CN107478670B - 一种沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法 - Google Patents

一种沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境化学分析测试方法领域，具体涉及一种水环境沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法。该方法通过采用生物酶水解和核磁共振综合分析，获得水环境沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，实现了对肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用后形成的肌醇磷酸盐‑腐殖酸复合物生物酶可降解比例的分析，进而在一定程度上评估肌醇磷酸盐受腐殖酸影响后在水环境中降解程度和生物有效性的变化。

Description

一种沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法
技术领域
本发明属于环境化学分析测试方法领域，具体涉及一种水环境沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法。
背景技术
富营养化已经成为一个全球性的环境问题，并且成为水环境及水资源保护中最为活跃的研究领域之一。尤其是在我国，富营养化已经严重制约水资源的可利用性和可持续发展，尤其是湖泊富营养化问题。磷是引起蓝藻水华暴发的主要限制性营养盐，尤其是从湖泊生态系统演化及其富营养化过程中营养盐长期来源考虑。水环境中磷可分为无机磷和有机磷两部分。目前，针对水环境如湖泊沉积物中无机磷，主要为磷酸盐，进行了大量的研究，方法也较为成熟。有机磷是湖泊水环境中磷的重要组成部分，在我国不同区域湖泊沉积物中有机磷含量可占湖泊沉积物总磷的30％左右，富营养化湖泊中有机磷的比例甚至更高。
有机磷是水环境中磷循环的重要组成部分，尤其有机磷生物地球化学循环过程已经成为一些富营养化湖泊內源磷的重要来源之一，并且可能成为湖泊水体磷营养水平自我调节的重要因素之一(Zhu,Y.,Wu F.,He Z.,Guo J.,Qu X.,Xie F.,Giesy,J.,Liao H.,Guo F.Characterization of Organic Phosphorus in Lake Sediments by SequentialFractionation and Enzymatic Hydrolysis.Environmental Science&Technology.47,7679-7687(2013))。然而，由于有机磷组成和结构特征复杂，与无机磷相比，到目前为止对有机磷的组成和生物地球化学循环过程及其与水体富营养化、蓝藻水华暴发过程的关系的认识还非常有限。
其中，肌醇磷酸盐是沉积物中有机磷最主要的组成部分之一。按分子中磷酸盐数量，肌醇磷酸盐包括肌醇一磷酸盐至肌醇六磷酸盐，还包括各类同分异构体如肌醇六磷酸盐中包括肌-肌醇六磷酸盐、鲨-肌醇六磷酸盐和新-肌醇六磷酸盐。其中，肌-肌醇六磷酸盐是最常见的同分异构体，一般称为植酸磷。与其他有机磷组分相比，肌醇磷酸盐类有机磷化学结构相对稳定，但其在水环境中生物地球化学循环过程的认识仍十分有限。一方面，认为水环境中一些肌醇磷酸盐具有很高的生物有效性，甚至可直接被水环境中一些微生物吸收利用；另一方面，认为肌醇磷酸盐在水环境中具有很高的稳定性，如肌醇磷酸盐中的植酸磷，其与金属离子如Al3+强烈螯合并沉淀，在沉积物中长期保存，认为是研究水环境古环境变化的指标之一。肌醇磷酸盐与有机质如腐殖酸相互作用，被认为是影响水环境中肌醇磷酸盐生物有效性的因素之一，推测具体机理包括两个方面：一方面，肌醇磷酸盐与腐殖酸等有机质以共价键方式相互结合，成为腐殖酸等大分子有机质一部分，难以进入生物酶活性点位而不易被降解；另一方面，腐殖酸等有机质以Al3+等金属为“桥键”，形成“肌醇磷酸盐—金属离子—有机质”的结构，也难以进入生物酶的活性点位而被生物降解和利用。腐殖酸是水环境中最常见的有机大分子，具有较强的稳定性，是水环境中有机质的主要组分。因此，研究肌醇磷酸盐与腐殖酸的相互作用，是认识水环境中肌醇磷酸盐生物地球化学过程关键环节，也是进一步揭示湖泊中有机磷生物地球化学特征及其对水环境营养盐水平影响的重要环节。
