CN107536846A - 一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，属于模型构建技术领域。该方法是将肌苷腹腔注射至树鼩，注射量为300mg/kg～400mg/kg，即获得急性高尿酸血症树鼩模型，本发明首次利用肌苷对医学生物研究中与人类遗传关系更接近的实验动物——树鼩建立了急性高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的疾病表征，数量指标具有统计学意义，是一种简单易行、可靠实用的技术，并且本发明提供了一种模拟人类尿酸代谢途径相似途径获得的高尿酸动物模型，对于开展相关疾病的研究意义重大。

Description

一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法

技术领域

本发明属于模型构建技术领域，具体涉及一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法。

背景技术

尿酸是人体嘌呤代谢的终产物，主要有肝脏代谢产生，肾脏排泄出体外。高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是血液中由于肝脏代谢产生尿酸过多或肾脏排泄尿酸减少，或者两者兼有的原因产生血液中尿酸水平增高，甚至高于血尿酸产生结晶的饱和浓度（>7.0mg/dl，相当于416.5μmol/L）的病理状态。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯的改变，高尿酸血症的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，这使人们对高尿酸血症产生了更多关注，并重新审视一些疾病的危险因素和防治策略，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。动物模型是研究疾病发病机理，寻找新型治疗药物的重要工具。

随着人们对高尿酸血症发病机制认识的日益加深，新的治疗靶点不断被发现，新型治疗药物也相继问世。寻找更加合理、科学的药效学评价动物模型迫在眉睫。

肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等，是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物，为人体的正常成分，是腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。在嘌呤的从头合成中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，Inosine是体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸等生命分子基本组成，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，并继而转换为其他多种核苷酸，同时肌苷也是尿酸合成的底物，肌苷位于尿酸代谢途径较前位置上。

目前高尿酸血症动物模型主要使用大、小鼠，但该类动物属于啮齿类动物，其分类地位较低，其解剖和生理也与人类相差甚远，其动物模型得到的数据参考性有限，迫切需要建立和开发模拟人体尿酸代谢异常相似途径的动物模型，深入开展高尿酸血症及其相关疾病的研究。中国专利CN 103977007 B使用氧嗪酸钾构建急性高尿酸血症树鼩模型，氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂，其成模型的原理是通过抑制体内尿酸酶活性而造成体内血清尿酸值升高，因为人类等高等灵长类在长期的进化过程中尿酸氧化酶等相关基因发生了突变，尿酸酶失去活性，其高尿酸血症形成机理主要是嘌呤代谢紊乱所致的肝脏代谢产生尿酸过多或肾脏排泄尿酸减少引起，因此该模型形成的机理与人类高尿酸血症形成的机理有所不同。

树鼩（Tupaia belangeri，tree shrews）在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目（Scandentia），介于灵长目与食虫目之间。树鼩具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物，已经被广泛地应用于医学与生物学的研究中。利用与人类遗传关系更接近的实验动物模拟人类尿酸代谢发病机制而建立的高尿酸血症动物模型更能反映人类尿酸代谢的本质。

此外，由于人体尿酸代谢的复杂性与实验动物种族差异性，不同的给药途径、给药剂量及动物来源对高尿酸血症影响较大；如果剂量过大，则死亡率增高；如果剂量不足，则成模率较低。所以摸索出合适的剂量选择区间，使用标准化试剂，通过药物量效关系实验摸索最佳造模剂量尤为重要。目前尚缺乏稳定的模拟人类尿酸代谢途径的高尿酸动物模型，因此如何克服现有技术的不足是目前模型构建技术领域亟需解决的问题。

发明内容

鉴于目前对模拟人类尿酸代谢途径相似途径获得的高尿酸动物模型开发的需求，本发明利用医学生物研究中与人类遗传关系更接近的实验动物-树鼩，提供一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，将肌苷腹腔注射至树鼩，注射量为300～400mg/kg，即获得急性高尿酸血症树鼩模型。

进一步，优选的是，所述的树鼩为中缅树鼩。

进一步，优选的是，所述的树鼩的年龄为1-3岁。

进一步，优选的是，所述的肌苷采用生理盐水进行溶解，按照给药容积/树鼩体重为0.1~0.2ml/10g配制。

进一步，优选的是，所述的树鼩的饲养环境温度20℃-25℃，湿度40%-70%，自由饮水和采食。

进一步，优选的是，所述的树鼩体重为110-150g。

本发明采用腹腔注射给树鼩一定剂量的尿酸合成底物-肌苷，导致次黄嘌呤在体内的蓄积，最终造成树鼩体内尿酸含量增加，造成高尿酸血症，其构建方法较为简单，无需联用其他药物，此种模型的形成比较接近人类高尿酸血症形成的机理，可为高尿酸血症的研究提供较为理想的动物模型。

