CN107412164B - 一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法 - Google Patents
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂‑聚合物制备方法，主要包括步骤有：准备多肽D8‑C和SDSSDC；将DSPE‑PEG、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物和卵磷脂混合制备脂质溶液；在DSPE‑PEG上外接多肽D8‑C得到D8‑C‑DSPE‑PEG；在DSPE‑PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC‑DSPE‑PEG；制备载抗骨吸收药物纳米颗粒；制备载促骨合成药物纳米颗粒；以载抗骨吸收药物纳米颗粒和载促骨合成药物纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂‑聚合物。本发明制备的产物增强了药物与其靶向细胞之间的特异性相互作用,且减少促骨合成药物和抗骨吸收药物作用于非靶向区域，这将最大限度地减少它们的副作用，实现两种药物的协同效应，以助于抗骨吸收和促骨合成药物的联合治疗。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体的说是涉及一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法。
背景技术
骨质疏松症是一种进行性全身性骨骼疾病，其中骨吸收的平衡和骨形成受到干扰，骨质疏松症的病理机制是相对减少的成骨细胞活性和/或相对增强的破骨细胞活性。破骨细胞附着于骨表面并通过分泌质子和蛋白酶混合物来分解骨，从而分解骨的无机和有机含量，此区域成为骨吸收区。在骨形成区时，活性成骨细胞占优势并形成新骨组织。而在骨质疏松的情况下，骨吸收区的密度变得显着高于骨形成区。在临床上，骨质疏松的特征在于低骨量和骨组织的微结构退化。
用于骨质疏松症的药物根据其主要作用可以分为两类：抗骨吸收药物和促骨合成药物。抗骨吸收药物的主要作用是通过靶向破骨细胞快速和持续地降低病理性升高的骨吸收。这种效应使骨吸收的减少，导致二次矿化的增加。但是，大多数抗骨吸收药物同时有一定抑制骨合成代谢、减少骨形成的能力，促骨合成药物主要通过靶向成骨细胞增加合成代谢活性和骨形成，使骨体积和骨矿物质密度的增加，但是促骨合成药物无意中也会对骨吸收有一定的促进作用。此外，这两类药物在骨组织中没有显示优先分布，通常同时出现于骨形成和骨吸收区。因此，这些药物与非靶向区域和细胞的非特异性相互作用导致联合治疗时疗效降低。例如，阿仑膦酸盐在1个月的治疗后会显著减少骨转换标志物，3个月内抑制骨形成。类似地，特立帕肽在增加骨形成的速率时也伴随着增加的骨吸收。这些药物的副作用可能严重影响其疗效。因此，与单一疗法相比，抗骨吸收和促骨合成药物的联合给药并不能促进骨矿物质密度更大的增加，骨结构的恢复和骨折风险的降低。实验结果表明促骨合成药物和抗骨吸收药物的联合应用可能会削弱其自身的功效。
在骨吸收区，大量破骨细胞附着于成熟骨表面使骨溶解；在骨形成区，成骨细胞成为主导细胞并形成新骨。在骨吸收区均为成熟骨质，矿化程度高，羟基磷灰石结晶度高；而在骨形成区为新生骨质，矿化程度低，羟基磷灰石结晶度低。一些特殊多肽对不同结晶度羟基磷灰石显示出了选择性吸附特性，为其作为双向选择性靶向分子，实现药物细胞靶向传递提供了可能。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，利用BMU中破骨细胞集聚的骨吸收区和成骨细胞集聚的骨形成区的骨质矿化差异，设计一种双向选择性的纳米靶向药物传递系统，可以大大减少骨质疏松治疗药物的副作用，实现联合用药的协同作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和卵磷脂混合制备脂质溶液；
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
步骤五、以抗骨吸收药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载抗骨吸收药物纳米颗粒；
步骤六、以促骨合成药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒；
步骤七、以载抗骨吸收药物纳米颗粒和载促骨合成药物纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
作为本发明的进一步改进，所述步骤二中制备脂质溶液的具体步骤如下：将DSPE-PEG与卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将20-30mLDSPE-PEG溶液与30-40mL卵磷脂溶液混合，加入60-90mL去离子水，再加入50-75mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
作为本发明的进一步改进，所述步骤三中合成D8-C-DSPE-PEG或步骤四中合成SDSSDC-DSPE-PEG的具体步骤如下：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化30-45gD8-C或SDSSDC羧基端3-4h，再加入160-235mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12-24h，透析，冻干，待用。
作为本发明的进一步改进，所述步骤五或六的具体步骤如下：
a、将9-12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、4-6mgD8-C-DSPE-PEG或SDSSDC-DSPE-PEG和2-5mg甾醇溶于10-25mL质量浓度35-70％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将抗骨吸收药物或促骨合成药物加入到水或乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中抗骨吸收药物或促骨合成药物的浓度为200-400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声5-10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载抗骨吸收药物纳米颗粒或载促骨合成药物纳米颗粒。
作为本发明的进一步改进，所述步骤七中制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物的具体步骤如下：
a、将20mg载抗骨吸收药物纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载促骨合成药物纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
作为本发明的进一步改进，所述卵磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述抗骨吸收药物为阿仑膦酸钠、雷洛昔芬或唑来膦酸中的一种，所述促骨合成药物为特立帕肽或甲状旁腺素中的一种。