目前，关于对于肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用大多处于假设阶段，初步研究方法有体积排阻色谱、超滤等分离分析方法，但是这些方法也都存在分离过程复杂，多原始样品破坏程度大，分析结果也具有许多不确定因素。更重要的问题是，这些分析化学手段如体积排阻色谱等无法确定相互作用后形成的“肌醇磷酸盐-金属-腐殖酸”结构的生物稳定性，进而无法判断其在水环境中的可降解程度等。磷核磁共振技术是分析有机磷结构组分的强有力工具。然而，单独的核磁共振技术只能获得肌醇磷酸盐的结构信息，无法获得肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用信息。酶水解是湖泊中有机磷降解并被生物利用的主要生物化学途径。单独使用酶水解技术，并计算肌醇磷酸盐酶降解过程释放正磷酸盐含量，只能分析判断酶可水解部分肌醇磷酸盐(未与腐殖酸等有机质相互作用的肌醇磷酸盐)的含量，并分析判断肌醇磷酸盐的生物可降解程度即生物有效性。单独的酶水解技术无法水解全部的肌醇磷酸盐，主要是不能水解与腐殖酸等有机质相互作用的肌醇磷酸盐而获得其含量，因此，也无法对样品中肌醇磷酸盐的总含量进行分析。因此，单独的酶水解技术也不能评估未知样品中肌醇磷酸盐受腐殖酸的影响后，在水环境中降解程度和生物有效性的变化。
现有的酶水解技术，多采用酸性磷酸酶、曲霉菌来源的植酸酶(最佳水解效果pH为2.5左右)等组合，其实验条件最佳pH一般在酸性条件下，如pH 5.0以下；而在中性条件或偏碱性条件下，活性较低，对实验过程中有机磷水解不彻底，对结果分析造成误差较大。
发明内容
为实现对肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的识别与分析，以及揭示肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用后肌醇磷生物有效性的变化，本发明提供了一种肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，通过该方法，可以分析肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用比例。在此基础上，可以进一步评估相互作用后肌醇磷酸盐受腐殖酸影响后在水环境中降解程度和生物有效性变化。
本发明的技术方案为：一种水环境中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
S1.取沉积物样品，获取沉积物样品提取液；
S2.沉积物样品提取液31P-NMR分析，分析得到沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐总量为y1；
S3.沉积物样品提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2；
S4.取含量为y2的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2；
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X＝(y1-y2)-(x1-x2)。
进一步地，所述酶水解分析的步骤包括：取沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品两份，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，
样品经培养后，检测沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
更进一步地，所述沉积物样品提取液有机磷的酶水解分析的具体步骤为：(1)取0.3-1mL沉积物样品提取液，稀释后，加入0.8-1.2mol/L HCl溶液，调节pH至7.0±0.1，定容至10mL；
(2)同时移取2份提取液并进行稀释和调节pH，分别加入\酶制备液，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸混合液，pH 7.0±0.1，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸混合酶液，pH 7.0±0.1；
(3)于37℃培养条件下，轻微振荡15-20h；
(4)培养后，降至室温，检测提取液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
更进一步地，所述植酸酶为提纯后的植酸酶。
更进一步地，所述植酸酶的提纯的具体步骤为：将200mg粗植酸酶溶解于20-40mL70-85％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃下过夜，结晶沉淀，初步提纯；离心分离后，将结晶沉淀获得的植酸酶进一步溶解于10-15mL，浓度为10m mol/L，pH 5.0-5.5的醋酸钠缓冲溶液，装入透析袋，在1.5-2.5L缓冲溶液中透析16-20h，每隔2-4h更换一次透析液；离心分离弃去沉淀物后获得提纯后植酸酶溶液，上清液稀释于0.1mol/L，pH 5.0-5.5的醋酸钠缓冲溶液，获得酶活性0.05-0.20U/mL的备用酶试剂。
进一步地，所述沉积物样品提取液的提取过程包括：取沉积物样品，加入酸溶液震荡提取2-4h；再加入碱溶液，室温振荡处理15-20h，离心分离，得沉积物样品提取液。
更进一步地，所述酸溶液为盐酸溶液；所述碱溶液为NaOH溶液和KOH溶液中的一种或两种的混合。
