CN107412771A - 靶向癌症干细胞的耐药性癌症疗法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向癌症干细胞的耐药性癌症疗法。本发明特别提供了用于预防、治疗和/或管理癌症的方法，所述方法包含向需要的对象给药治疗有效量的、减少或消除耐药性癌症干细胞群以及耐药性成熟癌细胞的偏亚砷酸钠。

Description

靶向癌症干细胞的耐药性癌症疗法

本申请为国际申请PCT/US2010/048308于2012年3月12日进入中国国家阶段、申请号为201080040472.X、发明名称为“靶向癌症干细胞的耐药性癌症疗法”的分案申请。

与相关申请的交叉引用

本申请要求2009年9月10日提交的美国临时申请号61/241,180的权益，所述临时申请在此以其全文引为参考。

技术领域

本发明提供了用于预防、治疗、减少或消除癌细胞的方法和药物组合物；更具体来说，本发明提供了用于减少或消除癌症干细胞和耐药性癌细胞的偏亚砷酸钠的预防和/或治疗有效的量或治疗方式。

背景技术

人类端粒酶是位于染色体末端处由(TTAGGG)_n六核苷酸重复序列构成的非编码DNA序列。在每次细胞分裂期间，端粒DNA(30-100bp)由于末端复制问题而丢失(BlackburnD.H.,Nature,408:53-56,2000和Phatak,P.等，Br.J.Pharmacol.,152:1003-11,2007)。端粒维持染色体完整性并防止缺陷基因的复制。因为染色体开始其寿命时具有有限量的端粒DNA，因此细胞在达到端粒临界长度之前只能经历有限的分裂数量。当正常细胞达到临界端粒长度时，它们退出细胞周期，并经历复制性衰老(Phatak,P.等，Br.J.Pharmacol.,152:1003-11,2007和Holt,S.E.等，Nature Biotechnol.,14:1734-1741,1996)。然而，在从正常到恶性细胞的肿瘤发生早期，端粒受到侵蚀，但是在绝大多数情况下，通过端粒酶的重激活，其随后维持在短但是稳定的长度(Blackburn D.H.,Nature,408:53-56,2000；Phatak,P.等，Br.J.Pharmacol,152:1003-11,2007和Holt,S.E.等，Nature Biotechnol.,14:1734-1741,1996)。端粒酶是核糖核蛋白反转录酶，其起到作为添加新的端粒重复序列的模板和催化亚基hTERT(人类端粒酶反转录酶)的作用。端粒酶允许癌细胞克服无限增殖的基本限制，并赋予其永生性。因此，端粒酶和端粒显现出可作为抗癌疗法的有希望的靶点(Phatak,P.等，Br.J.Pharmacol.,152:1003-11,2007；Chumsri,S.等，Curr.Opin.Mol.Ther.10:323-333,2008)。

开发癌症的有效和最终治愈性治疗的主要问题，在于癌症是非均质的并含有成熟细胞以及被称为干细胞的负责自我更新的细胞这一事实。目前的细胞毒性抗癌剂主要目的在于杀伤成熟细胞群，但是不能根除癌症干细胞。结果，癌症常常复发，并且那时肿瘤包含更具攻击性的干细胞样耐药性癌细胞(Chumsri,S.等，Curr.Opin.Mol.Ther.10:323-333,2008)。因此，对于能够抑制端粒酶或靶向端粒以减少或消除成熟和干细胞样癌细胞两者、包括耐药性癌症干细胞和成熟癌细胞的新治疗药剂和/或治疗方式，存在着需求。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了在患者中治疗难治型癌症的方法。这通过向患者单独或与其他抗癌剂组合地给药治疗有效量的偏亚砷酸钠(NaAsO₂或KML001)来实现。在某些实施方案中，偏亚砷酸钠以0.1至20mg的单位剂量每天一次或多次给药。在某些实施方案中，在用偏亚砷酸钠治疗后监测患者中干细胞群的存在。在某些其他实施方案中，在用偏亚砷酸钠治疗后，可以在长达四年或更长的时间段中对患者进行这样的监测。在某些实施方案中，难治型癌症是前列腺癌、肺癌、淋巴瘤或白血病。

在本发明的另一方面，提供了具有高于正常的血清IL-6水平的癌症患者的治疗方法，所述方法包含向患者给药治疗有效量的偏亚砷酸钠，并在最后的偏亚砷酸钠治疗后监测患者的血清IL-6水平。在完成偏亚砷酸钠治疗后，监测患者的IL-6水平可以定期执行长达四年或更长时间。

在本发明的另一方面，提供了在患有耐药型癌症的患者中提高抗癌剂的效能的方法，所述方法包含向患者给药治疗有效量的偏亚砷酸钠和癌症对其显示出耐药性的抗癌剂。

在本发明的另一方面，提供了使患者中的难治型癌细胞对癌细胞以前耐受的抗癌剂敏感的方法，所述方法包含向患者给药治疗有效量的每种偏亚砷酸钠和抗癌剂。可以在偏亚砷酸钠治疗方式给药之前、偏亚砷酸钠治疗方式完成之后或偏亚砷酸钠治疗方式给药期间给药抗癌剂。

在本发明的另一方面，提供了抑制或预防癌症在患者中复发的方法。所述方法包含在使用一种或多种抗癌剂的治疗方式完成之后，向患者给药治疗有效量的偏亚砷酸钠。在某些实施方案中，在用偏亚砷酸钠治疗之四年或更长时间后监测患者中癌症干细胞群的存在。监测可以定期执行长达四年或更长时间。

不受特定理论或机制的限制，癌症干细胞群的减少或消除，减少或消除了由癌症干细胞群产生的癌细胞群，并因此减少或消除了肿瘤的生长、肿瘤的主体尺寸、肿瘤的形成和/或转移肿瘤的形成。换句话说，癌症干细胞群的减少或消除阻止了肿瘤的形成、重新形成或生长和/或癌细胞转移。

根据一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包含向对象给药足以减少或消除耐药性癌症干细胞群的治疗有效量的偏亚砷酸钠。在与该方面相关的另一个实施方案中，癌症干细胞群对紫杉醇具有耐药性。在另一个相关实施方案中，癌症干细胞群对多烯紫杉醇具有耐药性。

附图说明

图1A显示了使用Hoechst 33342染料在DU145wt和Doc50耐药性细胞中检测侧群(side population)(SP)。图1B显示了通过流式细胞术测定的Pgp在野生型和耐药型克隆中的细胞表面表达。白色曲线＝PE(藻红蛋白)-同种型对照染色的细胞，灰色曲线＝Pgp阳性细胞。图1C显示了在野生型和紫杉烷耐药型DU145细胞中CD44染色(灰色曲线)与同种型对照(白色曲线)相比较的直方图。图1D显示了生长曲线，对在MTT测定中用多烯紫杉醇处理时紫杉醇、多烯紫杉醇耐药型和DU145wt细胞进行了比较。图1E显示了生长曲线，对在MTT测定中用KML001处理时紫杉醇、多烯紫杉醇耐药型和DU145wt细胞进行了比较。

图2A显示了使用DCV染料染色的DU145wt细胞的侧群。图2B显示了用BCRP/ABCG2抑制剂烟曲霉毒素C(FTC)处理的DU145wt细胞的侧群。图2C显示了用Pgp/ABCB1抑制剂维拉帕米处理的DU145wt细胞的侧群。

