CN107490504A - 一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法，通过筛选不同消化方法，最终确定用0.075g毛发加0.72mol/L NaOH 5ml混匀，56℃水浴加热1h溶解，然后用浓盐酸调至pH8，再加入2％胰酶至10ml，继续加热消化1h，得消解液；然后建立标准曲线，用4‑(二甲氨基)苯甲醛定量测定毛发中吡咯加合物含量。采用本发明的方法，毛发的最低检出限为0.07±0.01nmol/mg蛋白。本发明的测定毛发中吡咯加合物含量的方法可用于测定正己烷、2,5‑己二酮引起的慢性中毒。

Description

一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法

技术领域

本发明涉及吡咯加合物的含量测定技术领域，具体涉及一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法。

背景技术

正己烷(n-hexane，CH₃(CH₂)₄CH₃)，是一种常用的饱和脂肪烃类工业溶剂，主要用于粘胶配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制药、家具制造及电子元件制造等行业。近年来，在我国正己烷诱发的职业中毒事件时有发生，长期慢性低浓度接触可出现周围神经病变。患者主要表现为感觉运动神经功能减弱，手足发麻无力，感觉减退，严重者可表现为肌肉萎缩、双下肢瘫痪。

正己烷导致慢性周围神经病变的机制至今尚不清楚，现存在多种假说，其中正己烷代谢物-----2,5-己二酮(2,5-hexandione，2,5-HD)与神经丝等蛋白质结合形成吡咯加合物(Pyrrole adducts)使得神经轴索变性的假说受到大多数研究者的认同。因此，研究吡咯加合物成为研究正己烷中毒的重点，但有关吡咯加合物的文献报道较少，Kessler W等人曾发现吡咯加合物能与埃利希试剂反应后呈现特异性紫红色，通过测定光密度可计算吡咯加合物浓度。

对于吡咯加合物的检测样本，目前多采用动物的血液和尿液样本。但由于血液和尿液样品不易保存，半衰期较短，尿液酸化时可使含量上升等缺点，因此，需要寻找更好的样本用于吡咯加合物的检测。

毛发样本由于其自身的稳定性和可蓄积性，逐渐成为一个较好的生物标志物，目前已用于监测重金属蓄积和违禁药品使用。考虑到血液中的2,5-HD可能与毛发中的蛋白质结合并蓄积，以及毛发样本的收集简单，储存方便，能较好的反应机体的蓄积情况的特点。因此，以毛发作为检测样本用于吡咯加合物的含量测定，可以为预防正己烷中毒提供新的监测手段。但目前还未有关于测定毛发中吡咯加合物含量的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于吡咯加合物含量测定的毛发样品的处理方法，步骤如下：

(1)毛发样品的前处理：

将毛发样品与清洁剂和热水混匀并搅拌，再用无水乙醇浸泡脱脂处理，静置室温干燥；

(2)消化处理：

向前处理后的毛发样品中加入NaOH溶液，混匀，水浴加热溶解，然后调至pH＝8；再加入胰酶溶液继续加热消化0.5-1.5h，得毛发样品消解液。

优选的，步骤(1)中，毛发样品与清洁剂加入量的比为1g：(0.1-0.2)ml。

优选的，步骤(1)中，无水乙醇浸泡脱脂处理的次数为2次。

优选的，步骤(2)中，所述NaOH溶液的浓度为0.72mol/L；前处理后的毛发样品与NaOH溶液加入量的比为0.075g：5ml。

优选的，步骤(2)中，水浴加热的温度为56℃，水浴加热的时间为1h。

优选的，步骤(2)中，采用12mol/L的浓盐酸滴定至pH＝8。

优选的，步骤(2)中，胰酶溶液的质量浓度为2％。

优选的，步骤(2)中，加入胰酶溶液后在56℃消化1h。

本发明的第二方面，提供一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法，步骤如下：

(1)按上述的方法处理毛发样品，得毛发样品消解液；

(2)将毛发样品消解液离心，取上清中间液，加入盐酸胍、无水乙醇和埃利希试剂，震荡后测定吸光度值，利用内标工作曲线测定毛发样品消解液中吡咯加合物浓度；

(3)测定毛发样品消解液中蛋白质的含量；

(4)按C₃＝C₁/C₂nmol/mg计算毛发样品中吡咯加合物的含量；其中，C₃为毛发样品中吡咯加合物的含量。

优选的，步骤(2)中，上清中间液、盐酸胍、无水乙醇和埃利希试剂加入的体积比为1：1：1：1。

步骤(2)中，毛发样品消解液中吡咯加合物浓度的计算方法为：C₁＝(OD₁-0.0612)/0.0048nmol/ml；其中，C₁为毛发样品消解液中吡咯加合物浓度，OD₁为毛发样品消解液在526nm处测定的吸光值。

