CN107389913A - 生物传感器及生物检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种生物传感器，包括：信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有待测目标物的特异性识别体；模拟竞争物，包括纳米颗粒和固定于所述纳米颗粒表面的竞争分子，所述竞争分子与所述特异性识别体具有特异性亲和作用，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并能够可逆地捕获于所述敏感单元的表面。本发明还提供一种生物检测方法。本发明提供的生物传感器和生物检测方法可对不带电或带低量电的待测目标物实现便捷的带电模拟竞争物构建，并通过竞争亲和作用实现对不带电或带低量电的待测目标物的通用免标记检测。

Description

生物传感器及生物检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种生物传感器以及一种生物检测方法。
背景技术
基于生物分子间的特异性识别亲和作用，对半导体场效应管器件进行识别体修饰，可实现对目标被测物的特异性检测。由于场效应管传感器的信号来源于带电物质自身对器件产生的电场效应，因此具有实现无标记检测的优点，目前已成为新型传感器领域的研究热点。
由于并非所有目标被测物都可以在水中通过电离而带电，以小分子(通常指分子量500Da以下)为代表的一类目标被测物因官能团较少而不带电或带电量很低，因此不能通过直接在场效应管传感器敏感表面亲和进行检测。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够对不带电或带低电量的分子进行特异性检测的生物传感器以及生物检测方法。
一种生物传感器，包括：
信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有待测目标物的特异性识别体；
模拟竞争物，包括纳米颗粒和不可逆地连接于所述纳米颗粒表面的竞争分子，所述竞争分子与所述特异性识别体具有特异性亲和作用，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并可逆地捕获于所述敏感单元的表面。
在其中一个实施例中，所述待测目标物不带电或带低量电。
在其中一个实施例中，所述纳米颗粒表面不可逆地连接有聚合物长链分子，所述竞争分子不可逆地与所述纳米颗粒连接，或不可逆地与所述聚合物长链分子连接。
在其中一个实施例中，所述聚合物长链分子的分子量为15000至150000。
在其中一个实施例中，所述竞争分子为不可逆地连接于所述纳米颗粒表面的聚合物长链分子。
在其中一个实施例中，所述聚合物长链分子为葡聚糖、木质素、聚乙二醇和聚丙二醇中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述竞争分子与所述待测目标物的分子相同。
在其中一个实施例中，在所述胶体溶液中，所述模拟竞争物的zeta电位的绝对值大于15mV。
在其中一个实施例中，所述信号检测器为场效应晶体管，所述敏感单元为半导体沟道。
一种使用所述生物传感器进行生物检测的方法，包括：
提供所述胶体溶液，所述胶体溶液包括分散剂和分散于所述分散剂中的模拟竞争物；
将所述敏感单元的表面和所述胶体溶液接触，使所述模拟竞争物可逆地捕获于所述敏感单元的表面；以及
将含有所述待测目标物的样液通入所述敏感单元的表面，对所述信号检测器的电信号进行检测。
在其中一个实施例中，所述胶体溶液中所述模拟竞争物的zeta电位的绝对值大于15mV。
在其中一个实施例中，所述生物检测方法还包括提供所述待测目标物的浓度与所述信号传感器输出的电信号的检测标准曲线的步骤，包括：
提供至少三个含有所述待测目标物的标准液，该至少三个标准液中所述待测目标物的浓度已知且不同；
将该至少三个标准液分别通入捕获有所述模拟竞争物的所述敏感单元的表面，并记录所述信号检测器的输出的电信号值；以及
拟合该至少三个标准液中所述待测目标物的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
