CN107494591B - 提高纳米银颗粒特异性毒性的方法 - Google Patents

提高纳米银颗粒特异性毒性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，利用银离子提高纳米银颗粒特异性毒性。本发明方法利用外加银离子有效地提高了纳米银的颗粒特异性毒性，具有操作简单、所用试剂易获取、实用性强的优点，对于深入研究纳米银的毒性机理及拓展纳米银在杀菌、抗菌领域的应用具有重要意义。

Description

提高纳米银颗粒特异性毒性的方法
技术领域
本发明属于纳米银领域，涉及一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，具体涉及一种利用银离子提高纳米银颗粒特异性毒性的方法。
背景技术
纳米银(Nano Silver)是粒径小于100nm的金属银单质。纳米银因其具有独特的机械、光学、电学、催化特性以及良好的抗菌性，因此在纺织、食品、医疗、家电和水质净化等日常生活中得到广泛的应用。研究表明，纳米银的毒性机理主要源于纳米银释放的银离子和纳米银颗粒本身的颗粒特异性效应。溶解释放的银离子可以在一定程度上调控纳米银的毒害作用，而纳米银的这种颗粒特异性也可以直接作用于生物细胞或亚细胞。然而人们仍然不清楚纳米银释放的银离子效应以及纳米银本身的特异性效应在纳米银的毒性中所占的比例。
纳米银可以充当银离子源发挥毒性，然而纳米银释放银离子的速率不仅取决于非生物因素：纳米银的特性(例如尺寸、电荷和表面积)和周围环境的物理化学条件，还取决于纳米银与生物的相互作用。研究者发现，同等银浓度条件下银离子对微生物的毒害作用明显高于纳米银。但是，纳米银颗粒通过内吞作用或大胞饮易于进入细胞内，从而更加有效地且更加直接地实现对微生物的毒害作用。基于上述特点，提高纳米银的颗粒特异性毒性有利于纳米银发挥更强的杀菌作用，同时对于深入研究纳米银的毒性机理及拓展纳米银在杀菌、抗菌领域的应用具有重要意义。然而，现有技术中提高纳米银颗粒特异性毒性的方法尚未见到报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、所用试剂易获取、实用性强，能够有效提高纳米银颗粒特异性毒性的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，利用银离子提高纳米银的颗粒特异性毒性。
上述的方法中，优选的，利用银离子提高纳米银对微生物的颗粒特异性毒性。
上述的方法中，优选的，包括以下步骤：
S1、将银离子与纳米银溶液混合，得到混合溶液；
S2、将微生物加入到所述混合溶液中进行振荡反应，完成对微生物的处理。
上述的方法中，优选的，所述步骤S1中，所述混合溶液中银离子的浓度为1μM～20μM。
上述的方法中，优选的，所述步骤S1中，所述混合溶液中纳米银的浓度为10μM～20μM。
上述的方法中，优选的，所述步骤S2中，所述微生物的加入量为0.2g/L～0.5g/L。
上述的方法中，优选的，所述步骤S2中，所述振荡反应的转速为120rpm～160rpm；所述振荡反应的温度为33℃～39℃；所述振荡反应的时间为12h～24h。
上述的方法中，优选的，所述微生物为好氧微生物。
上述的方法中，优选的，所述好氧微生物包括白腐真菌。
上述的方法中，优选的，所述白腐真菌为黄孢原毛平革菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明提供了一种利用银离子提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，将银离子(如以AgNO3溶液作为银离子供体)加入到纳米银溶液中，外加银离子具有以下作用：外源银离子的附着推动负电荷的纳米银正向化，促使纳米银与带负电荷的微生物的相互作用，提高了纳米银对微生物的附着作用，进而有利于更多的银进入细胞内，从而增加纳米银的抗菌性；外源银离子的加入明显抑制了纳米银的溶解(根据方程式：减缓了纳米银的损耗，提高了纳米银的稳定性；银离子本身也具有杀菌作用。
2、本发明方法中，未引入其他类污染物，具有操作简单、所用试剂易获取、实用性强等优点。因此，本发明的方法对深入研究纳米银毒性机理及拓展纳米银在杀菌、抗菌领域的应用具有重要意义。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1、对比例1、对比例2中不同纳米银/银离子浓度条件下黄孢原毛平革菌的存活率示意图。
