CN107557312A - 一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基及制备方法和应用 - Google Patents
一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基及制备方法和应用，它由一定比例的氯化钙、氯化钾、氯化镁、氯化铵、磷酸二氢钾、乙酸钠、SL‑10、哌嗪‑1,4‑二乙磺酸、硫酸亚铁、硝酸钠、维生素B1组成，步骤是：（1）培养基的配置：A液；B液；C液；（2）培养基的灭菌：A液和C液的灭菌方法为：无菌条件下用聚醚砜膜进行抽滤除菌，备用；（3）B液的灭菌，依次将灭菌后的A液、B液和C液倒入培养瓶中分装，获得无菌培养液。经三代及以上富集传代培养，高通量测序后获得的微生物遗传信息具有通量高、专一性强，摒除了传统筛选培养方法的不足，全面准确地揭示了土壤、沉积物和地下水等环境中硝酸盐依赖性亚铁氧化菌群信息。
Description
技术领域：
本发明涉及土壤生态环境领域，更具体涉及一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基，还涉及可用于沉积物、水体中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基的制备方法，还涉及一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基的用途。
背景技术
铁是地壳中的第四大元素，也是土壤中活泼的变价元素。铁氧化物的存在对土壤、沉积物等环境中的微生物参与生物地球化学循环过程具有着重要影响。厌氧条件下，土壤铁氧化可为某些化能自养型(Chemolithotrophic)微生物提供电子供体；同样在厌氧环境下，甲酸根、乙酸根、丙酸根等短链脂肪酸可被铁还原菌氧化，而铁氧化物再次被还原。此外，土壤铁循环还与土壤中N和S等矿质元素循环以及污染物迁移密切相关。
硝酸盐依赖型铁氧化细菌是目前已知的几种铁氧化细菌中最为重要的一类功能微生物，在农田C、N循环过程中扮演着重要角色；该类微生物能在厌氧条件下利用硝酸根为电子受体，同时将土壤中的二价铁氧化；厌氧铁氧化与土壤氮循环中的反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐还原等过程密切相关，直接影响到作物对土壤氮素的利用以及土壤氧化亚氮(N2O)等温室气体的排放效应。
国内外对铁氧化细菌的研究相对较晚，上世纪九十年代才有关于好氧嗜中性铁氧化细菌和厌氧光能铁氧化细菌等研究报道。目前已知参与铁氧化过程的微生物包括嗜酸性铁氧化细菌在内的共有四大类营养类型铁氧化细菌。尽管硝酸盐依赖性的铁氧化细菌已在土壤、沉积物和水体中等环境中被陆续分离、鉴定，因传统培养分离的微生物占总群落微生物的比重很小，尚不能全面、准确的反映出真实条件下土壤中硝酸盐依赖性铁氧化菌群的分布类型及环境效应。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基，本培养基可以有效避免培养基中亚铁等组分在高温、高压灭菌的过程中被氧化或与其他物质络合等反应，形成絮凝状沉淀，导致培养基组分发生变化。
本发明的另一个目的是在于提供了一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养的制备方法，本方法对于揭示我国农田生态系统中铁细菌参与的铁循环以及铁-碳、铁-氮等耦合机制以及农田温室排放减排措施的制定等具有重要的科学意义和指导价值。
本发明还有一个目的是在于提供了一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基在土壤环境生态中的应用，该富集培养方法揭示我国几种亚热带土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌的群落构成，模拟了厌氧条件下对该类微生物对土壤中亚铁氧化能力以及硝酸盐的转化、小分子有机酸等基质利用情况，本方法对于开展陆地生态系统碳、氮循环研究具有重要参考价值。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，包括常规组分和特殊组分，其中常规组分为：氯化钙、氯化钾、氯化镁、氯化铵、磷酸二氢钾、微量元素溶液(SL-10)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)和维生素B1溶液(1.0％的母液)；特殊组分为：硫酸亚铁、硝酸钠和醋酸钠。
所述的微量元素溶液(SL-10)由以下成分构成：四水氯化亚铁1.5g，7.7M盐酸10ml，六水氯化钴0.006g，四水氯化锰0.036g，氯化锌0.024g，硼酸0.002g，二水钼酸钠0.19g，六水氯化镍0.1g，二水氯化铜0.07g，去离子水定容至1L，调pH6.0。
