CN107356578B - 一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg2+的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性‑共振散射光谱测定Hg²⁺的方法，其特征是，包括如下步骤：（1）制备已知浓度的Hg²⁺标准溶液体系I；（2）制备空白对照溶液体系；（3）计算ΔI=I‑I₀；（4）以ΔI对Hg²⁺的浓度关系做工作曲线；（5）制备被测样品溶液，测定其共振散射峰强度值为I_样品，计算ΔI_样品=I_样品‑I₀；（6）依据步骤（4）的工作曲线，计算出样品溶液Hg²⁺的含量。本发明与已有的方法相比，本测定方法不需要构建适配体纳米探针的复杂过程，方法更简便、快速；纳米粒子不需要聚集，体系更稳定；非金属纳米酶催化，灵敏度高。

Description

一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定 Hg2+的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体是一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法。

背景技术

适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列，能与多种目标物质高特异性、高亲和力和高选择性地结合，当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会发生变化，其检测信号随之发生变化从而实现对目标物的检测。汞是毒性很强的重金属，汞很容易通过食物链在人体和动物，特别是鱼类体内产生富集作用，即便在其浓度很低的情况下，汞也会对人体和环境造成很大的、长期的毒害作用。因此，研究痕量汞的测定方法具有重要意义。

目前，汞的测定方法主要有原子吸收光谱法和气液相色谱-质谱联用法以及与免疫反应结合的方法如比色法、荧光光谱法、共振瑞利散射光谱法、表面增强拉曼散射光谱法。这些方法中，原子吸收光谱法虽然仪器普及、稳定性好，但仪器精密度较差；气液相色谱-质谱联用技术比原子吸收光谱法较灵敏、具有线性范围宽等优点，但是过程繁杂，成本较高，且检测灵敏度依赖于柱后检测技术。免疫比色法简便易行、经济，但灵敏度欠佳。荧光光谱法过程繁杂，成本较高。共振瑞利散射光谱法灵敏、快速、简便在生物化学、分析化学、纳米材料研究等方面均有应用。然而，以上免疫分析方法基本是依据Hg²⁺与适配体中的胸腺嘧啶形成T-Hg²⁺-T结构，构建免疫探针分子，然后再进行相应的实验方法操作，总的来说实验操作都较复杂。

纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶具有催化效率高、稳定、经济和规模化制备的特点。自2007年HRP纳米酶报道以来，纳米酶的研究迅速崛起，研究的涉及面也逐渐广泛，已经包括材料科学、物理、化学、生物、医学和环境等不同领域。与天然酶相比，纳米材料具有稳定性高、催化活性高及廉价易得等优点, 特别是避免了天然酶所具备的不稳定和易变性特征，增加了其在过程催化和酶促动力学领域应用的前景，因而这些具有模拟酶活性的纳米材料在分析化学中具有重要的意义。纳米酶应用于分析化学中，主要涉及重金属离子检测以及生物分子检测和免疫分析，但均基于金属纳米酶的研究应用较多，对于非金属纳米酶的研究甚少。纳米二氧化硅作为一种新的纳米材料越来越得到广泛的应用，应用适配体调控纳米二氧化硅非金属纳米酶的催化作用与共振散射光谱技术应用于定量测定Hg²⁺的分析方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对测定Hg²⁺现有技术的不足，而提供一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法。这种不需要构建适配体纳米探针的复杂过程，方法更简便、快速；纳米粒子不需要聚集，体系更稳定；非金属纳米酶催化，灵敏度高。

实现本发明目的的技术方案是：

一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法，包括如下步骤：

（1）制备已知浓度的Hg²⁺标准溶液体系：于刻度试管中，依次加入 10μL-200 μL100 nmol/L的Hg²⁺标准溶液、50 μL-120 μL 66 ng/mL汞适配体和10μL-20 μL 100 μg/mL纳米二氧化硅，混匀，静置10分钟；然后在各试管中依次加入100 μL-200 μL 0.5 moL/L 葡萄糖、100 μL-180 μL 0.01 moL/L HCl和100 μL-120 μL 84 μmoL/L HAuCl₄，混匀，用二次蒸馏水定容至1.5 mL，75℃水浴反应20分钟，取出试管，用冰水冷却终止反应，用二次蒸馏水定容至2.0 mL；

（2）制备空白对照溶液体系：用步骤（1）的方法不加Hg²⁺标准溶液制备空白对照溶液体系；

（3）分别取按步骤（1）、(2）制备的Hg²⁺标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光分光光度计上，设定仪器参数，扫描获得体系的共振散射光谱，测定370nm处的共振散射峰强度值为I，同时测定空白对照溶液体系的共振散射峰强度值为I₀，计算ΔI = I - I₀；

（4）以ΔI对Hg²⁺的浓度关系做工作曲线；

（5）依照步骤（1）的方法制备样品溶液，其中加入的Hg²⁺标准溶液替换为样品溶液，并按步骤（3）的方法测定样品溶液的共振散射峰强度值为I_样品，计算ΔI_样品= I_样品- I₀；

（6）依据步骤（4）的工作曲线，计算出样品溶液Hg²⁺的含量。

步骤（1）中所述汞适配体的序列为5’-TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT-3’。

实现本技术方案的原理是：

在本技术方案条件下，纳米二氧化硅对葡萄糖-HAuCl₄生成金纳米粒子这一反应具有较强的催化作用；当适配体吸附在二氧化硅纳米酶表面时，抑制了葡萄糖-HAuCl₄生成金纳米粒子这一反应；当体系加入Hg²⁺时，与适配体结合形成稳定的适配体-Hg²⁺结合物并从二氧化硅纳米酶表面脱离，二氧化硅催化活性恢复。体系中随着Hg²⁺浓度的增大，二氧化硅催化活性增强，生成的金纳米粒子增多,共振散射峰强度增大。Hg²⁺浓度与体系共振散射峰增强值呈一定的线性关系，据此建立测定Hg²⁺的适配体调控二氧化硅纳米酶活性的共振散射光谱方法。

