CN107596386B - CARF在经典Wnt信号通路中的功能 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学中化学生物学研究领域，具体涉及CARF在经典Wnt信号通路中的功能。本发明首次揭示了CARF调控经典Wnt信号通路的作用机理以及CARF在斑马鱼中通过经典Wnt信号通路所产生的生物学功能。为靶向治疗Wnt信号通路异常失活或异常激活相关的疾病提供了全新的思路及潜在的药靶。

Description

CARF在经典Wnt信号通路中的功能

技术领域

本发明属于生命科学中化学生物学研究领域，具体涉及CARF在经典Wnt信号通路中的功能。

背景技术

Wnt信号通路是一条在真核生物中高度保守的信号转导途径，在细胞增殖与分化、极化和迁移、凋亡与抗凋亡等命运决定过程中发挥关键作用。Wnt信号通路对于胚胎发育和器官组织的正常功能维持都有及其重要意义。在胚胎早期发育中，Wnt信号的紊乱会导致多种发育缺陷；而在成体中，Wnt信号转导途径的失调则与多种疾病的发生发展密切相关。

Wnt蛋白在分泌细胞中生成、并经过一系列修饰成为有活性的蛋白后才被分泌到细胞外，结合自身或邻近细胞的受体，启动一系列信号传递过程。在没有Wnt配体存在时，也即是“静息状态”下，APC、GSK3β、Axin、CK1和β-TrCP等形成多元降解复合体，招募β-catenin，使其磷酸化、泛素化进而被降解，使得细胞内的游离β-catenin维持在较低的水平。在Wnt存在时，Wnt蛋白与受体分子Frizzled和LRP5/6结合，招募下游信号分子Dvl上膜进而促使了LRP5/6的磷酸化。磷酸化后的LRP5/6进一步招募了Axin上膜，同时Axin携带GSK3、CK1上膜，这些分子与LRP5/6的胞内区域结合，导致其进一步磷酸化从而会招募更多的细胞质内的Axin-GSK3-CK1结合到受体LRP5/6胞内区进行信号放大。胞质中降解复合体的解散使得β-catenin“逃脱”被降解的命运，累积的β-catenin入核与TCF/LEF转录因子形成转录复合体启动下游靶基因的表达。

经典Wnt信号通路下游靶基因种类繁多，功能多样，至少有20种靶基因可以激活肿瘤细胞的增生，如c-myc，cyclinD1，Survivin等都直接参与了细胞的生长、增殖、血管形成等生理过程，而这些过程都是肿瘤发生发展过程中的关键事件。在众多靶基因中，c-myc更是熟知的原癌基因。可想而知，Wnt/β-catenin经典信号通路异常活化与癌症有着紧密联系。已知结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等十几种高发性癌症都与Wnt信号通路的异常活化有关。已知90％以上的结肠癌都存在Wnt信号通路活化，其中80％以上散发性息肉腺瘤综合症都与APC突变有关；而肝癌中存在较大比例的Axin突变；此外β-catenin的功能获得性突变在肝癌、胃癌、胆囊癌等多种肿瘤中都有发现。

经典Wnt信号转导途径与肿瘤和疾病有广泛联系，因此通过干预Wnt信号通路来治疗相关疾病具有重要的临床意义。

但目前本领域的进展还不显著，临床药物中真正针对于经典Wnt信号通路的还很少，对其作用靶点和机理进行阐释的更是凤毛麟角。因此，发现经典Wnt信号通路的小分子抑制剂，确定其作用靶点并阐释该靶点在Wnt信号通路中的新功能对于相关疾病的分子靶向治疗具有广阔的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供CARF在经典Wnt信号通路中的功能。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了CARF作为药物调控经典Wnt信号途径的作用靶点的用途。

优选地，所述调控包括正向调控和负向调控。

本发明的第二方面提供了CARF作为作用靶点用于筛选调控经典Wnt信号途径的药物的用途。

优选地，所述调控包括正向调控和负向调控。

进一步地，CARF作为作用靶点用于筛选调控经典Wnt信号途径的药物包括两方面的内容：其一，将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径抑制剂的筛选；其二，将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径激动剂的筛选。

