CN107404899B

CN107404899B - 变性豌豆蛋白质溶液及其形成微粒的用途

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Publication number: CN107404899B
Application number: CN201580076105.8A
Authority: CN
Inventors: S·布莱尔; R·肯特
Original assignee: Nuobimei Co ltd
Current assignee: Sante Biology Co ltd; Anabio Technologies Ltd
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: WO2016096929A1; EP3628168A1; US20230354849A1; ES2837173T3; AU2015367632B2; DK3232806T3; EP3232806B1; CA2970975A1; AU2015367632A1; EP3628168B1; EP3232806A1; US20170367373A1; EP3042571A1; CN107404899A; EP3628168C0

Abstract

一种生产变性豌豆蛋白质溶液的方法，其包括以下步骤：将豌豆蛋白质与碱性溶剂混合以提供pH至少为10的1‑10％豌豆蛋白质溶液(w/v)，将所述豌豆蛋白质溶液静置至少15分钟，在足以使豌豆蛋白质热变性而不引起所述豌豆蛋白质溶液凝胶化的条件下加热豌豆蛋白质溶液，并迅速冷却所述变性豌豆蛋白质溶液以防止凝胶化，其中所述变性豌豆蛋白质溶液中至少90％的豌豆蛋白质是可溶的。本发明还描述了一种生产具有变性豌豆蛋白质基质的微粒的方法，所述方法包括以下步骤：提供根据本发明的变性豌豆蛋白质溶液，处理所述变性豌豆蛋白质溶液以形成微滴；以及交联和螯合所述液滴以形成微粒。

Description

变性豌豆蛋白质溶液及其形成微粒的用途

技术领域

本发明涉及变性豌豆蛋白质溶液。具体地，本发明涉及制备变性豌豆蛋白质溶液的方法，其适用于形成微粒，该微粒适合哺乳动物口服并且完整递送至哺乳动物小肠。本发明还涉及制备微粒的方法，以及根据本发明的方法形成微粒。

背景技术

从动物衍生产品(牛奶、胶原)中提取的动物蛋白质(乳清蛋白、明胶、酪蛋白)广泛用于活性物质的胶囊化(encapsulation)。这些天然聚合物具有明显的优点：生物相容性、生物降解性、良好的两亲性质和功能性质，如水溶性，以及乳化和发泡能力。但是，成本、变应原性和市场局限性表明了动物衍生蛋白质的一些不足。目前，广泛存在基于动物蛋白质的微粒，这与植物蛋白质在工业中非常有限的使用形成对比。这种趋势在未来几年应该被逆转。在食品应用中，与动物衍生蛋白质相比，植物蛋白质具有较少的过敏原是已知的。由于这些原因，在过去几年中，富含蛋白质的植物产品的新应用开发已经成为越来越令人感兴趣的研究领域。在过去十年中，由于消费者对动物衍生产品的安全性的担忧增加，蛋白质原料产业已经转向作为动物来源的首选替代品的植物，例如素食。

喷雾干燥和凝聚是主要用于将植物蛋白质活性物质微胶囊化的两种技术。两种方法都具有将植物蛋白质作为可再生和可生物降解的资源的“绿色化学”的方面，另外，这两种技术不需要使用有机溶剂。还可以考虑其它方法，比如溶剂蒸发技术；但是，需要引入其它赋形剂和多糖以产生明确的结构。

喷雾干燥是将初始液体转化成微粒的固体粉末的连续方法。这是非常常见的脱水方法，用于形成包裹活性物质的连续基质。该技术提供了几个优点：简单、相对廉价和快速。通过喷雾干燥成功地进行微胶囊化的重要因素是外壳材料在水中的高溶解度和在高固体含量下的低粘度。这种技术的缺点是大量产品的损失(由于微粒对喷雾干燥器壁的粘附)以及敏感产品在高干燥温度下降解的可能性。

通过凝聚进行微胶囊化是通过在以下因素之一的作用下沉淀活性核周围的壁形成材料进行的：pH或温度的变化，加入非溶剂或电解质化合物通过简单或复杂的方法发生凝聚。简单的凝聚仅涉及一种胶体溶质，从而形成单一的聚合物膜。通过混合两种相反电荷的聚电解质来产生复合凝聚，以便允许在活性核周围形成壳。Ducel等人(2004)通过复合凝聚外加pH和聚合物浓度对微胶囊大小的影响，研究了豌豆球蛋白(等电点在pH 4.4-4.6之间)用于甘油三酯微胶囊化的用途。在初始组成中增加豌豆球蛋白/阿拉伯胶(50:50)的混合浓度，导致微胶囊大小增加。例如，在pH 3.5时，浓度范围为1g/L至10g/L的微胶囊的直径分别从28μm变化到97μm。Conversely,Lazko等人(2004a)观察到随着大豆蛋白质浓度的增加，凝聚体的大小减小。事实上，随着蛋白质浓度从0.5g/L增加到5g/L，获得的微粒的平均直径分别从153μm下降到88μm。在公开的结果之间的这种不一致可能是由于凝聚过程的差异所致。将复合凝聚用在豌豆蛋白质的情况下，颗粒团聚和凝聚增加了其大小。在初始制备中，多糖的存在也可以影响凝聚体团聚(Klassen和Nickerson，2012)。另一方面，简单的凝聚用于制备大豆蛋白质微粒。乳液中较高浓度的表面活性蛋白质增加了凝聚体的凝聚抗性。

Klemmer等人(International Journal of Food Science and Technology2011,46,2248-2256)描述了豌豆蛋白质溶液及其制备含有益生菌的胶囊的用途。Klemmer的方法涉及将豌豆分离蛋白质溶解在碱性溶剂中，加热该溶液使蛋白质变性，然后冷却该变性蛋白质。然后将藻酸盐加入到所述变性蛋白质溶液中，接着将生物聚合物混合物进行进一步的加热和冷却步骤，然后加入益生菌并通过一针头挤出所述混合物以产生在钙浴中交联的液滴来形成平均直径约2mm的胶囊。使用豌豆/藻酸盐溶液作为胶囊化的基质用于口服消化是有问题的，因为豌豆/藻酸盐基质不能在胃转运(gastric transit)中存在，而是在胃中酸性条件下被破坏，分解释放出益生菌。此外，向豌豆蛋白质溶液中加入藻酸盐会使生物聚合物混合物的粘度增加到难以加工成微滴的程度，这意味着所得到的胶囊是大的而不是微珠或微胶囊。

