CN107345966A - 一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法 - Google Patents

一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法。本发明所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。本发明所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。本发明所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。

Description

一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法
技术领域
本发明属于毒品检测领域，尤其是批量样本检测领域，涉及一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法。
背景技术
盐酸美沙酮(简称美沙酮)为μ阿片受体激动剂，药效与吗啡类似，具有镇痛作用，并可产生呼吸抑制、缩瞳、镇静等作用。不良反应主要有头痛、眩晕、恶心、出汗、嗜睡、欣快(过量时)、便秘、体位性低血压；具有成瘾性，长期使用应注意组织蓄积产生的过量中毒以及导致的药物依赖(主要为身体依赖)，美沙酮导致的药物依赖属中度至重度，表现为突然停药后出现阿片戒断症状；长期使用美沙酮的妊娠妇女，娩出的新生儿可出现戒断综合征，表现为震颤、肌肉强直、烦躁不安(啼哭)、呵欠、喷嚏、呕吐、腹泻等，可采取镇静和对症治疗。美沙酮过量可导致呼吸抑制，呼吸抑制主要表现为昏迷、呼吸变浅变慢，瞳孔缩小呈针尖状(严重呼吸抑制可因脑缺氧而散大)，血压下降，甚至休克，严重者可因呼吸抑制而死亡。
目前美沙酮的检测方法主要为胶体金法和色谱法。胶体金试纸条虽然检测方便，但其以吸毒人员尿液为检测对象，其灵敏度只有几百ng/ml，且每个试纸条每次只能检测一个人。色谱法虽然灵敏度高，但前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器。而本技术以其高灵敏度，可实现对待检人员的唾液进行毒品检测，从而避免因取尿对客体隐私的侵犯，并可实现在几分钟内进行80个样品的高通量检测。
生物膜干涉技术生物膜干涉技术(Bio-1ayer interferometry，BLI)是一种实时、无需标记的快速检测技术，其原理是当生物分子结合到传感器表面形成一层生物膜层，该生物膜层对透过传感器的光的波形造成干涉现象。干涉现象以相位移动的方式被检测，可以检测结合到传感器分子数量的变化。BLI技术已经成功应用于蛋白质分子间相互作用的检测，在小分子检测领域也有进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高通量的检测待检人员唾液中美沙酮含量的技术。所述检测方法取样方便，操作简单，检测快速，灵敏度高，在批量样品检测场合具有重要的应用价值。
本发明的目的由以下技术方案实现：
一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)：胶体金的制备。取一定体积的氯金酸HAuCl4水溶液加热煮沸，再按100:1的体积比加入枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度；
所述的氯金酸溶液的质量分数为0.01％，枸橼酸三钠水溶液的质量分数为1％；所述的上述过程都是避光的；本方法所述的胶体金的粒径为30-40nm，在524nm波长下有最大吸光度值；
步骤(2)：金标抗体的制备。取一定体积的胶体金溶液,用碳酸钾溶液调节PH至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％,室温搅拌20-30min；4-8℃，12000rpm离心20-30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到美沙酮金标抗体溶液；
所述的胶体金溶液为步骤(1)检验合格的；碳酸钾溶液浓度为0.2M；美沙酮单克隆抗体为购买的鼠源单克隆抗体；BSA(牛血清白蛋白)溶液封闭抗体未结合的位置；PBS缓冲液的pH为7.4；
步骤(3)：光纤生物传感器的制备。将APS光纤生物传感器的检测端浸没在美沙酮-BSA溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器的检测端浸没在质量含量为10％的BSA溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器的检测端浸没在蔗糖溶液中，室温静置20-30min；室温晾干，置于2～8℃干燥保存；
所述的APS光纤传感器是用无水乙醇配置的0.5M的APS(Aminopropyls-ilane,氨基丙基硅烷)浸泡光纤探头12小时并干燥后制得的，处理后的光纤探头表面能通过蛋白的氨基固定蛋白分子；美沙酮-BSA为美沙酮完全抗原，即在BSA表面偶联了美沙酮分子，可购买获得；美沙酮-BSA溶液浓度为50-100μg/mL,蔗糖溶液浓度为15％(质量含量)；
步骤(4)：待测样品准备。用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5-1mL溶液的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液待用；
所述的棉签为医用一次性棉签，EP管内的溶液为步骤(2)制得的美沙酮金标抗体溶液，EP管内的溶液作为后续检测的样品；
步骤(5)：标准曲线的制作。采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①8个步骤(3)制备的光纤传感器没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中60-100s进行梯度标准品的检测，根据检测结果，绘制标准曲线，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；
所述的具体过程可通过操作软件设置后仪器自动操作进行；甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5-2；光纤传感器经过再生后可重复使用；
步骤(6)：样品检测。采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对步骤(4)的样品进行检测；检测过程为①步骤(5)平衡后的光纤传感器没入步骤(4)的样品中60-100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得样品中美沙酮的浓度。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述方法取样方便，避免检测人员在尿液取样中的不便和对待测人员隐私的侵犯。
(2)本发明所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。
(3)本发明所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。
(4)本发明所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。
附图说明
图1为制备的胶体金的吸光度检测结果。
图2为8个梯度标准品的检测结果。
图3为8个梯度标准品的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详述本发明，但不限于此。
以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。
表1
表2
实施例1：
(1)取100mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液置于烧杯内，加热煮沸，加入1mL质量分数为1％枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度,制备的胶体金的吸光度如图1所示，表明制备的胶体金的直径在30nm左右；
(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节PH至7.2，室温搅拌10min；加入1mg美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20min；加入2ml BSA溶液封闭抗体,室温搅拌20min；4℃，12000rpm离心20min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100mL的pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，得到美沙酮金标抗体溶液；
(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5M的APS溶液中12小时后干燥获得APS光纤传感器；将其末端没入50μg/mL美沙酮-BSA溶液中，室温静置20min；再将光纤生物传感器没入10％的BSA溶液中，室温静置20min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置20min；室温晾干，置于4℃干燥保存；
(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5mL美沙酮金标抗体的1.5mL的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液作为后续检测的样品；
(5)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入PBS缓冲液中30s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中100s进行梯度标准品的检测，检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中30s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中30s进行平衡；
