CN107407631A - 用于校准结合染料的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

描述一种用于校准荧光染料的计算机实现的方法(500)。所述方法(500)包括样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器。所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点。所述方法还包括识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道(508)、将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道(510)，和生成包括一组染料参考值的一个染料矩阵(518)。

Description

用于校准结合染料的系统和方法
技术领域
本公开针对例如聚合酶链反应(PCR)的生物分析，和例如用于PCR的仪器的生物分析设备，尤其是针对染料校准板以及与使用染料校准板来校准染料的方法有关的计算机系统和计算机软件。
技术背景
如上所述，简化生物分析系统的安装和设置的需求越来越大，这使得操作人员可更快速高效地使用生物分析系统完成其预期目的。例如，生物分析仪器校准的进步有利于减少操作人员错误、减少操作人员输入、减少校准生物分析仪器及其各种部件所需的时间，实现正确高效的安装。
发明内容
在一些实施例中，本公开涉及一种用于校准荧光染料的计算机实现的方法。所述方法包括样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器。所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点。所述方法还可包括识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道，将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道，和生成包括一组染料参考值的一个染料矩阵。染料矩阵可包括每个反应位点的一组染料参考值。
在一个实施例中，可提供一种可由处理器执行的指令编码的非暂态计算机可读存储介质。所述指令可包括用于以下操作的指令：样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器。所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点。所述指令还可包括用于以下操作的指令：识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道，将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道，和生成包括一组染料参考值的染料矩阵。染料矩阵可包括每个反应位点的一组染料参考值。
在另一实施例中，提供一种用于校准荧光染料的系统。所述系统可包括处理器和可由处理器执行的指令编码的存储器。所述指令可包括用于以下操作的指令：样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器。所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点。所述指令还可包括用于以下操作的指令：识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道，将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道，和生成包括一组染料参考值的染料矩阵。染料矩阵可包括每个反应位点的一组染料参考值。
在又一实施例中，提供一种用于校准荧光染料的样本固持器。样本固持器可包括多个反应位点。多个反应位点中的每个反应位点可被配置以接受单个染料。样本固持器可被配置以接受一种以上染料。另外，样本固持器可为一个板。又，多个反应位点可为多个孔。
附图说明
图1为校准板的图像，其中FAM染料占据96孔校准板中的每个孔。
图2是示出根据本公开的一些实施例可用以执行处理功能的计算机系统200的框图。
图3为示出PCR仪器300的框图，根据该PCR仪器200可实现本教导内容的实施例。
图4示出可用于根据本文所述实施例成像的一个示例性光学系统400。
图5和图6描绘了根据本公开的一个实施例的示例性流程。
图7A示出根据本公开的一个实施例的具有棋盘配置的校准板。
图7B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图7A所示的板700具有相同的构形。
图8示出根据本公开的一个实施例应用为96孔棋盘板的全局模型的示例性2D二次多项式函数，其中FAM染料在通道XIM2。
图9示出根据本公开的一个实施例具有全板的测量的染料校准因子(x轴)和棋盘板的建模染料校准因子(y轴)的全局建模性能。
图10示出根据本公开的一个实施例的具有棋盘配置的校准板。
具体实施方式
为了更全面地理解本发明，以下描述阐明了大量具体细节，如具体配置、参数、实例等。然而，应当认识到，此类描述并非旨在限制本发明的范围，而是旨在更好地描述示例性实施例。
还应认识到，本文所述的方法和系统可以在各种类型的系统、仪器和机器，诸如生物分析系统中实现。例如，各种实施例可以在对多个样本进行聚合酶链反应(PCR)的仪器、系统或机器中实现。虽然通常适用于对大量样本进行处理的定量聚合酶链反应(qPCR)，但是应当认识到，根据本文所述的各种实施例可使用任何合适的PCR方法。适当的PCR方法包括但不限于数字PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、连接法介导PCR、多重PCR、嵌套PCR、qPCR、基因组步行和桥PCR。此外，如本文所用，热循环可包括使用热循环仪、等温扩增、热对流、红外介导的热循环或解链酶扩增。
如上所述，简化生物分析系统的安装和设置的需求越来越大，这使得操作人员可更快速高效地使用生物分析系统完成其预期目的。此需求在例如校准一生物分析仪器及相关联的部件方面很明显。一种示例性校准是校准用于生物分析系统诸如qPCR系统中荧光检测的荧光染料。
校准qPCR仪器中所用的荧光染料使该仪器软件能够使用由染料标样采集的校准数据来表征和区分每种染料在所述仪器所采集的总荧光中各自的贡献。在一样本运行完成后，该仪器软件接收呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。该软件通过将每种染料贡献的原始光谱与纯光谱校准数据进行比较来确定每个反应位点中所用每种荧光染料的贡献。当一用户在分析后保存一项实验时，该仪器软件将所述纯光谱与采集的实验荧光数据以及每个孔中每种荧光染料的贡献一起存储。