本发明的目的是提供适用于形成微粒的变性豌豆蛋白质溶液及其生产方法。本发明的另一个目的是提供形成豌豆蛋白质微粒的方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了具有非常高含量的可溶性豌豆蛋白质的变性豌豆蛋白质溶液(即大于90％，使用下述方法)，并且具有足够低的粘度以使其能够在微珠形成期间通过喷嘴(包括喷雾干燥喷嘴和雾化轮)被挤出或喷雾。高含量的可溶性变性豌豆蛋白质提供了最大化使用豌豆蛋白质底物的有效方法。此外，根据本发明的方法形成的变性豌豆蛋白质溶液，其具有约为6-9％(w/v)的豌豆蛋白质浓度，可以在酸中有效聚合以形成微小的微粒，而不需要在基质中添加额外的生物聚合物，形成的微粒能够完整地胃转运和小肠释放，特别是回肠释放。

在第二方面，本发明提供了生产豌豆蛋白质微粒的方法，所述豌豆蛋白质微粒为球形，通常具有均匀的粒径分布，并且在通过哺乳动物的胃后完好无损，并随后在小肠中，特别是回肠中分解。这允许所述微粒将酸敏感活性剂递送到小肠而完好无损。此外，所述球形微粒及其均匀的粒径分布允许受控的和可重复的活性剂释放动力学。生产所述微粒的方法包括形成本发明的变性豌豆蛋白质溶液的液滴，然后在酸性浴中将所述液滴冷凝胶化(cold gelation)。令人惊奇的是，申请人发现使用具有与豌豆蛋白质的pI相同的pH的酸性凝胶浴导致形成形状不规则的微粒，并且为了获得高度球形的微珠(如图2所示的那些)要求所述凝胶浴的pH值小于豌豆蛋白质的pI。

在第一方面，本发明提供了生产变性豌豆蛋白质溶液的方法，包括以下步骤：

将豌豆蛋白质溶解在溶剂中以提供1-10％的豌豆蛋白质溶液(w/v)；

将所述溶解的豌豆蛋白质溶液静置至少15分钟，以进一步将所述豌豆蛋白质溶解和水合；

在足以使豌豆蛋白质热变性而不会引起所述豌豆蛋白质溶液凝胶化的条件下加热所述静置的豌豆蛋白质溶液；和

快速冷却所述变性豌豆蛋白质溶液以防止蛋白质凝胶化；其中在所述变性豌豆蛋白质溶液中，至少90％的豌豆蛋白质通常是可溶的。

在一个实施例中，在静置之前，将所述豌豆蛋白质通过化学或物理方法溶解。化学溶解通常包括将豌豆蛋白质与碱混合，以提供pH为10或更高的碱性豌豆蛋白质溶液。物理溶解包括用物理方法处理溶剂中的蛋白质的分散体(或部分分散体的部分溶液)，例如声能量(声处理(sonication)或超声波处理)。所述溶剂通常是水性溶剂，例如磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。通常，所述溶剂的pH约为6-9。理想地，所述缓冲液的pH约为7-8。

在一个实施例中，通过将该豌豆蛋白质与碱性溶剂混合来溶解所述豌豆蛋白质，以提供1-10％的豌豆蛋白质溶液(w/v)。

通常，将所述豌豆蛋白质与碱性溶剂混合以提供pH至少为7(在一个实施例中pH至少为10)的6-9％豌豆蛋白质溶液(w/v)。

优选地，将所述豌豆蛋白质与碱性溶剂混合以提供pH为7至10的豌豆蛋白质溶液。

通常，将冷却的变性豌豆蛋白质溶液澄清以除去不溶物质。各种澄清方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。优选地，通过离心来澄清所述溶液。

通常，将所述豌豆蛋白质溶液静置至少30分钟。理想地，将所述豌豆蛋白质溶液静置至少40分钟。在一个实施例中，将豌豆蛋白质溶液静置至少45、50、60、70、80、90、100、110、120分钟。

在另一方面，本发明提供了溶剂中包含1-10％变性豌豆蛋白质(w/v)的变性豌豆蛋白质溶液，其中，在所述变性豌豆蛋白质溶液中，至少90％的豌豆蛋白质是可溶的。

在一个实施例中，所述溶剂是碱性溶剂，并且所述溶液的pH至少为10。

优选地，所述变性豌豆蛋白质溶液包含6-9％变性豌豆蛋白质(w/v)。理想地，所述变性豌豆蛋白质溶液包含6.5-8.5％变性豌豆蛋白质(w/v)。

优选地，在变性豌豆蛋白质溶液中，至少95％的豌豆蛋白质是可溶的。

优选地，变性豌豆蛋白质溶液具有足够低的粘度以使溶液被挤出形成微滴。

在另一方面，本发明提供生产具有变性豌豆蛋白质基质的微粒的方法，该方法包括以下步骤：

处理根据本发明的变性豌豆蛋白质溶液或根据本发明的方法形成的变性豌豆蛋白质溶液，以形成微滴；和

交联(和任选地)螯合所述微滴以形成微粒。

优选地，交联和螯合所述液滴的步骤包括在酸性凝胶浴(通常其具有的pH小于豌豆蛋白质的pI)中立即将液滴凝胶化以形成微粒。

适当地，处理所述变性豌豆蛋白质溶液以形成微滴的步骤包括通过喷嘴组件挤出所述溶液以形成微滴的步骤。

在一个实施例中，在所述形成微滴的步骤之前和任选地在加热步骤之后，将活性剂加入到所述变性豌豆蛋白质溶液中，其中所述喷嘴组件通常包括单喷嘴，并且其中所述微粒是具有连续变性豌豆蛋白质基质的微珠，活性剂分布在整个变性豌豆蛋白质基质中。优选地，将所述喷嘴加热。

在另一实施例中，所述喷嘴组件包括外部喷嘴，该外部喷嘴同心地围绕内部喷嘴设置，其中所述变性豌豆蛋白质溶液通过外部喷嘴挤出，包含活性剂的活性剂溶液通过内部喷嘴挤出，并且其中所述微粒是具有变性豌豆蛋白质壳和包含活性剂的核的微胶囊。

通常，所述喷嘴组件包括静电电压系统，该静电电压系统配置为在喷嘴和设置在喷嘴下方的电极之间施加电势。所述喷嘴也可以代表在喷雾干燥器中遇到的典型喷嘴。

在优选的实施例中，本发明提供了生产微粒的方法，所述微粒通常为球形微粒，理想地，所述球形微粒具有均匀的粒径分布，所述微粒具有变性豌豆蛋白质基质，该方法包括以下步骤：

