CN107589105A - 一种用于单细胞快速拉曼测量和激光弹射分选的一体化装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种激光弹射基片以及包含该基片的一种用于单细胞快速测量和激光弹射分选的一体化装置。该一体化装置包括激光弹射基片、点样芯片和接收芯片，激光弹射基片、点样芯片以及接收芯片可按顺序叠加，可逆贴合，形成一体化对应结构。本发明采用全透明基片，避免了基片翻转及细胞再寻址，实现了对单个细胞的“即测即弹”；采用三层封闭体系，避免了操作过程中的外部暴露，降低了外源污染的可能性；采用阵列微井接收装置，提升了单细胞获取的效率并与下游操作直接衔接。

Description

一种用于单细胞快速拉曼测量和激光弹射分选的一体化装置

技术领域

本发明涉及单细胞分析及分选技术领域，具体涉及一种实现单细胞快速测量和激光弹射分选的一体化组合装置。

背景技术

近年来发展起来的单细胞拉曼光谱技术作为一种无需标记、且能真实反映细胞原位状态下的活性与功能的方法，一定程度上弥补了FACS技术的不足。单细胞拉曼弹射技术基于激光诱导向前转移(LIFT)原理，将细胞置于弹射基片上，弹射基片表面镀有一层无拉曼背景的薄膜材料，可在脉冲激光作用下迅速剥离或融化，从而使表面附着的细胞脱离基片获得分离。由于细胞位置固定，因此可对单个细胞进行长时间的观察或拉曼测量，提高了对目标细胞筛选的正确性。但该方法目前尚存在一些缺点：

(1)细胞在基片表面，需正向进行拉曼测量，随后翻转基片进行反向弹射，造成分选前需重新寻址定位对应的测量细胞，严重限制了分选的通量和效率；

(2)测量及分选中细胞暴露于外部环境，极易在后续基因组扩增操作中引入外源DNA污染；

(3)目前尚无能够将拉曼测量-细胞分选-细胞裂解-基因组扩增等操作无障碍进行对接的一体化装置。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一种激光弹射基片以及包含该激光弹射基片的一体化组合装置，提升了单细胞获取的效率并与下游操作直接衔接。

本发明提供一种激光弹射基片，包含基底和镀层膜，其特征在于：所述镀层膜在脉冲激光作用下气化或融化，所述镀层膜材料包括ITO(氧化铟锡)、FTO(氟掺杂氧化锡)、AZO(铝掺杂氧化锌)中的一种或多种，所述基底材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃和氟化钙玻璃中的一种或多种，所述激光弹射基片用于观察识别以及单细胞激光弹射分选。

所述镀膜层透光率不低于70％，优选地，不低于80％，更优选地，不低于85％。

所述镀层膜厚度为10-500nm，优选地，为10-100nm。

所述基底厚度为0.1-2mm，优选地，为0.1-1mm，更优选地，为0.1-0.2mm。

所述单细胞激光弹射分选所采用的激光波长为266nm-1064nm，优选地，为532nm，所述激光脉宽为1fs-1μs，优选地，为1ns，所述激光的能量范围为1μJ-100μJ，优选地，为10μJ，所述激光的脉冲频率为5-16.6kHz，优选地，为11.0-14.6kHz。

所述单细胞激光弹射的方法包括1)将细胞滴涂于前述激光弹射基片的镀层膜表面，2)利用显微镜从所述激光弹射基片的基底方向透过基底观察识别细胞，3)开启脉冲激光将识别的单细胞从基片镀层膜表面弹射分离。

所述观察识别包括收集拉曼散射信号，获得单细胞拉曼图谱，分析拉曼图谱识别目标单细胞。

所述观察识别包括收集荧光标记单细胞的荧光信号，获得单细胞的荧光图像，分析荧光图像识别单细胞。

所述单细胞包括微生物单细胞和动物单细胞。

所述微生物单细胞包括直径或长度小于5μm的微生物细胞或者直径小于30μm的球形微生物细胞。

一种单细胞激光弹射分选一体化装置，其特征在于包含前述激光弹射基片，还包括点样芯片和接收芯片。

所述激光弹射基片、点样芯片和接收芯片按顺序叠加，可逆贴合，形成一体化结构。

所述点样芯片为透明软质高分子材料，包括PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅橡胶或PVC(聚氯乙烯)中的一种或多种。

所述点样芯片的厚度为0.1-2mm，优选地，为0.5mm。

所述点样芯片上设有一个或多个微通孔。

所述微通孔的直径为0.5-2.5mm，优选地，为1mm。

所述微通孔与所述激光弹射基片形成点样孔，用于细胞样品点样。

所述接收芯片用于接收激光弹射分离的单细胞。

所述接收芯片由透明材料制成，所述透明材料包括硅酸盐玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或者PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)中的一种或多种。