所述的维生素B1溶液为维生素B1用去离子水配制成1.0％的母液。
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，它由以下重量份的原料制成1L培养液：
所述的微量元素溶液(SL-10)由以下成分构成：四水氯化亚铁1.5g，7.7M盐酸10ml，六水氯化钴0.006g，四水氯化锰0.036g，氯化锌0.024g，硼酸0.002g，二水钼酸钠0.19g，六水氯化镍0.1g，二水氯化铜0.07g，去离子水定容至1L，调pH6.0。
所述的维生素B1溶液为维生素B1用去离子水配制成1.0％的母液。
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，它由以下重量份的原料制成(优选范围)：
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，它由以下重量份的原料制成(较好范围)：
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，它由以下重量份的原料制成(最好范围)：
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，它由以下重量份的原料制成1L培养液：
一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基的制备方法，其步骤是：
(1)培养基的配置：
本培养基分为三个部分，现配现用，分别为：
A液：2.5ml微量元素溶液(SL-10)、5.0ml维生素B1溶液、5.0mM哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)混合，用去离子水稀释定容至250ml；
B液：0.6mM氯化钙(CaCl2)、0.2mM氯化钾(KCl)、0.5mM氯化镁(MgCl2)、1.0mM氯化铵(NH4Cl)、0.1mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、5.0mM乙酸钠、12.0mM硝酸钠(NaNO3)混合，用去离子水稀释定容至500ml；
C液：10.0mM硫酸亚铁(FeSO4)用去离子水溶解、定容至250ml。
(2)培养基的灭菌：
步骤(1)中的A液和C液的灭菌方法为：无菌条件下用0.45um聚醚砜膜进行抽滤除菌，备用；
步骤(1)中的B液的灭菌方法为：121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温(20－25℃)后备用。
在无菌条件下，依次将灭菌后的A液、B液和C液倒入培养瓶中分装，获得无菌培养液。
通过上述技术措施，解决了培养基中硫酸亚铁等组分在高温、高压灭菌的过程中被氧化或与其他物质络合等反应，导致培养基组分发生变化。其发明相对于现有技术的进步，主要在于进一步完善硝酸盐依赖性铁氧化菌富集培养方法。解决了现有的技术可能存在着培养基除菌不彻底或者各组分在高温、高压灭菌过程中发生变化，改变试验体系的真实条件。
一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基在土壤环境生态中的应用，其步骤是：
(1)富集条件优化：
取10g森林土壤样品添加到100ml除菌培养基中，血清瓶的容积为125ml；培养温度设置为25℃，厌氧培养箱气体由N2，H2和CO2构成，其组分分别为80:10:10，v/v，培养时间为2周；培养结束后取上清液10ml添加到90ml除菌后的培养基中传代富集培养，按此方法传代富集三代；
(2)样品制备：
取5ml步骤(1)中的第三代富集培养液，添加到95ml除菌后的培养基中，继续培养336h，即为样品，其中，一部分样品用于测定铁氧化细菌对硝酸盐和乙酸盐的基质利用能力以及铁氧化能力，另一部分样品用于送样进行高通量测序。
(3)高通量测序分析：
将步骤(3)中的样品，采用Illumina MiSeq高通量测序平台进行16S rRNA的V3-V4区测序分析，通用引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，反向引物为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)；PCR扩增条：98℃，2min(初始变性)；98℃，15s；55℃，30s；72℃，30s(25-27循环)；72℃，5min(链延伸)。
经高通量测序，获得一种森林土壤DNA序列优化后的条数为26329，该序列按97％相似性水平下可分为80个OTUs，获得的硝酸盐依赖性铁氧化细菌分别被划分为6个门，10个纲，20个目，32个科，60个属。
