CN107519481B - 一种壳聚糖纳米颗粒cs-il-17rc及其制备方法 - Google Patents

一种壳聚糖纳米颗粒cs-il-17rc及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其包括IL‑17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体，其中IL‑17RC蛋白由mIL‑17RC编码区胞外段去除信号肽部分的基因序列编码，IL‑17RC蛋白通过重组质粒pET28a‑IL‑17RC进行诱导表达蛋白制备；本发明还涉及一种壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：制备预定浓度的IL‑17RC蛋白；配制壳聚糖溶液；制备壳聚糖蛋白纳米颗粒(CS‑IL‑17RC)。本发明制备的壳聚糖纳米颗粒，选用有机纳米颗粒壳聚糖，包裹IL‑17RC蛋白，对组合的蛋白形成保护作用，且具有良好的粘膜粘附作用，通过鼻腔粘膜吸收，可达到良好的免疫效果。通过体外体内实验证实壳聚糖纳米颗粒能够与IL‑17特异性结合，抑制其功能，从而调控哮喘病理过程，减轻哮喘气道炎症反应，使临床症状得到缓解。

Description

一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC及其制备方法。
背景技术
支气管哮喘是全球最为关注的公共健康问题之一，被认为是仅次于癌症的全球第二大类致死和致残性疾病。目前，针对支气管哮喘主要采用吸入糖皮质激素(ICS)和变应原特异性免疫治疗(SIT)两大治疗策略。以ICS为主的哮喘控制方案，虽然可以较好控制哮喘，但并没有显著降低哮喘的发生率和死亡率，担心长时间吸入皮质激素的副作用，导致了我国哮喘患者ICS治疗依从性差。SIT虽是一种具有长期保护效应的对因治疗，但试剂标准化困难，仍有诱发严重过敏反应的可能，且治疗时间长、高费用，令许多患者望而却步。疫苗具有保护效应持久，给药方便，费用低廉等特点，因此，如能够在哮喘疫苗的研制上有所突破，可望对哮喘防治策略产生深远影响。
目前，细胞因子单克隆抗体已被用来治疗诸如关节炎、变应性脑炎等多种严重自身免疫性疾病，但费用昂贵、需大剂量多次注射的缺点限制了其临床应用。正如前所述，哮喘发病率逐年增高，严重影响人类健康，尤其哮喘急性发作消耗大量医疗资源，因此，研制一种有效的疫苗应用前景巨大，其必将产生较大的社会效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC，其利用壳聚糖包裹IL-17RC蛋白，获得纳米颗粒，其直径小、作用时间长、缓慢释放，生物利用度高，生产成本低，接种方便，依从性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其包括IL-17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体。
进一步地，所述IL-17RC蛋白由mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分(片段长度为1257bp)的基因序列编码，所述IL-17RC蛋白通过重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白制备。
进一步地，所述壳聚糖蛋白纳米颗粒的粒径为500-1000nm，包裹率为65％-85％。
本发明的第二个目的是提供一种上述壳聚糖蛋白纳米颗粒在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种上述壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备IL-17RC蛋白，其包括：
1)扩增IL-17RC基因序列，对扩增产物进行回收纯化并测序；
2)采用步骤1)中测序正确的IL-17RC构建重组质粒pET28a-IL-17RC；
3)采用步骤2)构建的重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白并对蛋白产物进行纯化、去内毒素，获得预定浓度的IL-17RC蛋白；
(2)壳聚糖溶液的配制：将壳聚糖溶于冰醋酸，加热溶解，获得壳聚糖溶液；
(3)壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备：取步骤(1)制备的已知浓度的IL-17RC蛋白与预定浓度的三聚磷酸钠溶液混合、定容，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)配制的壳聚糖溶液中，磁力搅拌一段时间后，获得壳聚糖蛋白纳米颗粒。
为了优化上述制备方法，本发明的技术措施进一步包括：
进一步地，所述IL-17RC基因序列为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分。
进一步地，用于扩增IL-17RC基因序列的引物包括如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列。
进一步地，所述SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列的引物均设置酶切位点。上述引物序列及其酶切位点如下所示：
上游引物P1(SEQ ID NO：1)：