提供根据发明的6-9％变性豌豆蛋白质溶液或根据本发明的方法形成的6-9％变性豌豆蛋白质溶液；

通过喷嘴组件挤出所述溶液以形成微滴；并立即在pH小于豌豆蛋白质的pI的酸性凝胶浴中，将微滴凝胶化以形成球形微珠。

本发明还涉及具有壳和包含天然蛋白质的核的微胶囊。在一个实施例中，所述天然蛋白质是天然植物蛋白质。在一个实施例中，所述天然蛋白质是豌豆蛋白质。在一个实施例中，所述微胶囊是耐胃酸的(gastric resistant)(其可以完整地通过哺乳动物(特别是人)的胃)。在一个实施例中，所述微胶囊能够在哺乳动物(特别是人)的小肠，优选回肠，理想地近端回肠中，释放所述核。在一个实施例中，所述壳是变性蛋白质。在一个实施例中，所述壳是变性豌豆蛋白质。在一个实施例中，所述微胶囊用壳聚糖或明胶包衣。

本发明还涉及具有由聚合生成的聚合物形成的连续基质和分散在整个聚合生成的聚合物基质中的活性剂的微珠。在一个实施例中，所述微珠是耐胃酸的。在一个实施例中，所述微珠能够在哺乳动物(特别是人)的小肠，优选回肠，理想地近端回肠中，释放所述活性剂。在一个实施例中，所述聚合生成的的聚合物是变性蛋白质。在一个实施例中，所述变性蛋白质是变性豌豆蛋白质。在一个实施例中，所述微珠用壳聚糖或明胶包衣。

本发明还涉及根据本发明的方法形成的微粒。

在一个实施例中，本发明的微粒(或根据本发明的方法形成的)(即微珠或微胶囊)被包衣在壳聚糖或明胶中。这可以通过将所述微粒浸入含有壳聚糖或明胶的浴中，并使微粒在所述浴中浸入一段时间以使壳聚糖或明胶在微粒上形成包衣来实现。在一个实施例中，壳聚糖浴包含在弱有机酸溶剂(即乙酸)中的0.5-2.0％的壳聚糖(w/v)。在一个实施例中，明胶浴包含在弱有机酸(即乙酸)或水性溶剂中的0.5-5.0％的明胶(w/v)。在一个实施例中，本发明的方法包括将所述微粒包衣在壳聚糖或明胶溶液中的额外步骤，任选地通过将所述微粒浸入明胶或壳聚糖浴中。

附图说明

图1：豌豆蛋白质微珠和胶囊的红外光谱。

图2：胶囊化后(A)和存在胶囊化的益生菌培养物(B)的豌豆蛋白质微珠的光学显微镜图像。条形代表200微米。

图3：使用BAC光共聚焦染色的豌豆蛋白质微珠的共聚焦显微镜图像。绿色荧光表示活的益生菌，红色荧光表示死的益生菌。图A示出了微珠形貌；图B和C示出了微珠膜的大表面积

图4：蛋白质微胶囊(A)和微珠(B)的表面的原子力显微镜图像

图5：豌豆蛋白质微珠体外胃肠递送的光学显微镜图像。图像示出了(A)在pH 1.6，胃温育(incubation)30min后；(B)在pH 1.6，胃温育180min后；图C示出了肠道温育(pH7.2)5min后的微珠消化。

图6：在体外胃温育期间，豌豆蛋白质微珠的拉伸强度。

图7：在体外胃肠道温育期间，豌豆蛋白质微珠逐渐溶解的可视化。肠道温育30min后，尺寸排阻HPLC测定从微胶囊(B)释放的蛋白质/肽。蛋白质/肽标准品(◆)的标准曲线示出了在肠道样品中发现的典型的肽的分子量。

图8:_8％(w/v)市售的豌豆分离蛋白质微珠中的菌株的胶囊化率。豌豆蛋白质悬浮液表示市售的豌豆分离蛋白质中存在游离细胞。豌豆蛋白质微珠表示在豌豆蛋白质悬浮液微胶囊化并且洗涤(在水中)后检测到的活细胞的水平。图B示出了胶囊化前的基质/细菌混合物(橙色)和胶囊化后的具有高的细胞能力的细菌微珠(灰色)的CFU/克的比较。

图9：在最终产物/样品中存活的游离细菌细胞，将细菌细胞包囊在8％(w/v)市售的豌豆分离蛋白质微珠内和将游离的细菌细胞包囊在8％(w/v)的市售的豌豆分离蛋白质悬浮液中。灰色条表示在最终样品/产物中的细胞浓度。每个样品分别加水保持在～85℃下90秒，接着在冰上冷却。使用平板计数法分析细胞活力。

图10：示出了在候选人体内的胃中存在豌豆蛋白质胶囊。

图11：豌豆蛋白质微胶囊在体内胃肠道输送过程中，肽和游离氨基酸在空肠中的释放。

图12：示出了存在完整的蛋白质(蓝线)和肽释放。黑线是在候选人的空肠和回肠内，通过尺寸排阻HPLC测定的。红色基线表示在T＝10min的肠道内消化鉴定的肽的痕量。

图13：使用在热变性ADDED步骤之前不静置的变性豌豆蛋白质溶液，通过包球(englobbing)方法制造的微珠。

具体实施方式

定义

“豌豆蛋白质”应该理解为指豌豆蛋白质源，例如全部的豌豆蛋白质。优选地，所述豌豆蛋白质是豌豆分离蛋白质(PPI)、豌豆浓缩蛋白质(PPC)，或两者的组合。在一个实施例中，按重量计，所述豌豆蛋白质具有豌豆蛋白质源的至少70％(即至少90％)豌豆蛋白质的纯度。在一个实施例中，所述豌豆蛋白质具有至少80％的纯度。在一个实施例中，所述豌豆蛋白质具有至少90％的纯度。具有高纯度的豌豆蛋白质的实例包括具有低灰分含量的材料。

“部分溶解”是指所述豌豆蛋白质基本上(但不是完全地)溶解在适当的溶剂中。通常，高达60％或70％的豌豆蛋白质溶解。部分溶解通常用化学方法(即碱增溶)或物理方法(例如，声处理来实现。需要静置的步骤来实现更彻底的增溶，例如增溶90％或更多的豌豆蛋白质。

“碱性溶剂”是指合适的碱(例如NaOH或KOH)的水溶液。优选地，所述碱性溶剂包含0.05-0.2M(更优选0.05-0.15)的碱的水溶液。理想地，所述碱性溶剂包含0.075-0.125M的碱的水溶液。通常，所述碱性溶剂是NaOH的水溶液，例如0.05-0.2M NaOH。优选地，所述碱性溶剂包含0.05-0.2M NaOH或KOH的水溶液，更优选0.05-0.15NaOH或KOH。理想地，所述碱性溶剂包含0.075-0.125M NaOH或KOH的水溶液。