更进一步地，所述盐酸溶液的浓度为0.05-0.12mol/L，所述沉积物样品与盐酸溶液的固液比(g/ml)为1:(15-25)。该步骤去除酸可溶解富里酸以及部分无机磷酸盐、以及去除部分影响31P-NMR核磁共振分析的Fe、Ca、Al等金属离子。
更进一步地，所述碱溶液的浓度为0.2-0.3mol/L，所述沉积物样品与碱溶液的固液比(g/ml)为1:(15-25)。
进一步地，所述31P-NMR分析的过程包括：沉积物样品提取液的前处理过程，取所述肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液冷冻干燥，浓缩成粉末样品；加入NaOH-EDTA重水溶液，手动摇晃并使用超声振荡使粉末样品充分溶解；
分析处理过程：经静置、离心分离得上清液，上清液经31P-NMR分析，采用分析处理软件定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐含量。
更进一步地，所述重水中含有过量的Na2S。Na2S用于去除样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境。
进一步地，所述31P-NMR分析，室温温度为20-25℃，核磁共振的频率为500MHz以上，配备适合进行31P-NMR谱图分析的探头，扫描次数为12000～15000次。
更进一步地，所述31P-NMR分析具体为：取所述肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液冷冻干燥，浓缩成粉末样品；加入1mol/L NaOH-50mmol/L EDTA重水溶液溶解，手动摇晃并使用超声振荡充分溶解；所述重水中含有过量的Na2S，沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；处理后浓缩样品于4℃条件下，静置沉淀17-20h后，离心分离，上清液经31P-NMR分析分析。
进一步地，所述31P-NMR分析还包括加标沉积物样品提取液的分析，所述加标沉积物样品提取液的分析具体为：向沉积物样品提取液中，加入适量肌醇六磷酸盐标准样品以及包括亚甲基二磷酸盐(MDPA)、葡萄糖6磷酸盐(G6P)、葡萄糖1磷酸盐(G1P)、α-甘油磷酸盐(α-Gly)、β-甘油磷酸盐(β-Gly)、单磷酸腺苷(AMP)、胆碱磷酸(Pcho)和二酯磷DNA-P的有机磷标准样品，再次分析加标后样品提取液31P-NMR谱图。采用MestReNova(MestrelabResearch SL)等核磁谱图分析处理软件，对比沉积物样品提取液和加标沉积物样品提取液31P-NMR谱图，并结合有机磷化合物31P-NMR谱图中相对化学位移，定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐总量。
进一步地，所述分析方法还包括对沉积物样品提取液中总磷、Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析。Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析，为提取液中加入过量Na2S基础。加入过量的Na2S(溶解于D2O)沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；也是认识提取液基本性质的基本参数。
本发明的酶水解分析采用碱性磷酸、磷酸二酯酶的最佳pH为9.0，偏碱性，而小麦来源的植酸酶，最佳pH为5.0-5.5，经过提纯后，除去了磷酸盐，同时活性也提高了很多。碱性磷酸、磷酸二酯酶和小麦来源的植酸酶的组合最终实验条件可以控制在中性pH7.0，在中性条件下，准确分析水环境中植酸磷与有机质相互作用。
单独的核磁共振分析，只能分析获得总量，而无法获得肌醇磷酸盐与腐殖质等有机质相互作用的信息；单独的酶水解分析能获得样品中酶可水解部分肌醇磷酸盐的含量，而无法获得样品中肌醇磷酸盐总量，也无法对其降解程度和生物有效性变化进行准确评估。因此，单独的磷核磁或者单独的酶水解技术均不能评估肌醇磷酸盐受腐殖酸影响后在水环境中降解程度和生物有效性的变化。只有将磷核磁和酶水解技术有机结合，才能评估肌醇磷酸盐受腐殖酸影响后在水环境中降解程度(比例)和生物有效性的变化。
本发明采用生物酶水解和核磁共振综合分析，获得水环境沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，实现了对肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用后形成的肌醇磷酸盐-腐殖酸复合物生物酶可降解比例的分析，进而在一定程度上评估肌醇磷酸盐受腐殖酸影响后在水环境中降解程度和生物有效性的变化
附图说明
图1；本发明的酶水解分析的流程图；
图2；本发明沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法的设计原理图；
图3(a)滇池沉积物样品DC-2(0-10cm)的31P-NMR谱图；