所述将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径抑制剂的筛选具体是指：将CARF作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以阻断CARF与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合从而发挥对典Wnt信号通路的负向调控作用的药物作为经典Wnt信号途径抑制剂。

所述经典Wnt信号途径抑制剂通过与作用靶点CARF结合来阻断CARF与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled的结合。

所述经典Wnt信号途径抑制剂与作用靶点CARF共价结合。

所述经典Wnt信号途径抑制剂与作用靶点CARF的第516位半胱氨酸结合。

所述经典Wnt信号途径抑制剂含有内酯环和迈克尔受体。

所述将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径激动剂的筛选具体是指：将CARF作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以促进CARF与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合从而发挥对典Wnt信号通路的正向调控作用的药物作为经典Wnt信号途径激动剂。

前述调控经典Wnt信号途径的药物药物选自以下之任一：

1)预防或治疗由经典Wnt信号途径异常所引起的疾病或失调的药物；

2)需要特异性激活或抑制经典Wnt信号途径的疾病或失调的药物；

3)干细胞数目扩增药物。

所述疾病或失调包括但不限于：癌症、老年痴呆症、风湿性关节炎、骨质疏松症或造血干细胞移植。

进一步的，所述癌症为结肠癌。

进一步的，所述药物选自：结肠癌药物、老年痴呆症药物、风湿性关节炎药物、骨质疏松症药物或造血干细胞移植药物、干细胞数目扩增药物、斑马鱼发育调控药物、骨发育调控药物等。

本发明的第三方面提供了CARF在制备经典Wnt信号途径激动剂中的用途。

本发明还发现，CARF通过促进转录复合体的形成发挥对经典Wnt信号通路的正向调控作用。

本发明还发现，所述转录复合体包括TCF4/β-catenin，Dishevelled/β-catenin。

本发明还发现，CARF通过与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合来促进转录复合体的形成。

本发明还发现，CARF通过其碳端与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合。

本发明还发现，所述经典Wnt信号途径激动剂能促进Dishevelled和β-catenin在经典Wnt信号途径下游靶基因的启动子区域结合。

本发明还发现，所述经典Wnt信号途径激动剂能激活经典Wnt信号途径的报告基因或目的基因的表达活性。

本发明的第四方面，提供了CARF在制备药物中的用途，所述药物选自以下之任一：

1)预防或治疗由经典Wnt信号途径异常失活所引起的疾病或失调的药物；

2)需要特异性激活经典Wnt信号途径的疾病或失调的药物；

3)干细胞数目扩增药物。

此处的“疾病或失调”包括任何可从本发明的处理获益的病症。其包括但不局限于各种慢性和急性失调或疾病。例如，所述疾病或失调可以是老年痴呆症、风湿性关节炎或骨质疏松症。再例如，所述疾病或失调包括造血干细胞移植。

进一步地，所述药物选自以下任一：老年痴呆症药物、风湿性关节炎药物、骨质疏松症药物、造血干细胞移植药物、干细胞多能性维持药物或斑马鱼发育调控药物。

优选地，所述斑马鱼发育调控药物选自以下任一：斑马鱼造血干细胞生成促进药物、斑马鱼尾鳍再生促进药物。

本发明进一步提供了一种用于预防或治疗由经典Wnt信号途径异常失活引起的或用于需要特异性激活经典Wnt信号途径的疾病或失调的药物组合物：含有治疗有效量的CARF以及在药学上可接受的赋形剂。

术语“包含”指“含有”和“由﹍构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X-Y。本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻。对于某一对象的精确有效剂量取决于该对象的体型和健康状况，病症的性质或程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

所述药学上可接受的赋形剂(或运载体)指用于治疗剂给药的赋形剂，其本身及其用量不应诱导接受该组合物的个体产生有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。药学上可接受的赋形剂通常包括无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包裹材料或任何常规类型的制剂辅助物。合适的赋形剂包括但不仅限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇或其组合。所述赋形剂还包含有其他试剂如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强制剂效力的佐剂。其他材料如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂和类似试剂可根据需要添加。脂质体也包括在药学上可接受的赋形剂的定义中。