5'-CTAGGATCCGAGAGACTGATGGAGCCT-3'；
下游引物P2(SEQ ID NO：2)：
5'-AGTAAGCTTGCGCCTGTGGATGTACTTGT-3'；
其中，划线部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
进一步地，所述重组质粒pET28a-IL-17RC的构建步骤包括：分别双酶切pET28a(+)质粒和测序正确的IL-17RC，酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，并进行酶切鉴定及测序。
进一步地，所述诱导表达蛋白包括重组质粒pET28a-IL-17RC转化感受态细胞的步骤；其中，所述感受态细胞为E.coli BL21(DE3)，或者采用其他任一合适的感受态细胞。
进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.2～0.4wt％，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～0.9wt％；更进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.2wt％，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.6wt％。
进一步地，所述磁力搅拌的时间为45mim～90min，更优选为60min。
本发明的第四个目的是提供一种用于扩增IL-17RC基因序列的引物组合物，该引物组合物扩增的目的基因为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分(片段长度为1257bp)；其中，所述引物组合物包括如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列，所述SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列的引物均设置酶切位点。
本发明的第五个目的是提供一种由上述mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分的目的基因编码的IL-17RC蛋白，所述IL-17RC蛋白采用重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白制备。
在本发明一较佳实施例中，上述壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法具体如下：
1.IL-17RC基因扩增；
特异性引物：
上游引物P1：5'-CTAGGATCCGAGAGACTGATGGAGCCT-3'；
下游引物P2：5'-AGTAAGCTTGCGCCTGTGGATGTACTTGT-3'；
其中，划线部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001384265340000031
Figure BDA0001384265340000041
PCR产物经试剂盒进行回收纯化，并测定浓度，并进行测序。
2.构建pET28a-IL-17RC原核表达体系；
用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切pET28a(+)质粒和测序正确的IL-17RC，反应体系如下：
Figure BDA0001384265340000042
酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，进行酶切鉴定及测序。
3.目的蛋白的诱导表达、SDS-PAGE鉴定及蛋白纯化；
3.1重组质粒转化E.coli BL21(DE3)；
(1)重组质粒转化E.coli BL21(DE3)。
(2)次日挑取单个菌落，接种于含Kan的LB液体培养基，37℃，250rpm，震荡培养过夜。
3.2蛋白诱导表达
(1)取4mL过夜培养的菌液，按1:50比例接种至200mL含Kan的LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养约3h，至对数生长期。
(2)将培养基中加入2mL100mM IPTG，使终浓度为1mM，37℃，220rpm，继续振荡培养4h，并设置未添加IPTG诱导的对照组。
(3)4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体沉淀。
3.3包涵体制备；
(1)每1g菌体湿重，用5mL裂解缓冲液重悬。
(2)冰浴超声：作用时间10s，间隔时间10s，约2h，直至菌液近似透明。
(3)4℃，4000rpm，离心20min，收集包涵体沉淀。
(4)用包涵体洗涤缓冲液Ⅰ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。
(5)用包涵体洗涤缓冲液Ⅱ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。
(6)将包涵体沉淀置于-20℃保存。
3.4蛋白的SDS-PAGE电泳；
(1)样品处理：取100μL未诱导的全菌体，100μL诱导后全菌体，100μL菌液超声后上清，100μL菌液超声后沉淀，各加入25μL 5×loading buffer，95℃，水浴5min。
(2)聚丙烯酰胺凝胶的配制：
1)组装好垂直电泳槽，确认无泄漏。