本发明通过肌苷致树鼩急性高尿酸血症有效性及量效关系实验来确定肌苷的最佳造模剂量为300mg/kg～400mg/kg，在给药0.5-1小时血清尿酸值就可高于血液尿酸产生结晶的饱和浓度416.5μmol/l，可获得稳定、可重复的与人类尿酸代谢途径相似途径的急性高尿酸血症树鼩模型。

本发明申请与申请人的授权发明“CN 103977007 B急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法”有以下实质的区别：

1.造模的药物不同，前者是氧嗪酸钾，本发明使用肌苷(Inosine)；

2.造模的原理不一样：前者是氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂，其成模型的原理是通过抑制体内尿酸酶活性而造成体内血清尿酸值升高，本发明使用肌苷(Inosine)；本发明采用腹腔注射给树鼩一定剂量的尿酸合成底物-肌苷，导致次黄嘌呤在体内的蓄积，最终造成树鼩体内尿酸含量增加，造成高尿酸血症，此种模型的形成比较接近人类高尿酸血症形成的机理。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

（1）本发明首次利用肌苷对医学生物研究人类遗传关系更接近的实验动物——树鼩建立了急性高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的疾病表征，数量指标具有统计学意义，同时对树鼩初步毒性及安全性研究证实该造模剂量区间较为安全，没有观察到动物有任何异常反应，大体解剖结果也未观察肝肾及相关脏器异常。是一种简单易行、可靠实用的技术，并且本发明提供了一种模拟人类尿酸代谢途径相似途径获得的高尿酸动物模型，对于开展相关疾病的研究意义重大。

（2）本发明树鼩高尿酸血症的建立方法安全可靠，操作简单，有效、灵敏，简便、重复性好。300mg/kg～400mg/kg剂量就可有效升高树鼩血清尿酸值，具有良好的应用前景；其次，通过建立树鼩高尿酸血症，可用于筛选和研制抗痛风药物，对评价相关抗高尿酸药物对该病的药效及作用机理具有十分重要意义。

（3）由于该模型的建立是模拟人类尿酸代谢相似途径获得的模型，其应用不仅可以验证目前治疗高尿酸血症常用药——XO抑制剂药效以及促尿酸排泄药物的药效，还可以验证PNP抑制剂药效，其应用范围及意义较大，应用价值较大。目前未见利用肌苷致树鼩急性高尿酸血症模型报道。

本申请得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程重大协同创新项目（2016-I2M-2-006）的资助。

附图说明

图1为肌苷致树鼩急性高尿酸血症的有效性实验及量效依赖实验；

图2为别嘌醇对高尿酸血症树鼩血尿酸的影响实验；

图3为别嘌醇对肌苷所致的树鼩肝脏、肾脏、小肠组织中尿酸代谢相关基因XDH/XO、GLUT9、URAT1 mRNA表达水平的影响图；其中A为树鼩肝脏、肾脏、小肠组织中GLUT9 mRNA表达水平；B为树鼩肝脏、肾脏、小肠组织中URAT1 mRNA表达水平；C为树鼩肝脏、肾脏、小肠组织中XDH/XO mRNA表达水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实验动物

中缅树鼩，滇西亚种树鼩，雌雄各半，80只，体重均在110g~150g范围内，年龄1-3岁，成年健康，由中国医学科学院医学生物学研究所提供，常规性饲养。饲养环境温度20℃～25℃，湿度40%～70%，自由饮水和采食。常规统一蒸糕饲料饲喂。实验动物使用许可证号：SYXK（滇）K2014-0007。

造模药物：

肌苷，Inosine，Sigma公司，批号：Lot # SLBP5740V，给药途径：腹腔注射。

相关药品及试剂

别嘌醇，南京都莱生物有限公司，纯度≥98%，CAS:315_30_0；

尿酸（UA）测定试剂盒，批号：20170402，南京建成生物工程研究所产品

逆转录试剂盒（Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 04 897 030 001），Roche公司产品；

qPCR试剂（Premix Taq™ Code No. RR003A），TaKaRa生物有限公司产品；

RNA助溶剂（Tripure Isolation Reagent），Roche公司产品；

核酸染料（Gelred），美国bio-rad公司产品；

4.实验仪器

美国Bio-tck连续波长多功能酶标仪MQX200R，美国制造；

Sigma高速冷冻离心机；

Sartoyius公司精密电子天平ME235S；

CFX 96TM real-time system荧光定量PCR仪，美国bio-rad公司；

ND-1000紫外分光光度计，美国DanoDrop公司；

HITACHI CT15RE冷冻离心机，宝日医学生物技术（北京）有限公司。

试剂配制

配制原则：根据药物的脂溶性或水溶性大小选择合适的溶剂进行溶解，且在浓度设置方面根据动物腹腔注射液体体积控制在0.1~0.2ml/10g体重为准。肌苷极易溶于水，因此在配制过程中用生理盐水进行溶解。