图3A显示了用正常(对照)培养基处理的DU145wt。图3B显示了用含有IC100浓度(13μΜ)的KML的培养基预处理72小时的DU145wt。

图4A显示了MTT增殖测定，其显示了用KML001处理的DU145/Pac200。图4B显示了MTT增殖测定，其显示了用GRN163L处理的DU145/Pac200。

图5A显示了只用DCV染料处理的DU145/Pac200细胞的侧群。图5B显示了用DCV和烟曲霉毒素C(FTC)处理的DU145/Pac200细胞的侧群。图5C显示了用DCV和维拉帕米处理的DU145/Pac200细胞的侧群。图5D显示了侧群测定，其显示了用IC100浓度下的KML001处理的DU145/Pac200。图5E显示了侧群测定，其显示了用IC100浓度下的GRN163L处理的DU145/Pac200。

图6A和6B显示了在产克隆测定中前列腺癌细胞(分别为DU145和DU145/pac200)的生长，其显示为在未处理的与KML001处理过的细胞系中相比形成的集落平均数。

图7是来自于用KML001处理5天的标准MTT的生长曲线，比较了来自于前列腺癌细胞系DU145/Pac200的未分拣细胞、SP-和SP+级份。

图8A和8B显示了通过定量RT-PCR测量的hTERT基因表达。A.在分拣过的级份中端粒酶mRNA转录本的水平：DU145/Pac200SP-和SP+具有相似的表达水平。B.在IC50和IC100下用KML001处理72小时后，通过标准MTT所测定到的hTERT表达水平降低了。

发明详述

本发明提供了用于在哺乳动物、特别是人类中预防、治疗和/或管理癌症的方法。方法包含向需要的对象给药治疗有效量的、减少或消除癌症干细胞群以及耐药性成熟癌细胞和耐药性癌症干细胞的偏亚砷酸钠。

本发明部分是基于下述发现，即一种处于I/II期临床试验的用于治疗前列腺癌的药物偏亚砷酸钠(KML001)，能够靶向端粒酶的催化亚基和端粒两者，并抑制未接触过化疗的和化疗耐药型前列腺癌细胞系的成熟和干细胞群的生长。

定义

当在本文中使用时，术语“癌症干细胞”是指可以是高度增殖性癌细胞的祖细胞的细胞。癌症干细胞具有重新生长肿瘤的能力，正如由其在免疫受损的哺乳动物例如小鼠中形成肿瘤，并典型地在免疫受损的哺乳动物例如小鼠中在随后的连续移植后形成肿瘤的能力所证实的。在典型情况下，癌症干细胞相对于肿瘤主体来说也生长较慢；也就是说，癌症干细胞一般是静息的。在某些但不是所有实施方案中，癌症干细胞可以占肿瘤的约0.1至20％。

当在本文中使用时，术语“抗癌剂”是指任何用于癌症的治疗，包括药物、免疫治疗、定向治疗、激素治疗、化疗，包括烷基化剂、抗代谢物、蒽环类药、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂和其他抗肿瘤药剂、手术和放疗。

当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指足以阻止癌症干细胞或癌症及其一种或多种症状的发生、复发或发作，增强或提高另一种疗法的预防效果，降低癌症的严重性和持续时间，改善癌症的一种或多种症状，阻止癌症的进展，引起癌症退行，和/或增强或提高另一种疗法的治疗效果的偏亚砷酸钠的量。在本发明的某些实施方案中，SMA的治疗有效量是在给药后有效获得一种、两种、三种或更多种下列结果的量：(1)减少或消除癌症干细胞群；(2)减少或消除癌细胞群；(3)降低肿瘤或赘生物的生长；(4)破坏肿瘤的形成；(5)根除、移除或控制原发、局部和/或转移的癌症；(6)降低死亡率；(7)增加无疾病、无复发、无进展和/或总体存活率、存活时间或比率；(8)增加响应率、响应持久性或响应或缓解中的患者数量；(9)肿瘤尺寸得以维持并且不增加或增加少于10％、或少于5％、或少于4％或少于2％；(10)增加缓解患者的数量；(11)增加缓解的长度或持续时间，(12)降低癌症的复发率；(13)增加癌症复发前的时间；(14)改善癌症相关症状和/或生活质量，以及(15)降低癌细胞的耐药性。

当在本文中使用时，术语“治疗有效方式”是指用于治疗和/或管理癌症或其症状的偏亚砷酸钠给药的剂量、定时、频率和持续时间的方式。在具体实施方案中，治疗方式获得一种或多种下述结果：(1)减少或消除癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞；(2)减少或消除癌细胞群；(3)降低肿瘤或赘生物的生长；(4)破坏肿瘤的形成；(5)根除、移除或控制原发、局部和/或转移的癌症；(6)降低死亡率；(7)增加无疾病、无复发、无进展和/或总体存活率；(8)增加响应率、响应持久性或响应或缓解中的患者数量；(9)降低住院治疗率；(10)减少住院治疗长度；(11)肿瘤尺寸得以维持并且不增加或增加少于10％、优选少于5％、优选少于4％、优选少于2％；以及(12)增加缓解患者的数量；(12)增加癌症患者的耐药性癌细胞、包括癌症干细胞对癌细胞所耐受的药物的敏感性。

当在本文中使用时，术语“对象”和“患者”可互换使用。当在本文中使用时，术语“对象”是指动物，优选为哺乳动物例如非灵长动物(例如奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长动物(例如猴和人)，最优选为人类。在一些实施方案中，对象是非人类动物例如家畜(例如马、猪或奶牛)和宠物(例如狗或猫)。在特定实施方案中，对象是老年人。在另一个实施方案中，对象是成年人。在另一个实施方案中，对象是儿童。在另一个实施方案中，对象是婴儿。

当在本文中使用时，术语“缓解”是指表现为不存在可检测的癌症，但具有癌活性恢复的可能性的对象健康状态。

癌症干细胞包含独特的肿瘤亚群(通常为0.1-10％左右，但是可多达0.1至20％或以上)，其相对于肿瘤的其余90％左右(即肿瘤主体)更具致瘤性，生长相对更慢或静息，并且通常与肿瘤主体相比相对更耐化疗。由于常规疗法和治疗方式在很大程度上被设计成攻击快速增殖的细胞(即构成肿瘤主体的癌细胞)，因此通常生长缓慢的癌症干细胞与生长更快的肿瘤主体相比，对常规疗法和治疗方式可能更具耐受性。癌症干细胞可以表现出使其相对耐化疗的其他特点，例如多重耐药性和抗凋亡途径。上面提到的特点构成了标准肿瘤学治疗方式不能在大多数患有晚期癌症的患者中确保长期益处，即不能充分靶向并根除癌症干细胞的关键原因。在一些情况下，癌症干细胞是肿瘤的起始细胞(即它是构成肿瘤主体的癌细胞的祖细胞)。

在大量不同癌症类型中已鉴定到癌症干细胞。例如，Bonnet等，使用流式细胞术能够分离到带有特定表现型CD34+CD38-的白血病细胞，并随后证实了是这些细胞(占给定白血病的<1％)而不是其余99+％的白血病主体，在转移到免疫缺陷小鼠中时能够重演它所源于的白血病。参见例如“人类急性髓性白血病被组织成源于原始造血细胞的层次结构”(Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originatesfrom a primitive hematopoietic cell)，Nat Med 3:730-737(1997)。也就是说，这些癌症干细胞在10,000个白血病细胞中少于1个，但这种低频群体能够启动人类白血病并将其连续转移到与原始肿瘤具有相同组织学表型的严重联合免疫缺陷/非肥胖糖尿病(NOD/SCID)小鼠中。