所述接收芯片的厚度为1-5mm，优选地，为1.5mm。

所述接收芯片上设有一个或多个与点样芯片微通孔一一对应的微井。

所述微井的直径为1-5mm，优选地，为2mm。

所述接收芯片与点样芯片可逆贴合，使微井与所述点样孔形成封闭的独立空间。

所述微通孔的直径小于微井直径，贴合时，微井可完全覆盖所述点样孔，保证了单细胞弹射后落入微井中。

弹射完成后，取下接收芯片，在微井中注入细胞裂解液，使裂解液充分覆盖于微井中，进行后续操作。

本发明还提供一种单细胞快速测量和分选的方法，包括1)将细胞滴涂于前述激光弹射基片的镀层膜表面；2)利用显微镜从所述激光弹射基片的基底方向透过基底观察识别单细胞；3)开启脉冲激光将识别的单细胞从激光弹射基片的镀层膜表面弹射分离。

本发明还提供一种单细胞快速测量和分选的方法，包括1)将所述点样芯片与所述激光弹射基片的镀层膜正面贴合形成点样孔，将细胞滴涂于点样孔中；2)将所述接收芯片贴合于所述点样芯片，微井与点样孔位置一一对应形成一体化装置；3)利用显微镜从所述激光弹射基片的基底方向透过基底观察识别细胞；4)开启脉冲激光将识别的单细胞从激光弹射基片的镀层膜表面弹射分离收集至下方接收芯片对应的微井中。

本发明的有益效果是：采用新型全透明基片，避免了基片翻转及细胞再寻址，实现了对单个细胞的“即测即弹”；采用一体化三层封闭体系，避免了操作过程中细胞的外部暴露，降低了外源污染的可能性；采用阵列微井接收装置，提升了单细胞获取的效率并与下游操作直接衔接。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为未覆盖镀层膜(1a)与覆盖有镀层膜(1b)的激光弹射基片的透光性比较。

图2为显微镜下从激光弹射基片镀层膜方向(2a、2c)及从基底方向(2b、2d)透过基底观察的细胞图像。其中，2a、2b中为海洋蓝细菌；2c、2d中为大肠杆菌。物镜倍率：50X。

图3为海洋蓝细菌单细胞的拉曼光谱。其中，3a为从激光弹射基片镀层膜方向测量，3b为从激光弹射基片基底方向透过基底测量。

图4为单细胞激光弹射分选一体化装置组合示意图的立体图(4a)和剖面图(4b)。

图5为海洋蓝细菌单细胞拉曼测量及弹射分选。5a为激光弹射前图像，5b为激光弹射后图像，5c为单细胞拉曼光谱图。

图6为绿色荧光标记的大肠杆菌经荧光成像识别及弹射分选。6a为激光弹射前图像，6b为激光弹射后图像.

图7为分别采用TiO₂及SiO₂为镀层膜的单细胞弹射效果。其中7a、7c为激光弹射前图像，7b、7d为激光弹射后图像。

图8为采用PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)为镀层膜的单细胞弹射效果。8a为激光弹射前图像，8b为激光弹射后图像。

图9为经单细胞激光弹射分选一体化装置分选和接收的大肠杆菌单细胞基因组MDA扩增及其产物的PCR验证。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，附图为示意图，因此本发明装置和设备的并不受所述示意图的尺寸或比例限制。

需要说明的是，在本专利的权利要求和说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例1：激光弹射基片的制作与效果。

激光弹射基片的基底采用光透明材料，包括但不限于硅酸盐玻璃、石英玻璃、氟化钙玻璃；弹射镀层膜材料为透明金属复合氧化物薄膜材料，包括但不限于ITO、FTO、AZO，采用喷涂、蒸发、溅射等沉积方式在基底材料表面形成镀层膜，镀层膜厚度为10-500nm，金属复合氧化物薄膜的透光率不小于70％(图1所示为石英玻璃基底，蒸镀ITO膜的透光性比较，1a为石英玻璃基底，1b为镀有ITO膜的激光弹射基片)。镀有镀层膜的激光弹射基片(1b)与基底(1a)相比，透光率几乎没有差别，可以从激光弹射基片的基底方向透过基底观测时可分辨单个细胞图像。图2为显微镜下从激光弹射基片镀层膜方向(2a、2c)及从基底方向透过基底观察(2b、2d)的单细胞图像，其中，2a、2b中为海洋蓝细菌；2c、2d中为大肠杆菌。从基片的基底方向透过基片并可获得较好的单细胞拉曼图谱。如图3所示海洋蓝细菌分别从镀层膜方向(3a)及基底方向透过基底(3b)进行拉曼测量的单细胞光谱图。