例如，一qPCR仪器中一种染料校准的产物为表示每个反应位点的每种染料标样之所述荧光特征的一系列光谱曲线。每条曲线由一组对应于从诸如一校准板或阵列卡的一个样本固持器的诸如孔等反应位点采集的荧光之光谱所组成。在每种染料的校准之后，仪器软件“提取”每个反应位点处的每种染料的光谱曲线。该软件将每条曲线的所得数据绘制于一张荧光对比滤光器的图中。当该软件提取所述染料校准数据时，它根据整个校准板或阵列卡的总光谱来评估每个孔所产生的荧光信号。如果染料光谱在与它们的组一样在相同的滤光器中产生峰值，但是在其它波长处稍微发散，则该染料光谱通常是可接受的。
在一样本固持器诸如一校准板上运行染料校准时，所述反应位点(例如，孔)通常包含相同浓度的染料以使得在该板的每个孔处生成一个纯光谱值。图1显示一校准板的一个图像，其中一种单一染料(在本例中，为FAM染料)占据一块96孔校准板中的每个孔。这使得能够对运行中每个孔所生成的荧光信号与该孔的一个纯光谱读数进行对比。通过对一校准板的每个孔使用一种单一染料，所述孔的所得信号应当相似。光谱位置和峰位的变化可例如由所述单个孔之间的光学特性和激发能量上的细微差异而引起。在染料校准中考虑这些变化在理论上将获得一个更准确的染料校准。
然而，每个校准板使用一种单一染料可能费时且复杂，在校准大量染料时尤其如此。荧光染料的非限制性示例包括FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA和CY5。因此，需要简化染料校准过程并且减少校准所需的时间，同时保持染料校准的结果具有相同的质量。
计算机实现的系统
根据本文所述的实施例的方法可在计算机系统中实现。
本领域的技术人员将认识到，可以适当地使用硬件、软件、固件或它们的组合来实现各种实施例的操作。例如，一些过程可使用处理器或软件、固件或硬连线逻辑部件控制下的其它数字电路进行。(术语“逻辑部件”在本文中是指如本领域的技术人员所认识到的能够执行上述功能的固定硬件、可编程逻辑部件和/或它们的适当的组合。)软件和固件可存储在非暂态计算机可读介质上。一些其它过程可使用模拟电路来实现，正如本领域的普通技术人员所熟知。另外，存储器或其它存储设备以及通信部件也可以用于本发明的实施例中。
图2为示出根据各种实施例可用于执行处理功能的计算机系统200的框图。执行实验的仪器可以连接至示例性计算系统200。根据各种实施例，可以利用的仪器包括例如图3的热循环仪系统300。计算系统200可包括一个或多个处理器，诸如处理器204。例如，处理器204可使用通用或专用处理引擎诸如微处理器、控制器或其它控制逻辑部件来实施。在这个例子中，处理器204连接到总线202或其它通信介质。
另外，应当理解，图2的计算系统200可以实现为多种形式中的任一种，诸如机架式计算机、大型机、超级计算机、服务器、客户端、台式计算机、笔记本电脑、平板计算机、手持式计算设备(例如，PDA、蜂窝电话、智能电话、掌上电脑等)、集群网格、上网本、嵌入式系统或给定应用或环境可能期望的或适当的任何其它类型的专用或通用计算设备。另外，计算系统200可包括传统网络系统或与LIS/LIMS基础设施的集成，其中传统网络系统包括客户端/服务器环境和一个或多个数据库服务器。多种传统网络系统在本领域中是已知的，其中包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，并且包括无线和/或有线部件。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域中已有充分记载。根据本文所述的各种实施例,计算系统200可以被构造成用于连接至分布式网络中的一个或多个服务器。计算系统200可接收来自分布式网络的信息或更新。计算系统200还可以传输待存储于分布式网络内的信息，该信息可以由连接至分布式网络的其它客户端来访问。
计算系统200可包括总线202或用于传送信息的其它通信机制，和与总线202耦合以处理信息的处理器204。
计算系统200还包括存储器206，该存储器206可为随机存取存储器(RAM)或其它动态存储器，其耦合到用于存储将由处理器204执行的指令的总线202。存储器206还可用于在执行将由处理器204执行的指令的过程中存储临时变量或其它中间信息。计算系统200还包括耦合到总线202用于存储处理器204的静态信息和指令的只读存储器(ROM)208或其它静态存储设备。
计算系统200还可包括存储设备210，诸如提供并且耦合到总线202以存储信息和指令的磁盘、光盘、或固态驱动器(SSD)。存储设备210可包括介质驱动器和可移动存储接口。介质驱动器可包括支持固定或移动存储介质的驱动器或其它机构，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪盘驱动器或其它可移动或固定介质驱动器。如这些示例所示，存储介质可包括计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质中具有特定的计算机软件、指令或数据。
在另选的实施例中，存储设备210可包括其它类似的工具以允许计算机程序或其它指令或数据加载到计算系统200中。此类工具可包括例如移动存储单元和接口，诸如程序盒式存储器和盒式存储器接口、移动存储器(例如，闪速存储器或其它移动存储模块)和存储器插槽，以及用于允许将软件和数据从存储设备210传送至计算系统200的其它移动存储单元和接口。
计算系统200也可包括通信接口218。通信接口218可用于允许软件和数据在计算系统200和外部设备之间传输。通信接口218的示例可包括调制解调器、网络接口(诸如以太网或其它NIC卡)、通信端口(诸如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和PCMCIA卡、蓝牙等。通过通信接口218传送的软件和数据可以是能够由通信接口218接收的电子、电磁、光学及其它信号的形式。这些信号可以由通信接口218通过诸如无线介质、线材或线缆、光纤、或其它通信介质的信道来发送和接收。信道的一些示例包括电话线、蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网及其它通信信道。