Cox等鉴定到人类急性成淋巴细胞性白血病(ALL)细胞中的少量亚级份，其具有CD34+/CD10-和CD34+/CD19-表型，并能够将ALL肿瘤移植到免疫受损小鼠中，即它们是癌症干细胞。相反，在使用ALL主体时，尽管在某些情况下注射了多10倍的细胞，但没有观察到小鼠的移植。参见Cox等，“急性成淋巴细胞性白血病祖细胞的表征”(Characterization ofacute lymphoblastic leukemia progenitor cells)，Blood 104(19):2919-2925(2004)。

已发现多发性骨髓瘤含有少量CD 138-的细胞亚群，它们相对于大量CD 138+骨髓瘤细胞主体群体具有更高的产克隆和致瘤能力。参见Matsui等，“产克隆多发性骨髓瘤细胞的表征“(Characterization of clonogenic multiple myeloma cells)，Blood 103(6):2332。作者得出结论，多发性骨髓瘤的CD138-亚群是癌症干细胞群。

Kondo等从C6-神经胶质瘤细胞系分离到少量细胞群，通过其自我更新以及在免疫受损小鼠中重演神经胶质瘤的能力将其鉴定为癌症干细胞群。参见Kondo等，“C6神经胶质瘤细胞系中少量癌症干细胞样细胞群的持久性“(Persistence of a small populationof cancer stem-like cells in the C6glioma cell line)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:781-786(2004)。在该研究中，Kondo等确定了癌细胞系含有癌症干细胞群，其赋予细胞系移植免疫缺陷小鼠的能力。

已显示，乳腺癌含有少量具有干细胞特征(带有表面标志物CD44+CD24低)的细胞群。参见Al-Hajj等，“致瘤乳腺癌细胞的远景鉴定”(Prospective identification oftumorigenic breast cancer cells)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:3983-3988(2003)。相当于总肿瘤细胞群的1-10％的少至200个这些细胞，能够在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤。相反，植入20,000个缺少这种表型的细胞(即肿瘤主体)不能重新生长肿瘤。

发现了源自于人类前列腺肿瘤的细胞亚群，其能够自我更新并重演其所源自的前列腺肿瘤的表型，因此构成了前列腺癌症干细胞群。参见Collins等，“致瘤前列腺癌症干细胞的远景鉴定”(Prospective Identification of Tumorigenic Prostate cancer stemcells)，Cancer Res 65(23):10946-10951(2005)。

Fang等从黑素瘤分离了具有癌症干细胞性质的细胞亚群。具体来说，该细胞亚群能够分化和自我更新。在培养中，亚群形成球形，但来自于病损处的分化更高的细胞级份更具黏附性。此外，当移植到小鼠中时，含有球状细胞的亚群比黏附性细胞更具致瘤性。参见Fang等，“黑素瘤中具有干细胞性质的致瘤亚群”(A Tumorigenic Subpopulation withStem Cell Properties in Melanomas)，Cancer Res 65(20):9328-9337(2005)。

Singh等鉴定到脑肿瘤干细胞。当分离并植入裸鼠中时，CD133+癌症干细胞与CD133-肿瘤主体细胞不同，形成了随后可以连续移植的肿瘤。参见Singh等，“人类脑肿瘤起始细胞的鉴定”(Identification of human brain tumor initiating cells)，Nature432:396-401(2004)；Singh等，“神经系统肿瘤中的癌症干细胞”(Cancer stem cells innervous system tumors)，Oncogene 23:7267-7273(2004)；Singh等，“人类脑肿瘤中的癌症干细胞的鉴定”(Identification of a cancer stem cells in human brain tumors)，Cancer Res.63:5821-5828(2003)。

因为常规癌症疗法靶向快速增殖细胞(即形成肿瘤主体的细胞)，因此据信这些治疗对于靶向和损伤癌症干细胞来说相对无效。事实上，已经显示癌症干细胞、包括白血病干细胞对常规化学治疗疗法(例如Ara-C、柔红霉素)以及更新的定向疗法(例如)相对耐受。来自各种肿瘤的对化疗具有耐受性的癌症干细胞的实例及其耐药性机制，描述在下表中。

例如，白血病干细胞生长相对缓慢或静息、表达多重耐药基因并利用其他抗凋亡机制-特点，其有助于它们的化疗耐受性。参见Jordan等，“作为干细胞生物学中的难题的最关键细胞的定向：通往白血病疗法”(Targeting the most critical cells:approachingleukemia therapy as a problem in stem cell biology)，Nat Clin Pract Oncol.2:224-225(2005)。此外，癌症干细胞凭借其化疗耐受性可能造成了治疗失败，并且可能在临床缓解后还继续存在于患者中，因此这些剩余的癌症干细胞可能造成了晚些时候的复发。参见Behbood等，“癌症干细胞将提供新的治疗靶点吗？”(Will cancer stem cellsprovide new therapeutic targets？)，Carcinogenesis 26(4):703-711(2004)。因此，预期靶向癌症干细胞将为癌症患者提供改进的长期结果。因此，需要被设计用于靶向癌症干细胞的新治疗剂和/或治疗方式来达到这一目标。

本发明通过向需要的对象给药治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式，实现了该目标。

癌症或赘生疾病，包括但不限于赘生物、肿瘤、转移肿瘤、白血病或任何以不受控制的细胞生长为特征的疾病或障碍，可以通过向需要的对象给药预防或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式来预防、治疗和/或管理。

本发明提供了通过减少或消除成熟癌细胞以及癌症干细胞、特别是耐药性癌症干细胞来预防、治疗和/或管理癌症的方法，所述方法包含向需要的对象给药预防或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式。在本发明的某些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞减少至少约5％。在某些实施方案中，在偏亚砷酸钠治疗完成后长达四年或更长时间，对癌症干细胞群的减少进行定期监测。因此，在具体实施方案中，本发明提供了在对象中防止癌症复发、治疗和/或管理癌症的方法，所述方法包含：(a)向需要的对象给药一剂或多剂有效量的偏亚砷酸钠；(b)在给药一定数量药剂之前、期间和/或之后以及在给药后续药剂之前监测对象中的癌症干细胞群；以及(c)如果需要，通过重复步骤(a)以检测到对象中癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞的至少5％的减少。如果在监测患者的癌症干细胞群的过程中，干细胞群的增加变得明显，执业医师可以相同或不同的剂量和/或用药方式再次向患者给药偏亚砷酸钠(单独或与另一种抗癌剂组合)。

偏亚砷酸钠可以以任何形式给药于患者，包括肠胃外(例如静脉内)、腹膜内或口服。每日剂量可以在一天内以一份或多份剂量给药。偏亚砷酸钠治疗方式可以包括每日剂量给药一日或多日，例如连续的1到10日或1到10日之间的任何日数，例如连续1到5、4、3或2日。可选地，剂量用药治疗方式可以包括将偏亚砷酸钠剂量在几日例如一周到一月的时间内，以不连续的方式例如每隔一日或每三日或四日给药，或连续治疗几日例如三日然后连续几日例如三日不治疗，并且重复该模式或者如果需要修改该模式。专业医师可以在患者健康、年龄、体重、药物耐受性等的基础上，容易地确定最有效的给药方式和患者获得最佳结果所需的偏亚砷酸钠剂量。

在某些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞减少至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。例如，在一些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞减少至少约5％-99％、5％-80％、5至40％、10％至99％、10至80％、10-60％、10％-40％、20至99％、20％-80％、20％-60％、20％-40％、50％-98％、50％-80％或60％-99％。