通常，可将药物组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次揭示了CARF调控经典Wnt信号通路的作用机理以及CARF在斑马鱼中通过经典Wnt信号通路所产生的生物学功能。为靶向治疗Wnt信号通路异常失活或异常激活相关的疾病提供了全新的思路及潜在的药靶。

附图说明

图1：利用生物素交联的NC043为探针发现NC043结合蛋白，其中，(a)NC043、生物素交联后NC043(S614)、S1和生物素标记的S1(S616)的化学结构式；(b)NC043、S614、S1和S616对Wnt信号通路的抑制效果对比；(c)SW480细胞经S614或S616处理后，对其裂解液进行生物素亲和沉淀，并对样品进行质谱分析鉴定出的S614的特异结合蛋白，红圈标记为CARF；(d)细胞过表达系统证明NC043结合CARF；(e)细胞内源条件下，NC043结合CARF。

图2：确定NC043与CARF的结合方式及结合位点，其中，(a)NC043与CARF共价结合；(b)NC043结合在CARF碳端；(c)CARF上第516位半胱氨酸是NC043的主要结合位点；(d)NC043的迈克尔受体修饰衍生物S1和内酯环改造衍生产物S9的化学结构式；(e)S1和S9都丧失了竞争结合CARF的能力。

图3：CARF是NC043抑制Wnt信号通路的蛋白靶点，WT CARF代表野生型CARF；MTCARF代表第516为半胱氨酸突变后的CARF；NS指无显著统计学差异；＊＊代表t-test P值小于0.01。

图4：CARF通过促进转录复合体的形成发挥对经典Wnt信号通路的调控作用，(a)细胞中过表达CARF能促进Wnt条件培养基诱导的报告基因表达；(b)用RNAi技术敲低CARF表达能够抑制Wnt信号通路下游靶基因Axin2和NKD1的mRNA水平；(c)细胞核中，CARF能结合Dvl2，且这种结合能被小分子S614阻断；d)用RNAi技术敲低CARF表达能够阻断Dvl2和β-catenin相互作用以及TCF4和β-catenin之间的相互作用；(e)下调CARF表达能够减少Dvl2和β-catenin在Wnt靶基因Axin2的启动子上TCF结合区域(TBE)的富集。

图5：CARF MO影响斑马鱼造血干细胞形成。

图6：CARF通过经典Wnt信号途径影响造血干细胞形成，(a)对造血干细胞生物标记物c-myb进行原位杂交检测，发现CARF突变鱼(编号cas009)有明显的造血干细胞生成缺陷；(b)CARF突变鱼cas009的造血干细胞缺陷能被过表达的CARF恢复；(c)过表达的具有组成型活性的β-catenin回复CARF突变鱼cas009的造血干细胞缺陷。

图7：CARF参与尾鳍再生，CARF突变鱼cas009表现出尾鳍再生迟滞。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1实验材料及实验方法

一、实验材料

1.质粒：TOPFlash质粒和GFP质粒购于Millipore公司。人源CARF全长序列是从HEK293的cDNA文库中通过PCR扩增获得，经酶切连接克隆到哺乳动物细胞表达载体pHA-CMV中。CARF的片段是以其全长质粒为模板通过PCR得到，并亚克隆到pHA-CMV表达载体中。CARF的一系列半胱氨酸突变体是通过点突变的方法得到。

2.抗体：β-actin(sc-47778)的抗体购自Santa Cruz公司；SP1(S9809)的抗体购自Sigma公司；β-catenin(610154)的抗体购自BD Biosci.Pharmingen公司。

3.试剂：蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合片剂)和NP-40购自Roche公司；Lipofectamine和PLUS转染试剂购自Invitrogen公司；Wnt3a条件培养基从Wnt3a细胞株(CRL-2647，购自美国ATCC细胞库)制备：采用加了10％小牛血清的DMEM细胞培养基培养Wnt3a细胞4天，然后离心收集上清培养基。对照条件培养基从L细胞株(CRL-2648，购自美国ATCC细胞库)制备：采用加了10％小牛血清的DMEM细胞培养基培养L细胞4天，然后离心收集上清培养基。