实施例2：点样芯片、接收芯片的制作及一体化装置组合

图4所示为单细胞激光弹射分选一体化装置示意图，由图可见，单细胞激光弹射分选一体化装置包括激光弹射基片1，点样芯片2和接收芯片3。

点样芯片2采用透明软质高分子材料，包括但不限于PDMS、硅橡胶、PVC，厚度制作为0.1-2mm，芯片上包含阵列微通孔2-1，微通孔直径为0.5-2.5mm。

接收芯片3采用透明材料，包括但不限于硅酸盐玻璃、PDMS、PMMA中的一种或几种组合，芯片上包含一定深度的阵列微井3-1，微井尺寸制作为1-5mm，其位置与上述点样芯片中微通孔位置一一对应。

所述单细胞激光弹射分选一体化装置通过将激光弹射基片1、点样芯片2及接收芯片3三者叠加组装(如图4所示示意图)，将点样芯片2贴合于激光弹射基片1镀层膜1-2正面形成点样孔，用于滴涂细胞悬液；接收芯片3正面贴合于点样芯片2上，并使微井3-1与点样孔一一对应，形成封闭的独立空间，用以接收经弹射分离的单细胞，并可在获取单细胞后将接收芯片单独取下进行单细胞裂解及基因组扩增等后续操作。

实施例3：采用一体化装置进行单细胞快速拉曼测量及分选

以海洋蓝细菌为对象，采用上述单细胞激光弹射分选一体化装置进行单细胞的快速拉曼测量和分选的方法，包括下列过程：

将点样芯片2贴合于激光弹射基片1镀层膜1-2正面，实验室纯培养海洋蓝细菌经离心和纯水清洗三次后重悬于清水中，取0.5μL细胞悬液滴涂于点样孔中，室温风干。随后将接收芯片3贴合于点样芯片2，微井3-1与点样孔一一对应形成一体。将上述单细胞激光弹射分选一体化装置放置于正置式共聚焦拉曼显微镜的载物台上，激光弹射基片1在上，接收芯片3在下，通过50X显微镜物镜透过激光弹射基片1成像并寻找细胞(如图5a所示)。随后，采用532nm激光对单细胞进行测量，激光功率10mW，信号采集时间1s，获得如图5c所示海洋蓝细菌单细胞拉曼图谱。单细胞经测量后，开启532nm脉冲激光将其从激光弹射基片1镀层膜1-2表面弹射分离，并收集至下方接收芯片3的微井3-1中。图5b显示经拉曼测量的6个单细胞经弹射分离后，单细胞原所处位置变为空白，说明目标单细胞已成功分选。

实施例4：采用一体化装置进行单细胞荧光成像及分选

以荧光蛋白标记的大肠杆菌为对象，采用上述单细胞激光弹射分选一体化装置进行单细胞的快速荧光成像和分选的方法，包括下列过程：

将点样芯片2贴合于激光弹射基片1镀层膜1-2正面，表达有绿色荧光蛋白的实验室纯培养大肠杆菌经离心和纯水清洗三次后重悬于清水中，取0.5μL细胞悬液滴涂于点样孔中，室温风干。随后将接收芯片3贴合于点样芯片2，微井3-1与点样孔一一对应形成一体。将上述单细胞激光弹射分选一体化装置放置于正置式荧光显微镜的载物台上，激光弹射基片1在上，接收芯片3在下，通过50X显微镜物镜透过激光弹射基片1检测荧光图像并寻找细胞(如图6a所示)。单细胞经荧光成像确认后，开启532nm脉冲激光将其从激光弹射基片1镀层膜1-2表面弹射分离，并收集至下方接收芯片3的微井3-1中。图6b显示6个单细胞经弹射分离后，细胞原所处位置荧光图像消失，说明目标单细胞已成功分选。

实施例5：镀层膜材料为TiO₂、SiO₂、PEN的激光弹射基片效果

采用TiO₂及SiO₂为镀层膜1-2，可获得优良的透光性，从基底1-1方向测量可获得良好的单细胞拉曼光谱，但无法有效弹射分离细胞。图7所示为分别采用TiO₂(7a、7c)及SiO₂(7b、7d)为镀层膜1-2，对单个海洋蓝细菌进行弹射前后的结果，在显微镜下观测到目标细胞仍然在激光弹射基片1上。

采用PEN及PET等高分子材料为镀层膜1-2，透光性尚可，且可进行单细胞弹射分离(如图8所示)。但由于此类高分子材料拉曼背景较高，对单细胞拉曼信号干扰较大；同时，镀层膜1-2厚度制作往往在数微米以上，均匀性较差，且弹射后细胞所在位置镀层膜1-2融化，视野变差，无法明确分辨细胞是否成功分离。图8a为激光弹射前图像，图8b为激光弹射后图像。因此为了保证激光弹射基片1对细胞样品的拉曼测量效果以及弹射效果，镀层膜1-2材料需同时满足：透光率高、拉曼背景低和在脉冲激光作用下气化或融化的要求。