2)配制10％分离胶15mL：水5.9mL，30％丙烯酰胺5.0mL，1.5M Tris-HCl(pH 8.8)3.8mL，10％SDS 150μL，10％过硫酸铵15μL，TEMED 6μL。
3)灌注分离胶：迅速用枪头灌胶约5mL，留出灌注浓缩胶所需空间。加入异丙醇2mL，轻轻晃动制胶板，使液面平直。室温静置30min待胶完全凝固，倾倒出异丙醇，并用吸水纸洗干。
4)配制5％浓缩胶5mL，水3.4ml，30％丙烯酰胺0.83mL，1.0M Tris-HCl(pH 6.8)0.63mL，10％SDS 50μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL。
5)灌注浓缩胶：迅速用枪头灌胶，灌满后迅速插入样梳，室温静置10～15min。
6)加入外槽缓冲液，凝胶装置连同梳子放入电泳槽，加入内槽缓冲液，垂直拔取梳子。
(3)加样：冷却后的样品，短暂离心后，用小枪头吸取10～30μL上清，垂直向下，缓慢加样，每孔上样量为10μL，最后加入蛋白marker。
(4)电泳：将电泳装置与电源连接，设置电压80V，待染料前沿进入分离胶成狭窄带时(约40min)，将电压设置为120V。电泳约2h后，待溴酚蓝迁移至接近凝胶底部时(约2h)，停止电泳。
(5)染色：电泳结束后，从玻璃板上分离凝胶，将分离胶切下，置于考马斯亮蓝染色液中，染色20min～1h，用水平脱色摇床使染色充分均匀。
(6)脱色：染色后的凝胶用水漂洗数遍后，置于脱色液中，摇床上脱色4～8h，期间更换脱色液3～4次，至条带清晰。
(7)使用凝胶成像系统采集图像。
3.5Ni2+-NTA柱纯化；
(1)Ni2+-NTA柱的预处理：用3mL结合/漂洗缓冲液冲洗空柱，然后加入2mL琼脂糖溶液(1mL琼脂糖+1mL乙醇)。再用2mL结合/漂洗缓冲液预平衡柱，以0.5～1mL/min速度流出，重复2次。
(2)取出-20℃保存的包涵体，加入5mL结合/漂洗缓冲液，剧烈震荡，使之充分溶解。4℃，12000rpm，离心15min。
(3)取上清，加到Ni2+-NTA柱内，混匀1h，收集流穿液。
(4)加入2mL结合/漂洗缓冲液，以0.5～1mL/min速度流出，重复3次。每次收集漂洗液于1个新的离心管。
(5)加入1.5mL洗脱缓冲液，以0.5～1mL/min速度流出，重复7次。每次收集洗脱液于1个新的离心管。
3.6尿素梯度透析；
(1)将25kD透析袋装入纯化水，确定无液体漏出，在纯化水中放置10min漂洗，再加入收集的全部洗脱液。
(2)4℃条件下，先用含6M尿素的PBS溶液透析6h，再每4h降低1M浓度，直至用不含尿素的PBS溶液透析4h后停止。
(3)收集透析后的溶液，4℃，12000rpm，离心10min，收集上清。
3.7超滤；
将15mL 30kD超滤管用纯化水润湿，加入透析后的蛋白上清。4℃，2000rpm，离心至剩余约500μL液体。把蛋白分装至PCR管，每管100μL，-20℃保存。
3.8去除内毒素
(1)在干净离心管中加入500μL IL-17RC，再加入50μL预冷的液相内毒素消除剂量；充分混匀后冰浴10min。
(2)37℃水浴直到溶液出现分层，约20min。
(3)室温12000rpm，离心2min，将上清经过0.22μm滤膜过滤除菌后，转移至新的离心管。
(4)Bradford法测定蛋白浓度。
4.蛋白壳聚糖包裹；
(1)0.2％壳聚糖配制：0.08g壳聚糖溶于40ml 1％冰醋酸，45℃加热溶解。
(2)0.6％三聚磷酸钠(STPP)配制：0.6g STPP溶于100ml ddH2O。
(3)离子交联法制备壳聚糖蛋白颗粒(CS-IL-17RC)：取制备的已知浓度的IL-17RC蛋白(1.5μg/μl)250μl与500μl 0.6％STPP混合，定容至lml，在磁力搅拌下(1000rpm)缓慢加入到3ml 0.2％壳聚糖溶液中，可观察到透明液体逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，1000rpm磁力搅拌l hr，即可制得壳聚糖蛋白颗粒(CS-IL-17RC)。
(4)CS-IL-17RC颗粒粒径及电位的检测：取适量CS-IL-17RC溶液，用NICOMP380ZLS电位/粒径分析系统分析其粒径，用马尔文电位/粒径分析仪分析其电位。
研究表明，IL-17是参与哮喘气道炎症的重要炎症介质，内源性IL-17是哮喘发病和加重的重要促发因子。哮喘患者IL-17mRNA、蛋白质表达均显著增高，且IL-17的水平与气道高反应性的严重程度呈正比。在严重哮喘或死亡的患者，常表现为以中性粒细胞和肥大细胞浸润为主的非特应性哮喘。这类患者痰液中IL-17的水平和中性粒细胞的数量显著增高，临床治疗往往对激素不敏感。动物实验证实，由Th2细胞诱导的气道高反应性可以被激素抑制，而由Th17细胞介导的气道高反应性则对激素抵抗。可见，IL-17是哮喘尤其是非特应性哮喘的关键因子之一，阻断内源性IL-17的致炎作用有望成为哮喘治疗的新靶点。