二、实验方法

1.克隆构建

HEK293T细胞经RNA抽提，反转录获得人源cDNA文库，以此为模板进行PCR扩增获得人源CARF CDS序列，以XhoI和NotI进行酶切，克隆入pHACMV表达载体获得pHA-hCARF质粒，再进行测序验证。相关的hCARF点突变质粒以pHA-hCARF质粒为模板进行PCR扩增，克隆产生，并进行测序验证。hCARF的系列点突变质粒以pHA-hCARF质粒为模板进行PCR扩增获得并测序。pCS2-zCARF质粒是以斑马鱼cDNA文库为模板进行PCR扩增，经ClaI和XhoI酶切，克隆入pCS2表达载体，经测序确认获得。所涉及的引物如下：

2.细胞培养

HEK293细胞在含10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen)培养液中培养，37℃，CO₂浓度5％。SW480细胞系根据ATCC推荐，培养于含10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15(gibco)培养液中，37℃，无CO₂。稳定分泌小鼠Wnt3a的L细胞株及对照株购自美国ATCC细胞库，该细胞在生长至大约70％密度时对其进行换液(含10％胎牛血清的DMEM)，连续培养四天后，收集培养液并离心，经液氮速冻后-80℃长期保存。

3.细胞转染

质粒转染：HEK293细胞按照适当的比例进行分盘，使得转染时细胞密度达到80％左右。转染所用质粒和转染试剂以24孔盘每孔的用量来计算：质粒总量为250ng/孔，如转染质粒量不足用lacZ质粒补足。首先按照1μl/孔的量将Lipofectamine 3000(Invitrogen)脂质体加入一份Opti-MEM(25μl/孔)中，再将质粒加入Opti-MEM(25μl/孔)中混匀，然后按照1μl/孔加入P3000试剂(Invitrogen)混合，再与上述Lipofectamine 3000混合液加入质粒/P3000混合液中，轻轻混匀，静置5分钟。用正常培养液为细胞换液后，将上述准备好的转染试剂及质粒混合物滴加入培养孔中，轻轻晃动混匀后，放置于培养箱中培养。

siRNA转染：siRNA的转染在细胞分盘的时候进行，采用的转染试剂是Lipofectamine RNAi max reagent(Invitrogen)，转染用的培养基是Opiti-MEM(Gibco)。根据说明书，对24孔盘每孔用0.5μl的20μM的siRNA储液，每孔转染试剂为1μl，将上述包含siRNA和转染试剂的混合物在室温下静置20分钟后和刚传代的细胞悬浮液混合，并进行后续的培养。细胞在转染24-48小时后用于其他相关实验。

4.报告基因测活

将用于测定报告基因活性的HEK293细胞按上述方法进行转染。在转染后18-24小时加入Wnt3a条件培养基刺激6-8小时，用裂解缓冲液(Boehringer Mannheim Luci-feraseAssay Kit)裂解细胞(200μL/孔)，在摇床上晃动5分钟使细胞充分裂解。取裂解液上清50μl于96孔板，用Synergy 2Multi-Mode Microplate Reader(Bio-Tek Instruments,Inc.)测细胞裂解液中GFP蛋白的强度，然后加入10μl荧光素酶的底物，充分混匀后再测定对应的荧光素酶活性。荧光素酶活性经过GFP强度校正，得到相对报告基因活性。

5.细胞RNA抽提、反转录和荧光实时定量PCR

待检测的细胞用TRIzol试剂(Invitrogen)裂解，经氯仿抽提和异丙醇沉淀。提取细胞总RNA，再用superscriptTM III first strand sythesis system(Invitrogen)试剂盒将其中mRNA反转录为cDNA。cDNA经适当稀释后，使用Quantitative SYBR green PCR kit(Takara SYBR premix Ex Taq)试剂盒配制实时定量PCR反应体系。然后使用AppliedBiosystems公司的ABI7500Fast Real-Time PCR系统进行实时定量PCR扩增反应。用于实时荧光定量PCR实验的相应引物如下(均为人源)：