计算系统200可通过总线202耦合到显示器212，诸如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，该显示器212用于向计算机用户显示信息。例如，包括字母数字键及其它键的输入设备214耦合到总线202，用于将信息和命令选择传输至处理器204。输入设备还可以是具有触摸屏输入能力的显示器，诸如LCD显示器。另一种类型的用户输入设备为光标控制装置216，诸如用于将方向信息和命令选择传递至处理器204并且用于控制光标在显示器212上移动的鼠标、轨迹球或光标方向键。该输入设备通常具有两个轴上的两种自由度以使设备指定平面的位置，所述两个轴为第一轴(例如，x轴)和第二轴(例如，y轴)。计算系统200提供数据处理并且提供此类数据的置信水平。与本教导内容的实施例的某些具体实施一致的是，数据处理和置信度值由计算系统200提供以响应处理器204执行包含在存储器206中的一个或多个指令的一个或多个序列。此类指令可以由另一个计算机可读介质诸如存储设备210读入存储器206中。执行包含在存储器206中的指令序列引起处理器204执行本文所述的过程。或者，硬连线电路可用于代替软件指令或与软件指令结合以实现本教导的实施例。因此，本教导内容的实施例的具体实施不限于硬件电路和软件的任何特定组合。
本文中使用的术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”通常是指涉及向处理器204提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令的任何介质。在执行时，通常被称为“计算机程序代码”的此类指令(其可以以计算机程序的形式或其它分组的形式分组)使计算系统200能够执行本发明的实施例的特征或功能。这些及其它形式的非暂态计算机可读介质可采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括例如固态光盘或磁盘，诸如存储设备210。易失性介质包括动态存储器，诸如存储器206。传输介质包括同轴线缆、铜线和光纤，该光纤包括线材，该线材包括总线202。
计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppy disk)、软磁盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、或任何其它磁介质、CD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡、纸带、任何其它具有孔图案的物理介质、RAM、PROM以及EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒式存储器、如下文所述的载波、或计算机可读取的任何其它介质。
各种形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至用于执行的处理器204。例如，指令最初可携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中并且使用调制解调器通过电话线路发送指令。计算系统200的本地调制解调器可接收电话线的数据并且使用红外发射器将数据转换为红外信号。耦合到总线202的红外检测器可接收红外信号中携带的数据并且将该数据置于总线202上。总线202将该数据携带至存储器206，处理器204从存储器206中检索并且执行指令。由存储器206接收的指令可选地在处理器204执行之前或执行之后存储于存储设备210上。
应当理解，为清楚起见，上述说明参考不同的功能单元和处理器描述本发明的实施例。然而，显而易见的是，在不脱离本发明的情况下可使用不同的功能单元、处理器或域之间的任何合适的功能分布。例如，示出的由独立的处理器或控制器执行的功能可以由相同的处理器或控制器来执行。因此，对特定功能单元的引用仅应视为对提供所述功能的合适装置的引用，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。
PCR仪器
如上所述，根据各种实施例可利用的仪器包括但不限于聚合酶链反应(PCR)仪器。图3为示出PCR仪器300的框图，根据该PCR仪器300可实现本教导内容的实施例。PCR仪器300可包括加热的盖子310，该加热的盖子310被置于基板(未示出)中所容纳的多个样本312上。在各种实施例中，基板可是具有多个样品区域的玻璃或塑料滑片，其样本区域具有介于样本区域和加热的盖子310之间的盖子。一块基板的一些示例可能包括但不限于一块多孔板(诸如一标准微量滴定96孔板、一384孔板或一微卡)、一基本平面的固持器(诸如一玻璃或塑料滑片)，或任何其它类型的阵列或微阵列。在一基板的各种实施例中，所述反应位点可能包括凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在所述基板的表面上形成规则或不规则阵列。PCR仪器的多种实施例包括一个样本块314、用于加热和冷却的元件316、一个热交换器318、控制系统320和用户界面322。根据本教导内容的热块组件的各种实施例包括图3所示的PCR仪器300的部件314-318。
实时PCR仪器300具有一个光学系统324。在图3中，光学系统324可具有发射电磁能量的照明源(未示出)、用于接收来自样本固持器的样本312的电磁能量的光学传感器、检测器或成像器件(未示出)、用于将电磁能量从每个DNA样本引导至成像器件的光学器件340。对于图3中PCR仪器300和图3中实时PCR仪器300的实施例，控制系统320可用于控制检测系统、加热的盖子和热块组件的功能。控制系统320可由最终用户通过图3的PCR仪器300和图3中实时PCR仪器300的用户界面322进行访问。此外，如图2所描绘，计算机系统200可用于提供对图3中PCR仪器300的功能，以及用户界面功能的控制。另外，图2的计算机系统200可提供数据处理、显示和报告准备功能。所有此类仪器控制功能可局部专用于PCR仪器，或者图2的计算机系统200还可提供对控制、分析和报告功能中的一部分或全部的远程控制，如随后所详述。
用于成像的光学系统
图4示出可用于根据本文所述实施例成像的一个示例性光学系统400。应当认识到，光学系统400是一个示例性光学系统，且本领域技术人员应认识到，其它光学系统可用于捕获感兴趣对象的图像。根据各种实施例，感兴趣对象可为样本固持器，例如，如本文描述的校准板。例如，相机404中包括的光学传感器402可对感兴趣对象410成像。光学传感器402可为一个CCD传感器，且相机404可为一个CCD相机。此外，光学传感器包括相机透镜406。
取决于感兴趣对象，可根据各种实施例选择发射滤光器408以对感兴趣对象410成像。在其它实施例中，可改变发射滤光器408以对从感兴趣对象401发射的荧光发射成像。
光学系统400可使用反射光源412来对感兴趣对象410成像。来自光源412的光可通过一非球面414、一聚焦器/分散器416和激发滤光器418进行过滤，再由分束器420反射到感兴趣对象410。光学系统400还可包括场透镜422。根据各种实施例，取决于感兴趣对象，可选择或改变励磁滤光器418以对感兴趣对象410成像。
