CN107556303B - 一种化合物、其合成方法和利用该化合物制成的试剂盒及其在谷胱甘肽检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物、其合成方法和利用该化合物制成的试剂盒及其在谷胱甘肽检测中的应用，该化合物为7‑(2‑酰基噻吩)‑3H‑吩恶嗪‑3‑酮，在催化剂存在的条件下，将式Ⅱ所示的7‑羟基吩恶嗪酮钠盐与式Ⅲ所示的2‑噻吩甲酰氯混匀进行反应制备得到，该化合物可以作为荧光探针、其试剂盒可以应用于检测内源性谷胱甘肽及细胞裂解液中的谷胱甘肽领域。而且该化合物的试剂盒是一种性能优良、使用方便的谷胱甘肽检测设备，有望会成为现代生物学、生理学和医学等相关领域提供有力的研究工具。

Description

一种化合物、其合成方法和利用该化合物制成的试剂盒及其 在谷胱甘肽检测中的应用

技术领域

本发明涉及荧光探针检测技术领域，尤其涉及一种可以用作荧光探针的化合物、其合成方法和利用该化合物制成的试剂盒及其在内源性谷胱甘肽、细胞裂解液中中谷胱甘肽检测的应用。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是细胞内含量最多的非蛋白类含巯基的生物小分子，具有多种生理功能，在细胞信号转导、基因调控、调节细胞内氧化还原稳态中均发挥着重要作用。因此，在临床医学中研发一种有效检测生物样品中谷胱甘肽含量的方法是具有十分重要的意义的。近年来，已有大量被报道的荧光探针用于检测生物体内的谷胱甘肽。然而，这些探针仍存在一些缺点。例如，谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸具有极其相似的结构，这对探针的高选择性检测造成了极大的挑战，这也是硫醇探针普遍存在的缺点。通过添加表面活性剂提高选择性又会限制其在生物体系中的应用。这些探针存在的另一个缺陷是短波长发射，这样会引发自体荧光和生物损伤。

因此，开发一种新化合物作为谷胱甘肽的荧光探针，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

发明内容

为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种化合物、其合成方法和利用该化合物制成的试剂盒及其在谷胱甘肽检测中的应用，以提高对谷胱甘肽检测的准确性。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

第一方面，本发明提供了一种化合物，该化合物具有如式Ⅰ的结构式：

以上化合物用作检测内源性谷胱甘肽的荧光探针，名称为7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮。

第二方面，本发明提供了该化合物的制备方法，包括下述步骤：在催化剂存在的条件下，将式Ⅱ所示的7-羟基吩恶嗪酮钠盐与式Ⅲ所示的2-噻吩甲酰氯混匀进行反应，得到式Ⅰ所示化合物。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述催化剂选自有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱选自三乙胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述7-羟基吩恶嗪酮钠盐、2-噻吩甲酰氯和催化剂的投料摩尔比为0.5：(1～5)：(0.5～5)，优选1:(2～4):(1～4)，更有选为1:4:4。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述反应的反应温度为0℃～60℃，优选为50℃，反应时间为1～24小时。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。有机溶剂的用量以完全溶解反应物为准，无需特别限定其用量。

第三方面，本发明提供了利用该化合物制成的试剂盒。

所述试剂盒，包括

试剂储备液1，所述试剂储备液1为缓冲液；

和试剂储备液2，所述所述试剂储备液2为本发明提供的化合物的溶液(即7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮的溶液)。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述试剂储备液1中，所述缓冲液为pH值为6.5～9的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M，优选为10mM。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述试剂储备液2中，所述7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮的浓度为1mM；溶剂为乙醇或二甲基亚砜，优选为二甲基亚砜。

第四方面，本发明提供了该化合物在谷胱甘肽检测中的应用，包括在检测内源性谷胱甘肽中的应用，及在检测细胞裂解液中的谷胱甘肽的应用。

在检测中，该化合物可以作为荧光探针发挥作用，该荧光探针本身的荧光强度非常弱，加入谷胱甘肽后，谷胱甘肽的巯基就会进攻双键碳，发生亲核加成；进而谷胱甘肽的氨基进攻酰基发生亲核取代，并切断酯键，从而释放出试卤灵荧光母体，溶液荧光显著增强并且颜色由几乎无色变成粉色，实现对谷胱甘肽的检测。

本发明中，作为一种优选的技术方案，在检测谷胱甘肽时，采用本发明提供的试剂盒进行检测，包括如下步骤：

1)制作标准曲线：

a)以550nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的谷胱甘肽标准品的溶液在发射波长为585nm处的荧光强度，记为F；并测定试剂空白在发射波长为585nm处的荧光强度，记为F₀，以谷胱甘肽的浓度C为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；