肌苷的配制：根据不同的浓度称取适量的肌苷于250ml锥形瓶中加入生理盐水，沸水浴中使溶液溶成透明状即可，溶液现配现用。

别嘌醇的配制：配制方法同肌苷。

实施例1：肌苷致树鼩急性高尿酸血症的有效性实验及量效依赖实验

选取中缅树鼩30只，雌雄各半，体重133.45±9.43g，1～3岁，随机分为5组，每组6只，分别腹腔注射肌苷200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg，腹腔注射生理盐水作为对照。分别于给药后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h尾静脉采血0.5ml于1.5ml EP管中，置于4℃冰箱放置1h，4℃、13000r离心15min，分离获得血清，磷钨酸法测定血清尿酸值，按照尿酸（UA）测定试剂盒说明书所描述的方法检测血清尿酸值。

结果显示：树鼩腹腔注射肌苷剂量300mg/kg和400mg/kg在给药后0.5h、1小时能使树鼩血清尿酸值升高，大于尿酸在血中的结晶浓度（416.5 μmol/L），2小时后血清尿酸值回落，300mg/kg和400mg/kg用药组与对照组在0.5h、1小时相比均有统计学差异（**P﹤0.01）；200mg/kg、250mg/kg剂量组与对照组对比尿酸值在升高不明显，与对照组在0.5h、1小时相比均没有统计学差异。综上所述，致使树鼩高尿酸血症肌苷的最佳剂量为300mg/kg～400mg/kg，该剂量组可形成稳定的急性高尿酸血症。结果见表1和图1。

表1肌苷致树鼩急性高尿酸血症的有效性实验及量效依赖实验

注：浓度单位：μmol/L，±S，n=6，与相应时间点的对照组比较**p<0.01

实施例2：急性高尿酸血症树鼩模型在降尿酸药物筛选中的应用-别嘌醇对高尿酸血症树鼩血尿酸的影响实验

别嘌醇为黄嘌呤氧化酶的抑制剂，是目前常用的降尿酸药物。选取中缅树鼩18只，雌雄各半，体重126.71±5.14g，随机分为3组，每组6只：300mg/kg肌苷组、300mg/kg肌苷+30mg/kg别嘌醇组、等体积生理盐水对照组，腹腔注射给药，于药后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h采静脉血，按上述方法检测血清尿酸值。

实验结果显示别嘌醇能有效降低高尿酸血症树鼩的血尿酸水平，树鼩单独注射剂量300mg/kg肌苷组与对照组比较，尿酸值有明显升高，差异有统计学意义，P<0.01；300mg/kg肌苷+30mg/kg别嘌醇组与单独肌苷组对比差异有统计学意义，P<0.01，结果见表2和图2。

表2 别嘌醇对高尿酸血症树鼩血尿酸的影响实验

注：浓度单位：μmol/L，±S，n=6，与相应时间点的对照组比较**p<0.01,与相应时间点300mg/kg肌苷组比较^##p<0.01。

实施例3：肌苷对树鼩初步毒性及安全性研究：

本实施例分别对上述实施例1的树鼩有效性实验及量效依赖实验后的不同组别树鼩（实验分组见实施例1：选取的中缅树鼩30只，雌雄各半，体重133.45±9.43g，1～3岁，随机分为5组，每组6只，分别腹腔注射肌苷200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg，腹腔注射生理盐水作为对照。200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg不同剂量肌苷腹腔注射树鼩，设对照组，每组6只树鼩），连续观察15天，记录动物中毒及死亡情况，结果表明所有动物未出现任何不适反应，活动自如，进水进食，大小便均正常，一般情况良好。每组动物取2只在腹腔注射15天后脱颈处死，作大体解剖，肉眼观察肝肾及相关脏器，结果均未发现异常。