6.免疫共沉淀和Western blot

外转蛋白的免疫共沉淀：将转染的293T细胞(6孔盘)弃去培养基，并置于冰上。加入500μL/孔细胞裂解液(1mM焦磷酸，2mM Na₃VO₄，10mM NaF，50mM Tris-HCl pH 7.4，150mMNaCl，1mM EDTA，5％甘油，1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。冰上裂解10分钟后，将细胞收到1.5ml的Eppendorf管中，4℃，13000rpm离心10分钟。将裂解液上清转移到另一干净EP管中。取30μl与2×SDS样品缓冲液混合，100℃煮样10分钟。其余裂解液上清中加入BSA至0.2％，并加入相应的抗体，4℃旋转混合2小时后，补加Protein A/G树脂25μl/管，4℃继续混合1小时后用裂解缓冲液洗涤树脂3次，最后加SDS样品缓冲液，100℃煮沸。免疫共沉淀后的样品和之前的上清样品分别进行SDS-PAGE电泳后做免疫印迹检测。

内源蛋白质的免疫共沉淀：在HEK293T Axin稳定株中进行。细胞被裂解在合适体积的裂解液中，经上述离心过程，取30μl上清制备上清样品。其余上清中加入甘油至终浓度10％和相应的免疫沉淀用抗体，并补加BSA至0.2％，然后4℃旋转混合过夜，次日加入50μl的Protein A/G树脂，再混合2小时。最后洗涤免疫沉淀产物并制备样品。

Western blot：配制合适浓度的SDS-PAGE胶，加入蛋白样品并进行电泳分离。经电转将蛋白质转到硝酸纤维膜上，硝酸纤维膜用封闭液(5％脱脂牛奶)封闭1小时，用TTBS洗涤3次，每次5分钟，再加对应的一抗室温孵育1小时(如果一抗为针对内源蛋白的抗体需要在4℃孵育过夜)。一抗处理过后用TTBS洗涤3次，每次5分钟，最后加入针对一抗物种的HRP二抗，室温孵育1小时，洗涤三次后，HRP偶联二抗免疫印迹的硝酸纤维素膜加入反应底物(Thermo Fisher SCIENTIFIC)后用FujiFilm Las4000或Tanon5200进行曝光扫描。

7.斑马鱼培养与显微注射

斑马鱼培养：Tüebingen strain的斑马鱼培养在28.5℃的水中。

胚胎注射：MO(Morpholino)注射入一细胞期(one-cell stage)的斑马鱼胚胎卵黄中。

实验中使用的wnt8MOs(wnt8-ORF1MO+wnt8-ORF2MO)，carf MO序列有两条，MO1抑制翻译，MO2抑制剪切，序列分别为：

MO名称	序列(5'-3')	SEQ ID NO.
			wnt8-ORF1MO	ACGCAAAAATCTGGCAAGGGTTCAT	23
wnt8-ORF2MO	GCCCAACGGAAGAAGTAAGCCATTA	24
			carf-MO1	CCTCTCCTCTTCTTGCCGCCATCAC	25
carf-MO2	AGGAAATAAGCGCTGTTTACCTCTA	26

8.斑马鱼原位杂交检测

地高辛标记的探针(Digoxigenin-UTP-labeled antisense RNA probes)以线性化的质粒为模板用DIG RNA Labeling kit(Roche)通过体外转录合成。原位杂交实验按照标准方法进行(Oxtoby and Jowett,1993)。所有的照片都是在室温下通过Olympus的DP71相机在Olympus的显微系统下拍摄(SZX16，Olympus)。本实验中所用的探针有CARF和c-myb(斑马鱼造血干细胞的基因)。质粒PCS2-CARF用ApaI线性化，PBSK-cmyb用BamHⅠ线性化后，纯化的DNA用T7体外转录酶(Ambion)进行转录合成相应的探针。

9.斑马鱼尾鳍再生检测

6月大的斑马鱼经Tricaine(三卡因,间氨基苯甲酸乙酯)麻醉后，用刀片切下半截尾鳍，然后培养于28–30℃。在培养不同时间后，对斑马鱼为其进行拍照，并测量其再生尾鳍的长度(从切割线到尾鳍远端的距离)。