(b)滇池其他参考沉积物样品X的31P-NMR谱图；
(c)沉积物样品X提取液中加入有机磷标准物质的31P-NMR谱图；
图4(d)滇池沉积物样品DC-2(0-10cm)的31P-NMR谱图；
(e)滇池其他参考沉积物样品X的31P-NMR谱图；
(f)沉积物样品X提取液中加入有机磷标准物质的31P-NMR谱图。
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
实施例1
1、一种水环境中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，该分析方法包括如下步骤：
S1.取沉积物样品，获取沉积物样品提取液；
S2.沉积物样品提取液31P-NMR分析，分析得到沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐总量为y1；
S3.沉积物样品提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2；
S4.取含量为y2的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2；
酶水解分析的步骤包括：取沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品两份，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，
样品经培养后，检测沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X＝(y1-y2)-(x1-x2)。
实施例2
云南滇池沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用研究
沉积物样品采集与预处理：
采用自制的重力型柱状沉积物采样器，采集滇池北部和中部区域样品，现场按照1cm间隔进行分样处理，样品立即装入封口袋中密封保存，使用干冰或冰袋低温保存并运回实验室。沉积物样品冷冻干燥后使用玛瑙碾钵研磨过100目筛子，装入封口袋中于0至-20℃低温冷冻保存备用。本实施例选取滇池中部(编号为DC-2)表层0-10cm混合沉积物样品[DC-2(0-10cm)]为例。
样品基本化学参数分析结果如下：总磷(TP)含量为2368mg/kg；元素分析：C含量为5.583％，N含量为0.682％，C/N摩尔比(原子比)为9.685；与磷密切相关金属元素：Al含量为88.9g/kg，Ca含量为49.3g/kg，Fe含量为69.3g/kg，Mn含量为0.9g/kg。
S1.沉积物中肌醇磷酸盐-腐殖酸的提取
称取2g滇池沉积物样品，以固液比1:20比例，加入40mL 0.1M HCl室温震荡提取2h，离心分离，弃去上清液。剩余残渣中，加入40mL 0.25M NaOH溶液，室温振荡16h，提取沉积物中肌醇磷酸盐和腐殖酸组分，离心分离，移取上清液，获得沉积物样品中肌醇磷酸盐与腐殖酸组分提取液，使用前冷冻保存。
S2.肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液31P-NMR分析
提取、前处理及基本参数分析：称取2g沉积物样品，以固液比1:20比例，加入40mL0.1M HCl室温震荡提取2h，离心，弃去上清液。沉积物残渣中加入40mL 0.25M NaOH溶液，室温振荡16h，提取沉积物中植酸磷-腐殖酸组分，离心分离，移取上清液，获得沉积物样品中腐殖酸-植酸磷组分提取液，备用。
将其中30mL提取液冷冻干燥，浓缩成粉末，冷冻保存，备用；剩余10mL提取液，小部分用ICP-OES仪器分析提取液中总磷(TP)和典型重金属Fe、Ca、Al、Mn等含量，剩余样品冷冻保存，备用。其中，TP含量为565mg/kg(以沉积物质量计算)；提取液中重金属浓度含量(提取液中浓度)为：Al(3.012mM)，Ca(18.035mM)，Fe(0.073mM)，Mn(0.076mM)。
31P-NMR实验、分析过程：冷冻干燥后提取液粉末，进一步加入2mL 1M NaOH-50mMEDTA重水(D2O)溶液溶解，手动摇晃并使用超声振荡充分溶解。加入过量的Na2S(溶解于D2O)沉淀样品中顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持样品溶液还原环境。处理后浓缩样品于4℃条件下，静置沉淀17-20h后，离心分离，上清液转移至核磁共振管(NMR管)中，采用安捷伦DD2型500MHz核磁共振仪(Agilent technologies)，仪器配备5mm OneNMR探头。分析过程，仪器条件如下：温度控制在25℃，脉冲为45℃(持续时间为5.3μS)，采集时间为0.6S，弛豫时间设置为5S，扫描次数为12000～15000次。
样品测完后，NMR管中直接加入有机磷标准物质，再次测定31P-NMR谱图的变化，以有机磷标准化合物的化学位移为参考，确定提取液中植酸磷的化学位移，在此基础上，依据已报道的相对化学位移，确定部分31P-NMR谱图中植酸磷异构体和其他肌醇磷酸盐。