本发明结果显示：单独使用肌苷注射造模能造成科学、稳定的树鼩的急性高尿酸血症模型，肌苷致使树鼩急性高尿酸血症的最佳剂量及最低有效剂量为300mg/kg。别嘌醇能降低病理条件下的尿酸水平，使得尿酸值稍微低于正常水平，一段时间后又恢复到原来水平。本发明用肌苷注射造模能获得科学、稳定的急性高尿酸血症模型。

以上实验数据均用均数±标准差（Mean±SEM）表示。采用 Graphpad prism 6.0（San Diego，CA，USA）软件进行柱形图绘制，统计学进行单因素方差分析及组间比较，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

实施例4: 别嘌醇对肌苷所致的树鼩肝脏、肾脏、小肠组织中XDH/XO 基因，尿酸代谢转运体基因GLUT9、URAT1 mRNA表达水平的影响

黄嘌呤氧化酶XDH/XO是机体内一种非特异性需氧脱氢酶，在嘌呤代谢过程中催化最后两步，在尿酸的代谢过程中发挥着重要的作用。尿酸重吸收转运体URAT1主要存在于肾小管上皮细胞刷状缘膜上，是负责尿酸重吸收的主要转运蛋白。果糖转运蛋白GLUT9在体内对尿酸具有转运作用，负责将尿酸从细胞中分泌出来。以上蛋白是各类降尿酸药物的主要靶点，其mRNA表达水平的变化，直接影响体内尿酸代谢的变化，是研究抗高尿酸药物的药效、评估其药物作用机制的重要手段。

选取中缅树鼩6只，雌雄各半，体重126.71±5.14g，随机分为3组，每组2只：300mg/kg肌苷组、300mg/kg肌苷+30mg/kg别嘌醇组、等体积生理盐水作为对照组，腹腔注射给药，于药后1小时后处死动物，每只动物取肝、肾、小肠获得新鲜组织各约100mg，分别放入已加1ml tripure试剂进行RNA的提取，逆转录获得cDNA，以GAPDH作为内参基因，利用本实验室已建立的树鼩XDH/XO、GLUT9、URAT1基因的RT-qPCR方法进行肝脏、肾脏、小肠组织中以上基因mRNA表达水平变化的检测，本实施例由于所选动物每组2只，没有进行统计学处理，只作为研究抗高尿酸药物的药效、评估其药物作用机制的探索及初步应用。

结果显示：

黄嘌呤氧化酶XDH/XO mRNA表达在树鼩肝、肾、小肠组织中均可被检测到，肌苷在促进尿酸生成时，在肝脏组织中，相对于未给药对照组树鼩， XDH/XO mRNA表达不活跃，肌苷组及肌苷加别嘌醇组下调XDH/XO mRNA表达。而在小肠组织中，别嘌醇显著下调肌苷组所致的高尿酸动物的XDH/XO mRNA表达，在肾脏组织中，相对于未给药对照组树鼩，肌苷组及肌苷加别嘌醇组上调了XDH/XO mRNA表达。见图3A；

实验显示树鼩URAT1 mRNA在树鼩肾脏组织中显著表达，在肝脏及小肠组织中没有检测到其mRNA的表达。在肾脏组织中肌苷组及肌苷加别嘌醇组上调了URAT1 mRNA的表达，其中，别嘌醇组较高尿酸组URAT1 mRNA的表达上调较多，见图3B；

本实施例中GLUT9 mRNA表达在肝、肾、小肠组织中均具有表达，相对于未给药对照组树鼩在肾脏组织中及小肠组织中，其中肾脏 GLUT9 mRNA表达较为活跃，肌苷组及肌苷加别嘌醇组上调GLUT9 mRNA表达。见图3C；

上述结果证实所建立的肌苷导致的急性高尿酸血症树鼩模型，可应用于筛选机验证抗高尿酸药物的药效、评估其药物作用机制的应用。

实施例5

一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，将肌苷腹腔注射至树鼩，注射量为350mg/kg，即获得急性高尿酸血症树鼩模型。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，将肌苷腹腔注射至树鼩，注射量为300mg/kg～400mg/kg，即获得急性高尿酸血症树鼩模型。

2.根据权利要求1所述的急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，所述的树鼩为中缅树鼩。

3.根据权利要求1所述的急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，所述的树鼩的年龄为1-3岁。

4.根据权利要求1所述的急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，所述的肌苷采用生理盐水进行溶解，按照给药容积/树鼩体重为0.1~0.2ml/10g配制。

5.根据权利要求1所述的急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，所述的树鼩的饲养环境温度20℃-25℃，湿度40%-70%，自由饮水和采食。

6.根据权利要求1所述的急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法，其特征在于，所述的树鼩体重为110-150g。