CN107550945A - 保护受损肝细胞的榆黄菇提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了保护受损肝细胞的榆黄菇提取物及其应用。该保护受损肝细胞的榆黄菇提取物为PSI；PSI的制备方法包括：M1)用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到榆黄菇粗提物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；M2)对榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到PSI；阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，用pH为6.8‑7.5的磷酸缓冲溶液进行洗脱。实验证明，PSI可显著提高受损肝细胞的存活率、降低胞内甘油三酯含量、提高细胞内SOD酶活性、降低胞外谷丙转氨酶含量和降低谷草转氨酶含量。

Description

保护受损肝细胞的榆黄菇提取物及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域中保护受损肝细胞的榆黄菇提取物及其应用。

背景技术

榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus)又名榆黄蘑、黄金菇、金顶侧耳，隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Agaricochaete)，为珍贵的经济菌之一。榆黄菇具有较高的营养价值，子实体中含有丰富的粗蛋白、不饱和脂肪酸、17种氨基酸、维生素和多种微量元素，能够满足人体对必需氨基酸、维生素和有益微量元素的营养需求。榆黄菇具有较高的药用价值，有文献报道其有滋补强壮的功效，有利于病体康复，降低胆固醇，可以治疗肾虚阳萎和痢疾等病患。

伴随着人们饮食结构的重大改变，过多的酒精和高热量食物的摄入直接导致肝脏损伤，主要体现在脂肪肝、酒精性肝中毒的高发，肝功指标的失衡等现象。流行病学调查发现由于不良生活习惯造成的肝脏损伤情况日益高发并逐步趋于年轻化，是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。

肝脏是人体内的一个重要器官，参与代谢和免疫系统的多种生理活动，发挥着解毒、代谢、分泌胆汁、调节循环血量、免疫防御的功能，其中体内和体外的许多营养和非营养物质都是需要通过肝脏进行生物转化，将其彻底分解成无毒或毒性较小的物质排出体外。肝细胞受多种因素的影响，如酒精刺激、甘油三酯堆积都会引发肝脏的代谢平衡失调，造成肝损伤。当肝脏细胞发生损伤后，促使细胞发生破裂，直接导致血液中转氨酶的升高；伴随着细胞受损的进程，肝脏内会聚集大量的细胞活性氧，在氧化应激的刺激下，细胞的抗氧化活性下降，加速损伤进程，引发脂肪代谢失衡，因此肝脏受损后极易发生脂肪肝的病症。同时损伤的肝组织在体内游离脂肪酸的氧化应激作用下会发生炎症反应，逐步演变为肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至是肝癌。研发保护受损肝细胞的产品对护肝药物的开发具有重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何保护受损肝细胞。

为了解决以上技术问题，本发明提供了保护受损肝细胞的产品。

本发明所提供的保护受损肝细胞的产品(食品、保健品或/药物)的活性成分为PSI或PSII；

所述PSI由包括下述步骤的方法制备：M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；M2)对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSI的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为一步洗脱，所述一步洗脱用pH为6.8-7.5(如7.0)的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM(如3.9mM)NaH₂PO₄和5.5-6.5mM(如6.1mM)Na₂HPO₄，溶剂为水；

所述PSII由包括下述步骤的方法制备：M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；M2')对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSII的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为二步洗脱，第一步洗脱用pH为6.8-7.5(如7.0)的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM(如3.9mM)NaH₂PO₄和5.5-6.5mM(如6.1mM)Na₂HPO₄，溶剂为水；第二步洗脱用pH6.8-7.5(如7.0)的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A。

上述产品中，所述榆黄菇子实体水提液按照包括如下步骤的方法制备：用水浸泡粉碎后的榆黄菇子实体8-12小时(如8小时)，加热至90-100℃(如90℃)保持3-4小时(如4小时)，收集水溶性物质，该水溶性物质即为榆黄菇子实体水提液。

上述产品中，所述水可为去离子水。

上述产品中，所述榆黄菇可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。

上述干燥的子实体是将新鲜的榆黄菇子实体在常温(如20-25℃)下干燥或冷冻干燥得到的。

上述产品中，所述收集水溶性物质可采用离心的方法进行，所述离心采用的离心力可为6000g-15000g(如6000g)，离心时间可为20-30分钟(如30分钟)。

上述产品中，所述产品还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。

上述产品中，所述保护受损肝细胞为下述1)-5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

1)提高受损肝细胞的存活率；

2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

上述产品中，所述提高受损肝细胞的存活率可为在含所述活性成分(所述活性成分为所述PSI或所述PSII)的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率高于在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率；含所述活性成分的培养基与不含所述活性成分的培养基的区别仅在于含所述活性成分的培养基中含有所述活性成分，不含所述活性成分的培养基中不含所述活性成分，其它完全相同；所述含所述活性成分的培养基为含所述PSI的培养基或含所述PSII的培养基；所述含所述PSI的培养基与所述不含所述活性成分的培养基的区别仅在于所述含所述PSI的培养基中含有所述PSI，所述不含所述活性成分的培养基中不含所述活性成分，其它完全相同；所述含所述PSII的培养基与所述不含所述活性成分的培养基的区别仅在于所述含所述PSII的培养基中含有所述PSII，所述不含所述活性成分的培养基中不含所述活性成分，其它完全相同；