实施例6：采用单细胞激光弹射分选一体化装置衔接单细胞基因组操作

以大肠杆菌为对象，采用上述单细胞激光弹射分选一体化装置，对单细胞进行弹射分选，完成弹射后取下接收芯片3，向微井3-1中加入碱性裂解液对单细胞进行裂解并分别转入离心管中，加入核酸扩增混合试剂及DNA合成酶，采用多重置换常温扩增技术(MDA)进行单细胞基因组扩增。随后对扩增产物进行大肠杆菌特异基因uspA片段及16S rRNA全长的PCR扩增验证，获得如图9所示凝胶电泳结果。其中，1至7及9为单个微井中弹射分选单个大肠杆菌的结果，8为未弹射分选细胞的空白对照，N、N1、N2为阴性对照，P1、P为阳性对照，M为Marker。结果表明，通过单细胞激光弹射分选一体化装置弹射分选可准确获得单个大肠杆菌，经MDA扩增可获得平均约10kb的DNA扩增产物，大肠杆菌特异基因uspA片段及16SrRNA全长的PCR产物经测序验证也证实，MDA产物来自于对单细胞基因组的高效扩增。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种激光弹射基片(1)，包含基底(1-1)和镀层膜(1-2)，其特征在于，所述镀层膜(1-2)在脉冲激光作用下气化或融化，所述镀层膜材料包括ITO(氧化铟锡)、FTO(氟掺杂氧化锡)、AZO(铝掺杂氧化锌)中的一种或多种，所述基底(1-1)材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃和氟化钙玻璃中的一种或多种，所述激光弹射基片(1)用于观察识别以及激光弹射分选单细胞。

2.根据权利要求1所述的激光弹射基片，其特征在于，所述基底的厚度为0.1-2mm，所述镀层膜的厚度为10-500nm。

3.根据权利要求1所述的激光弹射基片，其特征在于，所述激光弹射分选所采用的激光波长为266nm-1064nm，激光脉宽为1fs-1s，激光能量范围为1μJ-100μJ。

4.根据权利要求1所述的激光弹射基片，其特征在于，所述观察识别包括收集单细胞拉曼散射信号或荧光信号，获得单细胞拉曼图谱或荧光图像，分析拉曼图谱或荧光图像识别单细胞。

5.一种单细胞激光弹射分选一体化装置，其特征在于，包含权利要求1-4任一所述激光弹射基片(1)，点样芯片(2)和接收芯片(3)；

所述激光弹射基片(1)、所述点样芯片(2)和所述接收芯片(3)按顺序叠加，可逆贴合，形成一体化结构。

6.根据权利要求5所述的单细胞激光弹射分选一体化装置，其特征在于，所述点样芯片(2)的材料为透明软质高分子材料，包括PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅橡胶或PVC(聚氯乙烯)中的一种或多种，所述接收芯片(3)的材料为透明材料，包括硅酸盐玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)或者PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的单细胞激光弹射分选一体化装置，其特征在于，所述点样芯片(2)上设有一个或多个微通孔(2-1)，所述接收芯片(3)上设有一个或多个与点样芯片(2)上的所述微通孔(2-1)位置一一对应的微井(3-1)；所述微通孔(2-1)的直径小于所述微井(3-1)的直径。

8.一种单细胞快速测量和分选的方法，包括

1)将细胞滴涂于权利要求1-4任一所述的激光弹射基片(1)的镀层膜(1-2)表面；

2)利用显微镜从所述激光弹射基片(1)的基底(1-1)方向透过所述基底(1-1)观察识别单细胞；

3)开启脉冲激光将识别的单细胞从激光弹射基片(1)的镀层膜(1-2)表面弹射分离。

9.一种利用上述权利要求5所述的单细胞激光弹射分选一体化装置进行单细胞快速测量和分选的方法，包括

1)将所述点样芯片(2)与所述激光弹射基片(1)的镀层膜(1-2)正面贴合形成点样孔，将细胞滴涂于点样孔中；

2)将所述接收芯片(3)贴合于所述点样芯片(2)，微井(3-1)与点样孔位置一一对应形成一体化装置；

3)利用显微镜从所述激光弹射基片(1)的基底(1-1)方向透过基底(1-1)观察识别单细胞；

4)开启脉冲激光将识别的单细胞从激光弹射基片(1)的镀层膜(1-2)表面弹射分离收集至下方接收芯片(3)对应的微井(3-1)中。