本发明提供的生物传感器和生物检测方法，通过将所述竞争分子连接至所述纳米颗粒上形成所述待测目标物的模拟竞争物，所述纳米颗粒能够分散并形成胶体溶液，在所述胶体溶液中，所述纳米颗粒带电，从而使所述模拟竞争物带电。带电的模拟竞争物通过所述竞争分子与所述特异性识别体进行亲和或解离，在这一过程中，可引发所述敏感单元的表面发生电势变化，从而激发电信号对所述待测目标物进行检测。
本发明提供的生物传感器和生物检测方法可对不带电或带低量电的待测目标物实现便捷的带电模拟竞争物构建，并通过竞争亲和作用实现对不带电或带低量电的待测目标物的通用免标记检测。
附图说明
图1为本发明提供的捕获有模拟竞争物的生物传感器的结构示意图；
图2为本发明提供的对待测目标物进行检测时的生物传感器的结构示意图；
图3A为本发明实施例1提供的固定有ConA的石墨烯沟道表面的AFM(原子力显微镜)照片，图3B为本发明实施例1提供的捕获有模拟竞争物的石墨烯沟道表面的AFM照片；
图4A为本发明实施例1提供的固定有ConA的GFET的转移特性曲线图，图4B为本发明实施例1提供的捕获有模拟竞争物的GFET的转移特性曲线图；
图5为本发明实施例1提供的模拟竞争物的扫描电镜照片；
图6A至6D为本发明实施例1提供的不同浓度的葡萄糖通入石墨烯沟道表面后GFET的漏极电流及其归一化响应值随时间变化的曲线图；
图7为本发明实施例1提供的不同浓度的葡萄糖通入石墨烯沟道表面后GFET的前60s的漏极电流的归一化响应值随时间变化的曲线图；
图8为本发明实施例1提供的葡萄糖浓度和GFET漏极电流的归一化响应值的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请一并参阅图1以及图2，本发明第一实施方式提供一种生物传感器，包括信号检测器10和模拟竞争物20。所述信号检测器10具有用于感知信号变化的敏感单元12，所述敏感单元12的表面不可逆地连接有待测目标物30的特异性识别体14。所述模拟竞争物20包括纳米颗粒22和固定于所述纳米颗粒22表面的竞争分子24。所述竞争分子24与所述特异性识别体14具有特异性亲和作用。所述模拟竞争物20能够形成胶体溶液，并能够可逆地被捕获于所述敏感单元12的表面。
本发明提供的生物传感器，利用所述纳米颗粒22在胶体溶液中自身带电的性质，使得所述模拟竞争物20带电。带电的模拟竞争物20通过所述竞争分子24与所述特异性识别体14进行亲和或解离，来引发所述敏感单元12的表面发生电势变化。当所述模拟竞争物20被捕获于所述敏感单元12的表面时，所述待测目标物30本身的出现，即可引发所述待测目标物30与所述模拟竞争物20之间和所述特异性识别体14发生亲和作用的竞争，使得所述模拟竞争物20从所述敏感单元12的表面的解离，并激发电信号，从而可实现对所述待测目标物30的检测。
本发明提供的生物传感器可对不带电或带低量电的待测目标物30实现便捷的带电模拟竞争物构建，并通过竞争亲和作用实现对不带电或带低量电的待测目标物30的通用免标记检测。所述待测目标物30不带电或带低电量是指所述待测目标物30不可以在液相体系(例如本发明所述胶体溶液)中通过电离而带电，或者所述待测目标物30(例如分子量500Da下的小分子)因可电离官能团极少而在液相体系中不带电或带电量很低，例如所述待测目标物30可以为葡萄糖或四环素。
所述信号检测器10可以为能够感应和检测电势变化的检测器。在一实施例中，所述信号检测器10为场效应晶体管，所述敏感单元12为半导体沟道。
所述特异性识别体14可通过生化修饰操作不可逆地连接至所述敏感单元12的表面，例如可通过共价结合或吸附作用将所述特异性识别体14连接到所述敏感单元12的表面。所述特异性识别体14可以是蛋白质或核酸，例如抗体或适体。
所述纳米颗粒22用于通过形成胶体溶液而使得所述模拟竞争物20带电。所述纳米颗粒22的粒径可以为20nm至100nm。在一实施例中，所述纳米颗粒22可以为纳米银。
所述竞争分子24可以通过共价结合或吸附作用固定于所述纳米颗粒22的表面。所述竞争分子24和所述待测目标物30与所述特异性识别体14可具有相同或类似的特异性亲和作用。在一实施例中，所述竞争分子24和所述待测目标物30的分子相同，即可将与所述待测目标物30相同的分子固定于所述纳米颗粒22的表面，来形成该待测目标物30的带电模拟竞争物20。