测试后谱图采用MestRenova(MNova)软件(9.0.1版本，Mestrelab Research SL)处理，谱图的展宽(line broadening)设置为2Hz。
如图3和图4所示，沉积物提取液31P-NMR谱图结果：图3包含样品提取液中磷化合物所有峰：图3(a)滇池沉积物样品DC-2(0-10cm)；图3(b)滇池其他参考沉积物样品X；图3(c)沉积物样品X提取液中加入有机磷标准物质。谱图中磷化合物具体包括膦酸盐(Phosphonate)、正磷酸盐(Orthophosphate)、单酯磷(Orthophosphate Monoesters)、二酯磷(Orthophosphate Diesters)包括磷酯(Phospholipids)和DNA、焦磷酸盐(Pyrophosphate)。图4为31P-NMR谱图单酯磷区域，其中不同异构体的植酸磷、其他肌醇磷酸盐均分布于该区域，图4(d)滇池沉积物样品DC-2(0-10cm)；图4(e)滇池其他参考沉积物样品X；图4(f)沉积物样品X提取液中加入有机磷标准物质。
分析结果表明滇池沉积物[DC-2(0-10cm)]中肌醇磷酸盐包括D-手性-肌醇六磷酸盐(谱图中的Cle，chiro-IHP，2e/4a；Cla,chiro-IHP，2e/4a)、肌-肌醇六磷酸盐(*，myo-IHP)、新-肌醇六磷酸盐(N，neo-IHP)、D-肌-肌醇三磷酸盐(D，D-myo-ITP)、鲨-肌醇六磷酸盐(S，scyllo-IHP)。滇池沉积物[DC-2(0-10cm)]中肌醇磷酸总量：y1＝30.8mg/kg。
S3.肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸的含量y2；
如图1和图2所示，根据本发明设计方法原理和流程，包括如下步骤：(1)取0.5mL提取液，稀释后，加入1.0mol/L HCl溶液，调节pH至7.0±0.1，定容至10mL；
(2)同时移取2份提取液并进行稀释和调节pH，分别加入酶制备液，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，pH 7.0±0.1，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，pH 7.0±0.1；
(3)于37℃培养条件下，轻微振荡18h；
(4)培养后，降至室温，检测提取液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2＝4.0mg/kg。
所采用的植酸酶为提纯后的植酸酶，提纯步骤为：将200mg粗植酸酶溶解于20-40mL 70-85％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃下过夜，沉淀，初步提纯；离心分离后，将沉淀获得的植酸酶进一步溶解于10-15mL，浓度为10m mol/L，pH 5.15的醋酸钠缓冲溶液，装入透析袋，在1.5-2.5L缓冲溶液中透析16-20h，每隔2-4h更换一次透析液；离心分离后获得提纯后植酸酶沉淀，溶解于0.1mol/L，pH 5.15的醋酸钠缓冲溶液，获得酶活性0.1U/mL的备用酶试剂。
S4.取含量为y2＝4.0mg/kg的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1＝4.0mg/kg，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2＝4.0mg/kg；
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
基于滇池沉积物[DC-2(0-10cm)]样品NaOH提取液中肌醇磷酸盐的31P-NMR和酶水解分析获得肌醇磷酸盐含量y1与y2，可以推断中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X＝(y1-y2)-(x1-x2)＝(30.8mg/kg-4.0mg/kg)-(4.0mg/kg-4.0mg/kg)＝26.8mg/kg。滇池表层沉积物[DC-2(0-10cm)]肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用比例约为87.0％。
本实施例中结果表明，滇池沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用强烈，形成了肌醇磷酸盐-腐殖酸复合物具有抵抗酶水解结构，大大降低了肌醇磷酸盐的生物降解程度，即滇池沉积物中肌醇磷酸盐的生物有效性也大大降低了。肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用是滇池沉积物中肌醇磷酸盐长期埋藏与沉积物中的重要机理之一。这对于富营养化湖泊中磷，尤其是有机磷生物地球化学过程的进一步认识具有重要的作用，同时也是对湖泊中磷营养水平与富营养化响应机理、模型等提供基础科学依据。