所述提高受损肝细胞的SOD酶活性可为在所述含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性高于在所述不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性；

所述降低受损肝细胞内的甘油三酯含量可为在所述含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量低于在所述不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量；

所述降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量可为在所述含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量低于在所述不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

所述降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量可为在所述含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量低于在所述不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

上述产品中，所述提高受损肝细胞的存活率具体可为在所述含所述PSI的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率的4-5倍(如4.46倍)，和/或，所述提高受损肝细胞的存活率具体可为在所述含所述PSII的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率的1.5-2.0倍(如1.96倍)；所述含所述PSI的培养基中所述PSI的含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL；所述含所述PSII的培养基中所述PSII的含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL。

上述产品中，所述降低受损肝细胞内的甘油三酯含量具体可为在所述含所述PSI的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内的甘油三酯含量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内的甘油三酯含量的0.70-0.80倍(如0.73倍)，和/或，所述降低受损肝细胞内的甘油三酯含量具体可为在所述含所述PSII的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内的甘油三酯含量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内的甘油三酯含量的0.55-0.65倍(如0.61倍)；所述含所述PSI的培养基中所述PSI的含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL；所述含所述PSII的培养基中所述PSII的含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL。

上述产品中，所述提高受损肝细胞的SOD酶活性具体可为在所述含所述PSI的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性的1.50-2.00倍(如1.66倍)，和/或，所述提高受损肝细胞的SOD酶活性具体可为在所述含所述PSII的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性的1.40-2.00倍(如1.49倍)；所述含所述PSI的培养基中所述PSI的含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL；所述含所述PSII的培养基中所述PSII的含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL。

上述产品中，所述降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量具体可为在所述含所述PSI的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量的0.40-0.55倍(如0.47倍)，和/或，所述降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量具体可为在所述含所述PSII的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量的0.55-0.65倍(如0.61倍)；所述含所述PSI的培养基中所述PSI的含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL；所述含所述PSII的培养基中所述PSII的含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL。

上述产品中，所述降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量具体可为在所述含所述PSI的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量的0.35-0.50倍(如0.41倍)，和/或，所述降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量具体可为在所述含所述PSII的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量是在不含所述活性成分的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量的0.55-0.65倍(如0.62倍)；所述含所述PSI的培养基中所述PSI的含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL；所述含所述PSII的培养基中所述PSII的含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL。

所述PSI或所述PSII在制备上述保护受损肝细胞产品(食品、保健品或/药物)中的应用也属于本发明的保护范围。

所述榆黄菇粗提物、所述PSI或所述PSII的制备方法也属于本发明的保护范围。

名称为PSI的榆黄菇提取物的制备方法，包括所述M1)和所述M2)。

名称为PSII的榆黄菇提取物的制备方法，包括所述M1)和所述M2')。

所述榆黄菇粗提物在制备保护受损肝细胞产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述榆黄菇粗提物在制备保护受损肝细胞产品中的应用中，所述保护受损肝细胞为下述a1)-a5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

a1)提高受损肝细胞的存活率；

a2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

a3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

a4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

a5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

上述a1)中，所述提高受损肝细胞的存活率可为b11和/或b12，所述b11为在含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率高于在不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基与所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基的区别仅在于所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中含有所述榆黄菇粗提物，所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中不含所述榆黄菇粗提物，其它完全相同；所述b12为在含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率高于在含真菌提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率；所述含真菌提取物的培养基与所述含所述榆黄菇粗提物的培养基的区别仅在于所述含真菌提取物的培养基中含有真菌提取物不含所述榆黄菇粗提物，所述含所述榆黄菇粗提物的培养基含所述榆黄菇粗提物不含所述真菌提取物，其它完全相同；所述真菌提取物为灰树花提取物、红灵芝提取物或毛木耳提取物；所述灰树花提取物与所述榆黄菇粗提物的制备方法的区别仅在于将所述榆黄菇粗提物的制备方法中的所述榆黄菇子实体替换为灰树花子实体，其它完全相同；所述红灵芝提取物与所述榆黄菇粗提物的制备方法的区别仅在于将所述榆黄菇粗提物的制备方法中的所述榆黄菇子实体替换为红灵芝子实体，其它完全相同；所述毛木耳提取物与所述榆黄菇粗提物的制备方法的区别仅在于将所述榆黄菇粗提物的制备方法中的所述榆黄菇子实体替换为毛木耳子实体，其它完全相同；所述含真菌提取物的培养基为含所述灰树花提取物的培养基、含所述毛木耳提取物的培养基或含所述红灵芝提取物的培养基；