其中，ΔF＝F-F₀；所述一系列不同浓度的谷胱甘肽标准品的溶液由所述谷胱甘肽检测试剂盒中的试剂储备液1、试剂储备液2和谷胱甘肽的标准储备溶液混匀而得；

2)检测待测样品中谷胱甘肽的含量：

将所述步骤1)所述谷胱甘肽标准品替换为待测样品，按照所述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为585nm处的荧光强度，记为F’，将所述F’代入所述步骤1)所得标准曲线，进而得到所述待测样品中谷胱甘肽的含量。

上述检测方法中，所述一系列不同浓度的谷胱甘肽标准品的溶液中，所述谷胱甘肽的浓度依次为0，0.1，1，2，5，10，12，16，18和20μM。

所述一系列不同浓度的谷胱甘肽标准品的溶液的体积均为2mL。

所述谷胱甘肽标的准储备溶液中，溶剂为水；所述谷胱甘肽的标准储备溶液中谷胱甘肽的浓度为10mM。

所述谷胱甘肽检测试剂盒中的试剂储备液1和所述试剂储备液2的体积比为1mL：10μL。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明以试卤灵(resorufin)荧光染料为母体，2-噻吩甲酰氯作为特异性响应基团，设计合成了一种检测谷胱甘肽的荧光探针(式Ⅰ所示化合物)，实验发现，该探针本身的荧光强度非常弱，加入谷胱甘肽后，谷胱甘肽的巯基就会进攻双键碳，发生亲核加成；进而谷胱甘肽的氨基进攻酰基发生亲核取代，并切断酯键，从而释放出试卤灵荧光母体，溶液荧光显著增强并且颜色由几乎无色变成粉色，表明该方法可用于谷胱甘肽的检测。为了验证该方法的实用性，并将其运用于A549细胞中谷胱甘肽的定量测定，应用该原理，我们还将其应用于检测细胞裂解液中的谷胱甘肽。本发明具有操作简便，成本低，快速高效灵敏等优点，易于推广和应用。

另外，制备得到的试剂盒，在检测内源性谷胱甘肽或细胞裂解液中的谷胱甘肽的应用时，具有以下明显的优势：

1)试剂储备液2为微带桔黄色，且无荧光；而与谷胱甘肽反应后则可显示粉红色并且发出强烈的荧光。

2)生物相容性较好。

3)灵敏度高，谷胱甘肽浓度在≥0.1mM时即可用肉眼观察到明显的粉红色产生。

4)该显色反应仅在谷胱甘肽存在的条件下发生，其他常见的无机盐、糖类、氨基酸、蛋白质、生物巯基物种不产生干扰。

5)具有长荧光发射波长(585nm)，可用荧光光谱法检测，测定限可达8.9×10^-7M，可用于细胞和细胞裂解液中谷胱甘肽含量的检测。

因此，该试剂盒是一种性能优良、使用方便的谷胱甘肽检测设备，有望会成为现代生物学、生理学和医学等相关领域提供有力的研究工具。

附图说明

图1为本发明制备式Ⅰ所示化合物的化学反应方程式。

图2为谷胱甘肽检测试剂盒与不同浓度的谷胱甘肽的荧光光谱及其线性关系。

图3为谷胱甘肽检测试剂盒用于各种氨基酸反应的荧光发射光谱。

图4为谷胱甘肽检测试剂盒用于各种无机盐、活性氧和蛋白质反应的荧光发射光谱。

图5为谷胱甘肽检测试剂盒测定A549细胞中的谷胱甘肽的浓度。

图6为谷胱甘肽检测试剂盒测定细胞裂解液中谷胱甘肽的浓度。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮制备实施例

7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮制备时，采用在催化剂存在的条件下，将7-羟基吩恶嗪酮钠盐与2-噻吩甲酰氯混匀进行反应，从而得到7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮。其中，所述催化剂选自有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱选自三乙胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述7-羟基吩恶嗪酮钠盐、2-噻吩甲酰氯和催化剂的投料摩尔比为0.5：(1～5)：(0.5～5)，1：2-10：1-10

优选1:(2～4):(1～4)，更优选1:4:4；所述反应的反应温度为0℃～60℃，优选为50℃，反应时间为1～24小时；所述反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、四氢呋喃和乙腈中的至少一种。有机溶剂的用量以完全溶解反应物为准，无需特别限定其用量。