在其他实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞降低至原来的1.1分之一、1.2分之一、1.5分之一、2分之一、3分之一、4分之一、5分之一、10分之一、25分之一、50分之一、75分之一、100分之一、200分之一或1000分之一。在一些实施方案中，癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞的减少，在实施治疗方式的两周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、1年、2年、3年或4年后获得。检测癌症干细胞群和确定癌症干细胞量的变化的方法描述在下文中。如果在监测期间检测到癌症干细胞增加，可以用另一种偏亚砷酸钠治疗方式(与以前的治疗方式相同或不同)和/或其他抗癌剂对患者进行治疗。

在一些实施方案中，偏亚砷酸钠治疗的量或方式引起癌细胞群以及癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞的减少。在某些实施方案中，定期监测癌细胞群的减少，或者癌细胞群的减少与癌症干细胞群的减少。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在对象中预防、治疗和/或管理癌症的方法，所述方法包含：(a)向需要的对象给药一剂或多剂治疗有效量的偏亚砷酸钠；(b)在给药一定数量剂量之前、期间和/或之后以及在给药后续药剂之前监测对象中的癌症干细胞群和癌细胞群；以及(c)如果需要，通过重复步骤(a)以检测到对象中癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞和癌细胞群的至少5％的减少。

在某些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌细胞群减少至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。例如，在一些实施方案中，治疗方式导致癌细胞群减少约2％-98％、5％-80％、5至40％、10％至99％、10至80％、10-60％、10％-40％、20至99％、20％-80％、20％-60％、20％-40％、50％-98％、50％-80％或60％-99％。在其他特定实施方案中，治疗方式导致癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞降低至原来的1.1分之一、1.2分之一、1.5分之一、2分之一、3分之一、4分之一、5分之一、10分之一、25分之一、50分之一、75分之一、100分之一、200分之一或1000分之一。在一些实施方案中，癌细胞群的减少，在实施治疗方式的两周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年后获得。检测癌细胞群和测量癌细胞量的变化的方法描述在下文中。

在一些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致主体肿瘤尺寸减小以及癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞的减少。在某些实施方案中，定期监测主体肿瘤尺寸的减小，主体肿瘤尺寸的减少与癌症干细胞群包括耐药性癌症干细胞的减少，或者主体肿瘤尺寸的减小、癌症干细胞群的减少和癌细胞群的减少。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在对象中预防、治疗和/或管理癌症的方法，所述方法包含：(a)向需要的对象给药一剂或多剂有效量的偏亚砷酸钠；(b)在给药一定数量剂量之前、期间和/或之后以及在给药后续剂量之前监测对象中的癌症干细胞群和主体肿瘤尺寸；以及(c)如果需要，通过重复步骤(a)以检测到对象中癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞的至少5％的减少。

在某些实施方案中，偏亚砷酸钠的量或治疗方式导致癌症干细胞群包括耐药性癌症干细胞以及主体肿瘤尺寸减小至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％。例如，在一些实施方案中，治疗方式导致癌症干细胞群包括耐药性癌症干细胞以及主体肿瘤尺寸减小约2％-98％、5％-80％、5至40％、10％至99％、10至80％、10-60％、10％-40％、20至99％、20％-80％、20％-60％、20％-40％、50％-99％、50％-80％或60％-99％。在其他特定实施方案中，治疗方式导致癌症干细胞群包括耐药性癌症干细胞以及主体肿瘤尺寸减小至少1.1分之一、1.2分之一、1.5分之一、2分之一、2.5分之一、3分之一、4分之一、5分之一、10分之一、20分之一、25分之一、50分之一、75分之一、100分之一、200分之一或1000分之一。在一些实施方案中，癌症干细胞群包括耐药性癌症干细胞以及主体肿瘤尺寸的减少，在实施治疗方式的两周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年后获得。

多种已知方法可用于评估肿瘤的主体尺寸。这样的方法的非限制性实例包括成像方法(例如计算机断层扫描术(CT)、磁共振成像(MRI)、超声、X-射线成像、乳房造影术、PET扫描、放射性核素扫描、骨扫描)、可视方法(例如结肠镜检查、支气管镜检查、内窥镜检查)、身体检查(例如前列腺检查、乳腺检查、淋巴结检查、腹部检查、直肠检查、普通触诊)、血液化验(例如前列腺特异性抗原(PSA)化验、癌胚抗原(CEA)化验、癌抗原(CA)-125化验、甲胎蛋白(AFP)、肝功能化验)、骨髓分析(例如在血液恶性肿瘤的情况下)、组织病理学、细胞学和流式细胞术。

在一些实施方案中，可以通过基于从成像方法测定的肿瘤病损尺寸的评估来测定主体肿瘤尺寸。在特定实施方案中，评估按照“实体肿瘤中的响应评估判据(RECIST)准则”(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors(RECIST)Guidelines)来执行，所述准则公布在Therasse,P.等，“评估对实体肿瘤治疗的响应的新准则”(New Guidelines toEvaluate the Response to Treatment in Solid Tumors)，J.of the Nat.Cane.Inst.92(3),205-216(2000)中。例如，在特定实施方案中，选择对象中具有代表性主体肿瘤尺寸的病损，以便在基线时(治疗之前)当使用常规成像技术(例如常规CT扫描、PET扫描、骨扫描、MRI或X-射线)时它们的最长直径至少≥20mm，并且当使用螺旋CT扫描时选择在基线时最长直径至少≥10mm的病损。

在一些实施方案中，可以使用成像技术与血清标志物检测的组合来评估主体肿瘤尺寸的减小。这样的血清标志物的非限制性实例包括前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA)125和甲胎蛋白(AFP)。

本发明提供了在缓解对象中预防癌症复发的复发，所述方法包含向对象给药治疗或预防有效的偏亚砷酸钠的量或治疗方式。方法包含以等于或小于最大耐受剂量(MTD)或等于或小于“无明显损害作用水平”(NOAEL)的剂量向对象给药偏亚砷酸钠。偏亚砷酸钠的MTD典型地基于I期剂量递增试验的结果。在某些实施方案中，患者也用治疗有效量的第二种抗癌剂进行治疗，例如在缓解患者的第一线治疗中使用的抗癌剂。第二种抗癌剂可以在偏亚砷酸钠给药的同时、之后或之前给药。

在动物研究中测定的NOAEL常常被用于确定人类临床试验的最大推荐起始剂量。可以对NOAEL进行外推，以确定人体等效剂量(HED)。典型情况下，这种物种间的外推根据归一化到身体表面积的剂量(即mg/m²)来进行。在特定实施方案中，NOAEL在小鼠、仓鼠、大鼠、雪貂、豚鼠、兔、狗、灵长动物(猴、狨猴、鼠猴、狒狒)、微型猪(micropig)和小型猪中测定。关于使用NOAEL及其外推来确定人体等效剂量的讨论，参见美国卫生与人类服务部食品和药品管理局药物评估与研究中心(CDER)的“在成年健康志愿者中对疗法的初始临床试验中的最大安全起始剂量进行工业评估的准则”(Guidance for Industry Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers,U.S.Department of Health and Human Services Food andDrug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER))，Pharmacology and Toxicology，2005年7月。因此，在某些实施方案中，治疗方式包含以低于HED的剂量实施疗法。例如，本发明提供了在缓解对象中预防癌症复发的方法，所述方法包含向需要的对象给药预防或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式，方法包含以等于或小于HED的剂量向对象给药偏亚砷酸钠。