上述a2)中，所述提高受损肝细胞的SOD酶活性可为b21和/或b22，所述b21为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性高于在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性；所述b22为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性高于在所述含真菌提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性；

上述a3)中，所述降低受损肝细胞内的甘油三酯含量可为b31和/或b32，所述b31为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量低于在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量；所述b32为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量低于在所述含真菌提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量；

上述a4)中，所述降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量可为b41和/或b42，所述b41为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量低于在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；所述b42为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量低于在所述含真菌提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

上述a5)中，所述降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量可为b51和/或b52，所述b51为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量低于在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；所述b52为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量低于在所述含真菌提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

上述a1)中，所述b11具体可为与在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞相比，在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞存活率提高率为150％-220％(如204％)；所述b12具体可为与在所述含所述灰树花提取物的培养基、在所述含所述毛木耳提取物的培养基和在所述含所述红灵芝提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞相比，在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞存活率提高率分别为130％-160％(如146％)，150％-200％(179％)和120％-150％(如129％)；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中所述榆黄菇粗提物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述灰树花提取物的培养基中所述灰树花提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述毛木耳提取物的培养基中所述毛木耳提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述红灵芝提取物的培养基中所述红灵芝提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL。

上述a2)中，所述b21具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性是在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性的1.78倍；所述b22具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性分别是在所述含所述灰树花提取物的培养基、在所述含所述毛木耳提取物的培养基和在所述含所述红灵芝提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的SOD酶活性的1.20倍、1.54倍和1.06倍；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中所述榆黄菇粗提物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述灰树花提取物的培养基中所述灰树花提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述毛木耳提取物的培养基中所述毛木耳提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述红灵芝提取物的培养基中所述红灵芝提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL。

上述a3)中，所述b31具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量是在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量的0.73倍；所述b32具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量分别是在所述含所述灰树花提取物的培养基、在所述含所述毛木耳提取物的培养基和在所述含所述红灵芝提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量的0.80倍、0.95倍和0.90倍；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中所述榆黄菇粗提物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述灰树花提取物的培养基中所述灰树花提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述毛木耳提取物的培养基中所述毛木耳提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述红灵芝提取物的培养基中所述红灵芝提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL。

上述a4)中，所述b41具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量是在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量的0.49倍；所述b42具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量分别是在所述含所述灰树花提取物的培养基、在所述含所述毛木耳提取物的培养基和在所述含所述红灵芝提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量的0.92倍、0.70倍和0.80倍；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中所述榆黄菇粗提物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述灰树花提取物的培养基中所述灰树花提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述毛木耳提取物的培养基中所述毛木耳提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述红灵芝提取物的培养基中所述红灵芝提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL。

上述a5)中，所述b51具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量是在所述不含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量的0.55倍；所述b52具体可为在所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量分别是在所述含所述灰树花提取物的培养基、在所述含所述毛木耳提取物的培养基和在所述含所述红灵芝提取物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量的0.92倍、0.76倍和0.84倍；所述含所述榆黄菇粗提物的培养基中所述榆黄菇粗提物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述灰树花提取物的培养基中所述灰树花提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述毛木耳提取物的培养基中所述毛木耳提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL；所述含所述红灵芝提取物的培养基中所述红灵芝提取物的含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL。

上文中，所述受损肝细胞可为哺乳动物受损肝细胞，如人受损肝细胞。

实验证明，名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物、名称为PSI的榆黄菇提取物和名称为PSII的榆黄菇提取物均可显著提高受损肝细胞的存活率、降低胞内甘油三酯含量、提高细胞内SOD酶活性、降低胞外谷丙转氨酶含量和降低谷草转氨酶含量：与未用药组相比，受损肝细胞的细胞存活率提高率分别为203.68％、345.69％、96.15％，胞内甘油三酯含量分别降低26.99％、27.31％、38.59％，细胞内SOD酶活性分别提高78.02％、66.35％、48.85％，胞外谷丙转氨酶含量分别降低51.23％、52.49％、38.50％，胞外谷草转氨酶含量分别降低44.83％、59.10％、37.57％。

附图说明

图1为DEAE-Cellulose柱层析洗脱曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的榆黄菇为榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus)(又称榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus Singer)已于2013年4月9日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，China ForestryCulture Collection Center，英文缩写CFCC，简称林业微生物中心)，保藏号为CFCC89573，自该收藏日起公众可从CFCC获得该菌株。

下述实施例中的毛木耳为毛木耳(Auricularia polytricha(Mont.)Sacc.)3号(赵爽等.毛木耳菌丝体产多糖发酵条件的优化.食品科技.2012年第37卷第4期)公众可从北京市农林科学院获得该菌种，以重复本申请实验。