参照以下表格中的试验参数、并按照图1所示的化学反应流程图进行制备。

以D组试验为例，操作步骤如下：将试卤灵钠盐(58.8mg,0.25mmol)溶解于THF(5mL)中，然后，加入2-噻吩甲酰氯(54μL,0.5mmol)和三乙胺(0.5mL)。令反应液在氩气环境下50℃恒温搅拌1h。

反应完毕，减压蒸除溶剂得粗产品；所得粗品用二氯甲烷溶解，并用二氯甲烷和双蒸水反复萃取5次，取二氯甲烷层并用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干溶剂；以二氯甲烷/甲醇(10:1，V/V)作洗脱液，用柱层析提纯粗产品，得到桔黄色粉末，即为所需探针(44.4mg，产率55％)。

该产物的结构表征数据结果如下：

¹H NMR(600MHz,DMSO-d6,298K):δ8.16(d,J＝4.0Hz,1H),8.10(s,1H),7.94(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(d,J＝10.7Hz,2H),7.42(d,J＝8.6Hz,1H),7.35(s,1H),6.86(d,J＝9.8Hz,1H),6.33(s,1H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d6,298K):δ185.7,159.5,152.9,149.5,148.3,144.1,136.0,135.8,135.2,134.8,131.3,131.0,129.0,119.7,110.2,106.2.

高分辨质谱：HR-ESI-MS C₁₇H₁₀NO₄S，计算值：324.0325；实测值：324.0325.

由上可知，该产物结构正确，为式Ⅰ所示的7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮。

其余组别得到的产物检测结果与D组结果吻合。

实施例2

式Ⅰ所示化合物(下称试剂1)与不同浓度谷胱甘肽反应的光谱性质

称取3.24mg试剂1，配成10mL二甲基亚砜溶液作为母液(1mM)。

在10mL量筒里，加入5mL的PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)以及50μL探针储备溶液，混合均匀后加入所需谷胱甘肽样品溶液。最终用一定量的PBS将溶液定容至10mL，混合均匀。在37℃下反应100min后，测量其紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以550nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压400V。

图2为试剂1与0-20μM谷胱甘肽反应的荧光光谱。

图2结果表明，本发明中的试剂1具有以下特点：

1)探针在溶液中呈无色并且无荧光，但随着谷胱甘肽的加入，该探针在约575nm处产生吸收，并在585nm处产生粉红色荧光；

2)紫外可见吸收的强度和荧光强度随谷胱甘肽浓度的增加而增加；

3)使用10μM的试剂1时，荧光增强与谷胱甘肽的浓度在2.3～20μM范围内呈线性关系。

实施例3

试剂1(即式Ⅰ所示化合物)与各种氨基酸反应情况(选择性研究)

在10μM的试剂1溶液中分别加入各种物质：高半胱氨酸(1mM)、半胱氨酸(1mM)、丝氨酸(1mM)、亮氨酸(1mM)、谷氨酸(1mM)、精氨酸(1mM)、丙氨酸(1mM)、天冬氨酸(1mM)、酪氨酸(1mM)、组氨酸(1mM)。在37℃下反应100min后，测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以550nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压400V。

在10mL混合了上述各种物质的溶液中加入100μl的试剂1母液(1mM)，再加入谷胱甘肽使其最终浓度为100μM。

图3为试剂1(10μM)与各种氨基酸混合时得到的荧光发射光谱。图中数字代表为(1)探针,(2)高半胱氨酸,(3)半胱氨酸,(4)丝氨酸,(5)亮氨酸,(6)谷氨酸,(7)精氨酸,(8)丙氨酸,(9)天冬氨酸,(10)酪氨酸,(11)组氨酸,(12)二硫苏糖醇,(13)硫化氢,(14)二氧化硫,(15)抗坏血酸,(16)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,(17)谷胱甘肽。

实验结果表明，只有谷胱甘肽可引起试剂1产生明显的光信号响应，证明该试剂对谷胱甘肽具有高度的选择性，而其他氨基酸的存在不干扰谷胱甘肽的测定。

实施例4

试剂1(即式Ⅰ所示化合物)与各种无机盐、活性氧和蛋白质反应情况(选择性研究)

在10μM的试剂1溶液中分别加入各种物质：氯化钾(150mM)，氯化钙(2.5mM)，氯化镁(2.5mM)，氯化铜(2.5mM)，氯化镁(2.5mM)，氯化锌(2.5mM)，葡萄糖(10mM)，双氧水(10μM)，羟基自由基(10μM)，过氧化亚硝酸盐(10μM)，次氯酸(10μM)，人血清白蛋白(100μM)，肌酸激酶(100μM)，谷胱甘肽(100μM)，凝血酶(100μM)。在37℃下反应100min后，测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以550nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压400V。