根据本发明，预防和/或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于患有或预期将发生癌症的对象(例如对特定癌症类型具有遗传易感性的对象，已暴露于致癌物的对象，新近诊断为患有癌症的对象，癌症治疗失败的对象，癌症复发的对象，或从特定癌症缓解的对象)。在具体实施方案中，对象处于缓解中或无癌症通过目前使用的技术来测量，所述技术包括但不限于身体检查(例如前列腺检查、乳腺检查、淋巴结检查、腹部检查、皮肤观察、普通触诊)、可视方法(例如结肠镜检查、支气管镜检查、内窥镜检查)、PAP涂片分析(宫颈癌)、粪便愈创木脂分析、血液检验(例如全血计数(CBC)化验、前列腺特异性抗原(PSA)化验、癌胚抗原(CEA)化验、癌抗原(CA)-125化验、甲胎蛋白(AFP)、肝功能化验)、核型分析、骨髓分析(例如在血液恶性肿瘤的情况下)、组织学、细胞学、痰液分析和成像方法(例如计算机断层扫描术(CT)、磁共振成像(MRI)、超声、X-射线成像、乳房造影成像、PET扫描、放射性核素扫描、骨扫描)。这样的对象以前可能进行或可能未进行过癌症治疗。

在一个实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于正经历或已经历手术以移除肿瘤、癌细胞或赘生物的对象。在具体实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式在移除肿瘤、癌细胞或赘生物的手术的同时或之后给药于对象。在另一个实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式在移除肿瘤或赘生物的手术之前给药于对象，而在一些实施方案中，在手术期间和/或之后给药于对象。

在具体实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于将要、正在或已经经历放疗的对象。在这些对象中包括已经接受化疗、激素治疗和/或生物治疗包括免疫治疗的对象，以及已经历手术的对象。

在另一个实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于将要、正在或已经接受激素治疗和/或生物治疗包括免疫治疗和/或定向治疗的对象。在这些对象中包括已接受化疗和/或放疗的对象以及已经历手术的对象。

在某些实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于不能或难以用一种或多种疗法治疗的对象。在一个实施方案中，癌症难以用疗法治疗是指至少一些显著部分的癌细胞未被杀伤或其细胞分裂未停止。确定癌细胞是否难治，可以在体内或体外，通过本技术领域已知的用于测定疗法对癌细胞的效果的任何方法，使用在这种情形下本技术领域接受的“难治”的意义来进行。

在特定实施方案中，治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式被给药于细胞因子IL-6水平升高的患者，所述水平升高已与癌细胞对不同治疗方式例如化疗和激素治疗发生耐受性相关联。

按照本发明，可以预防、治疗和/或管理任何癌症类型。可以按照本发明来预防、治疗和/或管理的癌症的非限制性实例包括：白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病例如成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白细胞性白血病以及骨髓异常增生综合征(MDS)；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多发性骨髓瘤，例如但不限于冒烟型多发性骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；意义未明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、Ewing肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质细胞瘤、非神经胶质肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于导管癌、腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液癌、乳腺小管癌、乳腺乳头状癌、派杰氏病和炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库兴氏病、促乳素分泌肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤例如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，以及成视网膜细胞瘤；阴道癌，例如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌，例如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和派杰氏病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤；食管癌，例如但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、黏液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈状(息肉状)、溃疡性、浅表扩散性、弥散扩散性、恶性淋巴瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤；胆囊癌例如腺癌；胆管腺瘤，例如但不限于乳头状、结节性和弥散性；肺癌，例如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于胚细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)性、精母细胞性、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌，例如但不限于前列腺上皮内瘤、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底细胞癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、黏液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、肢端黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；肾母细胞瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、腺肉瘤。此外，癌症包括黏液肉瘤、骨源性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。

预防和/或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式也可用于治疗、预防和/或管理各种癌症或其他异常增殖性疾病，包括(但不限于)下列：包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤的癌；包括鳞状细胞癌；淋巴性谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤；髓性谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。在一些实施方案中，使用本发明的方法预防、治疗和/或管理与凋亡的畸变相关的癌症。这样的癌症包括但不限于滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，以及癌前期病变例如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合征。在具体实施方案中，使用本发明的方法预防、治疗和/或管理皮肤、肺、肝、骨、脑、胃、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰腺、卵巢和/或子宫的恶性肿瘤或增殖异常变化(例如化生和增生)或过度增殖障碍。在其他具体实施案中，使用本发明的方法预防、治疗和/或管理肉瘤或黑素瘤。

在某些实施方案中，按照本发明预防、治疗和/或管理的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。

可以按照本发明的方法预防、治疗和/或管理的白血病和其他血液癌症的非限制性实例，包括急性成淋巴细胞性白血病“ALL”、急性成淋巴细胞性B-细胞白血病、急性成淋巴细胞性T-细胞白血病、急性髓细胞白血病“AML”、急性早幼粒细胞白血病“APL”、急性单核细胞性白血病、急性红白细胞性白血病、急性巨核细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性肺淋巴细胞性白血病、急性未分化白血病、慢性髓细胞性白血病“CML”、慢性淋巴细胞性白血病“CLL”、骨髓增生异常综合征“MDS”和毛细胞白血病。

可以按照本发明的方法预防、治疗和/或管理的淋巴瘤的非限制性实例，包括霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病和真性红细胞增多症。

在另一个实施方案中，按照本发明预防、治疗和/或管理的癌症是实体肿瘤。可以按照本发明的方法预防、治疗和/或管理的实体肿瘤的实例，包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

在实施方案中，给药于对象以在患者中预防、治疗和/或管理癌症的偏亚砷酸钠的剂量以患者的体重计为500mg/kg或以下，例如250mg/kg或以下、100mg/kg或以下、95mg/kg或以下、90mg/kg或以下、85mg/kg或以下、80mg/kg或以下、75mg/kg或以下、70mg/kg或以下、65mg/kg或以下、60mg/kg或以下、55mg/kg或以下、50mg/kg或以下、45mg/kg或以下、40mg/kg或以下、35mg/kg或以下、30mg/kg或以下、25mg/kg或以下、20mg/kg或以下、15mg/kg或以下、10mg/kg或以下、5mg/kg或以下、2.5mg/kg或以下、2mg/kg或以下、1.5mg/kg或以下或1mg/kg或以下。例如，偏亚砷酸钠可以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.25mg/kg至约5mg/kg范围内的量，每天给药1至5次。

在另一个实施方案中，给药于对象以在患者中预防、治疗和/或管理癌症的偏亚砷酸钠的剂量，是0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg的单位剂量。

在某些实施方案中，给药于对象以在患者中预防、治疗和/或管理癌症的偏亚砷酸钠的剂量，以对象的体重计，在0.01至10g/m²的范围内，更典型情况下在0.1g/m²至7.5g/m²的范围内。在一个实施方案中，给药于对象的剂量以对象的身体表面积计，在0.5g/m²至5g/m²或1g/m²至5g/m²的范围内。

在一些实施方案中，预防和/或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式与一种或多种其他疗法组合使用。在组合疗法中使用的一种或多种其他疗法的剂量，可以低于已经用于或目前正用于在患者中预防、治疗和/或管理癌症的剂量。目前用于预防、治疗和/或管理癌症的一种或多种其他疗法的推荐剂量可以从本技术领域的任何参考文献获得，包括但不限于Hardman等主编的《Goodman&Gilman治疗学的药理基础》(Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis Of Therapeutics)第10版，Mc-Graw-Hill,New York,2001；《医生桌面参考》(Physician's Desk Reference)(第60版，2006)，在此以其全文引为参考。