下述实施例中的灰树花为灰树花(Grifola frondosa)l号(又称灰树花-1(Grifola frondosa(Dicks.)Gray)已于2013年4月9日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，China Forestry CultureCollection Center，英文缩写CFCC，简称林业微生物中心)，保藏号为CFCC 89544，自该收藏日起公众可从CFCC获得该菌株。

下述实施例中的红灵芝为红灵芝(Ganoderma sp.)已于2013年4月9日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，China Forestry Culture Collection Center，英文缩写CFCC，简称林业微生物中心)，保藏号为CFCC 89543，自该收藏日起公众可从CFCC获得该菌株。

下述实施例中的L-O2细胞株(人肝细胞)为中国医学科学院肿瘤细胞库的产品。

下述实施例中的RPMI1640培养液为Invitrogen公司产品，产品目录号为11875-093。

实施例1、保护受损肝细胞

1、名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物、毛木耳提取物、灰树花提取物和红灵芝提取物的制备

1.1、名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物的制备

将冷冻干燥的榆黄菇子实体放入高速万能破碎机。反复破碎4次，每次20秒，制成100目的均一榆黄菇子实体粉。向榆黄菇子实体粉中加入是榆黄菇子实体粉干重的40倍质量的去离子水，得到榆黄菇子实体混合液。将该榆黄菇子实体混合液在4℃的冰箱放置8小时后进行水浴。水浴前摇匀，封口，用水浴摇床对榆黄菇子实体混合液进行90℃、4h的高温水浴。水浴后，对榆黄菇子实体混合液进行6000g离心30min收集上清液(水溶性物质)，该上清液即为榆黄菇子实体水提液。用Seveage法去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白质得到去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，具体方法如下：将是榆黄菇子实体水提液1/3体积的Sevag试剂(由三氯甲烷和正丁醇按照4:1的体积比混合而成)加入榆黄菇子实体水提液中，涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，去除游离蛋白产生的凝胶状沉淀。向上清液中加入是上清液体积1/3的Sevag试剂涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，如此重复多次直至获得无蛋白质层出现的上清液，该上清液即为去除蛋白的榆黄菇子实体水提液。向该去除蛋白的榆黄菇子实体水提液中加入是该去除蛋白的榆黄菇子实体水提液4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后盖上锡箔纸，静置12小时待固液分离，6000g离心20分钟收集沉淀，将沉淀放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状,该粉末即为名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物。用硫酸-苯酚法测定该榆黄菇粗提物的多糖含量，结果表明该榆黄菇粗提物的多糖含量为57.82％。

1.2毛木耳提取物的制备

与1.1的区别仅在于将干燥的榆黄菇子实体替换为干燥的毛木耳子实体，其它操作均与1.1相同，得到毛木耳提取物。用硫酸-苯酚法测定该毛木耳提取物的多糖含量，结果表明该毛木耳提取物的多糖含量为39.97％。

1.3灰树花提取物的制备

与1.1的区别仅在于将干燥的榆黄菇子实体替换为干燥的灰树花子实体，其它操作均与1.1相同，得到灰树花提取物。用硫酸-苯酚法测定该灰树花提取物的多糖含量，结果表明该灰树花提取物的多糖含量为92.81％。

1.4红灵芝提取物的制备

与1.1的区别仅在于将干燥的榆黄菇子实体替换为干燥的红灵芝子实体，其它操作均与1.1相同，得到红灵芝提取物。用硫酸-苯酚法测定该红灵芝提取物的多糖含量，结果表明该红灵芝提取物的多糖含量为42.36％。

2人受损肝细胞模型的建立

2.1细胞培养：在RPMI1640培养液中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清(FBS)，使得青霉素和链霉素混合液在培养液中的最终体积百分含量为1％，FBS在培养液中的最终体积百分比含量为10％，即配制成含10％FBS的RPMI1640培养液。将对数生长期的L-O2细胞采用0.25％的胰蛋白酶进行消化并用含10％FBS的RPMI1640培养液收集重悬细胞，接种于96孔培养板中(每孔100μL，细胞密度为8×10³个/孔)，置于温度为37℃，相对湿度为95％，CO₂浓度为5％的培养箱中培养24h。

2.2建模诱导因子配置：向含10％FBS的RPMI1640培养液中加入无水乙醇和脂肪酸(该脂肪酸由油酸和棕榈酸组成)，配置成乙醇体积百分含量为1.8％、油酸含量为0.33mmol/L和棕榈酸的含量为0.17mmol/L培养液，将其称为含诱导因子培养液。

2.3诱导因子孵育：细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，加入200μL的2.2中的含诱导因子培养液，置于温度为37℃，相对湿度为95％，CO₂浓度为5％的培养箱中继续培养48h后，作为实验组，实验组中的细胞为人受损肝细胞模型。