步骤(3)中，毛发样品消解液中蛋白质含量的测定方法为：将毛发样品消解液用水稀释10倍，得稀释液；用牛血清白蛋白(BSA)配制系列蛋白标准溶液，取各浓度的蛋白标准溶液和稀释液加入BCA试剂盒AB混合液(A:B＝50:1)，在37℃震荡孵育30min，测定562nm吸光度值(OD₂)，根据标准曲线，计算毛发样品消解液中蛋白质浓度。

优选的，毛发样品消解液中蛋白质浓度的计算方法为：C₂＝(OD₂-0.158)/0.0011*10/1000mg/ml；其中，C₂为毛发样品消解液中蛋白质浓度，OD₂为毛发样品消解液在562nm处测定的吸光值。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明系首次提供了一种测定毛发样品中吡咯加合物含量的方法，为预防正己烷中毒提供了新的监测手段，可以用于监测评价正己烷或2,5-己二酮接触或慢性中毒人群，防止职业中毒发生。

(2)毛发样本不同于血液或尿液样本，毛发样本收集简单，储存方便，能较好的反应机体的蓄积情况；但如何对毛发样本进行前处理，使之能准确的反应2,5-HD在体内的蓄积情况，是对毛发样本中吡咯加合物含量测定的难点所在。本发明对毛发样本的前处理方法，特别是消解方法进行了优化筛选，结果发现，最优的消解方法为：将毛发样本与NaOH混匀，56℃水浴加热1h溶解，然后用浓盐酸调至pH8，再加入2％胰酶，继续加热消化1h。采用本发明的方法，毛发样本中吡咯加合物的最低检出限可达0.07±0.01nmol/mg蛋白。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：5种标准曲线的比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前还未有关于测定毛发中吡咯加合物含量的报道。基于此，本发明提出了一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明实施例中所用到的试剂和仪器如下：

氢氧化钠(NaOH)、偏重亚硫酸氢钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、氟化硼、无水乙醇、浓盐酸、浓硝酸、尿素、盐酸胍、正己烷(分析纯，天津富宇化工公司)、2,5-己二酮(分析纯，美国sigma公司)、2,5-二甲基吡咯(分析纯，美国sigma公司)、4-二甲氨基苯甲醛(分析纯，美国sigma公司)、2-巯基乙醇(分析纯，美国sigma公司)、胰酶(美国sigma公司)、BSA(thermo公司)、BCA蛋白定量试剂盒(thermo公司)、雕牌清洁剂(市售)、多功能酶标仪(200PRO，瑞士TECAN公司)、FA2004电子天平。

埃利希试剂的配制：准确称取4-(二甲氨基)苯甲醛2.50g于烧杯中，加入盐酸25ml溶解，然后转移到250ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此标准液含4-(二甲氨基)苯甲醛的浓度为10mg/ml。

实施例1：用于吡咯加合物含量测定的毛发样本的处理

(1)毛发样本的前处理：

称取大鼠或人头颈部毛发1g左右，加入0.1ml雕牌清洁剂，加热水混匀毛发并搅拌，反复三次后，用无水乙醇浸泡脱脂处理2次，静置室温干燥备用。

(2)取前处理后的毛发样本0.075g，加0.72mol/L NaOH 5ml，56℃水浴加热1h后，使用12mol/L浓盐酸滴定至pH为8，加入2％胰酶溶液至10ml，继续56℃水浴加热1h。

对比例1：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加入含有0.48g尿素、0.03g十二烷基硫酸钠(SDS)、1ml 2-巯基乙醇的混合液10ml，混匀，50℃水浴加热2h消化。

对比例2：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加入含有0.48g尿素、0.03gSDS、0.5g偏重亚硫酸氢钠的混合液10ml，混匀，60℃水浴加热2h。

对比例3：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加入含有0.48g尿素、0.5g偏重亚硫酸氢钠的混合液10ml，混匀，用5mol/L NaOH调pH至6.5，65℃水浴加热2h。

对比例4：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加入5％SDS溶液10ml，混匀，70℃水浴加热2h。

对比例5：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加6mol/L盐酸胍溶液10ml，65℃水浴加热2h。

对比例6：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加2％胰酶溶液10ml混匀，35℃水浴加热10h。