其他癌症疗法的实例包括但不限于：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿可达佐、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波毒素、醋酸阿美蒽醌、氨基格鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、蒽环霉素、安曲霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷(维达扎)、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、二膦酸盐类(例如帕米膦酸盐(Aredria)、氯曲磷酸钠(Bonefos)、唑来膦酸(Zometa)、阿仑膦酸盐(Fosamax)、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、斯孟膦酸盐、利塞膦酸盐和替鲁膦酸盐)、比折来新、硫酸博莱霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡米诺霉素、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷(Ara-C)、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨(Dacogen)、去甲基化药剂、右奥马铂、地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁、亚丝醌、多烯紫杉醇、阿霉素、盐酸阿霉素、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯、偶氮霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、EphA2抑制剂、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表阿霉素、厄布洛唑、盐酸表柔比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾托卜宁、盐酸法倔唑、法扎拉滨、维甲酰酚胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC-I)、羟基脲、盐酸依达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、甲磺酸伊马替尼(Gleevec、Glivec)、白介素II(包括重组白介素II或rIL2)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来那度胺(Revlimid)、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、抗CD2抗体(例如希普利珠单抗(MedImmune Inc.，国际公开号WO02/098370，在此以其全文引为参考))、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯基嘌呤、甲氨喋呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托卡星、丝裂红素、米托洁林、米托马星、丝裂霉素、丝裂帕菌素、米托坦、盐酸米托恩醌、霉酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马铂、奥沙利铂、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶、佩里霉素、戊氮芥、硫酸培洛霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、松龙苯芥、盐酸甲基苄肼、嘌呤霉素、盐酸嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、斯帕磷酸钠、司帕霉素、盐酸螺旋锗、螺莫司汀、螺铂、链黑菌素、链脲佐菌素、磺氯苯脲、他利霉素、替可加兰钠、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑羧胺核苷、替拉扎明、柠檬酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西瑞宾、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替哌、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁、盐酸佐柔比星。在某些实施方案中，偏亚砷酸钠可以与顺铂组合用于治疗原发或继发癌症，例如肺癌。

偏亚砷酸钠和一种或多种其他抗癌疗法可以分开、同时或相继给药，或以最适合于患者耐受的任何方式给药。药剂的组合可以通过相同或不同的给药途径给药于对象。在可选实施方案中，两种或更多种预防或治疗药剂在单一组合物中给药。

作为预防和/或治疗有效的偏亚砷酸钠量或治疗方式的一部分，可以监测癌症干细胞群以评估疗法或治疗方式的效能，以用作维持或改变疗法以及确定癌症对象预后的基础。在一个实施方案中，对经历治疗方式的对象进行监测，以评估治疗方式是否在对象中引起癌症干细胞群、包括耐药性癌症干细胞减少。

可以使用本技术领域的专业人员已知的标准技术监测/评估癌症干细胞的量。可以通过例如从对象获取样品例如组织/肿瘤样品、血液样品或骨髓样品并检测样品中的癌症干细胞，来监测癌症干细胞。样品中癌症干细胞的量(其可以表示成例如占全部细胞或全部癌细胞的百分率)，可以通过检测癌症干细胞上抗原的表达来评估。可以使用本技术领域的专业人员已知的技术来测量这些活性。抗原表达可以通过例如免疫测定法来测定，包括但不限于western印迹、免疫组织化学、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、免疫荧光、蛋白A免疫测定法、流式细胞术和FACS分析。在这样的情况下，来自于对象的测试样品中癌症干细胞的量，可以通过将结果与参比样品(例如来自于没有可检测癌症的对象的样品)中干细胞的量、或与预定参比范围、或与患者自身在较早时间点处(例如治疗之前或期间)的干细胞量进行比较来确定。

在具体实施方案中，从患者获得的样品(例如血液或肿瘤组织)中的癌症干细胞群通过流式细胞术来测定。这种方法利用某些表面标志物在癌症干细胞上相对于肿瘤主体上的差异表达。可以使用标记的抗体(例如荧光抗体)与样品中的细胞进行反应，随后用过FACS方法对细胞进行分拣。在一些实施方案中，为了确定样品中癌症干细胞的量利用了细胞表面标志物的组合。例如，可以使用阳性和阴性细胞分拣两者来评估样品中癌症干细胞的量。特定肿瘤类型的癌症干细胞可以通过评估标志物在癌症干细胞上的表达来确定。在某些实施方案中，肿瘤带有下表中显示的癌症干细胞及其相关标志物，该表提供了与各种癌症类型相关的癌症干细胞表型的非限制性列表。

其他癌症干细胞标志物包括但不限于CD123、CLL-1、SLAM(信号传导淋巴细胞活化分子家族受体；参见Yilmaz等，“SLAM家族标志物在来自于老年和重构小鼠的造血干细胞之间是保守的并显著增加它们的纯度”(SLAM family markers are conserved amonghematopoietic stem cells from old and reconstituted mice and markedlyincrease their purity)，Hematopoiesis 107:924-930(2006))例如CD150、CD244和CD48的组合，以及在Bergstein的美国专利No.6,004,528、待决的美国专利申请系列号09/468,286和美国专利申请公开号2006/0083682、2007/0036800、2007/0036801、2007/0036802、2007/0041984、2007/0036803和2007/0036804中公开的标志物，每个上述专利和专利申请在此以其全文引为参考。参见例如美国专利No.6,004,528的表1和美国专利申请系列号09/468,286的表1、2和3，以及美国专利申请公开号2006/0083682、2007/0036800、2007/0036801、2007/0036802、2007/0041984、2007/0036803和2007/0036804。

在使用样品的流式细胞术的某些实施方案中，可以使用Hoechst染料方案来鉴定肿瘤中的癌症干细胞。简单来说，将两种不同颜色(典型为红色和蓝色)的Hoechst染料与肿瘤细胞温育。癌症干细胞与主体肿瘤癌细胞相比在其表面上过表达染料外排泵，所述外排泵使这些细胞将染料泵回到细胞外。主体肿瘤细胞大部分具有较少的这些泵，因此对染料相对呈阳性，这可以通过流式细胞术检测。典型情况下，当观察整个细胞群时，出现染料阳性(“染料+”)对染料阴性(“染料-”)细胞的梯度。癌症干细胞包含在染料-或染料低(染料低)群体中。对于使用Hoechst染料方案表征干细胞或干细胞群的实例，参见Goodell等，“急性髓性白血病中具有固有药物外排泵能力的白血病干细胞”(A leukemic stem cell withintrinsic drug efflux pump capacity in acute myeloid leukemia)，Blood,98(4):1166-1173(2001)和Kondo等，“C6神经胶质瘤细胞系中少量癌症干细胞样细胞群的持久性”(Persistence of a small population of cancer stem-like cells in the C6 gliomacell line)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:781-786(2004)。通过这种方式，可以使用流式细胞术来测量治疗前和治疗后的癌症干细胞量，以评估由给定疗法或治疗方式引起的癌症干细胞量的变化。

在其他实施方案中，将从患者获得的样品(例如肿瘤或正常组织样品、血样或骨髓样品)在体外系统中进行培养，以评估癌症干细胞群或癌症干细胞的量。例如，可以将肿瘤样品在软琼脂上培养，并可以将癌症干细胞的量与样品产生可以目测计数的细胞集落的能力相关联。集落形成被认为是干细胞含量的代用度量，因此可用于定量癌症干细胞的量。例如，对于血液癌症来说，集落形成测定法包括集落形成细胞(CFC)测定法、长期培养起始细胞(LTC-IC)测定法和悬浮培养起始细胞(SC-IC)测定法。通过这种方式，集落形成或相关测定法例如细胞系的长期永存/传代，可用于测量治疗前和治疗后癌症干细胞的量，以评估由给定疗法或治疗方式引起的癌症干细胞量的变化。