细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，加入200μL含10％FBS的RPMI1640培养液(乙醇的体积百分含量为0，油酸含量为0.0mmol/L和棕榈酸的含量为0.0mmol/L)，置于温度为37℃，相对湿度为95％，CO₂浓度为5％的培养箱中继续培养48h后，作为对照组。实验设置三个复孔。

2.4MTT检测：诱导因子孵育结束后，将含有药物的培养液吸除，每孔加入200μLMTT稀释液(MTT浓度为0.5mg/mL)，置于37℃,相对湿度为95％，CO₂浓度为5％的培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸除每孔中的液体，每孔加入200μL DMSO溶液，混合均匀，在荧光全波长酶标仪测定每孔的OD₅₆₂值。

细胞存活率公式：细胞存活率(％)＝实验组的OD₅₆₂值/对照组的OD₅₆₂值×100％。

将对照组的细胞存活率设定为100％。实验结果表明，实验组的细胞存活率为67.47％，显微镜下观察发现细胞大量浮起。

3药物保护受损肝细胞特征性指标检测

3.1对受损肝细胞存活率的影响

实验设置对照组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、榆黄菇粗提物组(用含榆黄菇粗提物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用含灰树花提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用含毛木耳提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用含红灵芝提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，利用MTT法检测细胞的存活率，设定对照组的细胞活性为100％。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

其中，含榆黄菇粗提物的培养液是向2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液中加入1.1的榆黄菇粗提物得到的榆黄菇粗提物含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL的液体；含灰树花提取物的培养液是向2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液中加入1.3的灰树花提取物得到的灰树花提取物含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL的液体；含毛木耳提取物的培养液是向2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液中加入1.2的毛木耳提取物得到的毛木耳提取物含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL的液体；含红灵芝提取物的培养液是向2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液中加入1.4的红灵芝提取物得到的红灵芝提取物含量以其所含的多糖含量计为100μg/mL的液体。

结果如表1所示，榆黄菇粗提物、灰树花提取物、毛木耳提取物和红灵芝提取物均可以增加人受损肝细胞的存活率，在设定对照组细胞存活率为100％的条件下，与模型组相比较，细胞存活率提高率分别为203.68％、23.33％、8.89％和32.71％，榆黄菇粗提物提高人受损肝细胞的存活效果最好：榆黄菇粗提物组的细胞存活率比灰树花提取物组的细胞存活率提高146.23％，榆黄菇粗提物组的细胞存活率比毛木耳提取物组的细胞存活率提高178.88％，榆黄菇粗提物组的细胞存活率比红灵芝提取物组的细胞存活率提高128.83％。

表1、各处理组的细胞存活率

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

3.2对细胞内甘油三酯(TG)含量的影响

实验设置对照组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、榆黄菇粗提物组(用3.1中的含榆黄菇粗提物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用3.1中的含灰树花提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用3.1中的含毛木耳提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用3.1中的含红灵芝提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)说明书检测胞内TG含量，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表2所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著降低细胞内甘油三酯的含量，其中榆黄菇粗提物组效果最为明显，降低胞内甘油三酯的比率为26.99％(榆黄菇粗提物组的胞内甘油三酯含量是模型组的胞内甘油三酯含量的0.73倍)，高于毛木耳提取物组胞内甘油三酯降低率(18.73％)、灰树花提取物组胞内甘油三酯降低率(22.84％)和红灵芝提取物组胞内甘油三酯降低率(8.99％)。榆黄菇粗提物组的胞内甘油三酯含量是红灵芝提取物组的胞内甘油三酯含量的0.80倍，榆黄菇粗提物组的胞内甘油三酯含量是灰树花提取物组的胞内甘油三酯含量的0.95倍，榆黄菇粗提物组的胞内甘油三酯含量是毛木耳提取物组的胞内甘油三酯含量的0.90倍。

表2、各处理组的细胞内的甘油三酯含量

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

3.3对细胞内SOD酶活性的影响

实验设置对照组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、榆黄菇提取物组(用3.1中的含榆黄菇粗提物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用3.1中的含灰树花提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用3.1中的含毛木耳提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用3.1中的含红灵芝提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照总超氧化物歧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测胞内SOD活性，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表3所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以提高细胞内SOD酶活性，其中，榆黄菇粗提物组效果最为明显，细胞内SOD酶活性的提高比率为78.02％，高于毛木耳提取物组细胞内SOD酶活性的提高比率(15.60％)、灰树花提取物组细胞内SOD酶活性的提高比率(47.76％)和红灵芝提取物组细胞内SOD酶活性的提高比率(67.84％)。榆黄菇粗提物组的细胞内SOD酶活性分别是模型组、红灵芝提取物组、灰树花提取物组和毛木耳提取物组的细胞内SOD酶活性的1.78倍、1.06倍、1.20倍和1.54倍。