优选地，所述纳米颗粒22的表面包裹有聚合物长链分子(图未示)，所述聚合物长链分子为稳定剂，在所述聚合物长链分子的空间位阻效应的作用下，所述纳米颗粒22能够形成更加稳定的胶体溶液。所述聚合物长链分子的分子量可以为15000至150000，该范围能够使得所述纳米颗粒22在所述胶体溶液中具有较高的zeta电位，不仅可以使所述胶体溶液更稳定，而且使得所述模拟竞争物20与所述特异性识别体14进行亲和或解离时，能够产生较大的电势变化，从而提高所述生物传感器检测的灵敏度和精确度。所述聚合物长链分子可以为典型的长链高分子稳定剂，例如所述聚合物长链分子可以为葡聚糖、木质素、聚乙二醇、聚丙二醇等等中的至少一种。所述竞争分子24可以不可逆地与所述纳米颗粒22连接，或不可逆地与所述聚合物长链分子连接。
在一实施例中，所述聚合物长链分子可以与所述特异性识别体14具有特异性亲和作用，则该聚合物长链分子可以直接作为竞争分子24使用，例如当所述待测目标物30为葡萄糖时，所述聚合物长链分子可以为葡聚糖，葡聚糖和葡萄糖与特异性识别体ConA(concanavalin A，天然蛋白质凝集素伴刀豆球蛋白A)具有类似的特异性亲和作用。
本发明第二实施方式提供一种生物检测方法，包括：
S1，提供一信号检测器10，所述信号检测器10具有用于感知信号变化的敏感单元12，所述敏感单元12的表面不可逆地连接有待测目标物30的特异性识别体14；
S2，提供胶体溶液，所述胶体溶液包括第一分散剂和分散于所述第一分散剂中的模拟竞争物20，所述模拟竞争物20包括纳米颗粒22和固定于所述纳米颗粒22表面的竞争分子24，所述竞争分子24与所述特异性识别体14具有特异性亲和作用；
S3，将所述敏感单元12的表面和所述胶体溶液接触，使所述模拟竞争物20可逆地捕获于所述敏感单元12的表面；以及
S4，将含有所述待测目标物30的样液通入所述敏感单元12的表面进行检测。
在所述步骤S1和S2中，所述信号检测器10、所述敏感单元12、所述模拟竞争物20、所述纳米颗粒22和所述竞争分子24与第一实施例相同，在此不再赘述。
所述分散剂用于分散所述模拟竞争物20来形成所述胶体溶液。所述分散剂可以为水溶液。在一实施例中，所述分散剂为缓冲溶液。
优选地，在所述胶体溶液中，所述模拟竞争物20的zeta电位的绝对值大于15mV，一方面保证所述模拟竞争物20之间有足够的静电斥力来维持稳定的胶体状态，另一方面，保证所述模拟竞争物20从所述敏感单元12的表面解离时，能够产生较大的电势变化，以使所述待测目标物30具有较高的检测灵敏度。更为优选地，所述模拟竞争物20的zeta电位的绝对值大于25mV。
在所述步骤S3中，所述模拟竞争物20通过所述竞争分子24与所述特异性识别体14的亲和作用而捕获于所述敏感单元12的表面。将所述敏感单元12的表面和所述胶体溶液接触的方法不限，例如可通过将所述敏感单元12浸入所述胶体溶液中，使所述模拟竞争物20捕获于所述敏感单元12的表面，然后再将所述敏感单元12取出，用于对所述样液进行检测。在这一过程中，由于所述特异性识别体14本身的电离特性，而使得所述敏感单元12的表面具有一个基础电势E1，当所述模拟竞争物20捕获于所述敏感单元12的表面后，所述敏感单元12的表面的电势变为E2。E2的大小与所述基础电势E1、所述模拟竞争物20的zeta电位以及所述胶体溶液的离子强度有关。
在步骤S4中，当所述样液通入所述敏感单元12的表面时，所述待测目标物30本身的出现即可引发所述模拟竞争物20的竞争性解离，激发所述信号检测器10输出电信号，从而实现对待测目标物30的检测。此时，所述敏感单元12表面的电势变化和所述电信号的变化速率与所述待测目标物30和所述模拟竞争物20的竞争作用的强度有关，将所述信号检测器10输出的电信号与理论模型对比，即可实现对所述目标被测物浓度的定量检测。所述样液可以为水溶液，例如可以为缓冲溶液。
在一实施例中，所述生物检测方法还包括提供所述待测目标物的浓度与所述信号传感器输出的电信号的检测标准曲线的步骤，具体可包括：
S41，提供至少三个含有所述待测目标物30的标准液，该三个标准液中所述待测目标物30的浓度已知且不同；
S42，将该至少三个标准液分别通入所述敏感单元12的表面，并记录所述信号检测器10的输出的电信号值；以及