以下关于本教导内容各种实现的描述旨在供说明和描述之用。其并非详尽无遗，也不将本教导内容限制为所公开的确切形式。修改和变化可以根据上述教导内容，或者可从本教导内容的实践中习得。另外，所描述的实现包括软件，但本教导内容可以实现为硬件和软件的组合或仅硬件。本教导内容可以通过面向对象和非面向对象的编程系统实现。
用于校准荧光染料的改进流程和板
图5和图6示出一个流程图，其中示出根据本文所述的实施例校准一种或多种荧光染料的示例性方法500。方法500的步骤可能由处理器204实现，如图2所示。此外，用于由处理器204执行所述方法的指令可能被存储于存储器206中。
参见图5，在步骤502中，通过将染料加载进一块待处理基板的反应位点中来制备校准板。在本例中，所述基板为96孔板，但是可以使用不同的基板，包括例如384孔板。在各种实施例中，所述基板可能是具有多个样本区域的一个玻璃或塑料滑片。一块基板的一些示例可能包括但不限于一块多孔板诸如一标准微量滴定96孔板、一384孔板或一微卡，一基本平面载体诸如一玻璃或塑料滑片，或任何其它类型的阵列或微阵列。在一基板的各种实施例中，所述反应位点可能包括孔、凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在所述基板的表面上形成规则或不规则阵列。迄今为止，对孔或板的标引仅为示例性目的，而非以任何方式限制本文可用的反应位点或样本固持器的类型。
所述校准板可以制备成一个棋盘图案，如图7A所示(或如下文更详细描述的图10的384孔板)。如校准板700、720和740所示，所述板本身可以为一96孔形式，但是所述校准板上的孔数可根据需要进行改变，其取决于例如需要校准的染料数量、容纳该校准板的样本块314(见图3)形式，或对不同孔密度的板进行成像的仪器(例如，PCR仪器300)所具备的功能。
染料分布的棋盘图案允许每块校准板对多种染料进行校准。相对于每块校准板校准一种染料，所述棋盘图案有利地允许一用户使用较少的板来校准一个染料组，从而减少染料校准所需的时间和处理步骤。
在图7A所示的实施例中，利用三块板对十种独立的染料进行校准。每块校准板700/720/740被构造成容纳四种不同的染料，这四种染料沿所述板每行中的孔以重复图案交替布置，使得每个孔表示该重复图案中的一种特定染料(存在染料的孔)。例如，板700将FAM、VIC、ROX和SYBR染料容纳于由孔702(FAM)、704(VIC)、706(ROX)和708(SYBR)所示出的交替孔中；板720将一份缓冲液、MP染料、ABY染料和JUN染料容纳于由孔722(缓冲液)、724(MP)、726(ABY)和728(JUN)所示出的交替孔中；并且板740将NED染料、TAMRA染料、CY5染料和一份缓冲液容纳于由孔742(NED)、744(TAMRA)、746(CY5)和748(缓冲液)所示出的交替孔中。在该实施例中，由于仅校准十种染料，因此板720和740中使用缓冲液作为孔的填料，其中不容纳待校准的一种染料。
应当理解，图7A和7B中的实施例仅为一个实例，并且校准的染料总数、每块板的染料数量以及板数都可基于例如根据一用户的校准需求、所述板上的孔数、处理所述校准之仪器的容量而变化。例如，如果要在图7A所示的实施例中校准12种染料，则板720和740中将无需缓冲液，因为三块校准板700/720/740中的每块校准板可校准四种染料，总共可校准12种染料。
此外，每块板的染料数量可以为两种或更多种，其中每块板的最多染料数量基于例如所述校准板上的孔数、用以对一块整板进行正确建模之仪器的功能(见下文的进一步说明)，以及成像系统由所选的板获得可用荧光数据的能力。例如，与图7A所示使用一96孔板相反，可能有一个足够稳定的仪器及相关联的成像系统能够使用如图10中所提供的384孔校准板。在提供附加孔密度的情况下，每块板可以校准更多种染料，例如每板16种染料，并且仍可获得所需的每种染料(例如，24)相同数量的数据点(即，存在染料的孔)以获得足够的全局模型(如下文所详述)。在图10中，例如，可使用两块板校准10种染料，并且每块板可校准5种染料。
甚至样本固持器的类型和反应位点的类型也可能影响合适的染料的数量。如上文所述，可使用其它类型的样本固持器和反应位点进行校准。
返回图5，在步骤504中，可将制得的棋盘状校准板装载进所述仪器中。可一次装载进一台仪器中的板数取决于所用仪器的功能和容量。例如，一个具有一96孔块的标准qPCR热循环仪每次仅容纳一块校准板。然而，多块热循环仪可能提供多个块，每个块各自容纳一块校准板。此外，如果不使用一校准板，则根据所用的样本固持器的形式(例如，微阵列或微芯片阵列)，可以一个单一仪器中使用例如一个适用于所述仪器的加载组件容纳多个样本固持器。
在图5的步骤506中，仪器使用其相关联的光学成像系统(参见例如图4)连续或并行采集所述已装载校准板或板的图像。所采集的图像及相关联的数据可存储于例如图2中计算系统200的存储器206或存储设备210上。该光学成像系统可在每个光学通道处采集每块板的图像。通道的数量取决于所述成像系统中所提供的激发和发射滤光器的数量。例如，对于一个具有6个激发滤光器(X滤光器)和6个发射滤光器(M滤光器)的成像系统，通道的总数为21个，用下列滤光器组合来表示：X1Ml、X1M2、X1M3、X1M4、X1M5、X1M6、X2M2、X2M3、X2M4、X2M5、X2M6、X3M3、X3M4、X3M5、X3M6、X4M4、X4M5、X4M6、X5M5、X5M6和X6M6。每个通道处所采集的图像或曝光的数量可以是变化的。例如，所述成像系统可在每个通道中采集两个图像或曝光。拍摄的图像数量或曝光次数取决于用户需求，因为每个通道拍摄较少的图像或曝光可能减少采集图像或曝光所需的时间，而每个通道拍摄较多的图像或曝光则更有可能获得高质量数据。
在图5的步骤508中，仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图4)采集的图像或曝光中所收集的数据，识别所述校准板上每种染料的峰通道。每个反应位点的这一峰通道是其中所分析的特定染料在该反应位点表现出最强荧光的通道。峰通道识别可能发生在例如95％或更多的反应位点被染料占用时，在此例中允许在校准过程中存在不超过5％的异常反应位点。允许的异常值百分比可以是变化的。然后可以从将来的计算和分析中剔除异常反应位点。异常值可能发生在例如装载错误的染料、染料被装载为不正确的配置、染料的装载不正确或光学部件变脏(例如，灰尘颗粒)的情况下。可通过例如计算系统200的处理器204利用存储器206中存储的数据识别所述校准板上每种染料的峰通道。识别结果可存储于例如计算系统200的存储器206或存储设备210上。