对比例7：

毛发样本的前处理同实施例1，取前处理后的毛发样本0.075g，加浓硝酸10ml混匀，50℃水浴加热30min。

对实施例1和对比例1-7的样品处理方法进行评价，结果见表1。

表1：不同处理方法消化毛发的结果评价

由表1可以看出，只有浓硝酸(对比例7)、氢氧化钠结合胰酶(实施例1)能彻底消化毛发。但加入埃利希试剂，浓硝酸消化液(对比例7)出现白色沉淀并结晶，氢氧化钠结合胰酶消化液(实施例1)出现红色。因此，使用本发明实施例1的处理方法才能彻底消化毛发并进行吡咯加合物的测定。

实施例2：无水乙醇加入量与颜色持续时间的考察

取实施例1处理后的毛发样本0.10ml与2ml EP管内，加入0.10ml盐酸胍，并分别加入0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40ml无水乙醇和0.1ml埃利希试剂，肉眼观察出现特异性紫红色至颜色完全消失的时间并记录。探索颜色持续时间和加入乙醇体积的关系，结果见表2。

表2：不同体积乙醇处理与颜色持续时间的关系

由表2可以看出，加入的乙醇越多，特异性显色反应持续时间越长。乙醇能够很好的稳定显色，乙醇的浓度和颜色持续时间有很好的相关性(R²＝0.998，P<0.05)。考虑实际操作，加入1体积无水乙醇和1体积埃利希试剂进行显色反应。

实施例3：标准曲线的绘制

1.标准液配制：准确量取液体的2,5-二甲基吡咯(2,5-DMP)0.764ml(714mg，7.5mmol)于容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容至10ml，此标准液含2,5-DMP的浓度750μmol/mL。用蒸馏水稀释成浓度为0.0、60.0、150.0、225.0、300.0、600.0、1500.0nmol/mL溶液备用。

2.标准曲线的绘制

2.1无样品不消化的标准曲线绘制：

取以上标准液，用蒸馏水1：19稀释配制成0.00、3.00、7.50、11.25、15.00、30.00、75.00nmol/mL系列标准溶液。取50μl加入96孔板，加6mol/l盐酸胍100μl、无水乙醇50μl、埃利希试剂50μl，震荡1s后，526nm测定吸光度值。以吸光度为纵坐标，以2,5-DMP浓度为横坐标，绘制工作曲线，并求出回归方程。

2.2加标加样消化的标准曲线绘制：

在50ml的EP管中分别加入0.5ml系列标准液与0.150g毛发混匀，加入5ml0.72mol/L的NaOH溶液，56℃水浴消化1h，用浓盐酸滴定至pH为8，再加入2％胰酶至10ml后，继续56℃水浴加热1h。消化液浓度分别为：0.00、3.00、7.50、11.25、15.00、30.00、75.00nmol/mL。3000rpm离心10min，取上清中间液测定吸光度值，吸光度值测定方法同“2.1”，以吸光度为纵坐标，以2,5-DMP浓度为横坐标，绘制工作曲线，并求出回归方程。

2.3加样消化加标的标准曲线绘制：

0.150g毛发加入5ml 0.72mol/L的NaOH溶液，56℃水浴消化1h，用浓盐酸滴定至pH为8，加入2％胰酶至9.5ml后，继续56℃水浴消化1h。分别加入0.5ml系列标准液与消化液混合，3000rpm离心10min，取上清中间液测定吸光度，吸光度值测定方法同“2.1”，以吸光度为纵坐标，以2,5-DMP浓度为横坐标，绘制工作曲线，并求出回归方程。

3.结果

不同2,5-DMP浓度测定的无样品不消化的、加标加样消化和加样消化加标的吸光度值见表3，根据吸光度值绘制标准曲线(见图1)。结果显示，内标曲线(加样加标消化)和外标(消化后加标)之间差异不大，但在30.00和75.00nmol/ml时都与单纯2,5-DMP(无样品不消化)制作的标准曲线有明显差别(约1/2)。考虑实际消化情况，使用内标工作曲线测定毛发中吡咯加合物的含量。

表3不同浓度2,5-DMP测定的五种标准曲线的OD值

实施例4：毛发样本中吡咯加合物的测定

1.2,5-HD处理毛发消解液浓度测定

称量洗干净的大鼠毛发0.150g加入0、10、20、30mg/ml的2,5-HD溶液5ml，室温浸泡48h，毛发洗净干燥后备用。人毛发处理同上。加入2,5-HD对毛发进行处理，目的是观察不同浓度2,5-HD与毛发形成的吡咯加合物是否有随着2,5-HD浓度增加，吡咯加合物也有随之增加的趋势。如果有，本发明的毛发样本中吡咯加合物的测定方法才能进行实际应用；如果没有，则该测定方法就没有实际应用价值。

分别取0.075g 2,5-HD处理后的毛发，按消化方法8进行消化，消化后3000rpm离心10min，取上清中间液按实施例3中“2.1”的方法测定OD₁值。根据1.2.4.2.2绘制的内标工作曲线(加样加标消化)测定毛发消解液吡咯加合物浓度C₁，C₁＝(OD₁-0.0612)/0.0048nmol/ml。