表3、各处理组的细胞内SOD酶活性

处理组	细胞内SOD酶活性(U/mg蛋白质)
		对照组	12.67±0.54*
模型组	7.37±1.09
		榆黄菇粗提物组	13.12±1.08*
红灵芝提取物组	12.37±2.69*
		灰树花提取物组	10.89±0.32*
毛木耳提取物组	8.52±0.23

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

3.4对胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量的影响

实验设置对照组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、榆黄菇提取物组(用3.1中的含榆黄菇粗提物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用3.1中的含灰树花提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用3.1中的含毛木耳提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用3.1中的含红灵芝提取物的培养液培养2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，收集细胞培养液，按照谷草转氨酶和谷丙转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所，产品目录号为C009-2和C010-2)说明书检测胞外转氨酶的含量，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表4所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著降低胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量，其中，榆黄菇粗提物组效果最为明显，胞外谷丙转氨酶含量的降低比率为51.23％，高于毛木耳提取物组胞外谷丙转氨酶含量的降低比率(31.12％)、灰树花提取物组胞外谷丙转氨酶含量的降低比率(47.06％)和红灵芝提取物组胞外谷丙转氨酶含量的降低比率(39.30％)；榆黄菇粗提物组的胞外谷草转氨酶含量的降低比率为44.93％，高于毛木耳提取物组胞外谷草转氨酶含量的降低比率(27.47％)、灰树花提取物组胞外谷草转氨酶含量的降低比率(40.40％)和红灵芝提取物组胞外谷草转氨酶含量的降低比率(34.28％)。榆黄菇粗提物组的胞外谷丙转氨酶含量分别是模型组、红灵芝提取物组、灰树花提取物组和毛木耳提取物组的胞外谷丙转氨酶含量的0.49倍、0.80倍、0.92倍和0.70倍。榆黄菇粗提物组的胞外谷草转氨酶含量分别是模型组、红灵芝提取物组、灰树花提取物组和毛木耳提取物组的胞外谷草转氨酶含量的0.55倍、0.84倍、0.92倍和0.76倍。

表4、各处理组的胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量

处理组	胞外ALT含量(U/g蛋白质)	胞外AST含量(U/g蛋白质)
			对照组	12.98±1.58*	4.85±0.22*
模型组	33.87±1.07	21.88±0.14
			榆黄菇粗提物组	16.52±1.09*	12.05±0.56*
红灵芝提取物组	20.56±1.21*	14.38±0.7*
			灰树花提取物组	17.93±1.36*	13.04±1.45*
毛木耳提取物组	23.33±0.26*	15.87±0.28*

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

实施例2、保护受损肝细胞

1、榆黄菇提取物PSI和PSII的制备

1.1 PSI的制备

对实施例1制备的榆黄菇粗提物进行如下DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析，得到名称为PSI的榆黄菇提取物：

将实施例1制备的榆黄菇粗提物用蒸馏水溶解，并在pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)中透析12-16小时，经DEAE-Cellulose(Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为100ml。进行一步洗脱，流速2.5ml/min。洗脱用pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)洗脱2个柱体积，收集得到的洗脱峰(图1)，将该洗脱峰在蒸馏水中透析10-12小时后，加入4倍体积无水乙醇静置12小时后，离心收集沉淀，将该沉淀放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状，该粉末即为名称为PSI的榆黄菇提取物。用硫酸-苯酚法测定PSI的多糖含量，结果表明PSI的多糖含量为83.21％。

1.2 PSII的制备

对实施例1制备的榆黄菇粗提物进行如下DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析，得到名称为PSII的榆黄菇提取物：

将实施例1制备的榆黄菇粗提物用蒸馏水溶解，并在pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)中透析12-16小时，经DEAE-Cellulose(Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为100ml。进行两步洗脱，流速2.5ml/min。第一步洗脱用pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)洗脱2个柱体积，第二步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱4个柱体积：溶质是0.2MNaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)，收集第二步洗脱得到的洗脱峰(图1)，将该洗脱峰在蒸馏水中透析10-12小时后，加入4倍体积无水乙醇静置12小时后，离心收集沉淀，将该沉淀放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状，该粉末即为名称为PSII的榆黄菇提取物。用硫酸-苯酚法测定PSII的多糖含量，结果表明PSII的多糖含量为67.58％。

另外，发明人还对实施例1制备的榆黄菇粗提物进行如下DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析：将实施例1制备的榆黄菇粗提物用蒸馏水溶解，并在pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)中透析12-16小时，经DEAE-Cellulose(Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为100ml。进行三步洗脱，流速2.5ml/min。第一步洗脱用pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mMNa₂HPO₄，溶剂为水)洗脱2个柱体积，第二步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱4个柱体积：溶质是0.2M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)，第三步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱4个柱体积：溶质是1M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH₂PO₄和6.1mM Na₂HPO₄，溶剂为水)，第三步洗脱出现了多糖含量很低的洗脱峰(图1)。