这种方法的优点是：与现有的方法相比，本测定方法不需要构建适配体纳米探针的复杂过程，方法更简便、快速；纳米粒子不需要聚集，体系更稳定；非金属纳米酶催化，灵敏度高。

附图说明

图1为实施例中的共振散射光谱图。

图中，a.3.3 ng/mL 汞适配体+ 0.6 μg/mL 二氧化硅+0.75 mmoL/L HCl +37.5mmoL/L葡萄糖+4.2 μmoL/L HAuCl₄ b.a+0.5 nmoL/L Hg²⁺ c.a+2.5 nmoL/L Hg²⁺ d.a+5nmoL/L Hg²⁺ e.a+7.5 nmoL/L Hg²⁺ f.a+10 nmoL/L Hg²⁺。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。

实施例：

一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法法，包括如下步骤：

（1）制备已知浓度的Hg²⁺标准溶液体系：于7支刻度试管中，分别加入10μL, 50μL,100μL,150μL,200μL 100 nmol/L的Hg²⁺标准溶液、然后每只刻度试管中依次加入100 μL 66ng/mL汞适配体和12 μL 100 μg/mL 纳米二氧化硅，混匀，静置10分钟；然后在各试管中依次加入150 μL 0.5 moL/L 葡萄糖、150 μL 0.01 moL/L HCl和100 μL 84 μmoL/L HAuCl₄，混匀，用二次蒸馏水定容至1.5mL，75℃水浴反应20分钟，取出试管，用冰水冷却终止反应，用二次蒸馏水定容至2.0 mL；

（2）制备空白对照溶液体系：用步骤（1）的方法不加Hg²⁺标准溶液制备空白对照溶液体系；

（3）分别取按步骤（1）、(2）制备的Hg²⁺标准溶液体系及空白对照溶液体系适量置于石英比色皿中，在荧光分光光度计上，设定仪器参数检测器电压为350v, 激发狭缝和发射狭缝均为5nm, 激发波长与发射波长相同，扫描获得体系的共振散射光谱如图1，测定370nm处的共振散射峰强度值为I，同时测定空白对照溶液体系的共振散射峰强度值为I ₀，计算ΔI = I - I ₀；

（4）以ΔI对Hg²⁺的浓度关系做工作曲线；获得线性回归方程为ΔI _370nm=101.95C+108.7，其中Hg²⁺浓度C的单位为nmol/L，测定线性范围为0.5～10 nmoL/L，检出限为0.08nmol/L；

（5）样品测定：取来自桂林市郊区的池塘水、河水，用滤纸过滤，量取适量滤液，依照步骤（1）的方法制备被测样品，其中加入的Hg²⁺标准溶液替换为被测样品，按步骤（2）-（4）操作，算出被测样品的ΔI _样品= I _样品- I ₀；

（6）依据步骤（4）的工作曲线，计算出被测样品Hg²⁺的含量，池塘水中Hg²⁺含量为3.3 nmol/L，河水中Hg²⁺含量为4.2 nmol/L。

步骤（1）中所述汞适配体的序列为5’-TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT-3’。

本技术方案检测方法的验证：

取上述实施例步骤（5）中的两种水样各三份，分别加入浓度为2 nmol/L和5 nmol/L的Hg²⁺标准溶液，进行加标回收实验，求得回收率分别为99.5%、99.1%、100.4%和98.9%、99.9%、99.3%，相对标准偏差为3.6%和4.1%。

说明该技术方案准确可靠。

Claims (2)

1.一种用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法，其特征是，包括如下步骤：

（1）制备已知浓度的Hg²⁺标准溶液体系：于刻度试管中，依次加入 10μL-200 μL 100nmol/L的Hg²⁺标准溶液、50 μL-120 μL 66 ng/mL汞适配体和10μL-20 μL 100 μg/mL 纳米二氧化硅，混匀，静置10分钟；然后在各试管中依次加入100 μL-200 μL 0.5 moL/L 葡萄糖、100 μL-180 μL 0.01 moL/L HCl和100 μL-120 μL 84 μmoL/L HAuCl₄，混匀，用二次蒸馏水定容至1.5 mL，75℃水浴反应20分钟，取出试管，用冰水冷却终止反应，用二次蒸馏水定容至2.0 mL；

（2）制备空白对照溶液体系：用步骤（1）的方法不加Hg²⁺标准溶液制备空白对照溶液体系；

（3）分别取按步骤（1）、(2）制备的Hg²⁺标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光分光光度计上，设定仪器参数，扫描获得体系的共振散射光谱，测定370nm处的共振散射峰强度值为I，同时测定空白对照溶液体系的共振散射峰强度值为I₀，计算ΔI =I - I₀；

（4）以ΔI对Hg²⁺的浓度关系做工作曲线；

（5）依照步骤（1）的方法制备样品溶液，其中加入的Hg²⁺标准溶液替换为样品溶液，并按步骤（3）的方法测定样品溶液的共振散射峰强度值为I_样品，计算ΔI_样品 = I_样品 - I₀；

（6）依据步骤（4）的工作曲线，计算出样品溶液Hg²⁺的含量。

2.根据权利要求1所述的用适配体调控二氧化硅纳米酶活性-共振散射光谱测定Hg²⁺的方法，其特征是，步骤（1）中所述汞适配体的序列为5’-TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT-3’。