“pH至少为10”是指pH大于10，通常地，pH为10-13或10-12。理想地，所述豌豆蛋白质溶液的pH为10.5至11。

“声处理”是指应用声能量来部分溶解以及水合所述豌豆蛋白质。该方法通常包括制备豌豆蛋白质的分散体/溶液，然后将声能量(通常是超声频率的声音)施加在分散体/溶液中足够的时间以溶解以及水合所述豌豆蛋白质。声波仪(sonicators)可以从QsonicaLLC和SinapTec购买。

“豌豆蛋白质溶液”是指包含可溶性豌豆蛋白质和任选不溶性豌豆蛋白质的液体豌豆蛋白质组合物。本发明的方法提供了包含高浓度可溶性豌豆蛋白质的豌豆蛋白质溶液，通常大于90％或95％(例如95-98％可溶性豌豆蛋白质)。当所述豌豆蛋白质与碱性溶剂混合，或声处理所述豌豆蛋白质时，在静置步骤中可溶性豌豆蛋白质的量将逐渐增加，直到高含量的豌豆蛋白质溶解，此时豌豆蛋白质溶液是热变性的。这导致具有极高含量的变性豌豆蛋白质的变性豌豆蛋白质溶液以可溶性变性豌豆蛋白质聚集体的形式存在。

应用于豌豆蛋白质(或变性豌豆蛋白质)的术语“可溶性”或“溶解的”应理解为豌豆蛋白质以可溶性豌豆蛋白质聚集体的形式存在。通常，该术语是指在4℃以10,000×g离心30分钟后，所述可溶性聚集体不会从溶液中析出。

“将豌豆蛋白质溶液静置”是指将所述豌豆蛋白质溶液放置一段时间以使豌豆蛋白质溶解在碱性溶剂中。通常，将豌豆蛋白质溶液静置至少20、25、30、35、40或45分钟。通常，将所述豌豆蛋白质溶液在室温下静置。通常，将所述豌豆蛋白质溶液静置一段时间，直到至少90％的豌豆蛋白质溶解。在静置之前，所述豌豆蛋白质溶液趋于浑浊和不透明并含有沉淀物，但在静置一段时间后，随着溶解的豌豆蛋白质的量增加，浑浊消失。例如，所述静置步骤可将溶解的蛋白质的％从60％提高到90％或更高。

“足以使豌豆蛋白质热变性而不引起豌豆蛋白质溶液凝胶化的条件”是指将溶液中存在的豌豆蛋白质至少变性90％、95％或99％的温度和时间处理，同时保持溶液的形式适于挤出(即具有合适粘度，易于流动)。采用的温度和时间可以根据所述豌豆蛋白质溶液的浓度而变化。因此，例如，当使用8％豌豆蛋白质溶液(w/v)时，所述溶液可以在80-90℃的温度下处理20-30分钟(或优选的，在85℃下处理25分钟)。但是，应当理解也可以采用更高的温度和更短的时间。

“快速冷却变性豌豆蛋白质溶液”是指主动冷却所述溶液以加快冷却，与简单地使溶液在室温下冷却相比，申请人发现室温下冷却导致所述溶液凝胶化。可以通过将溶液放置在冰箱或冷冻箱中，或者放置在部分熔化的冰上，直到溶液的温度至少降到室温来实现快速冷却。

“变性豌豆蛋白质溶液中至少90％(w/w)的豌豆蛋白质是可溶的”是指溶液中总豌豆蛋白质的至少90重量％是溶解的形式。优选至少95％(w/w)，理想地95％至98％的豌豆蛋白质是溶解的。测定溶解度的方法是下文描述的摇瓶法。

“处理以除去可溶性物质”是指从豌豆蛋白质溶液中除去可溶性物质(比如不溶性豌豆蛋白质)的分离或澄清步骤。在本文所描述的具体实施例中，使用离心(在4℃下，10,000×g30分钟)使用，但对本领域技术人员而言，其它方法是显而易见的，例如过滤等。

“变性豌豆蛋白质溶液”是指豌豆蛋白质溶液，其中的总豌豆蛋白质的至少90％、95％或99％是变性的。下文提供了确定豌豆蛋白质溶液中变性豌豆蛋白质的％的方法。

“处理变性豌豆蛋白质溶液以形成微滴”通常是指使所述溶液通过小孔，从而将溶液分解成微小的液滴。优选地，所述溶液通过孔挤出。对于本领域技术人员而言用来产生液滴的各种方法是显而易见的，例如造粒和喷雾(即喷雾干燥)。生产微珠的优选方法是振动喷嘴技术，其中悬浮液通过喷嘴喷雾(挤出)，并且通过来自喷嘴的喷雾施加具有限定振幅的正弦频率来引起喷射射流的层流分解。振动喷嘴机的实例是封装机(伊诺科技，瑞士)(Inotech，Switzerland)和尼斯高工程股份公司(Nisco Engineering AG)生产的机器，或等同的放大版本，如布雷斯股份有限公司(Brace GmbH)生产的那些振动喷嘴机。通常，所述喷雾喷嘴具有50至600微米的孔，优选50至200微米，适当的是50-200微米，通常是50-150微米，理想地大约80-150微米。适当地，所述振动喷嘴的操作频率为900至3000Hz。通常，喷嘴和酸化浴之间的静电电位为0.85至1.3V。合适地，所述幅度为4.7kV至7kV。通常，下落距离(从喷嘴到酸化浴)小于50cm，优选小于40cm，合适地在20至40cm之间，优选在25至35cm之间，理想地约30cm。悬浮液(通过喷嘴)的流速通常为3.0至10ml/min；理想的流速取决于在该过程中使用的喷嘴尺寸。

“在酸性凝胶浴中立即将液滴凝胶化形成微珠”是指当浸入酸性浴时，液滴立即凝胶化。这是重要的，因为它确保液滴具有球形和均匀的粒径分布。优选并且令人惊奇的是，通过使用pH小于豌豆蛋白质的pI的酸性浴，例如3.8至4.2的pH，来实现瞬时凝胶化。