2.蛋白定量

2,5-HD处理的毛发样本消化液使用蒸馏水稀释10倍备用。

用BSA配置31.25、62.5、125、250、500、1000、2000μg/ml的系列蛋白标准溶液，取25μl各浓度标准溶液和样本消化稀释液，加入200μl BCA试剂盒AB混合液(A:B＝50:1)，在37℃震荡孵育30min，测定562nm吸光度值(OD₂)。根据标准曲线，计算原消解液中蛋白质浓度C₂，C₂＝(OD₂-0.158)/0.0011*10/1000mg/ml。

3.计算毛发中吡咯加合物含量C₃＝C₁/C₂nmol/mg。

4.结果：

采用SPSS 19.0进行统计处理，使用one-way ANOVA和Student’s t检验判断是否存在差异，以P<0.05为有统计学意义。

结果显示，不同浓度2,5-HD处理的大鼠毛发和人头发与各自的空白对照相比，2,5-HD浓度越高，吡咯加合物含量越高，具有明显的剂量反应关系(P<0.01)，说明本发明的方法具有实际应用价值；相同浓度处理条件下，各组大鼠和人毛发相比，空白组、10、20、30mg/ml组之间差异均无统计学差异(P>0.05)。

各组不同毛发中吡咯加合物浓度测定结果见表4。

表4各组不同毛发中吡咯加合物浓度

*P<0.05,**P<0.01

实施例5：正己烷处理毛发测定

称取0.075g大鼠毛发浸泡在5ml正己烷内，室温反应48h。洗净干燥后使用上述方法消化并测定吡咯加合物含量。

测定吸光度值后计算OD：0.062±0.001，计算消化大鼠毛发液中吡咯加合物浓度：0.21±0.03nmol/ml，消解液蛋白质浓度3.23±0.05mg/ml，计算毛发中吡咯加合物浓度：0.07±0.01nmol/mg。和空白大鼠毛发相比无统计学差异(P>0.05)，因此推测正己烷直接沾染毛发不会产生吡咯加合物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于吡咯加合物含量测定的毛发样品的处理方法，其特征在于，步骤如下：

(1)毛发样品的前处理：

将毛发样品与清洁剂和热水混匀并搅拌，再用无水乙醇浸泡脱脂处理，静置室温干燥；

(2)消化处理：

向前处理后的毛发样品中加入NaOH溶液，混匀，水浴加热溶解，然后调至pH＝8；再加入胰酶溶液继续加热消化0.5-1.5h，得毛发样品消解液。

2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(2)中，所述NaOH溶液的浓度为0.72mol/L；前处理后的毛发样品与NaOH溶液加入量的比为0.075g：5ml。

3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(2)中，水浴加热的温度为56℃，水浴加热的时间为1h。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用12mol/L的浓盐酸滴定至pH＝8。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入胰酶溶液后在56℃消化1h。

6.一种测定毛发中吡咯加合物含量的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)按权利要求1所述的方法处理毛发样品，得毛发样品消解液；

(2)将毛发样品消解液离心，取上清中间液，加入盐酸胍、无水乙醇和埃利希试剂，震荡后测定吸光度值，利用内标工作曲线测定毛发样品消解液中吡咯加合物浓度；

(3)测定毛发样品消解液中蛋白质的含量；

(4)按C₃＝C₁/C₂nmol/mg计算毛发样品中吡咯加合物的含量；其中，C₃为毛发样品中吡咯加合物的含量。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，上清中间液、盐酸胍、无水乙醇和埃利希试剂加入的体积比为1：1：1：1。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，毛发样品消解液中吡咯加合物浓度的计算方法为：C₁＝(OD₁-0.0612)/0.0048nmol/ml；其中，C₁为毛发样品消解液中吡咯加合物浓度，OD₁为毛发样品消解液在526nm处测定的吸光值。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，毛发样品消解液中蛋白质含量的测定方法为：将毛发样品消解液用水稀释10倍，得稀释液；用牛血清白蛋白配制系列蛋白标准溶液，取各浓度的蛋白标准溶液和稀释液加入BCA试剂盒AB混合液，在37℃震荡孵育30min，测定562nm吸光度值，根据标准曲线，计算毛发样品消解液中蛋白质浓度。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，毛发样品消解液中蛋白质浓度的计算方法为：C₂＝(OD₂-0.158)/0.0011*10/1000mg/ml；其中，C₂为毛发样品消解液中蛋白质浓度，OD₂为毛发样品消解液在562nm处测定的吸光值。