本发明与现有技术相比，具备以下优点和效果：
1、该方法避免培养基中亚铁等组分在高温、高压灭菌的过程中被氧化或与其他物质络合等反应，形成絮凝状沉淀，导致培养基组分发生变化；
2、经三代及以上传代富集培养后，目标菌群逐渐变成优势菌群，传统培养方法中的大量不可培养微生物依然能存在，物种多样性保持良好。
3、采用分部除菌再混合配制，能有效避免培养基各组分在高温下反应、失效，甚至造成假阳性结果；
4、取样、培养等实验过程均在厌氧条件下完成，避免环境中氧气干扰二价铁氧化，实验结果更准确可靠；
5、高通量测序技术具有测序通量高，准确率高，摒除了传统培养、测序技术的不足，能更全面准确的涵盖土壤环境中硝酸盐依赖性亚铁氧化菌群信息。
附图说明
图1为四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌对乙酸盐、硝酸盐等基质利用情况示意图：
四种土壤的硝酸盐依赖性铁氧化细菌在8天内将培养液中78.9％-95.9％的乙酸盐消耗掉，94.1％-98.4％硝酸盐被消耗或参与了反硝化反应。
图2为相对丰度大于1％的硝酸盐依赖性铁氧化细菌分类示意图：
四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌主要归属于7个属，其中Bicallus在四种土壤中相对丰度最高(21.7％-74.6％)，Massilia在四种土壤中相对丰度最低(4.8％-9.8％)。此外，所获得的铁氧化细菌在不同土壤中分布具有较大差异，体现出显著的物种多样性。
图3为四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化菌群对亚铁的氧化能力示意图：
四种土壤的硝酸盐依赖性铁氧化细菌在厌氧条件下对培养液中的Fe2+具有很强的氧化能力。富集培养6天内，共计50.1％-79.6％的亚铁被氧化为Fe3+；培养结束后，四种富集液中共计80.4％-86.6％的亚铁被氧化成Fe3+。
具体实施例
实施例1：
一种湖水中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基，包括常规组分和特殊组分，其中常规组分为：氯化钙、氯化钾、氯化镁、氯化铵、磷酸二氢钾、SL-10、PIPES和维生素B1溶液；特殊组分为：硫酸亚铁、硝酸钠和醋酸钠。
一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基，它由以下重量份的原料组成(1L富集培养液含)：
氯化钙：0.5mM；氯化钾：0.3mM；氯化镁：0.55mM；氯化铵：1.2mM；磷酸二氢钾：0.2mM；乙酸钠：6.0mM；SL-10：3.5ml；PIPES：6.0mM；硫酸亚铁：13mM；硝酸钠：13.0mM；维生素B1：6ml。
一种用于富集培养湖水中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基的制备方法，其步骤为：
(1)培养基的配置：
本培养基分为三个部分，现配现用，三部分为：
A液：3.5ml SL-10、6ml维生素B1溶液(1.0％母液)、6.0mM PIPES混合，用去离子水稀释至250ml；
B液：0.5mM CaCl2、0.3mM KCl、0.55mM MgCl2、1.2mM NH4Cl、0.2mMKH2PO4、6.0mM乙酸钠、13.0mM NaNO3混合，用去离子水稀释至500ml；
C液：13.0mM FeSO4用去离子水溶解、定容至250ml。
(2)培养基的灭菌：
步骤(1)中的A液和C液的灭菌方法为：无菌条件下用0.45um聚醚砜膜进行抽滤除菌，备用；
步骤(1)中的B液的灭菌方法为：121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温(20－25℃)后备用。
在无菌条件下，依次将灭菌后的A液、B液和C液倒入培养瓶中，调节pH为7.0，分装后获得用于富集培养湖水中硝酸盐依赖性铁氧化细菌的培养基。
实施例2：
一种用于硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基，它由以下重量份的原料制成1L培养液：
其制备步骤与实施例1相同。
通过上述技术措施，在湖北省第四纪红壤和钙质潮土两类典型土壤中均富集获得了多种硝酸盐依赖性铁氧化细菌，该类细菌丰度大于1.0％的有7个属；两周富集培养结束后，该类微生物在上述几种培养液中对亚铁氧化能力达到72.44％–86.58％，与公开报道的文献Eric E.Roden,Dmitri Sobolev,Brian Glazer,et al.Potential for MicroscaleBacterial Fe Redox Cycling at the Aerobic-Anaerobic Interface[J].Geomicrobiology Journal,2004,21(6):379-391)较为接近，证实了上述技术有效可靠。