10.生物素亲和沉淀和质谱分析

小分子S614和S616处理细胞后进行正常亲和沉淀，用裂解缓冲液(4％SDS，100mMTris/HCl pH 7.6，0.1M DTT)处理小分子结合的蛋白，95℃5分钟。利用超声波剪切DNA降低样品的粘稠度。使用Filter Aided Sample Preparation(FASP)方法消化处理后的蛋白样品。消化后的蛋白样品利用液相色谱分离胰酶消化后的肽段，通过纳升电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific)利用Q Exactive质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific)分析样品。捕获后的原始数据利用MaxQuant(version 1.3.0.5)软件分析。并与HumanUniProtKB/Swiss-Prot database(version 2012-06-14)数据库匹配。

11.小分子化合物的制备

S614:将化合物15-氧代绣线菊内酯(40mg，0.12mmol)，催化量的4-二甲氨基吡啶置于干燥的反应瓶中，用10ml干燥的二氯甲烷溶解，N₂护下搅拌，置于0℃下相继加入三乙胺(0.5ml)，氯乙酰氯(45μl，0.6mmol)，搅拌30分钟后，置于常温搅拌12小时，TLC点板跟踪，发现原料消失后，反应液溶解在200ml的乙酸乙酯中，相继用5％柠檬酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经过硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚：丙酮＝10:1–5:1)得化合物S-406(42mg)；将化合物S-406(37mg，0.091mmol)、生物素biotin(111mg，0.45mmol)、碳酸氢钠(38.3mg，0.45mmol)、氯化铯(催化量，2mg)溶解在干燥的10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在氮气保护下50℃下搅拌24小时，至原料消失后，反应液溶解在100ml的乙酸乙酯中，相继用水、饱和实验室洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品，经过硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚：丙酮＝5:1–1:1)得白色粉末S-614(17mg，45％)。

S1:取粉花绣线菊生物碱Spiramines A-D粗品溶于250g加热溶解于3000ml的甲醇中，缓慢加入1400g KOH，加热回流72小时，直至生物碱原料消失后，停止搅拌，减压回收MeOH，盐酸中和至弱酸性，CHCl₃萃取三次，水洗至中性，减压回收CHCl₃，经过硅胶柱层析得到S1(51.5g，收率：24.8％)，spiramilactone(S1)和spiramilactone C(S2)混合物(41.7g，收率：20.1％)。

S616:以S-1原料，参照S-614得制备方法得到。

S9：将化合物S-1(500mg，1.50mmol)置于250ml的圆底反应瓶中，用100ml分析纯甲醇溶解样品，加入(7.5mmol，420mg)的KOH，搅拌，加热回馏24小时，原料消失后，停止反应，加水稀释，减压浓缩去掉甲醇，用2N的稀盐酸调成中性溶液，用乙酸乙酯萃取2次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到中间体(粗品550mg)，取干燥中间体(100mg，0.28mmol)溶解于装有50ml干燥DCM圆底反应瓶中，N₂保护下，分批加入新制MnO₂(1.42mmol，123.5mg)，常温搅拌72小时，待原料不再变化后，过滤二氧化锰，浓缩，残余物经过硅胶柱层析得到化合物S9(无色粉末30mg，得率：30.2％)。

实施例2、15-氧代绣线菊内酯抑制经典Wnt信号通路的蛋白靶点的发现与鉴定

如图1所示，发明人利用生物素偶联的15-氧代绣线菊内酯(NC043)为探针，通过亲和沉淀和质谱鉴定，分别从SW480结肠癌细胞系的细胞核组分中鉴定出75个潜在的15-氧代绣线菊内酯(NC043)特异结合蛋白，细胞质组分鉴定出87个，全细胞组分鉴定到91个。在三个组分中存在两两重叠的蛋白质共20个，其中全细胞/核8个，全细胞/质组分11个，三个组分都存在的6个。鉴于15-氧代绣线菊内酯(NC043)是在细胞核内转录复合体层面上发挥Wnt信号通路抑制功能，所以发明人挑选了存在全细胞/核组分重叠的蛋白质进行了Wnt活性检测和15-氧代绣线菊内酯的结合验证，发现CARF既能调控经典Wnt信号通路活性又能特异结合15-氧代绣线菊内酯(NC043)。如图2所示，通过构建一系列CARF截短片段和点突变体，证明15-氧代绣线菊内酯(NC043)主要是经过共价方式结合在人源CARF的第516位半胱氨酸上。