“酸性凝胶浴”是指凝胶浴的pH低于豌豆蛋白质的pI，其能够将液滴立即凝胶化。通常，所述酸性凝胶浴的pH小于4.3，例如为3.5至4.2、3.7至4.2或4.0至4.2。所述酸性凝胶浴通常由有机酸形成。理想地，所述酸是柠檬酸。通常，所述酸性凝胶浴的酸浓度为0.1M至1.0M，优选为0.3M至0.7M，更优选为0.4M至0.6M。通常，所述酸性凝胶浴具有浓度为0.1M至1.0M的柠檬酸，优选为0.3M至0.7M，更优选为0.4M至0.6M。优选地，所述酸性胶凝浴包含0.4至0.6M的柠檬酸，并且具有小于4.3的pH，通常为4.0至4.2的pH。

“微粒”应理解为通常是指包含凝胶聚合物的球形颗粒，例如变性蛋白质，例如变性豌豆蛋白质，并且使用下文描述的光学显微镜方法测定的平均直径为50至500微米。优选地，使用下文描述的光学显微镜方法测定所述微粒的平均直径为50-200微米。优选地，使用下文描述的光学显微镜方法测定所述微粒的平均直径为80-200微米。优选地，使用下文描述的光学显微镜方法测定所述微粒的平均直径为80-150微米。取决于制造方法，所述微粒可以是微珠或微胶囊。

“微珠”是指通常为球形并具有连续聚合基质的微小颗粒，例如变性蛋白质基质，例如变性豌豆蛋白质基质，以及任选分散在整个豌豆蛋白质基质中的活性剂。

“微胶囊”是指通常为球形并具有由凝胶聚合物形成的壳的微小颗粒，例如变性蛋白质，例如变性豌豆蛋白质和所述壳内的核。所述核可以是液体或固体，或者实际上是气体。在一个实施例中，所述核包含天然蛋白质，例如天然豌豆蛋白质。

“活性剂”是指适合用于递送至哺乳动物小肠或回肠的任何组分，但通常是指对外部条件(例如热、pH、压力、化学应激或酶)敏感的组分。因此，所述活性成分可以在储存期间对pH、酶(即蛋白酶)、高压、高剪切和温度破坏(temperature abuse)敏感。在本发明的一个特别优选的实施例中，所述活性成分是细胞，通常是细菌细胞，理想地是益生菌细胞。这样的细胞对低pH条件(例如在胃中会遇到)敏感，因此需要屏蔽胃的pH环境和胆汁盐环境。益生菌和其它类型的细胞也对高剪切或高压敏感，例如用于产生微小聚合物微珠的常规方法中。可以包囊在本发明的微珠中的其它类型的活性成分包括微量营养素、维生素、矿物质、酶、发酵剂菌、细胞提取物、蛋白质和多肽(天然的或变性的)、糖和糖衍生物、核酸和核酸构建体、药物活性剂、成像染料和配体、抗体和抗体片段、植物化学物质等。

“活性剂溶液”是指包含在形式为溶液、分散体或悬浮液的合适液体载体内的活性剂。

“喷嘴组件”是指包括至少一个喷嘴的装置，所述喷嘴配置为通过至少一个喷嘴挤出豌豆蛋白质溶液。在一个实施例中，喷嘴组件包括单喷嘴，从而当凝胶化形成微珠时，活性剂和豌豆蛋白质溶液的混合物可以从单喷嘴中挤出以形成液滴。在另一个实施例中，所述喷嘴组件包括外部喷嘴，其同心地布置在内部喷嘴周围，并且其中豌豆蛋白质溶液通过外部喷嘴挤出，并且活性剂溶液/悬浮液/分散体通过内部喷嘴挤出液滴，用凝胶的豌豆蛋白质壳和含核的活性剂将所述液滴凝胶化形成微囊。

“在酸性凝胶浴中固化”是指允许所述微珠保留在凝胶浴中一段时间，足以使微珠固化(硬化)。该时间段根据微珠的不同而改变，但通常使用至少30分钟的固化时间。

实施例1

形成高度溶解的变性豌豆蛋白质溶液(碱增溶)

将豌豆蛋白质溶液在0.1M NaOH水溶液中制备成浓度为8％w/v(即8g/100ml)

确保pH在10.5-11.0的范围内

将所述溶液在室温下放置储存45min直至蛋白质完全溶解

根据需要使用HC1或NaOH/KOH调节pH至10

热处理所述溶液至温度85℃并保持该温度持续25min。

加热后，在部分融化的冰上立即冷却30-45min

将冷却的溶液在4℃，10,000xg下离心30分钟

实施例2

形成高度溶解的变性豌豆蛋白质溶液(通过声处理溶解)

声波仪

Hielscher l000hd声波仪，目前位于爱尔兰农业与食品发展部摩尔庄园(TeagascMoorepark)的BFE附近。

步骤

●在处理之前，在H20中将蛋白质水合至少1h。

●调节至所需的pH(例如7)。

●该系统的最佳体积为200-600ml样品。样品烧杯不应过满以允许声波仪探头插入。

●在处理之前将样品烧杯放在冰上。

●在房间里使用声波仪，将设备转到房间的右角落，并将黑色的三孔插头插入到所述设备的背面。

●将样品放置于声波仪中，调整高度(可以使用书籍、手套箱等)，使得探头的3/4在样品中。

●确保带上正确的护耳用具后，使用机器右上角的开关打开设备。

●为了成功操作，不需要关闭声波仪的门。

●使用位于控制面板上的轮可以调整设备的功率(当前的操作使用最大功率10分钟)。

●以需要的功率需要的时间进行声波处理。

●取出样品，建议按以下步骤记录样品的温度。

●该步骤可以导致样品中片段(fragments)的变化。如果需要(特别是如果样品用于胶囊化/喷雾干燥)，可以使用试管分散机(Ultra Turrax)，以便分解可能出现的任何片段(参见试管分散机程序附录二)。

ο时间和RPM将取决于样本。

实施例3

生产微珠(包球)

目的：用于将生物活性物质递送至近端回肠，用于热保护防止环境处理条件和胃递送

根据实施例1或2制备的变性豌豆蛋白质溶液可以与活性组分(益生菌、色素等)组合。

变性豌豆蛋白质溶液+活性组分的分散体通过孔口挤出，自由落入聚合浴中

所述聚合浴由柠檬酸(0.5M)、NaCl(0.3M)、(0.4M)和聚山梨醇酯80(0.01％)组成

优化所述幅度，并调整正电荷的幅度产生稳定的自由下落微滴流。所述聚合浴在37℃回火，自由下降距离孔口16cm，搅拌速度为90转/分，以使变性豌豆蛋白质溶液和活性组分瞬间聚合成微珠