在具体实施方案中，按照包含下列步骤的方法在对象中对癌症干细胞的量进行体内检测：(a)向对象给药有效量的、与癌症干细胞上存在的细胞表面标志物特异性结合的、标记的癌症干细胞标志物结合药剂，以及(b)在足以允许标记药剂集中在对象中表达癌症干细胞表面标志物的位点处的时间间隔后，检测对象中的标记药剂。根据这种实施方案，通过本技术领域任何适合的方法，例如肠胃外(例如静脉内)或腹膜内方法，向对象给药癌症干细胞表面标志物结合药剂。根据这种实施方案，药剂的有效量是允许在对象中检测药剂的量。该量将随着具体对象、使用的标记物和使用的检测方法而变。例如，在本技术领域中应该理解，对象的体重和使用的成像系统将决定使用成像手段在对象中检测药剂所需的标记药剂的量。在用于人类对象的放射性标记药剂的情况下，给药的标记药剂的量根据放射活性来计算，例如约5至20毫居里的99Tc。在标记药剂给药后足以允许标记药剂集中在对象中表达癌症干细胞表面标志物的位点处的时间间隔，将随着几种因素而变，例如使用的标记物类型、给药方式和所成像的对象身体部位。在具体实施方案中，充足的时间间隔是6至48小时、6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，时间间隔是5至20日或5至10日。对象中标记的癌症干细胞表面标志物结合药剂的存在可以使用本技术领域已知的成像手段来检测。总的来说，使用的成像手段取决于所使用的标记物类型。专业技术人员将能够确定用于检测特定标记物的适合手段。可以使用的方法和装置包括但不限于计算机断层扫描(CT)、全身扫描例如正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)、能够检测和定位荧光标记物的成像仪和超声波扫描术。在特定实施方案中，将癌症干细胞表面标志物结合药剂用放射性同位素标记，并使用辐射响应性外科仪器在患者中检测(Thurston等，美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中，将癌症干细胞表面标志物结合药剂用荧光化合物进行标记，并使用荧光响应性扫描仪器在患者中检测。在另一个实施方案中，将癌症干细胞表面标志物结合药剂用正电子发射金属进行标记，并使用正电子发射断层扫描术在患者中检测。在另一个实施方案中，将癌症干细胞表面标志物结合药剂用顺磁性标记物进行标记，并使用磁共振成像(MRI)在患者中检测。

可以使用本技术领域的专业人员已知的能够检测和/或定量癌症干细胞的任何体外或体内(离体)测定法来监测癌症干细胞，以便评估偏亚砷酸钠的预防和/或治疗用途。然后可以使用这些测定的结果来可能的维持或改变症疗法或治疗方式。

在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请，在此引入本说明书中作为参考，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体并单独地指明在本文中引为参考。本文中参考文献的引用或讨论不应被解释为承认其是本发明的现有技术。

具体实施方式

在本文描述的实施例中使用了下列材料和方法。

细胞系：DU145wt、DU145/Pac200和DU145/Doc50细胞由马里兰大学(Universityof Maryland)UMGCC的Hussain博士提供。细胞系按照推荐方法，在增补有5％FBS、1％抗生素的1：1DMEM/F12培养基(Invitrogen)中培养，并在37℃和5％CO₂的标准条件下生长。紫杉醇和多烯紫杉醇耐药性克隆在药物选择压力下维持。

药物：KML001(偏亚砷酸钠)从Sigma-Aldrich Co.获得(CAS#7784-46-5)；在PBS中制备50mM的药物储用液，并将等份试样储存在-20℃下。GRN163L从Geron Corp.(MenloPark,CA)获得。在PBS中制备10mM药物工作储用液。

MTT增殖测定法：收获指数生长的细胞并将其铺板于96孔板中(对于DU145wt来说1,500个/孔，对于DU145/Pac200和DU145/Doc50来说2,000-3,000个/孔)。待测试药物以0.01μΜ至100μΜ的浓度添加，以评估它们的生长抑制潜力。在连续暴露于药物5天后，向板加入活体染料3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)。使用Gen5软件和Synergy2读板器在550nm处测量由活细胞引起的MTT向紫色甲腊的转变。使用MicrosoftExcel产生生长曲线，并确定生长抑制浓度50(IC50)和100％。

细胞系的预处理：在进行侧群测定之前，将DU145wt和DU145/Pac200细胞系，在用KML或GRN163L以其IC50和IC100值(单位为μΜ)处理的培养基中培养48(PAC 200)或72小时(DU145wt)。

侧群测定：对合生前(Sub-confluent)活细胞进行计数(需要10⁶个/管)并用H33343或Dye Cycle Violet(DCV)染色；这两种染料区分干细胞(侧群)和成熟细胞。使用了由Goodell等描述的流程(Goodell,M.A.等，J.Exp.Med.,183:1797-806,19966)。每次分析三份样品。在这些样品中，一份样品只用DCV处理，另一份用DCV和50μΜ维拉帕米(PgP抑制剂)处理，最后一份用DCV和10μΜ烟曲霉毒素C(FTC，BCRP抑制剂)处理。然后使用流式细胞术对样品进行读取和分析。

流式细胞术：样品在BDLSR II流式细胞仪上读数。405nM紫色激光激发DCV染料，根据细胞差异产生不同波长。检测器在450/50(蓝色)和680/30(红色)处截取发射的波长，并将数据分别作图在散点图上。CD44和Pgp染色使用PE(Pgp)或APC(CD44)标记的抗体及其同种型对照，按照常规表位标记程序来进行。

实施例1

在癌细胞系中鉴定癌症干细胞

在本研究中，在下列前列腺癌细胞系中鉴定了癌症干细胞(也称为侧群(SP))和定义SP的ATP结合性盒(ABC)转运蛋白：DU145wt(亲本)，DU145/Pac200(紫杉醇耐药性)和DU145/Doc50(多烯紫杉醇耐药性)。

所有检查的前列腺癌细胞系：DU145wt、DU145/Pac200、DU145/Doc50都显示出侧群(图1、3、5)。重要的是，发现DU145/Pac200和DU145/Doc50细胞具有占其总细胞群约40至60％的非常大的侧群(图1、5)，这与我们关于耐药性细胞可以由癌症干细胞产生的假设相一致。

实施例2

耐药性癌症干细胞和成熟癌细胞对偏亚砷酸钠的敏感性

将紫杉烷耐药性细胞系DU145/Pac200(高紫杉醇耐药性)和DU145/Doc50(高多烯紫杉醇耐药性)与亲代细胞系DU145以及雄激素耐药性癌细胞系(LNCaP/C81和LAPC-4/CSS100)及其相应的激素响应性亲代细胞系(LNCaP和LAPC-4)一起，测试了它们对偏亚砷酸钠的响应。从标准MTT测定法得到的生长曲线显示，那些细胞系无论其耐药性如何，都对偏亚砷酸钠具有灵敏度相似的响应(表1)。