图2为对比例1中单独暴露于10μM纳米银条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
图3为对比例2中单独暴露于1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
图4为对比例2中单独暴露于10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
图5为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
图6为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
图7为对比例1中单独暴露于10μM纳米银条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
图8为图7中亮斑1处的能谱示意图。
图9为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
图10为图9中亮斑2处的能谱示意图。
图11为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
图12为图11中亮斑3处的能谱示意图。
图13为对比例2中单独暴露于1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
图14为对比例2中单独暴露于10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的原料和仪器均为市售。
实施例1
一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，具体为利用银离子提高纳米银对黄孢原毛平革菌的颗粒特异性毒性，包括以下步骤：
(1)黄孢原毛平革菌菌球的制备：将黄孢原毛平革菌孢子加入到无菌水中，形成黄孢原毛平革菌孢子悬浮液(孢子量为2.0×106个/mL)，取3mL孢子悬浮液于装有200mL Kirk液体培养基的500mL锥形瓶中，在37℃、150rpm的条件下于恒温振荡培养箱中培养60h，得到黄孢原毛平革菌菌球。使用前，将黄孢原毛平革菌菌球用浓度为2mM的碳酸氢钠缓冲溶液清洗3次，然后再用滤纸脱去菌球表面多余的缓冲液。
(2)向纳米银溶液中加入2,4-二氯酚、银离子(以AgNO3溶液作为银离子供体)和碳酸氢钠缓冲溶液，混合均匀后，得到不同银离子浓度的混合溶液。上述的混合溶液中银离子的浓度分别为1μM和10μM，2,4-二氯酚的浓度均为25mg/L(2,4-二氯酚的浓度为20mg/L～40mg/L均可实施)，纳米银的浓度均为10μM，碳酸氢钠的浓度均为2mM。本发明中，通过加入碳酸氢钠缓冲溶液调节缓冲溶液为弱碱性，抑制纳米银的溶解(根据方程式：即碳酸氢钠缓冲溶液的加入有利于减少溶液中纳米银的溶解，同时结合外源银离子对纳米银溶解的抑制作用，大大减缓了纳米银的损耗且提高了纳米银的稳定性。
(3)分别取步骤(1)中制备得到的黄孢原毛平革菌菌球，按加入量0.325g/L(即每升混合溶液中添加黄孢原毛平革菌菌球0.325g)加入到步骤(2)制备的不同银离子浓度的混合溶液中，在37℃、150rpm的条件下于恒温振荡培养箱中振荡反应12h，完成对黄孢原毛平革菌的处理。
(4)将步骤(3)中暴露于纳米银/银离子后的黄孢原毛平革菌从溶液中滤除，用超纯水洗涤，检测黄孢原毛平革菌的存活率，结果如图1所示。
设置空白对照组：与步骤(2)相比，不同之处在于，空白对照组中纳米银、银离子和2,4-二氯酚的浓度均为0，结果如图1所示。
设置2,4-二氯酚对照组：与步骤(2)相比，不同之处在于，2,4-二氯酚对照组中纳米银和银离子的浓度均为0；2,4-二氯酚的浓度为25mg/L，结果如图1所示。
对比例1
一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，包括以下步骤：
(1)黄孢原毛平革菌菌球的制备：与实施例1中的步骤(1)相同。
(2)向纳米银溶液中加入2,4-二氯酚、碳酸氢钠缓冲溶液，混合均匀后，得到不同纳米银浓度的混合溶液。上述的混合溶液中纳米银的浓度分别为10μM和20μM，2,4-二氯酚的浓度均为25mg/L，碳酸氢钠的浓度均为2mM。
(3)分别取步骤(1)中制备得到的黄孢原毛平革菌菌球，按加入量0.325g/L(即每升混合溶液中添加黄孢原毛平革菌菌球0.325g)加入到步骤(2)制备的不同纳米银浓度的混合溶液中，在37℃、150rpm的条件下于恒温振荡培养箱中振荡反应12h。