多肽D8-C在体外可以优先吸附高结晶度羟基磷灰石而不是低结晶度羟基磷灰石，因此，通过多肽D8-C的引导，骨吸收抑制药物可以特异性作用于骨吸收区集聚的破骨细胞。多肽SDSSD特异性吸附在低结晶度羟基磷灰石表面；在体外多肽SDSSD也显示出良好地吸附至成骨细胞矿化结节和无定形磷酸钙的特性。促骨合成药物在多肽SDSSD引导下可以特异性作用于骨形成区集聚的成骨细胞。因此，多肽D8-C和多肽SDSSD可以作为特异性靶向分子，实现药物的细胞靶向传递。
本发明基于破骨细胞与成骨细胞两种靶向细胞及其空间分布情况，提出一种新的双靶向载药纳米颗粒的制备方法，将抗骨吸收药物和靶向破骨区的多肽D8-C连接，D8-C可以优先引导作用于骨吸收区；而促骨合成药物与多肽SDSSD连接，SDSSD可以将药物引导至骨形成区，增强了药物与其靶向细胞之间的特异性相互作用,且减少促骨合成药物和抗骨吸收药物作用于非靶向区域，这将最大限度地减少它们的副作用，实现两种药物的协同效应，以助于抗骨吸收和促骨合成药物的联合治疗。
附图说明
图1为本发明双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物选择性传递模式图；
图2为本发明制备载抗骨吸收药物纳米颗粒路线示意图；
图3为本发明制备载促骨合成药物纳米颗粒路线示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的详述。
多肽Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Cys简称D8-C；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物简称PLGA。
实施例1
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和大豆卵磷脂混合制备脂质溶液；将DSPE-PEG与大豆卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和大豆卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将20mLDSPE-PEG溶液与30mL大豆卵磷脂溶液混合，加入60mL去离子水，再加入50mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化30gD8-C羧基端3h，再加入160mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化30g SDSSDC羧基端3h，再加入160mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤五、以阿仑膦酸钠、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载阿仑膦酸钠纳米颗粒；
a、将9mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、4mgD8-C-DSPE-PEG和2mg甾醇溶于10mL质量浓度35％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将阿仑膦酸钠加入到水中混合均匀得到B溶液，使B溶液中阿仑膦酸钠的浓度为200ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声5min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载阿仑膦酸钠纳米颗粒。
步骤六、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载特立帕肽纳米颗粒；
a、将9mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、4mg SDSSDC-DSPE-PEG和2mg甾醇溶于10mL质量浓度35％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将特立帕肽加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中特立帕肽的浓度为200ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声5min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒。
步骤七、以载阿仑膦酸钠纳米颗粒和载特立帕肽纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物：
a、将20mg载阿仑膦酸钠纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载特立帕肽纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
实施例2
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和氢化大豆卵磷脂混合制备脂质溶液；
将DSPE-PEG与氢化大豆卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和氢化大豆卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将25mLDSPE-PEG溶液与35mL氢化大豆卵磷脂溶液混合，加入70mL去离子水，再加入60mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化40gD8-C羧基端3h，再加入180mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应16h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化35g SDSSDC羧基端4h，再加入190mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应18h，透析，冻干，待用。
步骤五、以雷洛昔芬、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载雷洛昔芬纳米颗粒；
a、将10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、5mgD8-C-DSPE-PEG和3mg甾醇溶于10-25mL质量浓度40％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将雷洛昔芬加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中雷洛昔芬的浓度为300ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声6min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载雷洛昔芬纳米颗粒。