或者，可通过使用本领域中已知背景和均匀性校准方法测定的背景组分和均匀性因子，在峰通道识别之前进行背景和均匀性校正，以对从光学成像系统采集的每个反应位点上每种滤光器组合的图像或曝光中所收集的荧光数据进行校正。
在图5的步骤510中，仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图4)采集的图像或曝光中所收集的数据，针对所有存在染料的孔，将每个通道归一化到步骤508的所述已识别的峰通道。通过例如计算系统200的处理器204利用存储器206中存储的数据可将每个通道归一化到所识别的峰通道。所述归一化的结果可存储于例如计算系统200的存储器206或存储设备210上。
所有存在染料的孔均给出了一个基线量值，由该基线量值进行归一化。一般来讲，该量值越大，则检测到的荧光越强。因此，一种给定染料的已识别峰通道将具有所述存在染料的孔中的该染料之最大量值，峰通道异常值除外。不管该峰通道中的量值如何，为了归一化，该通道处的该量值被重置为1。然后根据峰通道的重置值1来调整其它通道处相同染料的剩余量值。例如，如果对于染料X，峰通道A在所述孔中具有一个100的量值，并且其它通道B在所述孔中具有一个40的量值，则在归一化时，峰通道A被设置为1.0，并且通道B被设置为0.40。此归一化值也被称为校准因子，如上文所述，该峰通道的校准因子被设置为1.0。
在图7A和B所示的实施例中，其中四种染料均匀分散于一块96孔板的孔中，每种染料存在染料的孔数为24个。存在染料的孔数可由于前文所述的原因而变化，所述原因诸如所述样本固持器(例如，校准板)上反应位点(例如，孔)的数量、分散于所述样本固持器上的染料数量。例如，在一块96孔板上，如果分散三种染料，则每种染料存在染料的孔数为32个。如果所述96孔板上分散有六种染料，则每种染料存在染料的孔数为16个。
现在参见图6，在步骤512中，该仪器对每种染料的所有孔进行全局建模。为校准一种样本固持器形式的所有孔的一种染料，该仪器可使用一种特定染料的所述存在染料的孔中之数据对所有孔建模，包括不含特定染料的孔。通过计算系统200的处理器204使用存在染料的孔中特定染料的数据进行全局建模，可对所有孔进行建模。所得模型可存储于例如存储器206或存储设备210上。参见图7A，对于存在于板700的24个孔702中的所述FAM染料，该板上的其它72孔将不存在FAM染料。相同的24个存在/72个不存在的分布将适用于图7A中的每种染料。不存在染料的孔数取决于存在染料的孔数，如上文所述，存在染料的孔数可取决于多种因素。无论如何，一块给定板上存在染料的孔和不存在染料的孔的总和等于该板上的孔数。图7B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图7A所示的板700具有相同的构形。
在一个另选的实施例中，该仪器对所有通道或具有例如大于已识别峰通道0.01％或1％的归一化值的那些通道进行全局建模。对于低于此阈值的那些通道，该仪器将执行局部建模(见图6的步骤522)而非执行全局建模。在某些通道处电平如此之低的情况下，全局建模可能变得不必要，在此情况下检测到的荧光主要是例如噪音或其它干扰的结果，而不是被校准的实际染料的贡献。
一种全局建模算法可用于一次染料校准中，以基于所述测定的特定存在染料的孔的染料校准因子推导出每种染料的每个滤光器通道的染料校准因子之模型。例如，如果所述96孔棋盘状板上存在特定染料的孔为24个，则全局建模利用这24个孔的染料校准因子推导出包括其它检测到不存在染料的72个孔在内的所有孔的校准因子，从而生成一个针对每种染料每个通道的整块板的模型。
二维(2D)二次多项式函数是一个实例，所涉及的是可用作染料校准因子的一个全局模型的一个函数。其它全局建模函数是已知的，并且可用于本文中。可使用一个非线性最小二乘法求解器以通过最大程度减小模型残差(出于所述模型所计算的值与测定的染料校准因子之差)，从测定的特定存在染料的孔的染料校准因子来导出2D二次多项式函数。Levenberg-Marquardt置信域算法可用作此求解器中的优化算法。但是本文可以使用许多其它优化算法，另一个实例是Dogleg方法，该方法的关键在于使用高斯-牛顿和Cauthy方法以计算优化步骤从而优化非线性对象。此方法使用称为置信域的搜索空间之子集上的模型函数(通常为二次式)近似得到目标函数。如果该模型函数成功使真实的目标函数最小化，则置信域得到扩展。相反，如果近似结果不理想，则缩小该域并且再次应用所述模型函数。一个损失函数，例如，也可能用以减小高残差(计算得到的校准因子和测定的校准因子之间的最大差值)的影响。这些高残差通常基于所述优化构成异常值。
在图6的步骤514中，针对一种给定染料和多种染料对所有孔建模后，该仪器执行一次拟合优度(GOF)检验。这样可确保所述全局建模步骤足够可靠。通过例如计算系统200的处理器204使用存储于例如存储器206或存储设备210中的结果，可执行一次GOF检验。拟合优度的量度通常总结了观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异。GOF可通过多种方式测定，包括例如确定系数R平方和均方根误差(RMSE)值。例如，R平方是一个统计量，可提供有关一个模型之拟合优度的一些信息。在回归分析中，所述R平方确定系数是一种统计量度，涉及的是回归线接近实际数据点的程度。一个R平方等于1指示所述回归线与数据完全吻合。RMSE是观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异或残差的均方的平方根。RMSE是对模型之预测精度的良好测量。一个RMSE等于0指示模型预期的值与观测值精确匹配。
图8示出应用为96孔棋盘板的全局模型的示例性2D二次多项式函数，其中FAM染料在通道XIM2。相比之下，来自具有96个检测值的全染料板的纯FAM理论值覆盖模型。图9通过将测量的一块整板的染料校准因子(x轴)与棋盘板的建模染料校准因子(y轴)比较来提供全局建模性能的表示。这个例子中计算的R平方值是0.983，从而建立良好的GOF。
在图6的步骤516中，如果拟合良好，则该仪器在图6的步骤518中输出一个染料矩阵。在统计学上拟合良好的结果可发生在以下情况下：例如在R平方分析中，当R平方值大于或等于0.85时；或RMSE值为例如小于或等于0.01时，如图9。可通过例如计算系统200的处理器204制备染料矩阵并且输出到显示器212。
在图6的步骤520中，如果拟合不佳，则该仪器在图6中的步骤522中执行一个局部建模。这可能是必要的，例如，如果一次GOF校验的计算所得R值小于0.85以及例如RMSE值大于0.01。可通过计算系统200的处理器204使用所述存在染料的孔中之一种特定染料的数据对剩余不存在染料的孔进行建模。所得模型可存储于例如存储器206或存储设备210上。