IL-17RC是2002年新发现的IL-17家族受体，IL-17RC能与IL-17A、IL-17F、IL-17A/F结合，其胞质区含有与成纤维细胞生长因子IL-1受体相似的表达(SEFIR)结构域。IL-17RC与配体结合后，SEFIR首先被激活，进而与核因子κB激活剂1(Act1)结合，再将信息传递给肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，后者活化下游信号通路，从而参与细胞内外信号传递。制备外源性的IL-17RC，通过呼吸道黏膜进行免疫接种，拮抗内源性IL-17RC与IL-17的结合，进而阻断IL-17RC的下游信号传导，从而调控哮喘病理过程，减轻哮喘气道炎症反应，使临床症状得到缓解。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明提供的壳聚糖纳米颗粒，外源性的IL-17RC可通过原核表达大量获得，利用壳聚糖进行包裹，获得纳米颗粒，其直径小、作用时间长、缓慢释放，生物利用度高，生产成本低，接种方便，依从性好。本发明选用有机纳米颗粒壳聚糖，其是由甲壳素脱乙酰基作用形成的一种阳离子多糖，带有很多带正电的氨基基团，可以包裹蛋白颗粒，对组合的蛋白形成保护作用，且具有良好的粘膜粘附作用，通过鼻腔粘膜吸收，可达到良好的免疫效果。通过体外体内实验证实壳聚糖纳米颗粒能够与IL-17特异性结合，抑制其功能，从而调控哮喘病理过程，减轻哮喘气道炎症反应，使临床症状得到缓解。
附图说明
图1是PCR扩增IL-17RC基因的电泳分析图；其中M表示200bp DNA标记物；1、2表示PCR扩增的IL-17RC基因。
图2是IL-17RC蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定图；其中1表示未染色的蛋白标记物；2表示未诱导的rE.coli的总细胞裂解液；3表示1mM IPTG诱导的rE.coli的总细胞裂解液；4表示超声处理的rE.coli包涵体；5表示超声处理的rE.coli上清液。
图3是IL-17RC蛋白的Western-blot鉴定图；其中1表示野生E.coli BL21的总细胞裂解液；2、3表示来自E.coli的纯化IL-17RC蛋白。
图4是小鼠BALF中炎症细胞总数及分类计数的变化图；其中，在瑞吉氏染色后，计数BALF中的细胞总数和分类计数，结果表示为平均值±SD；N＝8，*P<0.01vs.哮喘组(Asthma)，#P<0.01vs.IL-17RC组。
图5是小鼠BALF中细胞因子变化图；其中，结果表示为平均值±SD；N＝8，*P<0.01vs.哮喘组(Asthma)，#P<0.01vs.IL-17RC组。
具体实施方式
本发明提供了一种用于扩增IL-17RC基因序列的引物组合物，其包括如SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：2所示序列；还提供一种由上述IL-17RC基因编码的IL-17RC蛋白，以及含有该蛋白的壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和其在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明提供的壳聚糖蛋白颗粒，由重组的原核表达质粒pET28a-IL-17RC经诱导表达蛋白，经纯化、复性、去内毒素后，最后经壳聚糖包裹获得。
实施例1
本实施例为IL-17RC基因扩增、琼脂糖凝胶电泳及产物回收纯化
根据GenBank中mIL-17RC的基因序列(基因登录号NM_134159.4)，设计一对特异性引物：
上游引物P1(SEQ ID NO：1)：
5'-CTAGGATCCGAGAGACTGATGGAGCCT-3'；
下游引物P2(SEQ ID NO：2)：
5'-AGTAAGCTTGCGCCTGTGGATGTACTTGT-3'；
划线部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，扩增目的基因为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分，片段长度为1257bp。
以小鼠全基因组cDNA为模板，采用Taq DNA聚合酶进行PCR，反应体系如下：
Figure BDA0001384265340000091
PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分析，其结果如图1所示，在约1300bp处有一特异性条带，与目的基因大小1257bp相符；PCR产物经试剂盒进行回收纯化，并测定浓度，并送公司进行测序。
实施例2
本实施例为pET28a-IL-17RC原核表达体系的构建。
用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切pET28a(+)质粒和实施例1中测序正确的IL-17RC，反应体系如下：
Figure BDA0001384265340000101
酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，进行酶切鉴定及测序。
实施例3
本实施例为IL-17RC蛋白诱导表达、SDS-PAGE鉴定及其纯化，其包括以下步骤：
1.IL-17RC蛋白诱导表达；
(1)实施例2中的连接产物重组质粒pET28a-IL-17RC转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)；
1)从-80℃冰箱取出1支感受态细胞E.coli BL21(DE3)(100μL)，置于冰上融化后，加入以上连接体系(重组质粒pET28a-IL-17RC)5μL，轻柔混匀，冰上放置30min。
2)将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，取出后立即冰上放置3min。