实施例2、NC043通过CARF发挥对经典Wnt信号通路的抑制作用

进一步研究表明CARF在细胞核中结合Dishevelled蛋白，进而促进经典Wnt信号通路转录复合体的形成和稳定。为了证明NC043是通过CARF蛋白发挥对经典Wnt信号通路的抑制作用，如图3和图4所示，我们检测了小分子对CARF蛋白与Dishevelled蛋白之间的相互作用的影响。事实表明，野生型CARF和Dishevelled的结合会被NC043阻断，而第516位半胱氨酸突变后的CARF和Dishevelled的结合则不再受小分子影响。同时，CARF能够增强TCF4蛋白和β-catenin蛋白的相互作用，并且这种增强会被NC043减弱，但第516位半胱氨酸突变后的CARF对TCF4/β-catenin相互作用的增强不受NC043影响。NC043通过结合CARF抑制经典Wnt信号通路，最终体现在，由CARF所引起的Wnt活性增强能够被NC043削弱，但将CARF的第615位半胱氨酸突变后，突变体增强CARF Wnt信号通路活性不再受NC043影响。

实施例3、CARF通过经典Wnt信号通路调控斑马鱼造血干细胞生成和尾鳍再生

CARF是经典Wnt信号通路的一个全新的调控分子，为了进一步探讨CARF的生理功能，我们检测了CARF对斑马鱼造血干细胞生成的影响。结果，如图5所示。我们在早期胚胎中通过注射CARF morpholino阻断CARF蛋白翻译，在发育的36小时左右检测造血干细胞生物标记物cmyb，发现cmyb阳性细胞明显减少。用CRISPR/cas9技术构建筛选出的CARF突变鱼也有类似的造血干细胞生成缺陷，且这种缺陷能被早期注射的CARF mRNA回复，表明CARF确实参与调控造血干细胞生成。如图6所示，为了进一步证明该过程与Wnt信号通路相关，我们在CARF突变鱼中表达组成型活性的β-catenin，发现内皮细胞因子诱导表达的组成型活性的β-catenin能够有效回复CARF突变导致的造血干细胞生成缺陷，证明CARF是通过调控经典Wnt信号通路进而参与造血干细胞生成过程。经典Wnt信号活性在斑马鱼尾鳍再生过程中有着重要作用，而我们的结果显示CARF突变鱼的尾鳍再生过程较正常鱼明显变迟缓。

讨论

随着对经典Wnt信号通路在生理和病理过程中的功能的认识逐步深化，经典Wnt信号通路与各种恶性肿瘤及其他人类疾病的关联系受到广泛重视。通过Wnt信号通路干预进行相关疾病治疗的思路得到普遍关注，相关研究者主要通过化学小分子库筛选或利用生物信息学的方法针对信号传递过程中关键成员“hot-spot”位点进行化学小分子或者多肽的设计合成两种方式获得Wnt信号通路的抑制剂或激动剂。据统计目前针对Wnt信号通路的小分子有两百多个。在这众多小分子中，只有少数进入临床研究，例如姜黄素和没食子酸酯EGGG，小部分处于临床前研究，如沙利霉素，而绝大多数小分子仅处于初期生物活性研究阶段。迄今，只有以抗真菌类药物环吡酮胺、非甾体类的抗炎药物(NSAIDs)为代表的屈指可数的几个靶向经典Wnt信号通路的小分子走向了市场。

总体来说，尽管靶向经典Wnt信号通路进行相关疾病治疗具有诱人的前景，但目前尚未取得重大突破。可能原因在于：(一)由于多数疾病都是由于共转录因子β-catenin本身突变或负责其降解的降解复合体成员突变，从而造成经典Wnt信号通路的过度激活。对于这类疾病，针对Wnt信号传递上游过程，尤其是在β-catenin降解复合体或其上游发挥作用的小分子抑制剂并没有太大的实际应用意义；(二)经典Wnt信号转导途径涉及成员众多，且多数成员还有除Wnt信号传导之外的重要功能，这致使筛选出的小分子可能在临床前或后期临床研究中体现众多的毒副作用。例如，TCF4/β-catenin互作是经典Wnt信号通路下游靶基因得以转录表达的基础，针对这组互作设计抑制小分子有很大的吸引力。但β-catenin除了结合TCF外，还与E-cadherin结合参与细胞粘附并决定EMT过程。而且β-catenin与E-cadherin或TCF的结合模式和结合区域都十分相近，这无疑为直接针对TCF4/β-catenin互作的小分子的开发利用增加了难度。