允许所述微珠在聚合缓冲液中以低搅拌速度在室温下固化2小时

实施例4

生产微胶囊

目的：将天然豌豆蛋白质递送至近端回肠以刺激释放饱腹激素GLP-1并抑制食欲

使用共挤出层流喷射分散技术(co-extrusion laminar jet break-uptechnique)制备单分散和单核微胶囊。所述包封器装配有两个不同尺寸的同心喷嘴(内部和外部)中的一个

根据实施例1或2制备变性豌豆蛋白质(7％w/v)溶液

使用空气压力调节系统将变性豌豆蛋白质溶液供应至外部喷嘴，所述空气压力调节系统能够使用0.5-0.8巴的最大压头产生1-3L/min的流速

使用减压阀设定所需流速。使用连接到内部喷嘴的精密注射泵供应内相(天然豌豆蛋白质，非变性的)，以5至15L/min的流速供应内相

如果加入生物活性物质，则将它们并入内相。

通过将具有确定的振幅的设定的振动频率应用于由变性豌豆蛋白质和核天然蛋白质组成的共挤出液体射流，获得球形微胶囊

将内部喷嘴和外部喷嘴中的材料都加热到40℃，以便在商业操作中允许更好的流动性

所得到的同心射流分解成微胶囊，其落入喷嘴下方20cm的磁力搅拌的凝胶浴中

凝胶浴由36g/l柠檬酸、10mM MOPS组成，pH4.0

加入吐温80(0.1-0.2％(v/v))以降低所述凝胶溶液的表面张力

为了防止在射流分解期间和/或当进入凝胶浴时微胶囊的凝聚，使用静电电压系统在其表面上诱导高负电荷，该静电电压系统在喷嘴和直接放置在喷嘴下方的电极之间施加0-2.15kV的电势

当微胶囊掉落在电极上时，它们从垂直位置偏转，导致它们的作用在凝胶溶液中的较大面积上

使微胶囊硬化至少30分钟，以确保完全凝胶化，然后洗涤并用多孔筛网过滤以除去任何未反应的组分

实施例5(比较例)

生产微珠(包球)

根据实施例3制备微珠，但使用在热变性之前没有静置的变性豌豆蛋白质溶液。所得微珠如图14所示。

实施例3的微珠和实施例4和2的微胶囊的表征

粒径分布分析

验证豌豆蛋白质胶囊和微珠的平均粒径分布以确保生产过程的重复性。使用范围为0.2-200μm的激光衍射仪测定包囊的批次的D(v，0.9)(累积体积达到总体积的90％的粒径)。对于粒径分析，将批次重新悬浮在超纯水(Milli-Q water)中，并基于散射光的光强度分布数据计算粒径分布。

蛋白质含量：

使用标准方法(AOAC，1990)测定蛋白质(氮×6.25)。将分离蛋白质(200mg)悬浮于20ml去离子水中，并使用0.1N的HCl溶液或NaOH溶液将悬浮液的pH调节为2.0至9.0。将这些悬浮液磁力搅拌1小时；如果需要，检查并调整pH，然后以8,000×g离心10min。通过估算氮含量(凯氏定氮法)计算上清液的蛋白质含量(N×6.25)。

电动电位ζ和表面疏水性(Ho)

测定豌豆蛋白质微珠和微胶囊的电动电位ζ和表面疏水性(Ho)。使用纳米粒度及电位分析仪(Zetasizer Nano ZS)(马尔文仪器有限公司，英国)测量分离蛋白质的电动电位ζ。在分析前，将新鲜制备的蛋白质微珠和微胶囊悬浮在去离子水中。根据Kato和Nakai的方法(1980)(Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and itscorrelation with surface properties of proteins,Biochim Biophvs Acta.1980Jul24；624(1):13-20).)，使用ANS-疏水性探针估算豌豆蛋白质微珠/微胶囊的表面疏水性(Ho)。将所述胶囊化的分散体在黑暗中温育15分钟，并且使用光致发光/荧光光谱仪分别在390nm和470nm的激发和发射波长处测量荧光强度(FI)。还测量了ANS空白和无ANS的稀释的蛋白质溶液的FI，并从用ANS包囊的蛋白质分散体的FI中减去。通过线性回归分析计算校正的FI对蛋白质浓度的曲线的初始斜率，并用作蛋白质Ho的指标。结果如下表1所示：

表1

FTIR

使用配备有衰减全反射(ATR)池(派克技术有限公司，美国)(PIKE TechnologyInc.，USA)的FTIR光谱仪(Vertex 70，布鲁克光谱有限公司.，德国)记录豌豆蛋白质微珠和微胶囊的红外光谱。蛋白质微胶囊/微珠在P₂O₅的干燥器中储存超过两周以除去水分。将无水分离物放置于ATR晶体上并按压以确保良好的接触。采用干燥的空气将所述光谱仪连续吹扫。记录在4000-600cm^-1范围内的光谱(以4cm^-1分辨率平均为120个光谱)，并参照空白池的光谱。将光谱进行傅立叶自解卷积(FSD)，二次导数(SD)分析和曲线拟合程序，以定位酰胺-I(1700-1600cm^-1)区域中的重叠峰。图4示出了由豌豆蛋白质制成的微珠和微胶囊的二级结构的对比。该图还示出了相对于那些由豌豆蛋白质组成的微珠，牛奶蛋白质微珠之间的差异。因此，二级结构是不同的，并且在胶囊化期间材料的聚合也将是不同的。

显微镜

除了光学显微镜之外，还使用Leica TCS SP5共聚焦扫描激光显微镜(CSLM)进行进一步的图像分析，用于微粒形态学评估。图5示出了豌豆蛋白质微胶囊的均匀的粒径分布(平均直径150微米)。图5b进一步示出益生菌在豌豆蛋白质微珠中的胶囊化，在整个微珠中具有优选的细胞分布。

还在生产过程之后，利用共聚焦显示生物活性物质(即鼠李糖乳杆菌GG)在微胶囊内的均匀分布。图6表明微胶囊化的处理对益生菌的生存无害。

通过使用氩激光器(488nm激光激发)的照明和使用2.0的缩放因子获得512×512像素的红-绿-蓝图像(24位)进行共聚焦分析，得到最终像素分辨率为0.2μm/像素。

还使用原子力显微镜(AFM；Asylum Research MFP-3D-AFM)和扫描电子显微镜(SEM)来研究在胶囊化期间益生菌和豌豆蛋白质之间的静电相互作用的显著性和量级。图7示出了豌豆蛋白质微珠的表面形貌(图7A)和豌豆蛋白质微胶囊的表面形貌(图7B)。很明显，相对于微胶囊的表面，微珠的表面具有更多的孔颈(cervices)和可能的孔。因此，豌豆蛋白质胶囊可能具有很大的抗扩散和传质效应(即吸水)的能力。微胶囊还示出了保护磷虾油和脂肪酸(DHA和ARA)免受氧化的能力