3)加入800μL预热至37℃的不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀后，37℃，250rpm，振荡培养1h。
4)用不含抗生素的LB液体培养基稀释细菌悬液，以设置浓度梯度，然后均匀涂布在含Kan的LB固体培养基上。
5)将LB固体培养基在37℃下正向放置1h，以吸收多余液体，倒置培养过夜。
6)次日挑取单个菌落，接种于含Kan的LB液体培养基，37℃，250rpm，震荡培养过夜。
(2)蛋白的诱导表达
1)取4mL过夜培养的菌液，按1:50比例接种至200mL含Kan的LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养约3h，至对数生长期。
2)将培养基中加入2mL 100mM IPTG，使终浓度为1mM，37℃，220rpm，继续振荡培养4h，并设置未添加IPTG诱导的对照组。
3)4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体沉淀。
(3)包涵体制备
1)每1g菌体湿重，用5mL裂解缓冲液重悬。
2)冰浴超声：作用时间10s，间隔时间10s，约2h，直至菌液近似透明。
3)4℃，4000rpm，离心20min，收集包涵体沉淀。
4)用包涵体洗涤缓冲液Ⅰ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。
5)用包涵体洗涤缓冲液Ⅱ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。
6)将包涵体沉淀置于-20℃保存。
2.蛋白SDS-PAGE电泳；
(1)样品处理：取100μL未诱导的全菌体，100μL诱导后全菌体，100μL菌液超声后上清，100μL菌液超声后沉淀，各加入25μL 5×loading buffer，95℃，水浴5min。
(2)聚丙烯酰胺凝胶的配制：
1)组装好垂直电泳槽，确认无泄漏。
2)配制10％分离胶15mL：水5.9mL，30％丙烯酰胺5.0mL，1.5M Tris-HCl(pH 8.8)3.8mL，10％SDS 150μL，10％过硫酸铵150μL，TEMED 6μL。
3)灌注分离胶：迅速用枪头灌胶约5mL，留出灌注浓缩胶所需空间。加入异丙醇2mL，轻轻晃动制胶板，使液面平直。室温静置30min待胶完全凝固，倾倒出异丙醇，并用吸水纸洗干。
4)配制5％浓缩胶5mL：水3.4ml，30％丙烯酰胺0.83mL，1.0M Tris-HCl(pH 6.8)0.63mL，10％SDS 50μL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 5μL。
5)灌注浓缩胶：迅速用枪头灌胶，灌满后迅速插入样梳，室温静置10～15min。
6)加入外槽缓冲液，凝胶装置连同梳子放入电泳槽，加入内槽缓冲液，垂直拔取梳子。
(3)加样：冷却后的样品，短暂离心后，用小枪头吸取10～30μL上清，垂直向下，缓慢加样，每孔上样量为10μL，最后加入蛋白marker。
(4)电泳：将电泳装置与电源连接，设置电压80V，待染料前沿进入分离胶成狭窄带时(约40min)，将电压设置为120V。电泳约2h后，待溴酚蓝迁移至接近凝胶底部时(约2h)，停止电泳。
(5)染色：电泳结束后，从玻璃板上分离凝胶，将分离胶切下，置于考马斯亮蓝染色液中，染色20min～1h，用水平脱色摇床使染色充分均匀。
(6)脱色：染色后的凝胶用水漂洗数遍后，置于脱色液中，摇床上脱色4～8h，期间更换脱色液3～4次，至条带清晰。
(7)使用凝胶成像系统采集图像，其结果如图2所示。结果显示，与未诱导全菌体相比，诱导后全菌体和包涵体，在约60kD处可见明显条带，诱导后上清则无此条带。提示在该诱导条件下，目的蛋白主要以包涵体形式存在。
3.蛋白Ni2+-NTA柱纯化；
(1)Ni2+-NTA柱的预处理：用3mL结合/漂洗缓冲液冲洗空柱，然后加入2mL琼脂糖溶液(1mL琼脂糖+1mL乙醇)。再用2mL结合/漂洗缓冲液预平衡柱，以0.5～1mL/min速度流出，重复2次。
(2)取出-20℃保存的包涵体，加入5mL结合/漂洗缓冲液，剧烈震荡，使之充分溶解。4℃，12,000rpm，离心15min。
(3)取上清，加到Ni2+-NTA柱内，混匀1h，收集流穿液。
(4)加入2mL结合/漂洗缓冲液，以0.5～1mL/min速度流出，重复3次。每次收集漂洗液于1个新的离心管。
(5)加入1.5mL洗脱缓冲液，以0.5～1mL/min速度流出，重复7次。每次收集洗脱液于1个新的离心管。
4.蛋白尿素梯度透析；
(1)将25kD透析袋装入纯化水，确定无液体漏出，在纯化水中放置10min漂洗，再加入收集的全部洗脱液。
(2)4℃条件下，先用含6M尿素的PBS溶液透析6h，再每4h降低1M浓度，直至用不含尿素的PBS溶液透析4h后停止。
(3)收集透析后的溶液，4℃，12000rpm，离心10min，收集上清。
5.超滤；
将15mL 30kD超滤管用纯化水润湿，加入透析后的蛋白上清。4℃，2000rpm，离心至剩余约500μL液体。把蛋白分装至PCR管，每管100μL，-20℃保存。
6.去除内毒素；
(1)在干净离心管中加入500μL IL-17RC，再加入50μL预冷的液相内毒素消除剂量；充分混匀后冰浴10min。
(2)37℃水浴直到溶液出现分层，约20min。
(3)室温12000rpm，离心2min，将上清经过0.22μm滤膜过滤除菌后，转移至新的离心管。