(4)将步骤(3)中单独暴露于纳米银后的黄孢原毛平革菌从溶液中滤除，用超纯水洗涤，检测黄孢原毛平革菌的存活率，结果如图1所示。
对比例2
一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，包括以下步骤：
(1)黄孢原毛平革菌菌球的制备：与实施例1中的步骤(1)相同。
(2)向银离子溶液中加入2,4-二氯酚、碳酸氢钠缓冲溶液，得到不同银离子浓度的混合溶液。上述的混合溶液中银离子的浓度分别为1μM、10μM和20μM，2,4-二氯酚的浓度均为25mg/L，碳酸氢钠的浓度均为2mM。
(3)分别取步骤(1)中制备得到的黄孢原毛平革菌菌球，按加入量0.325g/L(即每升混合溶液中添加黄孢原毛平革菌菌球0.325g)加入到步骤(2)制备的不同银离子浓度的混合溶液中，在37℃、150rpm的条件下于恒温振荡培养箱中振荡反应12h。
(4)将步骤(3)中单独暴露于银离子后的黄孢原毛平革菌从溶液中滤除，用超纯水洗涤，检测黄孢原毛平革菌的存活率，结果如图1所示。
图1为本发明实施例1、对比例1、对比例2中不同纳米银/银离子浓度条件下黄孢原毛平革菌的存活率示意图。由图1可知，单独加入低浓度纳米银(10μM～20μM)和低浓度银离子(1μM)均能有效提高黄孢原毛平革菌的存活率，如单独加入纳米银时，黄孢原毛平革菌的存活率均高于100％，这说明单独加入纳米银有利于促进黄孢原毛平革菌的生长；同样的，单独加入银离子时，在浓度为1μM下黄孢原毛平革菌的存活率高于100％，这也说明单独加入低浓度的银离子同样有利于促进黄孢原毛平革菌的生长。另外，从图1中可知，当银离子加入到纳米银溶液中时，能够降低黄孢原毛平革菌的存活率，如在纳米银浓度为10μM的条件下，加入的银离子的浓度为1μM时，黄孢原毛平革菌的存活率降低到82％；当加入的银离子的浓度为10μM时，黄孢原毛平革菌的存活率为68％。可见，本发明中将银离子加入纳米银溶液后，有效降低了黄孢原毛平革菌的存活率，表明利用银离子能够增强纳米银对黄孢原毛平革菌的毒害作用。
从图1中可知，低浓度的2,4-二氯酚(25mg/L)有利于黄孢原毛平革菌的生长，这是因为低浓度的2,4-二氯酚可以作为黄孢原毛平革菌的碳源和能源，供黄孢原毛平革菌的新陈代谢作用，以便更好地去除废水中的有害污染物。而当黄孢原毛平革菌暴露于单独的10μM银离子时，其存活率为63％。同时还发现，当溶液中总银的含量等同时(如20μM时)，银离子对黄孢原毛平革菌的毒性比纳米银更强。
基于图1中的上述结果，本发明进一步探讨纳米银和银离子共同作用时其毒性的来源，包括以下步骤：将实施例1中暴露于纳米银/银离子条件下振荡反应12h的黄孢原毛平革菌、对比例1中单独暴露于10μM纳米银条件下振荡反应12h的黄孢原毛平革菌、对比例2中单独暴露于1μM和10μM银离子条件下振荡反应12h的黄孢原毛平革菌继续振荡反应96h，然后分别从各自的溶液中滤除，用超纯水洗涤，放入冷冻干燥机中干燥。将部分干燥后的黄孢原毛平革菌菌球置于扫描电子显微镜下镜检，结果如为图2至图6。将另外一部分干燥后的黄孢原毛平革菌菌球研磨成粉，并加入一定量的甲醇，超声破碎20min后，取上清液滴置碳膜上，室温静置干燥一夜，置于高角环形暗场条件下进行扫描透射电子显微镜镜检，结果如为图7、图9、图11、图13和图14。同时对图7中的亮斑1、图9中的亮斑2和图11中亮斑3分别进行能谱分析，结果如图8、图10和图12所示。
图2为对比例1中单独暴露于10μM纳米银条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。图3为对比例2中单独暴露于1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。图4为对比例2中单独暴露于10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。图5为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。图6为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描电镜示意图。
由图2、图3和图5可知，单独暴露于10μM纳米银后的黄孢原毛平革菌、单独暴露于1μM银离子后的黄孢原毛平革菌、同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子后的黄孢原毛平革菌，它们的菌丝表面均干净、光滑，且表面没有附着颗粒状物质。