实施例3
一种水环境中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：
S1.取沉积物样品，获取沉积物样品提取液；
沉积物样品提取液的提取过程包括：取沉积物样品，加入酸溶液震荡提取2h；再加入碱溶液，室温振荡处理15h，离心分离，得沉积物样品提取液。
酸溶液为盐酸溶液，浓度为0.05mol/L，沉积物样品与盐酸溶液的固液比(g/ml)为1:25。该步骤去除酸可溶解富里酸以及部分无机磷酸盐、以及去除部分影响31P-NMR核磁共振分析的Fe、Ca、Al等金属离子。
碱溶液为NaOH溶液，浓度为0.2mol/L，沉积物样品与NaOH溶液的固液比(g/ml)为1:25。
S2.沉积物样品提取液31P-NMR分析，分析得到沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐总量为y1；
31P-NMR分析的过程包括：取所述肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液冷冻干燥，浓缩成粉末样品；加入1mol/L NaOH-50mmol/L EDTA重水溶液溶解，手动摇晃并使用超声振荡充分溶解；所述重水中含有过量的Na2S，沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；处理后浓缩样品于4℃条件下，静置沉淀17h后，离心分离，上清液经31P-NMR分析分；
31P-NMR分析，室温温度为20℃，核磁共振的频率为500MHz以上，配备适合进行31P-NMR谱图分析的探头，扫描次数为12000～15000次；
采用分析处理软件定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐含量。
S3.沉积物样品提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2；
沉积物样品提取液有机磷的酶水解分析的具体步骤为：(1)取0.3mL沉积物样品提取液，稀释后，加入0.8mol/L HCl溶液，调节pH至7.0±0.1，定容至10mL；
(2)同时移取2份提取液并进行稀释和调节pH，分别加入\酶制备液，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸混合液，pH 7.0±0.1，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸混合酶液，pH 7.0±0.1；
(3)于37℃培养条件下，轻微振荡15h；
(4)培养后，降至室温，检测提取液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
S4.取含量为y2的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2；
酶水解分析的具体步骤为：取肌醇磷酸盐溶液样品两份，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，
样品经培养后，检测沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X＝(y1-y2)-(x1-x2)。
其中，植酸酶为提纯后的植酸酶，提纯的具体步骤为：将200mg粗植酸酶溶解于20mL70-85％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃下过夜，结晶沉淀，初步提纯；离心分离后，将结晶沉淀获得的植酸酶进一步溶解于10mL，浓度为10m mol/L，pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液，装入透析袋，在1.5L缓冲溶液中透析16h，每隔2h更换一次透析液；离心分离弃去沉淀物后获得提纯后植酸酶溶液，上清液稀释于0.1mol/L，pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液，获得酶活性0.05-0.20U/mL的备用酶试剂。
本实施例的31P-NMR分析还包括加标沉积物样品提取液的分析，具体为：向沉积物样品提取液中，加入适量肌醇六磷酸盐标准样品以及包括亚甲基二磷酸盐(MDPA)、葡萄糖6磷酸盐(G6P)、葡萄糖1磷酸盐(G1P)、α-甘油磷酸盐(α-Gly)、β-甘油磷酸盐(β-Gly)、单磷酸腺苷(AMP)、胆碱磷酸(Pcho)和二酯磷DNA-P的有机磷标准样品，再次分析加标后样品提取液31P-NMR谱图。采用MestReNova(Mestrelab Research SL)等核磁谱图分析处理软件，对比沉积物样品提取液和加标沉积物样品提取液31P-NMR谱图，并结合有机磷化合物31P-NMR谱图中相对化学位移，定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐总量。