实施例3：
一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群富集培养基在水稻土壤中的富集培养应用，其步骤是：
(1)富集条件优化：
取10g土壤样品添加到100ml除菌培养基中，血清瓶的容积为125ml；培养温度设置为25℃，厌氧培养箱气体由N2，H2和CO2构成，其组分分别为80:10:10，v/v，培养时间为2周；培养结束后取上清液10ml添加到90ml除菌后的培养基中传代富集培养，按此方法传代富集三代；
(2)样品制备：
取5ml步骤(1)中的第三代富集培养液，添加到95ml除菌后的培养基中，继续培养336h，即为样品，其中，一部分样品用于测定铁氧化细菌对硝酸盐和乙酸盐的基质利用能力以及铁氧化能力(富集培养期间每24h取样一次)，另一部分样品培养后送样进行高通量测序。
(3)高通量测序分析：
将步骤(3)中的样品，采用Illumina MiSeq高通量测序平台进行16S rRNA的V3-V4区测序分析，通用引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，反向引物为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)；PCR扩增条：98℃，2min(初始变性)；98℃，15s；55℃，30s；72℃，30s(25-27循环)；72℃，5min(链延伸)。
经高通量测序，获得一种水稻土壤DNA序列优化后的条数为45427，该序列按97％相似性水平下可分为183个OTUs，获得的硝酸盐依赖性铁氧化细菌分别被划分为6个门，11个纲，23个目，34个科，66个属。
实施例4：
借助实施例1-3，本实施例研究了湖北省四种不同土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌的多样性分布状况，经三代富集传代培养、Illumina MiSeq高通量测序后，四种富集土样DNA序列优化后的条数为26329-41431，以下序列在不同样品中按97％相似性水平下可分为75-169个OTUs，获得的硝酸盐依赖性铁氧化细菌分别被划分为6个门，10个纲，20个目，32个科，64个属。其中，相对丰度大于1.0％的有7个属。
富集培养经高通量测序后表明Actinobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes为首次发现存在于我国亚热带土壤中的硝酸盐依赖性铁氧化细菌。
Claims (7)
1.一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，其特征在于，它由以下重量份的原料制成1L培养液：
原料 重量份
氯化钙 0.2－1.0 mM
氯化钾 0.06－0.3 mM
氯化镁 0.2－1.0 mM
氯化铵 0.5－2.0 mM
磷酸二氢钾 0.05－0.2 mM
乙酸钠 0.5－10.0 mM
微量元素溶液 1－5 ml
哌嗪-1,4-二乙磺酸 2.0－10.0 mM
硫酸亚铁 5.0－20.0 mM
硝酸钠 5.0－20.0 mM
维生素B1溶液 2.0－10.0 ml
pH 6.8－7.2，
所述的微量元素溶液，它由以下成分构成：四水氯化亚铁1.5g，7.7M盐酸10ml，六水氯化钴0.006g，四水氯化锰0.036g，氯化锌0.024g，硼酸0.002g，二水钼酸钠0.19g，六水氯化镍0.1g，二水氯化铜0.07g，去离子水定容至1L，调pH6.0；
所述的维生素B1溶液为维生素B1配制成含量为1.0%的母液。
2.根据权利要求1所述的一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，其特征在于：
原料 重量份
氯化钙 0.3－0.9 mM
氯化钾 0.08－0.3 mM
氯化镁 0.3－0.8 mM
氯化铵 0.6－1.8 mM
磷酸二氢钾 0.06－0.18 mM
乙酸钠 2.0－8.0 mM
微量元素溶液 1.5－4.5 ml
哌嗪-1,4-二乙磺酸 3.0－9.0 mM
硫酸亚铁 6.0－16.0 mM
硝酸钠 8.0－18.0 mM
维生素B1溶液 3.0－9.0 mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，其特征在于：
原料 重量份
氯化钙 0.4－0.8 mM
氯化钾 0.1－0.3 mM
氯化镁 0.4－0.7mM
氯化铵 0.8－1.6 mM
磷酸二氢钾 0.08－0.16 mM
乙酸钠 3.0－7.0 mM
微量元素溶液 2.0－4.0 ml
哌嗪-1,4-二乙磺酸 4.0－8.0 mM