(4)Bradford法测定蛋白浓度。
实施例4
本实施例为IL-17RC蛋白Western-blot鉴定，其包括以下步骤：
1.SDS-PAGE电泳；
方法同实施例3中的2.蛋白SDS-PAGE电泳。
2.湿法转膜；
(1)PVDF膜的预处理：将PVDF膜和厚滤纸裁剪成8.0×5.0cm大小，浸入甲醇10s，至PVDF膜均匀透明。
(2)凝胶的预处理：将电泳完毕的凝胶从玻璃板中剥离，冲洗干净电泳缓冲液，在双蒸水中浸泡10min。
(3)转膜缓冲液浸润：滤纸、PVDF膜、凝胶，均用4℃预冷的转膜缓冲液浸泡，使用脱色摇床振摇10min。
(4)制作转膜三明治：按照“滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸”的顺序，制作转膜三明治。然后合上转膜夹，安装至转移电泳槽。放入-80℃预冷的冰槽，加入4℃预冷的转膜缓冲液至完全覆盖转移夹。
(5)转膜：电源设置为200mA(电压设置为最大耐受电压230V)，转膜4h。
3.抗体孵育；
(1)封闭：将转印膜置入封闭缓冲液，室温，脱色摇床振摇1h 40min。用1×TBST漂洗，室温，脱色摇床振摇5min，重复2次。
(2)一抗孵育：以兔抗小鼠IL-17RC抗体为一抗，以1:2000比例稀释，4℃孵育过夜。用1×TBST漂洗，室温，脱色摇床振摇10min，重复4次。
(3)二抗孵育：以HRP标记羊抗兔IgG抗体为二抗，以1:4000比例稀释，室温，脱色摇床振摇1h 30min。用1×TBST漂洗，室温，脱色摇床振摇10min，重复4次。
4.发光及显影；
(1)取ECL底物A和底物B各300μL，混匀后置于保鲜膜上，将PVDF膜置于溶液上方并轻轻拖动，以使膜与底物充分接触。
(2)用镊子抖动PVDF膜，滴干多余的底物溶液，使用Image Quant LAS4000mini系统观察和收集图像，其结果如图3所示。结果显示：目的蛋白在约60kD处出现阳性条带，野生型大肠杆菌的菌体则无阳性条带。
实施例5
本实施例为生物素-亲和素ELISA鉴定，其包括以下步骤：
1.生物素标记IL-17RC蛋白；
(1)打开生物素前平衡到室温。
(2)准备10mM的生物素：溶解2mg Sulfo-NHS-LC-Biotin在590μL DMSO中。
(3)1mL IL-17RC蛋白加入34.7μL生物素(摩尔比约1:30)。
(4)置于冰上孵育2h，然后室温孵育30min。
(5)采用Bradford法测定蛋白浓度。
2.生物素-亲和素ELISA；
(1)IL-17A包板：用包被缓冲液稀释商品化IL-17A至终浓度2.5μg/ml，每孔加入100μL，4℃过夜。
(2)洗板：每孔加入300μL洗涤液，室温孵育3min。在吸水纸上轻拍，吸去多余液体。重复2次。
(3)封闭：每孔加入300μL封闭缓冲液，室温孵育2h。洗板3次。
(4)IL-17RC孵育：每孔加入100μL生物素标记的IL-17RC蛋白，以样品稀释液稀释，设置浓度梯度，室温孵育2h。洗板5次。
(5)HRP标记的链霉亲和素标记的HRP孵育：加入HRP标记的链霉亲和素100μL(按1:1000比例，以样品稀释液稀释)，室温避光孵育2h。洗板7次。
(6)底物显色：阴暗避光环境下，吸取10mL底物溶液A，0.5mL底物溶液B，2μL溶液C，充分混匀。每孔加入100μL混合反应液，避光显色30min。
(7)终止显色反应：每孔加入50μL溶液D。
(8)吸光度检测：使用酶标仪，测定450nm处的吸光度，以空白对照孔调零。
实施例6
本实施例为IL-17A和IL-17RC对小鼠肺上皮细胞系(MLE-12)细胞分泌趋化因子的影响，其包括以下步骤：
1.MLE-12细胞的复苏；
(1)从-80℃冰箱中取出一支冻存的小鼠肺上皮细胞系MLE-12，用镊子夹取，迅速浸入37℃水浴箱中，不停摇动令其在1～2min内尽快融化。
(2)取出冻存管，用酒精消毒外壁后，放入超净台内，打开盖子，吸出1mL细胞悬液，至已加入10mL含2％FBS和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素的DMEM/F-12培养基的15mL离心管内，混匀。
(3)离心，1000rpm，5min。
(4)弃去上清液，加入10mL培养液重悬细胞，倒置显微镜下采用血细胞计数板计数，调整细胞密度至5×105个/mL左右，接种于培养皿，置于5％CO2，37℃培养箱静置培养。
(5)次日更换一次培养液，以除去DMSO，并洗去未贴壁的细胞，继续于37℃培养箱培养。以后隔2～3天换液一次，以洗去未贴壁细胞。观察细胞状况，至细胞覆盖培养皿80％以上后，进行传代。
2.MLE-12细胞的传代；
(1)吸去培养皿内旧培养液，反复用PBS洗涤干净。
(2)向培养皿内加入约2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA，轻轻晃动培养皿，使消化液分布均匀，把培养皿放至37℃培养箱，消化5min左右，放置显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化。
(3)加入培养基约5mL终止消化，吸取培养皿内培养基，反复吹打皿底，以使细胞脱壁，成为细胞悬液。
(4)把细胞悬液转移至离心管内，室温，1000rpm，离心5min。弃上清，用新的培养基重悬细胞。
(5)台盼兰染色，计数，分别接种在新的培养皿内，放置37℃培养箱培养。细胞传代1～2次后，生长状态恢复良好，可以进行刺激。