本实施例的分析方法还包括对沉积物样品提取液中总磷、Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析。Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析，为提取液中加入过量Na2S的基础。加入过量的Na2S(溶解于D2O)沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；也是认识提取液基本性质的基本参数。
实施例4
一种水环境中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：
S1.取沉积物样品，获取沉积物样品提取液；
沉积物样品提取液的提取过程包括：取沉积物样品，加入酸溶液震荡提取2-4h；再加入碱溶液，室温振荡处理20h，离心分离，得沉积物样品提取液。
酸溶液为盐酸溶液，浓度为0.12mol/L，沉积物样品与盐酸溶液的固液比(g/ml)为1:15。该步骤去除酸可溶解富里酸以及部分无机磷酸盐、以及去除部分影响31P-NMR核磁共振分析的Fe、Ca、Al等金属离子。
碱溶液为NaOH和KOH的混合溶液，混合溶液中NaOH浓度为0.2mol/L，KOH的浓度为0.1mol/L，沉积物样品与碱溶液的固液比(g/ml)为1:15。
S2.沉积物样品提取液31P-NMR分析，分析得到沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐总量为y1；
31P-NMR分析的过程包括：取所述肌醇磷酸盐-腐殖酸提取液冷冻干燥，浓缩成粉末样品；加入1mol/L NaOH-50mmol/L EDTA重水溶液溶解，手动摇晃并使用超声振荡充分溶解；所述重水中含有过量的Na2S，沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；处理后浓缩样品于4℃条件下，静置沉淀20h后，离心分离，上清液经31P-NMR分析分；
31P-NMR分析，室温温度为20-25℃，核磁共振的频率为500MHz以上，配备适合进行31P-NMR谱图分析的探头，扫描次数为12000～15000次；
采用分析处理软件定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐含量。
S3.沉积物样品提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2；
沉积物样品提取液有机磷的酶水解分析的具体步骤为：(1)取1mL沉积物样品提取液，稀释后，加入1.2mol/L HCl溶液，调节pH至7.0±0.1，定容至10mL；
(2)同时移取2份提取液并进行稀释和调节pH，分别加入\酶制备液，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸混合液，pH 7.0±0.1，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸混合酶液，pH 7.0±0.1；
(3)于37℃培养条件下，轻微振荡20h；
(4)培养后，降至室温，检测提取液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
S4.取含量为y2的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2；
酶水解分析的具体步骤为：取肌醇磷酸盐溶液样品两份，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，
样品经培养后，检测沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X＝(y1-y2)-(x1-x2)。
其中，植酸酶为提纯后的植酸酶，提纯的具体步骤为：将200mg粗植酸酶溶解于40mL 85％饱和度的硫酸铵溶液，在4℃下过夜，结晶沉淀，初步提纯；离心分离后，将结晶沉淀获得的植酸酶进一步溶解于15mL，浓度为10m mol/L，pH 5.5的醋酸钠缓冲溶液，装入透析袋，在2.5L缓冲溶液中透析20h，每隔4h更换一次透析液；离心分离弃去沉淀物后获得提纯后植酸酶溶液，上清液稀释于0.1mol/L，pH 5.5的醋酸钠缓冲溶液，获得酶活性0.05-0.20U/mL的备用酶试剂。
本实施例的31P-NMR分析还包括加标沉积物样品提取液的分析，具体为：向沉积物样品提取液中，加入适量肌醇六磷酸盐标准样品以及包括亚甲基二磷酸盐(MDPA)、葡萄糖6磷酸盐(G6P)、葡萄糖1磷酸盐(G1P)、α-甘油磷酸盐(α-Gly)、β-甘油磷酸盐(β-Gly)、单磷酸腺苷(AMP)、胆碱磷酸(Pcho)和二酯磷DNA-P的有机磷标准样品，再次分析加标后样品提取液31P-NMR谱图。采用MestReNova(Mestrelab Research SL)等核磁谱图分析处理软件，对比沉积物样品提取液和加标沉积物样品提取液31P-NMR谱图，并结合有机磷化合物31P-NMR谱图中相对化学位移，定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐总量。