一种局部建模方法可包括例如使用所述校准因子，这些校准因子来自所述板上相同染料之周围存在染料的孔。例如，为对一种特定染料测定一个不存在染料的孔之校准因子值，所述局部模型可以取周围孔的一个5×5局部窗口内或整个板中相同染料的所有特定存在染料的孔之中值。测定该中值直至完成该板的一个完整建模。然后所述局部建模输出可替代全局建模输出。
在所述局部建模完成时，该染料矩阵足以使得仪器在图6的步骤518中输出所述染料矩阵。此染料矩阵用作每种经校准染料之所述荧光特征图的一个分布图。在每次运行后，该仪器接收呈每个读数的一个原始光谱信号形式的数据。仪器通过比较所述原始光谱与染料矩阵的纯光谱校准数据来确定每次反应中所用荧光染料的贡献。仪器使用从染料标样(即，染料矩阵)所采集的校准数据来表征和区分每种染料在该仪器所采集的总荧光中的单独贡献。
在第一实施例中，提供一种用于校准荧光染料的计算机实现的方法，所述方法包括：样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和生成包括一组染料参考值的染料矩阵。
在第二实施例中，提供如第一实施例的计算机实现的方法，其中样本固持器是板。
在第三实施例中，提供如第一和第二实施例的计算机实现的方法，其中多个反应位点是多个孔。
在第四实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中一种染料占用每个孔。
在第五实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
在第六实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
在第七实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中仪器是生物分析设备。
在第八实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中仪器是PCR仪器。
在第九实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
在第十实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点应用二维二次多项式函数作为第一个模型。
在第十一实施例中，提供如第九和第十实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：对所述第一个模型的所述结果执行拟合优度检验。
在第十二实施例中，提供如第九和第十实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：对第一个模型的结果执行r平方分析或RMSE。
在第十三实施例中，提供如第九到第十二实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第十四实施例中，提供如第九到第十二实施例中任一实施例的计算机实现的方法，还包括：当第一个模型的拟合优度未能达到阈值时，对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第十五实施例中，提供如第十二实施例的计算机实现的方法，还包括：当第一个模型的r平方分析未能达到阈值时，对于给定染料，向未被给定染料占用的反应位点执行r平方或RMSE分析。
在第十六实施例中，提供如第十四实施例和第十五实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中r平方的阈值是0.85且RMSE的阈值是0.01。
在第十七实施例中，提供如前述实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中一种以上染料选自由包含以下组成的群：FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA、CY5、定制染料和其组合。
在第十八实施例中，提供一种非暂态计算机可读存储介质，其编码有当被处理器执行时校准荧光染料的指令，所述指令包括用于以下操作的指令：一个样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和生成包括一组染料参考值的染料矩阵。
在第十九实施例中，提供如第十八实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中样本固持器是板。
在第二十实施例中，提供如第十八和第十九实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中多个反应位点是多个孔。
在第二十一实施例中，提供如第十八到第二十实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中一种染料占用每个孔。
在第二十二实施例中，提供如第十八到第二十一实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
在第二十三实施例中，提供如第十八到第二十二实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
在第二十四实施例中，提供如第十八到第二十三实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中仪器是生物分析设备。
在第二十五实施例中，提供如第十八到第二十四实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中仪器是PCR仪器。
在第二十六实施例中，提供如第十八到第二十五实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
在第二十七实施例中，提供如第十八到第二十六实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括：对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点应用二维二次多项式函数作为第一个模型。
在第二十八实施例中，提供如第二十六和第二十七实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括对所述第一个模型的所述结果执行拟合优度检验。
在第二十九实施例中，提供如第二十六和第二十七实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括对第一个模型的结果执行r平方分析。
