子细胞中MIWI蛋白的D-box突变引起的MIWI蛋白的异常积累抑制了RNF8的入核以及RNF8介导的组蛋白泛素化。这一过程进一步阻碍了鱼精蛋白对组蛋白的替换，从而对Miwi^+/DB-Cre雄性小鼠精子的数量及质量产生了影响。因此，本发明人目前的研究不仅拓展了对人类PIWIL1蛋白生物学功能的认识，同时还揭示了一个基因组DNA压缩以形成正常精子的新机制。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种突变型人Piwil1基因或其编码的多肽，其特征在于，相应于野生型人Piwil1基因，该突变型人Piwil1基因的核苷酸序列第649-672位碱基中存在碱基突变，所述的第649-672位碱基中存在碱基突变为：第649-651位的AGG突变为GCG，或第658-660位的TTG突变为GCG、GGG或CGG，或第670-672位的AAT突变为CAT；或

相应于野生型人Piwil1基因编码的多肽，该突变型人Piwil1基因编码的多肽的氨基酸序列第217-224位中存在氨基酸突变；所述的第217-224位中存在氨基酸突变为：第217位由R突变为A，或第220位由L突变为A、G或R，或第224位由N突变为H。

2.权利要求1所述的突变型人Piwil1基因或其编码的多肽在制备诊断男性不育的试剂或试剂盒中的应用。

3.特异性识别权利要求1所述的突变型基因或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备诊断男性不育的试剂或试剂盒。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位碱基中是否发生突变的引物或探针。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位碱基中是否发生突变的芯片。

6.一种用于诊断男性不育的试剂盒，其特征在于，它包括：特异性扩增或鉴定人Piwil1基因第649-672位是否发生突变的引物、探针或芯片；所述的第649-672位碱基中存在碱基突变为：第649-651位的AGG突变为GCG，或第658-660位的TTG突变为GCG、GGG或CGG，或第670-672位的AAT突变为CAT。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：PCR扩增缓冲液，DNA聚合酶和/或说明试剂盒使用方法的使用说明书。

9.一种筛选治疗男性不育的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理包含突变型人Piwil1基因或其编码的多肽的体系；该突变型人Piwil1基因的核苷酸序列第649-672位碱基中存在碱基突变；或相应于野生型人Piwil1基因编码的多肽，该突变型人Piwil1基因编码的多肽的氨基酸序列第217-224位中存在氨基酸突变；所述的第649-672位碱基中存在碱基突变为：第649-651位的AGG突变为GCG，或第658-660位的TTG突变为GCG、GGG或CGG，或第670-672位的AAT突变为CAT；所述的第217-224位中存在氨基酸突变为：第217位由R突变为A，或第220位由L突变为A、G或R，或第224位由N突变为H；

(2)鉴定人Piwil1基因或其编码的多肽突变是否被回复；若是被回复，那么该候选物质为治疗男性不育的潜在物质；其中，所述的男性不育是人Piwil1基因突变导致的男性不育。

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