本实施例的分析方法还包括对沉积物样品提取液中总磷、Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析。Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析，为提取液中加入过量Na2S的基础。加入过量的Na2S(溶解于D2O)沉淀样品中影响31P-NMR谱图分辨率的顺磁性离子如Fe3+和Mn，并维持溶液还原环境；也是认识提取液基本性质的基本参数。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种水环境中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：
S1.取沉积物样品，获取沉积物样品提取液；
S2.沉积物样品提取液31P-NMR分析，分析得到沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐总量为y1；
S3.沉积物样品提取液的酶水解分析，分析获得沉积物样品提取液中酶水解肌醇磷酸盐的含量y2；
S4.取含量为y2的肌醇磷酸盐溶液，分别采用31P-NMR分析和酶水解分析肌醇磷酸盐的含量，采用31P-NMR分析得到肌醇磷酸盐的含量为x1，采用酶水解分析得到肌醇磷酸盐的含量为x2；
S5.沉积物中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量的计算
沉积物样品提取液中肌醇磷酸盐与腐殖酸相互作用含量X=（y1-y2）-(x1-x2)。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述酶水解分析的步骤包括：取沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品两份，第一份加入植酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合液，第二份加入磷酸二酯酶和碱性磷酸酶混合酶液，
样品经培养后，检测沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中释放正磷酸盐含量，分析二者的差值，获得沉积物样品提取液或肌醇磷酸盐溶液样品中酶水解肌醇磷酸盐的含量。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述植酸酶为提纯后的植酸酶。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述沉积物样品提取液的提取过程包括：取沉积物样品，加入酸溶液震荡提取2-4h；再加入碱溶液，室温振荡处理15-20h，离心分离，得沉积物样品提取液。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述酸溶液为盐酸溶液；所述碱溶液为NaOH溶液和KOH溶液中的一种或两种的混合。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述31P-NMR分析的过程包括：沉积物样品提取液的前处理过程：取所述沉积物样品提取液冷冻干燥，浓缩成粉末样品；加入NaOH-EDTA 重水溶液，手动摇晃并使用超声振荡使粉末样品充分溶解；
分析处理过程：经静置、离心分离得上清液，上清液经31P-NMR分析，采用分析处理软件定量分析沉积物样品中肌醇磷酸盐含量。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述重水溶液中含有过量的Na2S。
8.根据权利要求1-7任一项所述的分析方法，其特征在于，所述31P-NMR分析，室温温度为20-25oC，核磁共振的频率为500MHz以上，配备适合进行31P-NMR谱图分析的探头，扫描次数为12000~15000次。
9.根据权利要求1-7任一项所述的分析方法，其特征在于，所述31P-NMR分析还包括加标沉积物样品提取液的分析，所述加标沉积物样品提取液的分析具体为：向沉积物样品提取液中，加入适量肌醇六磷酸盐标准样品以及包括亚甲基二磷酸盐、葡萄糖6磷酸盐、葡萄糖1磷酸盐、α-甘油磷酸盐、β-甘油磷酸盐、单磷酸腺苷、胆碱磷酸和二酯磷DNA-P的有机磷标准样品，再次分析加标后样品提取液31P-NMR谱图。
10.根据权利要求1-7任一项所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法还包括对沉积物样品提取液中总磷、Fe、Ca、Al、Mg和Mn金属元素含量的分析。
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