使用DCV侧群分析，分析了每种前列腺细胞系中癌症干细胞样细胞级份的存在。在耐药性细胞系中鉴定到基于Dye Cycle Violet(DCV)染料外流的侧群(SP)，证实了以前对DU145/Doc50使用Hoechst 33342染料的结果(未显示)。SP的存在是基于药物外排泵例如P-糖蛋白或BCRP的表达，所述外排泵对阻止标准细胞毒性疗法发挥作用负有责任。对标准化疗药剂紫杉醇和多烯紫杉醇具有耐药性的DU145前列腺癌细胞系具有最高SP(表1)。尽管激素耐药性细胞系LnCaP/C81及其亲代细胞系也显示出可以用药物外排泵抑制剂维拉帕米(P-gP抑制剂)或烟曲霉毒素C(FTC，BCRP抑制剂)抑制的明显侧群，但通过这种方法没有检测到LAPC-4及其激素耐药性衍生株的明确侧群。由于激素疗法例如雄激素合成抑制剂不是药物外排泵的底物，因此这些发现并不令人吃惊。

表1

前列腺癌细胞系和用PgP和BRCP转运蛋白抑制剂(维拉帕米和烟曲霉毒素C，FTC)预处理的细胞中DCV侧群的百分数、对KML001的敏感性、端粒长度(TRF)和相对端粒酶活性(TA)。

实施例3

耐药性癌症干细胞中的端粒酶活性和端粒长度的测定

在本研究中，确定了高紫杉醇和多烯紫杉醇耐药性DU145/Pac200和DU145/Doc50细胞系与其亲代药物敏感性DU145细胞相比，具有相似的端粒酶活性和端粒长度(表1)。

表1

人类前列腺癌细胞系中紫杉烷的IC50值和端粒长度

TA＝端粒酶活性

TRF＝端粒限制性片段

实施例4

维拉帕米对耐药性癌症干细胞的影响

Pac和Doc耐药性DU145细胞的SP被维拉帕米抑制，但是不被FTC抑制，表明Pgp(P-糖蛋白)是负责SP出现的优势ABC转运蛋白(图1、5)。这与这些细胞的Pgp以及前列腺癌特异性干细胞标志物CD44的高表面表达相一致(图1B)。

实施例5

KML001和GRN163L对癌细胞和癌症干细胞的影响

在本研究中，将端粒酶抑制剂KML001(偏亚砷酸钠)与目前正进行临床试验的端粒酶抑制剂GRN163L对DU145wt、DU145/Pac200和DU145/Doc50细胞的影响进行了比较。

用KML001或GRN163L处理的DU145wt、DU145/Doc50和DU145/Pac200的MTT测定揭示出显著的生长抑制(表1，图1、4)。在耐药性和亲代DU145细胞中，KML001同等有效(表1，图1D)。

实施例6

偏亚砷酸钠和GRN163L对癌症干细胞的影响

在本研究中，调查了偏亚砷酸钠和GRN163L当以其IC100对DU145wt和DU145/Pac200预处理48-72小时时根除DU145wt和DU145/Pac200的侧群的能力。

本研究证实，用KML001以将细胞生长抑制到100％的药物浓度处理DU145和DU145/Pac200细胞，能够急剧减少SP(图3B、5D)。然而，成熟细胞(非SP)也被根除。使用特异性(只对端粒酶)抑制剂GRN163L来验证偏亚砷酸钠对SP的影响。GRN163L也显著减少SP，但是不能以与KML001相同的程度杀伤非SP细胞(图5)。

总的来说，数据证实偏亚砷酸钠能够有效根除成熟的耐药性癌细胞和耐药性癌症干细胞。

实施例7

耐药性癌细胞群中分离SP/对KML001的响应

所有前列腺癌细胞系、紫杉烷耐药性和雄激素耐药性癌细胞系和激素响应性亲代细胞，对KML001的响应具有相似敏感性(IC50为1-6μΜ)。使用沿用已久的肿瘤产克隆干细胞测定法测试了对紫杉醇和多烯紫杉醇具有耐药性的癌细胞系对KML001的响应(图6)。测定法只允许癌症干细胞群在软琼脂基质中生长，这归因于它们的自我更新能力。因此，这种测定法特异性测试干细胞群对抗癌剂的敏感性。

细胞的铺板效率(对于DU145和DU145/Pac200来说为2％)与以前报告的在侧群测定中测定的干细胞群(对于DU145来说为1％，对于DU145/Pac200来说为50％)相近。对于亲代以及紫杉醇耐药性细胞系来说，观察到对KML001的相近敏感性，正如在KML001存在下集落形成能力的降低所显示的。在本测定中，推导出与以前进行的标准MTT测定法(对于DU145来说为4μΜ，对于DU145/Pac200来说为6μΜ)相似的细胞系IC50(6μΜ)。

紫杉烷耐药性细胞系具有最高SP，而激素响应性细胞系LAPC-4及其激素耐药性衍生株显示出较不确定的可以被药物外排抑制剂维拉帕米(Pgp抑制剂)和烟曲霉毒素c(FTC，BCRP抑制剂)抑制的SP。测试了SP阳性细胞系DU145中CD44和CD133的存在，并且结果显示0.46％的细胞具有两种标志物(数据未显示)。

从主体肿瘤物质中分离SP，并且来自标准MTT测定法的生长曲线显示，两种级份、即癌症干细胞样SP阳性(SP+)和阴性(SP-)级份，对KML001的响应具有相近的敏感性(图7)。

实施例8

端粒长度、端粒酶活性和hTERT活性的测定

如上所示(实施例3)，使用SP测定法鉴定到的癌症干细胞样级份显示出比主体细胞级份更高的端粒酶活性。初步研究表明，对于两种群来说，人类端粒酶(hTERT)催化亚基的mRNA转录本水平相似(图8A)，其可能表明癌症干细胞样群的较高端粒酶活性可能是端粒酶结合蛋白刺激信号传导途径的结果。在未分拣的DU145/Pac200细胞系中的初步结果表明，在IC50和IC100下用KML001处理72小时后，显著降低了hTERT转录本水平(图8B)。

药物外排泵(Pgp)在紫杉烷耐药性前列腺癌细胞系中的大多数细胞中功能性表达(在膜上)，这是意料之中的，因为那些细胞系的SP可以用药物外排泵抑制剂维拉帕米抑制。用KML001以IC50处理72小时显著减少了Pgp阳性细胞群，其证实了产克隆和SP测定法的结果。

实施例9

在标准MTT中，检查了顺铂在紫杉醇耐药性前列腺癌细胞系DU145/Pac200以及亲代细胞系DU145中的影响。结果显示，两种细胞系响应的敏感性相近(IC50分别为3和4μΜ)。初步结果表明在亲代以及紫杉醇耐药性细胞系中，顺铂与KML001之间存在协同效应(结果未显示)。

Claims (9)

1.偏亚砷酸钠在制备用于在紫杉醇耐药型或多烯紫杉醇耐药型前列腺癌中减少耐药性的治疗剂中的应用，其中所述治疗剂包含治疗有效量的偏亚砷酸钠。

2.权利要求1的应用，其中偏亚砷酸钠被配制用于口服、肠胃外或腹膜内给药。

3.权利要求1或2的应用，其中偏亚砷酸钠以约0.1-20mg的剂量被提供。

4.偏亚砷酸钠在制备用于治疗顺铂耐药型癌症的治疗剂中的应用，其中所述治疗剂包含治疗有效量的偏亚砷酸钠。

5.权利要求4的应用，其中所述治疗剂另外包含包括顺铂的组合物。

6.权利要求4或5的应用，其中偏亚砷酸钠以约0.1-20mg的剂量被提供。

7.用于治疗顺铂耐药型癌症的抗癌剂，其中所述抗癌剂包含包括偏亚砷酸钠的组合物。

8.权利要求7的抗癌剂，其中所述治疗剂另外包含包括顺铂的组合物。

9.权利要求7或8的抗癌剂，其中偏亚砷酸钠以约0.1-20mg的剂量被提供。