S43，拟合该至少三个标准液的所述待测目标物30的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
将含有所述待测目标物30的样液通入所述敏感单元12的表面进行检测，将其输出的电信号值代入上述检测标准曲线中，即可得到所述样液中所述待测目标物30的浓度。
本发明提供的生物检测方法，通过将含有待测目标物的样液通入捕获有带电模拟竞争物的敏感单元的表面，引发带电模拟竞争物的解离，从而引发敏感单元表面的电势变化而产生电信号，来实现对所述待测目标物的检测。本发明提供的生物检测方法可对不带电或带低量电的待测目标物实现便捷的带电模拟竞争物构建，并通过竞争亲和作用实现对不带电或带低量电的待测目标物的通用免标记检测。
实施例1：
葡萄糖是一种具有代表性的在水溶液中不能通过电离带电的小分子物质，本实施例1提供一种葡萄糖的免标记检测方法。本实施例1采用ConA(concanavalin A)作为葡萄糖的特异性识别体，ConA是一种从刀豆(Canavalia ensiformis)中提取的天然蛋白质凝集素伴刀豆球蛋白A，在水溶液中存在钙离子(Ca2+)和锰离子(Mn2+)的条件下可对吡喃糖环上的C3、C4、C6位羟基发生特异性亲和，从而实现对葡萄糖的特异性结合。
【信号检测器】
选用石墨烯场效应管(Graphene field-effect transistor,GFET)作为信号检测器。使用N-羟基琥珀酰亚胺酯-1-芘丁酸连接体分子，将ConA蛋白分子通过氨基偶联作用固定到GFET的石墨烯沟道表面。如图3A和图4A所示，完成ConA固定的GFET器件分别进行了原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)观测表面形貌，以及转移特性曲线测试。
【模拟竞争物和胶体溶液】
在去离子水中加入5mM银氨溶液(即土伦溶液，硝酸银溶液加氢氧化钠后再加氨水滴定)作为银前驱体，再加入300μM重均分子量为20000Da的长链葡聚糖作为还原剂和稳定剂得到一混合溶液。将所述混合溶液混匀后加热到80℃保持40分钟，得到表面吸附有葡聚糖的银纳米颗粒，即得到葡萄糖的模拟竞争物。合成完毕的模拟竞争物经离心处理(10000转/分钟，1小时)去除残余反应物后，重新分散到pH＝7.4，离子强度50mM的HEPES缓冲液(含HEPES和NaNO3各50mM)中得到胶体溶液，通过zeta电位仪测得其zeta电位约为-25mV。图5为所述模拟竞争物的扫面电镜照片。
银纳米颗粒和模拟竞争物所带负电势来源于表面包裹的葡聚糖长链。依据氧化反应理论，葡聚糖在被银氨溶液氧化前不会电离，在水热条件下，长链上富含的醇羟基表现出还原性，通过失取电子依次被氧化为醛基和羧基。羧基在pH＝7.4的水溶液中存在电离平衡，因此使长链稳定剂表现出一定的负电性，从而使银纳米颗粒通过负电荷提供的经典斥力(zeta电位约-25mV)在水相胶体体系中稳定存在：
【模拟竞争物的捕获】
向完成ConA修饰的石墨烯沟道表面通入含有所述模拟竞争物的所述胶体溶液(胶体中添加钙离子和锰离子各0.1mM)，通过葡聚糖与ConA蛋白的特异性亲和，所述模拟竞争物捕获于石墨烯沟道表面。如图3B和图4B所示，捕获有所述模拟竞争物的GFET器件分别进行了原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFM)观测表面形貌，以及转移特性曲线测试，从图3可以看出，所述模拟竞争物被证实成功捕获。
【葡萄糖的检测】
将不同浓度的葡萄糖溶液(HEPES缓冲液配制，pH＝7.4，离子强度50mM，额外添加钙离子和锰离子各0.1mM)通入捕获有所述模拟竞争物的石墨烯沟道表面。在GFET栅极电压恒定为1V条件下连续记录GFET输出电导率值，如图6A到图6D所示，并取该过程的前60秒近似线性的快速上升段作为传感器响应值，如图7所示。
请参阅图8，可以看出传感器响应值与葡萄糖浓度间存在比较理想的线性关系，证实了基于银纳米颗粒用作模拟竞争物可以实现基于场效应管传感器的葡萄糖免标记检测。
将含有葡萄糖的样液通入所述石墨烯沟道表面，得到所述样液的传感器响应值，带入上述线性关系方程，即可得到所述样液的葡萄糖浓度。
实施例2
选用GFET作为信号检测器。将四环素的特异性识别体固定到GFET的石墨烯沟道表面。