在10mL混合了上述各种物质的溶液中加入100μl的试剂1母液(1mM)，再加入谷胱甘肽使其最终浓度为100μM。

图4为试剂1(10μM)与各种氨基酸混合时得到的荧光发射光谱。图中，数字代表(1)探针,(2)次氯酸,(3)过氧化亚硝酸盐,(4)过氧化氢叔丁基,(5)超氧阴离子,(6)过氧化氢,(7)氯化钾,(8)氯化铁,(9)氯化铜,(10)氯化钙,(11)氯化锌,(12)氯化镁,(13)细胞色素C,(14)葡萄糖,(15)人血清白蛋白,(16)肌酸激酶,(17)硝基还原酶,(18)凝血酶,(19)谷胱甘肽。

实验结果表明，只有谷胱甘肽可引起试剂1产生明显的光信号响应，证明该试剂对谷胱甘肽具有高度的选择性，而其他物质的存在不干扰谷胱甘肽的测定。

实施例5

利用试剂1制备试剂盒的实施例

该试剂盒中，包括试剂储备液1和试剂储备液2，其中，所述试剂储备液1为pH值6.5～9的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种，所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M，优选为10mM。所述所述试剂储备液2为本发明提供的化合物的溶液，所述试剂1(即7-(2-酰基噻吩)-3H-吩恶嗪-3-酮)的浓度为1mM；溶剂为乙醇或二甲基亚砜，优选为二甲基亚砜。

更详细的，本实施例按照以下参数配制成多个试剂盒。

实施例6

以实施例5中制备的试剂盒C为例，定量测定A549细胞中的谷胱甘肽的浓度

A549细胞生长于玻璃底培养皿(Corning Inc.)中，培养基采用含10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco's modified eaglemedia(DMEM)液体培养基，环境温度37℃，分别在正常条件、含有1mM N-甲基马来酰亚胺(NMM)、1mM硫辛酸(ALA)条件下孵育细胞。在进行细胞荧光成像前，贴壁的细胞用不含胎牛血清的DMEM培养基洗涤三次，然后与10μM的探针1在37℃孵育100min。孵育完成后，细胞用PBS(pH 7.4)洗涤三次后进行成像实验。

实验结果表明，该探针具有良好的水溶性及生物相容性，且能够识别并监测细胞内的谷胱甘肽。

采用其余组别的试剂盒，得出的结果一致。

实施例7

以实施例5中制备的试剂盒C为例，用谷胱甘肽试剂盒定量测定细胞裂解液中谷胱甘肽的浓度

细胞培养：A549细胞生长于玻璃底培养皿(Corning Inc.)中，培养基采用含10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco'smodified eagle media(DMEM)液体培养基，环境温度37℃，分别在正常条件、含有1mM N-甲基马来酰亚胺(NMM)、1mM硫辛酸(ALA)条件下孵育细胞。

细胞裂解：细胞经冰浴的PBS(pH 7.4)冲洗3次，离心弃上清，加入3mLPBS-EDTA(PBSE：pH 7.4，0.1M)，200W超声3s，重复30次(冰浴环境)，超声结束，加入3％的高氯酸脱蛋白，充分混匀，14000rpm，4℃离心5min，收集上清液。

在5mL上述上清液中加入50μl的试剂1母液(1mM)。将检测结果与常用的商业检测GSH试剂盒相比较。

实验结果表明，该探针的检测结果与常用的商业检测GSH试剂盒的检测结果接近，进一步验证了使用该探针检测GSH的可行性。与试剂盒相比，该试剂盒需要复杂的操作步骤检测GSH，该探针使用方便，可直接用于检测GSH。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种试剂盒，其特征在于：包括

试剂储备液1，所述试剂储备液1为缓冲液，所述试剂储备液1中，所述缓冲液为pH值为6.5～9的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M；

和试剂储备液2，所述试剂储备液2为具有如式Ⅰ的结构式化合物的溶液，

且所述化合物采用如下步骤的方法制备得到：

在催化剂存在的条件下，将7-羟基吩恶嗪酮钠盐与2-噻吩甲酰氯混匀进行反应，得到式Ⅰ所示化合物；

所述催化剂选自有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱选自三乙胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种；

所述7-羟基吩恶嗪酮钠盐、2-噻吩甲酰氯和催化剂的投料摩尔比为0.5：(1～5)：(0.5～5)；

所述试剂储备液2中，所述式Ⅰ所示化合物的浓度为1mM；溶剂为乙醇或二甲基亚砜。

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