由图4和图6可知，单独暴露于10μM银离子后的黄孢原毛平革菌和同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子后的黄孢原毛平革菌，它们的菌丝表面均致密而粗糙，且无颗粒状物质附着在菌丝表面。
由图2至图6可知，纳米银颗粒未附着在黄孢原毛平革菌菌丝表面，而是通过内吞作用或大胞饮进入细胞内部对黄孢原毛平革菌进行作用。
图7为对比例1中单独暴露于10μM纳米银条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。图8为图7中亮斑1处的能谱示意图。图9为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。图10为图9中亮斑2处的能谱示意图。图11为本发明实施例1中同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。图12为图11中亮斑3处的能谱示意图。图13为对比例2中单独暴露于1μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。图14为对比例2中单独暴露于10μM银离子条件下振荡反应108h后黄孢原毛平革菌的扫描透射电镜示意图。
由图7、图9和图10可知，单独暴露于10μM纳米银的黄孢原毛平革菌、同时暴露于10μM纳米银和1μM银离子后的黄孢原毛平革菌以及同时暴露于10μM纳米银和10μM银离子后的黄孢原毛平革菌，它们的细胞内均发现了颗粒状亮斑，且这些颗粒状物质的数量随加入银离子浓度的增加而增大，这可能是因为加入的外源银离子被吸附到纳米银的表面，这不仅抑制了纳米银的聚集和溶解，使纳米银保持较高的稳定性，而且推动带负电荷纳米银的正向化，更有利于纳米银对带负电荷微生物的附着作用，加重对微生物膜的损坏，促使更多的纳米银进入细胞内部。
对该颗粒状亮斑进行能谱分析(如图8、图10和图12)得知，该颗粒物质中含有大量银元素，说明这些颗粒物质为纳米银颗粒物质。
与此同时，从图13和图14中可知，单独暴露于1μM和10μM银离子的黄孢原毛平革菌菌球的细胞内未发现颗粒状亮斑，即这些黄孢原毛平革菌菌球的细胞内无纳米银颗粒物质。
由图1-14可知，纳米银对黄孢原毛平革菌的毒害作用主要源于最初加入的纳米银颗粒本身的颗粒特异性毒性，而不是外加银离子的毒性，也不是外加银离子还原生物合成的纳米银颗粒的毒性。即本发明中利用银离子能够增强纳米银对黄孢原毛平革菌的颗粒特异性毒性，且纳米银的这种颗粒特异性毒性随外源银离子浓度的增加而增强。
本发明中，当外源银离子浓度低于1μM时，吸附在纳米银表面的银离子量相对不足，不利于纳米银的稳定性；当外源银离子浓度高于10μM时，溶液中银离子含量高于纳米银的含量，且同等银离子的浓度明显高于纳米银，那么纳米银的颗粒特异性毒性明显弱化。因此，当外源银离子浓度为1μM～10μM时，更有利于提高纳米银对黄孢原毛平革菌的颗粒特异性毒性。需要说明的是，当外源银离子浓度高于10μM时，由于银离子也本身具有杀菌作用，因此本发明采用银离子提高纳米银颗粒特异性毒性的方法对黄孢原毛平革菌的毒害作用更加突出。因此，本发明利用银离子提高纳米银颗粒特异性毒性的方法对于将纳米银和银离子的结合应用到微生物的杀菌、抗菌中具有重要意义。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种提高纳米银颗粒特异性毒性的方法，其特征在于，利用银离子提高纳米银对微生物的颗粒特异性毒性，包括以下步骤：
S1、将银离子与纳米银溶液混合，得到混合溶液；所述混合溶液中银离子的浓度为1 µM；所述混合溶液中纳米银的浓度为10 μM～20 μM；
S2、将微生物加入到所述混合溶液中进行振荡反应，完成对微生物的处理；所述微生物为好氧微生物；所述好氧微生物包括白腐真菌；所述白腐真菌为黄孢原毛平革菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述微生物的加入量为0.2g/L～0.5 g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述振荡反应的转速为120rpm～160 rpm；所述振荡反应的温度为33℃～39℃；所述振荡反应的时间为12 h～24 h。
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