在第三十实施例中，提供如第二十六到第二十九实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第三十一实施例中，提供如第二十六到第二十九实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括：当第一个模型的拟合优度未能达到阈值时，对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第三十二实施例中，提供如第二十六到第二十九实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，还包括：当第一个模型的r平方分析未能达到阈值时，对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行r平方分析或RMSE。
在第三十三实施例中，提供如第二十六到第三十二实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中r平方的阈值是0.85且RMSE的阈值是0.01。
在第三十四实施例中，提供如第十八到第三十三实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中一种以上染料选自由包含以下组成的群：FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA、CY5、定制染料和其组合。
在第三十五实施例中，提供一种用于校准荧光染料的系统，系统包括处理器；和存储器，所述存储器编码有可由所述处理器执行的指令，所述指令用于：样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和生成包括一组染料参考值的染料矩阵。
在第三十六实施例中，提供如第三十五实施例的系统，其中样本固持器是板。
在第三十七实施例中，提供如第三十五和第三十六实施例中任一实施例的系统，其中多个反应位点是多个孔。
在第三十八实施例中，提供如第三十五到第三十七实施例中任一实施例的系统，其中一种染料占用每个孔。
在第三十九实施例中，提供如第三十五到第三十八实施例中任一实施例的系统，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
在第四十实施例中，提供如第三十五到第三十九实施例中任一实施例的系统，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
在第四十一实施例中，提供如第三十五到第四十实施例中任一实施例的系统，其中仪器是生物分析设备。
在第四十二实施例中，提供如第三十五到第四十一实施例中任一实施例的系统，其中仪器是PCR仪器。
在第四十三实施例中，提供如第三十五到第四十二实施例中任一实施例的系统，还包括对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
在第四十四实施例中，提供如第三十五到第四十二实施例中任一实施例的系统，还包括：对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点应用二维二次多项式函数作为第一个模型。
在第四十五实施例中，提供如第四十三到第四十四实施例中任一实施例的系统，还包括对所述第一个模型的所述结果执行拟合优度检验。
在第四十六实施例中，提供如第四十三到第四十四实施例中任一实施例的系统，还包括对第一个模型的结果执行r平方或RMSE分析。
在第四十七实施例中，提供如第四十三到第四十六实施例中任一实施例的系统，还包括对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第四十八实施例中，提供如第四十三到第四十六实施例中任一实施例的系统，还包括：当第一个模型的拟合优度未能达到阈值时，对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
在第四十九实施例中，提供如第四十三到第四十六实施例中任一实施例的系统，还包括：当第一个模型的r平方分析未能达到阈值时,对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行r平方分析。
在第五十实施例中，提供如第四十八到第四十九实施例中任一实施例的系统，其中r平方阈值是0.85且RMSE阈值是0.01。
在第五十一实施例中，提供如第三十五到第五十实施例中任一实施例的系统，其中一种以上染料选自由包含以下组成的群：FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA、CY5、定制染料和其组合。
在第五十二实施例中，提供一种用于校准荧光染料的样本固持器，样本固持器包括多个反应位点，多个反应位点中的每个反应位点被配置以接受单个染料，且其中样本固持器被配置以接受一种以上染料。
在第五十三实施例中，提供如第五十二实施例的样本固持器，其中样本固持器是板。
在第五十四实施例中，提供如第五十二到第五十三实施例中任一实施例的样本固持器，其中多个反应位点是多个孔。
在第五十五实施例中，提供如第五十二到第五十四实施例中任一实施例的样本固持器，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得一种以上染料中的每种染料占用与一种以上染料中其它染料基本相同数量的反应位点。
在第五十六实施例中，提供如第五十二到第五十五实施例中任一实施例的样本固持器，其中染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
在第五十七实施例中，提供如第五十二到第五十五实施例中任一实施例的样本固持器，其中染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
在第五十八实施例中，提供如第五十二到第五十六实施例中任一实施例的样本固持器，其中染料的分布形成棋盘图案。
在第五十九实施例中，提供如第五十二到第五十七实施例中任一实施例的样本固持器，其中单个染料分布在每个反应位点中。
在第六十实施例中，提供如第一到第六实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
在第六十一实施例中，提供如第一到第六实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中染料的分布形成棋盘图案。
在第六十二实施例中，提供如第十八到第二十三实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
在第六十三实施例中，提供如第十八到第二十三实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中染料的分布形成棋盘图案。