步骤六、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载特立帕肽纳米颗粒；
a、将11mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、5mg SDSSDC-DSPE-PEG和4mg甾醇溶于18mL质量浓度40％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将特立帕肽加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中特立帕肽的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒。
步骤七、以载雷洛昔芬纳米颗粒和载特立帕肽纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
a、将20mg载雷洛昔芬纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载特立帕肽纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
实施例3
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和蛋黄卵磷脂混合制备脂质溶液；将DSPE-PEG与蛋黄卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和蛋黄卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将28mLDSPE-PEG溶液与36mL蛋黄卵磷脂溶液混合，加入75mL去离子水，再加入60mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化42gD8-C羧基端4h，再加入200mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应19h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化42g SDSSDC羧基端3h，再加入230mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应20h，透析，冻干，待用。
步骤五、以唑来膦酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载唑来膦酸纳米颗粒；
a、将10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、6mgD8-C-DSPE-PEG和5mg甾醇溶于17mL质量浓度58％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将唑来膦酸加入到水中混合均匀得到B溶液，使B溶液中唑来膦酸的浓度为350ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声7min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载唑来膦酸纳米颗粒。
步骤六、以甲状旁腺素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载甲状旁腺素纳米颗粒；
a、将12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、4mg SDSSDC-DSPE-PEG和3mg甾醇溶于22mL质量浓度66％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将甲状旁腺素加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中甲状旁腺素的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声6min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载甲状旁腺素纳米颗粒。
步骤七、以载唑来膦酸纳米颗粒和载甲状旁腺素纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
a、将20mg载唑来膦酸纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载甲状旁腺素纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
实施例4
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和氢化蛋黄卵磷脂混合制备脂质溶液；
将DSPE-PEG与氢化蛋黄卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和氢化蛋黄卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将30mLDSPE-PEG溶液与36mL氢化蛋黄卵磷脂溶液混合，加入78mL去离子水，再加入72mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化42gD8-C羧基端3h，再加入190mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化39g SDSSDC羧基端4h，再加入220mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应24h，透析，冻干，待用。
步骤五、以阿仑膦酸钠、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载阿仑膦酸钠纳米颗粒；
a、将11mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、5mgD8-C-DSPE-PEG和3mg甾醇溶于22mL质量浓度65％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将阿仑膦酸钠加入到水中混合均匀得到B溶液，使B溶液中阿仑膦酸钠的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载阿仑膦酸钠纳米颗粒。
步骤六、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载特立帕肽纳米颗粒；
a、将10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、6mg SDSSDC-DSPE-PEG和2mg甾醇溶于14mL质量浓度44％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将特立帕肽加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中特立帕肽的浓度为250ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声8min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒。