2药物保护受损肝细胞特征性指标检测

2.1对受损肝细胞存活率的影响

实验设置对照组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、30μg/mL PSI组(用含30μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、40μg/mL PSI组(用含40μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、50μg/mL PSI组(用含50μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、60μg/mL PSI组(用含60μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、70μg/mL PSI组(用含70μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、80μg/mLPSI组(用含80μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)；30μg/mL PSII组(用含30μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、40μg/mL PSII组(用含40μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、50μg/mL PSII组(用含50μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、60μg/mL PSII组(用含60μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、70μg/mL PSII组(用含70μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、80μg/mL PSII组(用含80μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，利用MTT法检测细胞的存活率，设定对照组的细胞活性为100％。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

其中，含30μg/mL PSI的培养液、含40μg/mL PSI的培养液、含50μg/mL PSI的培养液、含60μg/mL PSI的培养液、含70μg/mL PSI的培养液和含80μg/mL PSI的培养液分别是向实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液中加入1.1的PSI，得到的PSI含量以其所含的多糖含量计为30μg/mL的液体、PSI含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL的液体、PSI含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL的液体、PSI含量以其所含的多糖含量计为60μg/mL的液体、PSI含量以其所含的多糖含量计为70μg/mL的液体、PSI含量以其所含的多糖含量计为80μg/mL的液体。含30μg/mL PSII的培养液、含40μg/mL PSII的培养液、含50μg/mL PSII的培养液、含60μg/mL PSII的培养液、含70μg/mL PSII的培养液和含80μg/mL PSII的培养液分别是向实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液中加入1.2的PSII，得到的PSII含量以其所含的多糖含量计为30μg/mL的液体、PSII含量以其所含的多糖含量计为40μg/mL的液体、PSII含量以其所含的多糖含量计为50μg/mL的液体、PSII含量以其所含的多糖含量计为60μg/mL的液体、PSII含量以其所含的多糖含量计为70μg/mL的液体、PSII含量以其所含的多糖含量计为80μg/mL的液体。

结果如表5所示，PSI含量和PSII含量以其所含的多糖含量计为30-80μg/mL之间的多作用浓度处理人受损肝细胞，经过MTT检测细胞存活率发现已检测各作用浓度的PSI和PSII可以显著提高人受损肝细胞的存活率，PSI的修复效果明显高于PSII的作用。与模型组相比较，PSI组可提高细胞存活率平均高于200％，细胞存活率显著高于正常对照组；经过PSII的作用可平均提高细胞存活率为72.67％，细胞存活率略高于正常对照组。PSI的最佳作用浓度以其所含的多糖含量计为40μg/mL，40μg/mL PSI组的人受损肝细胞的存活率是模型组的人受损肝细胞的存活率的4.46倍；PSII最佳作用浓度以其所含的多糖含量计为50μg/mL，50μg/mL PSII组的人受损肝细胞的存活率是模型组的人受损肝细胞的存活率的1.96倍。

表5、各处理组的细胞存活率

处理组	细胞存活率(％)
		对照组	100±2.75*
模型组	67.47±1.47
		30μg/mL PSI组	217.08±5.81*
40μg/mL PSI组	300.71±5.25*
		50μg/mL PSI组	254.85±8.83*
60μg/mL PSI组	250.68±5.86*
		70μg/mL PSI组	256.05±5*
80μg/mL PSI组	204.9±5.23*
		30μg/mL PSII组	108.25±1.93*
40μg/mL PSII组	127.24±8.53*
		50μg/mL PSII组	132.34±2.53*
60μg/mL PSII组	117.19±5.03*
		70μg/mL PSII组	112.99±5.98*
80μg/mL PSII组	113.76±7.99*

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

2.2对细胞内甘油三酯(TG)含量的影响

实验设置对照组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、40μg/mL PSI组(用2.1的含40μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、50μg/mL PSII组(用2.1的含50μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)说明书检测胞内TG含量，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表6所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著降低细胞内甘油三酯的含量，与模型组比较均达到显著性差异的程度(P<0.05)，均具有消脂的作用，能够减少脂肪在细胞内的堆积。与模型组相比较，40μg/mL PSI组可降低细胞内TG含量的27.31％，50μg/mL PSII组降低38.59％。40μg/mL PSI组的人受损肝细胞的细胞内甘油三酯的含量是模型组的人受损肝细胞的细胞内甘油三酯的含量的0.73倍；50μg/mL PSII组的人受损肝细胞的细胞内甘油三酯的含量是模型组的人受损肝细胞的细胞内甘油三酯的含量的0.61倍。