用木质素作为稳定剂和还原剂与银氨溶液进行反应，得到纳米银颗粒，纳米银颗粒表面固定有木质素，进一步将四环素固定于纳米银颗粒表面，得到模拟竞争物。具体方法为：使用一种一端具有可与纳米银颗粒不可逆结合的巯基，且另一端可与四环素不可逆结合的分子(例如12-巯基十二酸或N-羟基琥珀酰亚胺酯)作为连接体，将四环素溶液与连接体溶液按1:1摩尔比混合，常温下反应4小时，四环素与连接体通过氨基偶联反应不可逆地被固定在一起。再用反应后的产物溶液与纳米银颗粒胶体混合孵育4小时，四环素-连接体分子通过一端的巯基与纳米银颗粒不可逆地结合，从而将四环素固定于纳米颗粒表面。将反应后溶液离心去除上清液，去离子水分散，并重复数次，即得到纯净的模拟竞争物。
将所述模拟竞争物用缓冲溶液进行分散，得到胶体溶液，将所述GFET的石墨烯沟道进入所述胶体溶液中一段时间后取出。
将含有四环素的样液通入所述GFET的石墨烯沟道的表面，记录输出的电信号进行检测。
本发明提供的生物传感器和生物检测方法，可对不易通过在场效应管传感器表面直接亲和进行检测的不带电、低带电目标被测物实现便捷的竞争物构建，并通过竞争亲和作用实现对一类物质的通用免标记检测。该方法操作简单，易于推广。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种生物传感器，其特征在于，包括：
信号检测器，具有用于感知信号变化的敏感单元，所述敏感单元的表面不可逆地连接有待测目标物的特异性识别体；
模拟竞争物，包括纳米颗粒和固定于所述纳米颗粒表面的竞争分子，所述竞争分子与所述特异性识别体具有特异性亲和作用，所述模拟竞争物能够形成胶体溶液，并能够可逆地捕获于所述敏感单元的表面。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述待测目标物不带电或带低量电。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述纳米颗粒表面包裹有聚合物长链分子，所述竞争分子不可逆地与所述纳米颗粒连接，或不可逆地与所述聚合物长链分子连接。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述聚合物长链分子的分子量为15000至150000。
5.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述聚合物长链分子为葡聚糖、木质素、聚乙二醇和聚丙二醇中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述竞争分子不可逆地连接于所述纳米颗粒表面或聚合物长链分子上。
7.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，在所述胶体溶液中，所述模拟竞争物的zeta电位的绝对值大于15mV。
8.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述竞争分子与所述待测目标物的分子相同。
9.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述信号检测器为场效应晶体管，所述敏感单元为半导体沟道。
10.一种使用根据权利要求1至9中的任意一项所述的生物传感器进行生物检测的方法，包括：
提供所述胶体溶液，所述胶体溶液包括分散剂和分散于所述分散剂中的模拟竞争物；
将所述敏感单元的表面和所述胶体溶液接触，使所述模拟竞争物捕获于所述敏感单元的表面；
将含有所述待测目标物的样液通入所述敏感单元的表面，对所述信号检测器的电信号进行检测。
11.根据权利要求10所述的生物检测方法，其特征在于，还包括提供所述待测目标物的浓度与所述信号传感器输出的电信号的检测标准曲线的步骤，包括：
提供至少三个含有所述待测目标物的标准液，该至少三个标准液中所述待测目标物的浓度已知且不同；
将该至少三个标准液分别通入捕获有所述模拟竞争物的所述敏感单元的表面，并记录所述信号检测器的输出的电信号值；以及
拟合该至少三个标准液中所述待测目标物的浓度与所述电信号值的关系方程式，即得到所述检测标准曲线。
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