步骤七、以载阿仑膦酸钠纳米颗粒和载特立帕肽纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
a、将20mg载阿仑膦酸钠纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载特立帕肽纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
实施例5
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和氢化大豆卵磷脂混合制备脂质溶液；
将DSPE-PEG与氢化大豆卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和氢化大豆卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将29mLDSPE-PEG溶液与34mL氢化大豆卵磷脂溶液混合，加入86mL去离子水，再加入73mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化41gD8-C羧基端4h，再加入185mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化45g SDSSDC羧基端4h，再加入195mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12h，透析，冻干，待用。
步骤五、以雷洛昔芬、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载雷洛昔芬纳米颗粒；
a、将12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、5mgD8-C-DSPE-PEG和4mg甾醇溶于16mL质量浓度65％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将雷洛昔芬加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中雷洛昔芬的浓度为300ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载雷洛昔芬纳米颗粒。
步骤六、以甲状旁腺素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载甲状旁腺素纳米颗粒；
a、将10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、5mg SDSSDC-DSPE-PEG和4mg甾醇溶于24mL质量浓度56％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将甲状旁腺素加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中甲状旁腺素的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声8min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载甲状旁腺素纳米颗粒。
步骤七、以载雷洛昔芬纳米颗粒和载甲状旁腺素纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
a、将20mg载雷洛昔芬纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载甲状旁腺素纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
实施例6
一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法
步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；本实施例中多肽D8-C和SDSSDC从美国基因泰克公司采购。
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和蛋黄卵磷脂混合制备脂质溶液；将DSPE-PEG与蛋黄卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和蛋黄卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将30mLDSPE-PEG溶液与40mL蛋黄卵磷脂溶液混合，加入90mL去离子水，再加入75mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化45gD8-C羧基端4h，再加入235mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应24h，透析，冻干，待用。
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化45g SDSSDC羧基端4h，再加入235mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应24h，透析，冻干，待用。
步骤五、以唑来膦酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载唑来膦酸纳米颗粒；
a、将12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、6mgD8-C-DSPE-PEG和5mg甾醇溶于25mL质量浓度70％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将唑来膦酸加入到水中混合均匀得到B溶液，使B溶液中唑来膦酸的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载唑来膦酸纳米颗粒。
步骤六、以特立帕肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载特立帕肽纳米颗粒；
a、将12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、6mg SDSSDC-DSPE-PEG和5mg甾醇溶于25mL质量浓度70％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将特立帕肽加入到乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中特立帕肽的浓度为400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载特立帕肽纳米颗粒。
步骤七、以载唑来膦酸纳米颗粒和载特立帕肽纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