表6、各处理组的细胞内的甘油三酯含量

处理组	甘油三酯含量(μmol/mg蛋白质)
		对照组	408.93±4.55*
模型组	817.22±11.89
		40μg/mL PSI组	594.08±17.23*
50μg/mL PSII组	501.88±10.16*

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

2.3对细胞内SOD酶活性的影响

实验设置对照组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、40μg/mL PSI组(用2.1的含40μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、50μg/mL PSII组(用2.1的含50μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照总超氧化物歧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测胞内SOD活性，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表7所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著提高细胞内SOD酶活性，减小细胞因氧化而发生的损伤，其中，PSI组的细胞内SOD酶活性的提高比率为66.35％，PSII组的细胞内SOD酶活性的提高比率为48.85％。

2.4对胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量的影响

实验设置对照组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI1640培养液培养L-O2细胞)、模型组(用实施例1的2.1的含10％FBS的RPMI 1640培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、40μg/mL PSI组(用2.1的含40μg/mL PSI的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)、50μg/mL PSII组(用2.1的含50μg/mL PSII的培养液培养实施例1的2.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，收集细胞培养液，按照谷草转氨酶和谷丙转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所，产品目录号为C009-2和C010-2)说明书检测胞外转氨酶的含量，同时采用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。

结果如表7所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著降低胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量，都具有保护细胞完整性的作用，减少胞内酶的释放，具有护肝的作用。其中，PSI组的胞外谷丙转氨酶含量的降低比率为52.49％，PSII组的胞外谷丙转氨酶含量的降低比率为38.50％。PSI组的胞外谷草转氨酶含量的降低比率为59.10％，PSII组的胞外谷草转氨酶含量的降低比率为37.57％。PSI组的胞外谷丙转氨酶含量是模型组的胞外谷丙转氨酶含量的0.47倍，PSII组的胞外谷丙转氨酶含量是模型组的胞外谷丙转氨酶含量的0.61倍；PSI组的胞外谷草转氨酶含量是模型组的胞外谷草转氨酶含量的0.41倍，PSII组的胞外谷草转氨酶含量是模型组的胞外谷草转氨酶含量的0.62倍。

表7、各处理组的细胞内SOD酶活性、胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量

注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(P＜0.05)。

通过细胞存活率、细胞内甘油三酯含量、胞内SOD酶活性以及胞外转氨酶的检测结果显示PSI和PSII都具有护肝的功能，从功效上比较，PSI的护肝效果优于PSII。

Claims (10)

1.保护受损肝细胞的产品，其特征在于：所述产品的活性成分为PSI或PSII；

所述PSI由包括下述步骤的方法制备：M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；M2)对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSI的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为一步洗脱，所述一步洗脱用pH为6.8-7.5的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM NaH₂PO₄和5.5-6.5mM Na₂HPO₄，溶剂为水；

所述PSII由包括下述步骤的方法制备：M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；M2')对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSII的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为二步洗脱，第一步洗脱用pH为6.8-7.5的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM NaH₂PO₄和5.5-6.5mM Na₂HPO₄，溶剂为水；第二步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于：所述保护受损肝细胞为下述1)-5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

1)提高受损肝细胞的存活率；

2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

3.权利要求1中所述PSI在制备保护受损肝细胞产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述保护受损肝细胞为下述1)-5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

1)提高受损肝细胞的存活率；

2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

5.名称为PSI的榆黄菇提取物的制备方法，包括：

M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；

M2)对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSI的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为一步洗脱，所述一步洗脱用pH为6.8-7.5的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM NaH₂PO₄和5.5-6.5mM Na₂HPO₄，溶剂为水。

6.权利要求1中所述PSII在制备保护受损肝细胞产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述保护受损肝细胞为下述1)-5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

1)提高受损肝细胞的存活率；

2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。

8.名称为PSII的榆黄菇提取物的制备方法，包括：

M1)制备名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物，所述榆黄菇粗提物的制备方法包括用乙醇沉淀去除蛋白的榆黄菇子实体水提液，收集沉淀，得到名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物；所述去除蛋白的榆黄菇子实体水提液是去除榆黄菇子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述榆黄菇子实体水提液是用水从榆黄菇子实体中提取出来的水溶性物质；

M2’)对所述榆黄菇粗提物进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，得到名称为PSII的榆黄菇提取物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为二步洗脱，第一步洗脱用pH为6.8-7.5的磷酸缓冲溶液A进行洗脱，所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM NaH₂PO₄和5.5-6.5mM Na₂HPO₄，溶剂为水；第二步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A。

9.权利要求1中所述名称为榆黄菇粗提物的榆黄菇提取物在制备保护受损肝细胞产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述保护受损肝细胞为下述a1)-a5)中的5种、4种、3种、2种或1种：

a1)提高受损肝细胞的存活率；

a2)提高受损肝细胞的SOD酶活性；

a3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；

a4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；

a5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。