我们之前自主筛选到的经典Wnt信号通路的小分子抑制剂NC043也是作用在TCF4/β-catenin相互作用层面。但与其他干扰TCF4/β-catenin转录复合体形成的小分子不同，NC043是间接作用于TCF4/β-catenin相互作用。本发明中我们发现NC043抑制经典Wnt信号通路的真正作用靶点是CARF蛋白，它能共价结合于人源CARF的第516位半胱氨酸上。而此前，CARF与经典Wnt信号通路的关系并未被认识，此发明中，我们首次发现CARF是经典Wnt信号通路的一个新的正向调控分子，它能够与细胞核中的dishevelled蛋白结合，这种结合能够促进以TCF4和β-catenin为基础的多元转录复合体的形成。并且，我们首次发现CARF通过调控经典Wnt信号通路参与了斑马鱼造血干细胞生成和尾鳍再生过程。而NC043通过结合CARF，从而阻断了CARF与dishevelled相互作用，进而干扰TCF4和β-catenin的结合，最终实现了对经典Wnt信号通路的抑制。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (21)

1.CARF作为作用靶点用于筛选由于CARF缺失导致的经典Wnt信号途径异常药物或者用于筛选负向调控经典Wnt信号途径药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述CARF作为作用靶点用于筛选由于CARF缺失导致的经典Wnt信号途径异常药物或者用于筛选负向调控经典Wnt信号途径药物的用途指将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径抑制剂的筛选。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述将CARF作为药物或制剂针对经典Wnt信号途径的作用靶标应用于经典Wnt信号途径抑制剂的筛选具体是指：将CARF作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以阻断CARF与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合从而发挥对经典Wnt信号通路的负向调控作用的药物作为经典Wnt信号途径抑制剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述经典Wnt信号途径抑制剂通过与作用靶点CARF结合来阻断CARF与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled的结合。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述经典Wnt信号途径抑制剂与作用靶点CARF共价结合。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述经典Wnt信号途径抑制剂与作用靶点CARF的第516位半胱氨酸结合。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述经典Wnt信号途径抑制剂含有内酯环和迈克尔受体。

8.根据权利要求1～7任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述药物为预防或治疗由于经典Wnt信号途径异常所引起的疾病或失调的药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物为干细胞数目扩增药物。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病或失调包括：癌症、老年痴呆症、风湿性关节炎、骨质疏松症或造血干细胞移植。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述癌症为结肠癌。

12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物选自：结肠癌药物、老年痴呆症药物、风湿性关节炎药物、骨质疏松症药物或造血干细胞移植药物、干细胞数目扩增药物、斑马鱼发育调控药物、骨发育调控药物。

13.CARF在制备由于CARF缺失导致经典Wnt信号通路异常药物中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，CARF通过促进转录复合体的形成发挥对经典Wnt信号通路的正向调控作用。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述转录复合体包括TCF4/β-catenin，Dishevelled/β-catenin。

16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，CARF通过与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合来促进转录复合体的形成。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，CARF通过其碳端与细胞核中的蓬乱蛋白Dishevelled结合。

18.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述药物为干细胞数目扩增药物。

19.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述药物选自以下任一：老年痴呆症药物、风湿性关节炎药物、骨质疏松症药物、造血干细胞移植药物、干细胞多能性维持药物或斑马鱼发育调控药物。

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述斑马鱼发育调控药物选自以下任一：斑马鱼造血干细胞生成促进药物、斑马鱼尾鳍再生促进药物。

21.一种用于预防或治疗由于CARF缺失而导致的经典Wnt信号途径异常失活引起的或用于需要特异性激活经典Wnt信号途径的疾病或失调的药物组合物：含有治疗有效量的CARF以及在药学上可接受的赋形剂。

Images