在第六十四实施例中，提供如第三十五到第四十实施例中任一实施例的系统，其中染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
在第六十五实施例中，提供如第三十五到第四十实施例中任一实施例的系统，其中染料的分布形成棋盘图案。
在第六十六实施例中，提供如第一到第十七实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中样本固持器包括3种染料。
在第六十七实施例中，提供如第一到第十七实施例中任一实施例的计算机实现的方法，其中样本固持器包括4种染料。
在第六十八实施例中，提供如第十八到第三十四实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中样本固持器包括3种染料。
在第六十九实施例中，提供如第十八到第三十四实施例中任一实施例的非暂态计算机可读存储介质，其中样本固持器包括4种染料。
在第七十实施例中，提供如第三十五到第五十一实施例中任一实施例的系统，其中样本固持器包括3种染料。
在第七十一实施例中，提供如第三十五到第五十一实施例中任一实施例的系统，其中样本固持器包括4种染料。
在第七十二实施例中，提供如第五十二到第五十八实施例中任一实施例的样本固持器，其中样本固持器被配置以接受3种染料。
在第七十三实施例中，提供如第五十二到第五十八实施例中任一实施例的样本固持器，其中样本固持器被配置以接受4种染料。
在第七十四实施例中，提供如第五十九实施例的样本固持器，还包括3种染料。
在第七十五实施例中，提供如第五十九实施例的样本固持器，还包括4种染料。
上文已描述了本发明的各种实施例。应理解，这些实施例仅以举例而非限制的方式呈现。相关领域技术人员应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行上文描述的实施例的形式和细节的各种改变，本发明的精神和范围由以下权利要求书限定。因此，本发明的广度和范围不应由上述示例性实施例中任一实施例限制，而是仅应根据以下权利要求书及其等效物来限定。

Claims (20)

1.一种用于校准荧光染料的计算机实现的方法，所述方法包括：
一个样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到一个仪器上，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；
识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；
将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和
生成包括一组染料参考值的一个染料矩阵。
2.如权利要求1所述的计算机实现的方法，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
3.如权利要求1所述的计算机实现的方法，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
4.如权利要求1所述的计算机实现的方法，其中所述染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
5.如权利要求1所述的计算机实现的方法，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
6.如权利要求5所述的计算机实现的方法，进一步包括：
对所述第一个模型的所述结果执行拟合优度检验。
7.如权利要求5所述的计算机实现的方法，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
8.一种非暂态计算机可读存储介质，其以处理器可执行的指令编码，以便校准荧光染料，所述指令包括用于以下操作的指令：
样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；
识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；
将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和
生成包括一组染料参考值的一个染料矩阵。
9.如权利要求8所述的非暂态计算机可读存储介质，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
10.如权利要求8所述的非暂态计算机可读存储介质，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
11.如权利要求8所述的非暂态计算机可读存储介质，其中所述染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
12.如权利要求8所述的非暂态计算机可读存储介质，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
13.如权利要求12所述的非暂态计算机可读存储介质，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
14.一种用于校准荧光染料的系统，所述系统包括：
一个处理器；和
一个存储器，所述存储器可由所述处理器执行的指令编码，所述指令用于：
样本固持器成像，所述样本固持器在一个以上通道上加载到仪器，所述样本固持器包括多个反应位点和一种以上染料类型，其中每种染料占用一个以上反应位点；
识别所述样本固持器上每种染料的一个峰通道；
将每个通道归一化为每种染料的所述峰通道；和
生成包括一组染料参考值的一个染料矩阵。
15.如权利要求14所述的系统，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得每种染料占用基本相同数量的反应位点。
16.如权利要求14所述的系统，其中所述染料沿着所述反应位点以一种图案分布，使得占用相邻反应位点的染料不同。
17.如权利要求14所述的系统，其中所述染料沿着所述反应位点以一种重复交替图案分布。
18.如权利要求14所述的系统，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第一个模型。
19.如权利要求18所述的系统，进一步包括：
对所述第一个模型的所述结果执行拟合优度检验。
20.如权利要求18所述的系统，进一步包括：
对于给定染料，向未被所述给定染料占用的反应位点执行第二个模型。
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