3.IL-17A和IL-17RC(已去除内毒素)刺激MLE-12细胞；
(1)步骤同前，进行MLE-12细胞传代，将细胞传代至24孔培养板，每孔加入细胞5×105个，置于37℃培养箱培养。
(2)培养约4h后，显微镜下观察，大部分细胞贴壁，于超净台中，吸去旧培养基，用培养基洗去未贴壁细胞。
(3)在3个培养孔中加入250ng/mL商品化IL-17A，3个孔中加入250ng/mL商品化IL-17A+50μg/mL所制备IL-17RC(实施例3制备)，另外3个孔中加入PBS作为对照。培养箱中继续培养24h后，ELISA法检测培养液上清中趋化因子浓度。
4.ELISA法检测细胞培养液中趋化因子含量；
(1)样品准备：从24孔培养板中吸取上清约1mL，置于1.5mL离心管，室温，4,000rpm，离心5min，吸取上清至新的1.5mL离心管。
(2)标准品准备：提前拿出试剂平衡至室温，配制标准品浓度梯度。
(3)加样：每孔分别加入100μL各浓度标准品及待测样品，并以样品稀释液设置空白对照，室温下脱色摇床上孵育2.5h。
(4)洗板：弃去样品液，每孔加入1×Wash Buffer 300ul，脱色摇床上孵育3min，弃去孔内液体，在吸水纸上轻轻叩打拍去残留液体。重复洗板3次。
(5)加入检测抗体：按说明书要求稀释生物素标记的检测抗体，每孔加入100μL稀释后的检测抗体，室温下，脱色摇床上孵育1h。洗板4次。
(6)加入HRP标记链霉亲和素：按相应的说明书要求稀释HRP-链霉亲和素溶液，每孔加入稀释后溶液100μL，室温下置脱色摇床上孵育45min。洗板5次。
(7)底物显色：每孔加入TMB溶液100μL，室温下脱色摇床上避光孵育30min。
(8)终止反应：每孔加入50μL终止液，终止反应。
(9)吸光度的检测：在波长450nm下，读取酶标板各孔的OD值，并以空白对照孔调零。
(10)制作标准曲线：以OD值为自变量，浓度为因变量，采用CurveExpert Pro2.3.0软件拟合标准曲线方程，并根据样品OD值计算各样本浓度。
实施例7
此实施例为壳聚糖纳米颗粒的制备，其蛋白壳聚糖包裹的具体步骤包括：
(1)0.2％壳聚糖配制：0.08g壳聚糖溶于40ml 1％冰醋酸，45℃加热溶解。
(2)0.6％三聚磷酸钠(STPP)配制：0.6g STPP溶于100ml ddH2O。
(3)离子交联法制备壳聚糖蛋白颗粒(CS-IL-17RC)：取实施例3制备的已知浓度的IL-17RC蛋白(1.5μlg/μl)250μl与500μl 0.6％TPP混合，定容至lml，在磁力搅拌下(1000rpm)缓慢加入到3ml 0.2％壳聚糖溶液中，可观察到透明液体逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，1000rpm磁力搅拌lhr。
(4)CS-IL-17RC颗粒粒径及电位的检测：取适量CS-IL-17RC溶液，用NICOMP380ZLS电位/粒径分析系统分析其粒径，用马尔文电位/粒径分析仪分析其电位。本实施例制备的CS-IL-17RC颗粒粒径为500-1000nm。
(5)包裹率测定：将4ml CS-IL-17RC溶液置入离心机中离心30min(4℃，12000rpm)，取上清液，用BCA法检测上清液中蛋白含量。按以下公式计算包裹率：包裹率＝(蛋白总投入量-上清蛋白量)/蛋白总投入量×100％。本实施例制备的CS-IL-17RC颗粒的包裹率为65％-85％。
实施例8
本实施例为壳聚糖包裹蛋白颗粒的功能研究，其包括如下步骤：
1.动物分组
6～8周龄BALB/c小鼠随机分为5组，分别为哮喘组(Asthma)、壳聚糖包裹颗粒CS-IL-17RC组(CS-IL-17RC)、未包裹蛋白IL-17RC组(IL-17RC)、壳聚糖组(Chitosan)和PBS组(PBS)，每组8只动物。
各组动物处理方案如下：
(1)哮喘组：小鼠分别于实验第7天和第21天腹腔注射200μl OVA混悬液(含10μgOVA和1.6mg氢氧化铝)，于实验第28天到第34天，以10mg/mL OVA雾化吸入20min，24h后处死小鼠收集标本。
(2)CS-IL-17RC组：小鼠分别在实验第0天和第14天鼻腔接种CS-IL-17RC20μl(含20μg IL-17RC)，于实验第7天和第21天腹腔注射200μL OVA混悬液，于实验第28天到第34天，以10mg/mL OVA雾化吸入20min，24h后处死小鼠收集标本。
(3)IL-17RC组：小鼠分别在实验第0天和第14天鼻腔接种IL-17RC 20μl(20μg)，于实验第7天和第21天腹腔注射200μL OVA混悬液，于实验第28天到第34天，以10mg/mL OVA雾化吸入20min，24h后处死小鼠收集标本。
(4)壳聚糖组：小鼠分别在实验第0天和第14天鼻腔接种壳聚糖，于实验第7天和第21天腹腔注射200μL OVA混悬液，于实验第28天到第34天，以10mg/mL OVA雾化吸入20min，24h后处死小鼠收集标本。
(5)PBS组：小鼠于相同实验时间分别以等量PBS鼻腔接种、腹腔注射及雾化吸入处理。
2.肺泡灌洗液(BALF)采集处理；
(1)沿小鼠颈部正中线剪开皮肤，无菌分离皮下组织，暴露颈部正中气管，小心分离气管周围组织，用弯头眼科镊伸入气管下面轻轻抬起气管，于气管上1/3处用弯剪斜行约45度剪开气管形成小切口，切口大小约为气管直径1/3。
(2)以无菌腰椎麻醉用导管制成约3cm长套管，后接7号注射器针头制成气管插管，连接1ml注射器，抽取0.4mL无菌生理盐水，插入气管插管约1.5cm，与助手配合，用两把弯镊交叉垂直固定密闭气管插管，缓缓注入生理盐水，可见肺组织充盈，反复灌洗4次，BALF总回收量每只小鼠约为1.2ml。