测定豌豆蛋白质溶液的溶解度的方法

确定热力学水性化合物溶解度的标准技术是摇瓶法。通过在pH 1.2、4.5、6.8、7.5和纯化水的缓冲溶液中平衡过量的豌豆蛋白质来确定豌豆蛋白质的溶解度研究。在容量为50mL的塑料烧瓶中进行试验。在每个烧瓶中分别加入10mL的介质/水和相应量的豌豆蛋白质。所述量足以饱和每种介质，其特征在于沉积未溶解的物质。在测试期间，使用恒温振荡培养箱将样品保持在37℃，同时以150rpm搅拌72小时(直至达到平衡条件)。此后，将样品立即过滤(0.45μm)，并在容量瓶中用相应介质稀释。对于豌豆蛋白质的定量，使用UV-Vis分光光度计(美国瓦里安公司)(Varian)，每种介质的吸收波长为214nm和280nm。使用预先确定的可溶性蛋白质源的校准曲线计算溶解度值。

使用溶解度结果，计算剂量:溶解度的比值，其通过将豌豆蛋白质的商业上可接受的剂量(毫克)除以在测试中获得的溶解度(以毫克每毫升计)获得。剂量的值：然后将溶解度比值与原料制造商指导确定的标准进行比较，以验证蛋白质是否高度可溶。

确定变性豌豆蛋白质的％的方法

豌豆蛋白质变性评估涉及三个基本的分析步骤：

-豌豆蛋白质浓度的测定

-反应方程式的准备

-电泳、浊度和团聚物测量

i)豌豆蛋白质浓度的测定

通过使用Source^TM 5RPC柱(安玛西亚生物科学英国有限公司)(AmershamBiosciences UK limited)的反相HPLC测定豌豆蛋白质浓度。HPLC系统由Waters 2695分离模块和Waters 2487双波长吸光度检测器组成。

ii)反应方程式的准备

豌豆蛋白质的变性动力学根据以下方程式确定：

dC/dt-kCⁿ

其中k是反应速率，n是反应级数，C是天然豌豆蛋白质的浓度。这个方程式可以整合得出

(Ct/Co)^1-n＝1+(n-1)kt(用于n>1)

其中Ct是时间t时的天然豌豆蛋白质的浓度，Co是初始豌豆蛋白质的浓度。

进一步重新排列得出，

Ct/Co＝[1+(n-1)kt]^1/1-n

对该方程式取自然对数，

ln(Ct/Co)＝[1/(1-n)]ln[1+(n-1)kt]。 (方程式1)

诸如此类的记录衰变数据使每单位时间的数据相等，并且在求解方程时减小误差。通过将实验数据拟合至方程式1来确定反应级数和速率。所有实验点均包括在曲线拟合中；考虑到所述蛋白质溶液的快速升温时间，这是合理的。将滞后时间引入数据并没有显著改变所获得的结果。也将所述数据拟合至一阶衰变方程式，

ln(Ct/Co)＝-kt (方程式2)

以排除一级动力学的可能性。

iii)HPLC分析

使用高压分子排阻色谱法研究二硫化物连接的团聚体。在加热阶段期间形成的团聚体用包含20mM二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-tris)pH 7.0、5％SDS和50mM碘乙酰胺(IAA)的缓冲液进行处理。将处理过的团聚体在室温下搅拌过夜，并在分析之前用0.45μm注射器式滤器过滤。使用具有TSK G2000和TSK G3000色谱柱(屠苏哈斯，豪哥马利，PA.美国)(TosoHaas，Montogomeryville，PA.USA)的

净化器色谱系统(安玛西亚生物科学英国有限公司)((Amersham Bioscience UK limited)进行分离。洗脱液为含有1％SDS、pH为7.0的20mM磷酸钠缓冲液。使用染料(蓝色葡聚糖2000)测定色谱柱的空隙体积。游离胺(NH₂)基团的确定通过Adler-Nissen，1979的2,4,6-三硝基苯-1-磺酸(TNBS)方法测定(Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates bytrinitrobenzenesulfonic acid,J.Adler-Nissen J.Agric.Food Chem.,1979,27(6),1256-1262)。

iv)电泳、浊度和团聚物测量

根据上文描述的方法(Laemmli U.K.(1970).Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature 227(5259):680-5.)进行二维电泳。使用的电泳缓冲液由于其对蛋白质的分离作用而不含β-巯基乙醇。这通过减少分子内和分子间二硫键导致蛋白质团聚体的分解。将凝胶条放置在由含有0.1％SDS的12％丙烯酰胺和4％浓缩胶组成的分离凝胶的顶部上。在Mini Protean II系统(生物-拉德，阿尔法技术，都柏林，爱尔兰)(Bio-Rad，Alpha Technologies，Dublin，Ireland)中使用155V的恒定电压进行电泳。将凝胶在0.5％考马斯亮蓝R-250、25％异丙醇、10％乙酸溶液中染色。变性豌豆蛋白质溶液的浊度使用美国瓦里安公司卡里尔(Varian Caryl)UV/可见分光光度计(JVA分析，都柏林，爱尔兰)在590nm的波长下测量。随着团聚体的尺寸和/或数量增加，更多的光散射，导致溶液的表观吸光度增加；因此与变性动力学相关。动态光散射(莫尔文泽塔；型号7EM；莫尔文仪器有限责任公司，伍斯特，英国)(Malvern Zetamaster；model7EM；Malvern Instruments Ltd，Worcester，UK)也用于测量在豌豆蛋白质加热步骤期间形成的团聚体的大小。以90°的固定角度检测散射光。使用累积方法来找出对应于强度分布平均值的粒子的平均值(z-平均值)或粒子大小。

体外肠胃耐性/稳定性

为了确定豌豆蛋白质微珠/微胶囊作为递送载体的效率，重要的是阐明其对胃条件的抵抗力和随后在肠道条件下的消化。为了评估这些情况，使用从屠宰的猪获得的胃和肠道的内容物(离体条件)进行胃肠道研究。胃条件为pH 1.6，测定胃蛋白酶活性(44.46±2.34μmol酪氨酸当量)。肠道内容物从近端回肠获得，并进一步研究酶活性。胰蛋白酶活性测定为21.39μmol±2.13，胰凝乳蛋白酶活性为319.43±23.85μmol。