a、将20mg载唑来膦酸纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载特立帕肽纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
检测结果：
一、物理特征
对实施例1步骤五得到的载抗骨吸收药物纳米颗粒、步骤六得到的载促骨合成药物纳米颗粒和步骤七得到的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物分别进行NMR和傅里叶红外检测，结果显示载抗骨吸收药物纳米颗粒的氢核磁谱和傅里叶红外光谱上同时出现D8-C和DSPE-PEG的特征峰，证明D8-C与DSPE-PEG成功连接；载促骨合成药物纳米颗粒的氢核磁谱和傅里叶红外光谱上同时出现SDSSDC和DSPE-PEG的特征峰，证明SDSSDC与DSPE-PEG成功连接；双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物的氢核磁谱和傅里叶红外光谱上同时出现D8-C、SDSSDC和DSPE-PEG的特征峰。
用透射电镜进行扫描，测得平均直径为460nm左右,显示形貌为均一的球形结构。
二、细胞摄取能力及毒理实验
使用MG63细胞与实施例1-6得到的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物共孵育显示，细胞可以很好的摄取此纳米粒子。
使用MTT法检测未见实施例1-6得到的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物有明显毒性，使用2％兔血悬液检测无明显的溶血与凝集效应。
三、骨亲和力
使用小动物活体荧光成像仪显示其在动物体内也有较好的骨靶向能力，可以在骨组织内沉积。
四、抗骨质疏松作用
在体内，分组实验1、阴性对照(未使用药物的骨质疏松动物)；2、阳性对照(骨质正常的动物)；3、同时给予抗骨吸收药物(阿仑膦酸钠)和促骨合成药物(特立帕肽)；4、单一给药，给予实施例4中载阿仑膦酸钠纳米颗粒；5、单一给药，给予实施例4中载特立帕肽纳米颗粒；6、联合给药，给予实施例4中得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
三个月后结束实验测量动物股骨的骨密度，显示6组的骨密度最大，其治疗作用最佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：主要包括以下步骤：步骤一、准备多肽D8-C和SDSSDC；
步骤二、将DSPE-PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和卵磷脂混合制备脂质溶液；
步骤三、将多肽D8-C加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽D8-C得到D8-C-DSPE-PEG；
步骤四、将多肽SDSSDC加入到脂质溶液中，在DSPE-PEG上外接多肽SDSSDC得到SDSSDC-DSPE-PEG；
步骤五、以抗骨吸收药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、甾醇和D8-C-DSPE-PEG为原料制备载抗骨吸收药物纳米颗粒；
步骤六、以促骨合成药物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、甾醇和SDSSDC-DSPE-PEG为原料制备载促骨合成药物纳米颗粒；
步骤七、以载抗骨吸收药物纳米颗粒和载促骨合成药物纳米颗粒为主要原料制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物；
所述步骤七中制备双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物的具体步骤如下：a、将20mg载抗骨吸收药物纳米颗粒加入0.5mL二甲基亚砜中，得到药物油溶液；
b、将10mg聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入到50mL二氯甲烷中得到聚合物溶液，将药物油溶液加入到聚合物溶液中，混合均匀形成混悬液；
c、将混悬液滴加到5mL矿物油中，超声形成复乳乳液；
d、将5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、20mg载促骨合成药物纳米颗粒加入到10mL水中混合均匀，将复乳乳液滴加进去，超声形成微球；
e、将微球分散到棉籽油中固化，离心收集微球，干燥后得到双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：所述步骤二中制备脂质溶液的具体步骤如下：将DSPE-PEG与卵磷脂分别溶于4％乙醇得到浓度分别为1mg/mL的DSPE-PEG溶液和卵磷脂溶液，将PLGA溶于80％乙腈得到浓度为2mg/mL的PLGA溶液，将20-30mLDSPE-PEG溶液与30-40mL卵磷脂溶液混合，加入60-90mL去离子水，再加入50-75mLPLGA溶液，混合后在130W超声5分钟，超滤三次。
3.根据权利要求2所述的一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：所述步骤三中合成D8-C-DSPE-PEG或步骤四中合成SDSSDC-DSPE-PEG的具体步骤如下：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联试剂活化30-45gD8-C或SDSSDC羧基端3-4h，再加入160-235mL脂质溶液中，在室温以及氮气条件下混合反应12-24h，透析，冻干，待用。
4.根据权利要求3所述的一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：所述步骤五或六的具体步骤如下：
a、将9-12mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物、4-6mgD8-C-DSPE-PEG或SDSSDC-DSPE-PEG和2-5mg甾醇溶于10-25mL质量浓度35-70％的乙醇水溶液中得到A溶液；
b、将抗骨吸收药物或促骨合成药物加入到水或乙腈中混合均匀得到B溶液，使B溶液中抗骨吸收药物或促骨合成药物的浓度为200-400ug/mL；
c、将10mL A溶液和20mL B溶液混合均匀得到C溶液；
d、将C溶液用超声破碎仪超声5-10min；
e、收集步骤d得到的超声后的混合液于10kDa的超滤管内离心超滤三次，即得载抗骨吸收药物纳米颗粒或载促骨合成药物纳米颗粒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：所述卵磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种用于骨质疏松的双靶向载药纳米颗粒脂-聚合物制备方法，其特征在于：所述抗骨吸收药物为阿仑膦酸钠、雷洛昔芬或唑来膦酸中的一种，所述促骨合成药物为特立帕肽或甲状旁腺素中的一种。
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