(3)BALF以4000g低温离心，取上清置-80℃冻存，待测。
(4)重悬BALF沉淀，用血球计数板计数细胞，计算出每毫升BALF中白细胞总数，并涂片瑞吉氏染色，镜下计数白细胞的分类，其结果如图4所示。结果显示，与哮喘组比较，CS-IL-17RC组小鼠BALF中炎性细胞数量明显降低；与IL-17RC组比较，CS-IL-17RC组小鼠BALF中性粒细胞下降更显著。
3.ELISA法测定BALF中IL-17A、IL-4、IL-10、IFN-γ浓度；
(1)用抗体包被液将捕获抗体按照产品说明书要求稀释至所需浓度，每孔100μl加入微孔酶标板，4℃包被过夜。
(2)洗板5次，每孔加入100μl含1％BSA的PBS，室温下孵育2h。
(3)按照产品说明书，以样品稀释液分别将各标准品倍比稀释至所需浓度，并以样品稀释液作为0浓度设置对照。洗板5次后，按预定顺序依次每孔加入100μl稀释好的标准品、处理好的待检样品，并设空白对照，室温下孵育约1h。
(4)洗板5次后加生物素标记的检测抗体：按照产品说明书，以抗体稀释液分别将各个检测抗体稀释至所需浓度，按每孔100μl加入微孔酶标板中，室温孵育1h。
(5)洗板5次后加入Avidin-HRP：按1∶2000稀释亲和素标记的HRP，100μl/孔加入微孔酶标板中，37℃避光孵育30min。
(6)洗板7次，按每孔加入TMB底物溶液100μl，室温避光反应15-30min，至标准曲线颜色梯度明显时，即刻于各反应孔中加入2M H2SO4 50μl终止液终止反应。
(7)结果判定：将酶标板置酶标仪于450nm和570nm处分别测定各孔OD值，以空白对照孔调零。
(8)标准曲线：以OD为自变量，样品浓度为因变量，采用CurveExpert Pro2.3.0软件拟合标准曲线方程，并根据样品稀释倍数计算各样本相应的浓度，其结果如图5所示。结果显示，与哮喘组比较，CS-IL-17RC组小鼠BALF中IL-17、IL-4表达水平明显降低，IL-10表达水平则显著升高。
通过上述实施例可知，本发明选用有机纳米颗粒壳聚糖包裹蛋白颗粒，对组合的蛋白形成保护作用，且具有良好的粘膜粘附作用，通过鼻腔粘膜吸收，可达到良好的免疫效果。通过体外体内实验证实壳聚糖纳米颗粒能够与IL-17特异性结合，抑制其功能，从而调控哮喘病理过程，减轻哮喘气道炎症反应，使临床症状得到缓解。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备IL-17RC蛋白，其包括：
1)扩增IL-17RC基因序列，对扩增产物进行回收纯化并测序；
2)采用步骤1)中测序正确的IL-17RC构建重组质粒pET28a-IL-17RC；
3)采用步骤2)构建的重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白并对蛋白产物进行纯化、去内毒素，获得预定浓度的IL-17RC蛋白；
(2)壳聚糖溶液的配制：将壳聚糖溶于冰醋酸，加热溶解，获得壳聚糖溶液；
(3)壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备：取步骤(1)制备的已知浓度的IL-17RC蛋白与预定浓度的三聚磷酸钠溶液混合、定容，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)配制的壳聚糖溶液中，磁力搅拌一段时间后，获得壳聚糖蛋白纳米颗粒；
所述IL-17RC基因序列为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分；
用于扩增IL-17RC基因序列的引物包括如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列；其中，所述SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2所示序列的引物均设置酶切位点；
所述壳聚糖蛋白纳米颗粒的粒径为500-1000nm；
所述IL-17RC蛋白的浓度为1.5μlg/μl；所述壳聚糖溶液的浓度为0.2wt％，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.6wt％。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述重组质粒pET28a-IL-17RC的构建步骤包括：分别双酶切pET28a(+)质粒和测序正确的IL-17RC，酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，并进行酶切鉴定及测序。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述诱导表达蛋白包括重组质粒pET28a-IL-17RC转化感受态细胞的步骤。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖蛋白纳米颗粒包裹率为65％-85％。
5.一种如权利要求1所述的制备方法制备的壳聚糖蛋白纳米颗粒在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。
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