硫酸亚铁 7.0－14.0 mM
硝酸钠 9.0－16.0 mM
维生素B1溶液 4.0－8.0 ml
pH 6.8－7.2。
4.根据权利要求1所述的一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，其特征在于：
原料 重量份
氯化钙 0.5－0.7 mM
氯化钾 0.15－0.25 mM
氯化镁 0.45－0.65 mM
氯化铵 0.9－1.5 mM
磷酸二氢钾 0.1－0.15 mM
乙酸钠 4.0－6.0 mM
微量元素溶液 2.5－3.5 ml
哌嗪-1,4-二乙磺酸 5.0－7.0 mM
硫酸亚铁 8.0－12.0 mM
硝酸钠 10.0－14.0 mM
维生素B1溶液 5.0－7.0 ml
pH 6.8－7.2。
5.根据权利要求1所述的一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基，其特征在于：
原料 重量份
氯化钙 0.6 mM
氯化钾 0.2 mM
氯化镁 0.5 mM
氯化铵 1.0 mM
磷酸二氢钾 0.1 mM
乙酸钠 5.0 mM
微量元素溶液 2.5 ml
哌嗪-1,4-二乙磺酸 5.0 mM
硫酸亚铁 10.0 mM
硝酸钠 12.0 mM
维生素B1溶液 5.0 ml
pH 7.0。
6.权利要求1所述的一种用于富集培养土壤中硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基的制备方法，其步骤是：
（1）培养基的配置：
A液：2.5 ml微量元素溶液、5.0 ml维生素B1溶液、5.0 mM哌嗪-1,4-二乙磺酸混合，用去离子水稀释定容至250 ml；
B液：0.6 mM 氯化钙、0.2 mM氯化钾、0.5 mM 氯化镁、1.0 mM 氯化铵、0.1 mM磷酸二氢钾、5.0 mM乙酸钠、12.0 mM 硝酸钠混合，用去离子水稀释定容至500ml；
C液：10.0 mM硫酸亚铁用去离子水溶解、定容至250ml；
（2）培养基的灭菌：
步骤（1）中的A液和C液的灭菌方法为：无菌条件下用0.45um聚醚砜膜进行抽滤除菌，备用；
步骤（1）中的B液的灭菌方法为：121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温20-25℃后备用；在无菌条件下，依次将灭菌后的A液、B液和C液倒入培养瓶中分装，获得无菌培养液。
7.权利要求1所述的一种硝酸盐依赖亚铁氧化菌群培养基在土壤环境生态中的应用，其步骤是：
（1）富集条件优化：
取10g土壤样品添加到100ml除菌培养基中，血清瓶的容积为125ml；培养温度设置为25℃，厌氧培养箱气体由N2，H2 和 CO2 构成，其组分分别为80:10:10，v/v，培养时间为2周；培养结束后取上清液10ml添加到90ml除菌后的培养基中传代富集培养，按此方法传代富集三代；
（2）样品制备：
取5ml步骤（1）中的第三代富集培养液，添加到95ml除菌后的培养基中，继续培养336h，为样品，其中：一部分样品用于测定铁氧化细菌对硝酸盐和乙酸盐的基质利用能力以及铁氧化能力，另一部分样品用于送样进行高通量测序；
（3）高通量测序分析：
将步骤（3）中的样品，采用Illumina MiSeq高通量测序平台进行16S rRNA的V3-V4区测序分析，通用引物为： 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，反向引物为5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’ ；PCR扩增条件：98℃，2 min；98℃，15s；55℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min。
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| CN112226524B (zh) * | 2020-09-09 | 2023-10-27 | 广东省科学院生态环境与土壤研究所 | 判别土壤中参与硝酸盐依赖性锑氧化过程的菌种及其关键功能基因的方法 |
| CN115124142A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-09-30 | 兰州资源环境职业技术大学 | 一种利用铁铵氧化脱除污水中氮素的装置及脱氮工艺 |
| CN115124142B (zh) * | 2022-07-28 | 2024-06-07 | 兰州资源环境职业技术大学 | 一种利用铁铵氧化脱除污水中氮素的装置及脱氮工艺 |
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