图8示出了3小时温育期间，体外猪胃消化过程中，豌豆蛋白质微珠/微胶囊的酸稳定性。所述微珠/微胶囊保持坚固，3小时后，表面开始收缩，这可能是响应所述珠的核和外部环境之间的酸性梯度。图8A和图8B显示3小时温育期间所述微珠外观的视觉变化；但是结构保持不变。图8C示出了在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和其它典型的肠酶存在下，肠道温育期间这些微珠的消化。在胃温育期间微珠的强度如图10所示，并示出了在胃温育期间微珠强度降低；但是，微珠的总体强度保持较高(632.32g±24.32g)。豌豆蛋白质微珠的肠消化可见于图10，其中凝胶渗透色谱筛选肽释放。

豌豆蛋白质微珠中的益生菌胶囊化

在表征耐胃酸和肠消化的微珠之后，将益生菌菌株包囊在豌豆蛋白质微珠内，并在i)胶囊化过程(图10)和热应激(图11)期间评估细胞存活；。图10示出了用于在豌豆蛋白质中将益生菌胶囊化的温和条件。图11示出了存在热应激时益生菌的存活。该图示出了通过胶囊化(微珠结构)提供的热保护，其显著高于由豌豆蛋白质单独提供的热保护。

获得用于将天然豌豆蛋白质胶囊递送至回肠的人类数据

人类研究设计：

四名参与者插管有145cm的鼻十二指肠导管

将导管引入胃，并在放射学指导和验证下将尖端置于肠道内

隔夜禁食之后，指示参与者5分钟内服下包囊的样品(40mL体积+约120mL水)

在十二指肠内液体(drink)输注期间，将流体输注10-200min

180-220min后，取出鼻十二指肠导管，允许受试者任意进食

导管的位置显示在右侧

下表2示出了导管在受试者的肠道中的位置

表2

结果：

-10-35分钟：十二指肠完整微胶囊的可视化

-10-55分钟：十二指肠、空肠或回肠区域的蛋白质或肽的含量没有显著增加

-35-90分钟：在空肠区域检测微胶囊分解

-35-120分钟：空肠区域中的蛋白质含量显著增加

-90分钟以上：天然豌豆蛋白质在近端空肠和回肠中自然出现

-90分钟以上：近端空肠和回肠中肽的累积存在

-180分钟以上：天然豌豆蛋白质在近端空肠和回肠中没有出现

本发明不限于上述实施例，其在不脱离本发明的精神下，可以在结构和细节上变化。

Claims

1.生产变性豌豆蛋白质溶液的方法，包括以下步骤：

将豌豆蛋白质基本上但不完全溶解在pH至少为7的碱性溶剂中，或通过声处理pH为6-9的溶剂中的蛋白质的分散体或部分分散体的部分溶液，以提供6-9％溶解的豌豆蛋白质溶液（w/v）；

将所述溶解的豌豆蛋白质溶液静置至少15分钟，以进一步将所述豌豆蛋白质溶解和水合，并提供静置的豌豆蛋白质溶液；

在足以使至少90％的所述豌豆蛋白质热变性的条件下加热所述静置的豌豆蛋白质溶液，同时将所述溶液保持在适合于挤出成微滴的形式，从而提供变性豌豆蛋白质溶液；其中所述变性豌豆蛋白质溶液中，按重量计，至少90%的豌豆蛋白质作为可溶性豌豆蛋白质聚集体存在，其通过摇瓶法测定；和

通过冷藏、冷冻或在冰上快速冷却所述变性豌豆蛋白质溶液以加快冷却和防止凝胶化从而提供冷却的变性豌豆蛋白质溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述豌豆蛋白质部分溶解在碱性溶剂中以提供pH至少为10的豌豆蛋白质溶液。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述豌豆蛋白质部分溶解在碱性溶剂中以提供pH为10至11的豌豆蛋白质溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其中将冷却的变性豌豆蛋白质溶液离心以除去不溶物质。

5.如权利要求1所述的方法，其中将所述溶解的豌豆蛋白质溶液静置至少30分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其中将所述溶解的豌豆蛋白质溶液静置至少40分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述豌豆蛋白质通过声处理溶解，其中在声处理之前，将所述豌豆蛋白质分散在去离子水、磷酸盐或硼酸盐缓冲液中。

8.如权利要求1所述的方法，其中按重量计，所述豌豆蛋白质包含纯度为至少70%的豌豆蛋白质源。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述豌豆蛋白质选自豌豆分离蛋白质或豌豆浓缩蛋白质。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法生产的冷却的变性豌豆蛋白质溶液。

11.如权利要求10所述的变性豌豆蛋白质溶液，其中所述变性豌豆蛋白质溶液中，至少95％（w/w）的豌豆蛋白质作为可溶性豌豆蛋白质聚集体存在，其通过摇瓶法测定。

12.生产具有变性豌豆蛋白质基质的微粒的方法，所述方法包括以下步骤：

提供根据权利要求10至11中任一项所述的变性豌豆蛋白质溶液或根据权利要求1至9中任一项所述的方法形成的变性豌豆蛋白质溶液；

处理所述变性豌豆蛋白质溶液以形成微滴；和

交联和螯合所述微滴以形成微粒，其中交联和螯合所述微滴的步骤包括立即在pH小于豌豆蛋白质的pI的酸性凝胶浴中将所述微滴凝胶化以形成微粒。

13.如权利要求12所述的方法，其中处理所述变性豌豆蛋白质溶液以形成微滴的步骤包括通过喷嘴组件挤出所述溶液以形成所述微滴的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其中在所述形成微滴的步骤之前，在加热步骤之后，向所述变性豌豆蛋白质溶液中加入活性剂。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述喷嘴组件包括单喷嘴，并且其中所述微粒是具有连续变性豌豆蛋白质基质的微珠，活性剂分布在整个所述变性豌豆蛋白质基质中。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述喷嘴组件包括外部喷嘴，该外部喷嘴同心地围绕内部喷嘴设置，其中所述变性豌豆蛋白质溶液通过外部喷嘴挤出，包含活性剂的活性剂溶液通过内部喷嘴同时挤出，并且其中所述微粒是具有变性豌豆蛋白质壳和包含活性剂的核的微胶囊。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述喷嘴组件包括静电电压系统，该静电电压系统配置为在所述喷嘴和设置在所述喷嘴下方的电极之间施加电势。

18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其包括将所述形成的微粒、微珠或微胶囊包衣于壳聚糖或明胶中的附加步骤。

19.如权利要求18所述的方法，其中通过将所述微粒、微珠或微胶囊浸入壳聚糖或明胶浴中进行包衣。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法生产的具有含有益生菌细胞的变性豌豆蛋白质基质的微粒。