(6)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中30s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中30s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中美沙酮的含量分别为743.59ng/mL，54.61ng/mL，16.69ng/mL，>1000ng/mL，115.73ng/mL，<10ng/mL，276.59ng/mL，478.62ng/mL；
(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)和固相萃取技术(SPE)相结合测得待检人员1-8号唾液中的美沙酮含量分别为752.55ng/mL，57.15ng/mL，19.52ng/mL，1952.42ng/mL，118.52ng/mL，3.68ng/mL，286.34ng/mL，489.15ng/mL，与本发明测得的结果一致。
实施例2：
(1)取100mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液置于烧杯内，加热煮沸，加入1mL质量分数为1％枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度,制备的胶体金的吸光度如图1所示，表明制备的胶体金的直径在30nm左右；
(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节PH至7.4，室温搅拌10min；加入2mg美沙酮单克隆抗体,室温搅拌30min；加入2ml BSA溶液封闭抗体,室温搅拌30min；4℃，12000rpm离心30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100mL的pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，得到美沙酮金标抗体溶液；
(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5M的APS溶液中12小时后干燥获得APS光纤传感器；将其末端没入100μg/mL美沙酮-BSA溶液中，室温静置30min；再将光纤生物传感器没入10％的BSA溶液中，室温静置30min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置30min；室温晾干，置于4℃干燥保存；
(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5mL美沙酮金标抗体的1.5mL的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液作为后续检测的样品；
(5)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入PBS缓冲液中60s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中60s进行梯度标准品的检测，检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中60s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中60s进行平衡；
(6)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中60s进行检测，②检测后的光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中60s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中60s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中美沙酮的含量分别为761.41ng/mL，60.53ng/mL，21.76ng/mL，>1000ng/mL，121.53ng/mL，<10ng/mL，291.82ng/mL，503.68ng/mL；
(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)和固相萃取技术(SPE)相结合测得待检人员1-8号唾液中的美沙酮含量分别为752.55ng/mL，57.15ng/mL，19.52ng/mL，1952.42ng/mL，118.52ng/mL，3.68ng/mL，286.34ng/mL，489.15ng/mL，与本发明测得的结果一致。
实施例3：
(1)取100mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液置于烧杯内，加热煮沸，加入1mL质量分数为1％枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度,制备的胶体金的吸光度如图1所示，表明制备的胶体金的直径在30nm左右；
(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节PH至7.4，室温搅拌15min；加入1.5mg美沙酮单克隆抗体,室温搅拌25min；加入1.5ml BSA溶液封闭抗体,室温搅拌25min；4℃，12000rpm离心25min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100mL的pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，得到美沙酮金标抗体溶液；
(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5M的APS溶液中12小时后干燥获得APS光纤传感器；将其末端没入75μg/mL美沙酮-BSA溶液中，室温静置25min；再将光纤生物传感器没入10％的BSA溶液中，室温静置25min；再将光纤生物传感器没入15％蔗糖溶液中，室温静置25min；室温晾干，置于4℃干燥保存；
(4)用医用一次性棉签沾取1-8号待检人员的下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5mL美沙酮金标抗体的1.5mL的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液作为后续检测的样品；
(5)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①将上述制备好的8个光纤传感器没入PBS缓冲液中100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中100s进行梯度标准品的检测，检测结果如图3所示，根据检测结果如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中100s进行平衡；
(6)采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪上述待测样品进行检测；检测过程为①将上述平衡后的光纤传感器分别没入1-8号待检样品中100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入pH＝1.5的甘氨酸-盐酸缓冲液中100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入pH＝7.4的PBS缓冲液中100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，求得1-8号样品中美沙酮的含量分别为748.91ng/mL，60.46ng/mL，20.57ng/mL，>1000ng/mL，120.52ng/mL，<10ng/mL，304.19ng/mL，485.59ng/mL；
(7)验证本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)和固相萃取技术(SPE)相结合测得待检人员1-8号唾液中的美沙酮含量分别为752.55ng/mL，57.15ng/mL，19.52ng/mL，1952.42ng/mL，118.52ng/mL，3.68ng/mL，286.34ng/mL，489.15ng/mL，与本发明测得的结果一致。

Claims (5)

1.一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、金标抗体的制备
将胶体金溶液调节PH至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的美沙酮单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％，室温搅拌20-30min；然后置于4-8℃下离心，沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；
所述的胶体金粒径为30-40nm，在524nm波长下有最大吸光度值；
步骤(2)、待测样品准备
用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，置于0.5-1mL安非他命金标抗体溶液中，旋转混匀后弃掉棉签，得到所需的待测样品；
步骤(3)、样品检测
采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对步骤(2)的待测样品进行检测，检测过程如下：
①将再生平衡后的APS光纤传感器的检测端浸没在步骤(2)的待测样品60-100s进行检测；
②检测后的APS光纤传感器的检测端再次进行再生平衡；
③将检测结果代入美沙酮标准曲线中，获得待测样品中美沙酮的浓度。
2.如权利要求1所述的一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于所述的美沙酮标准曲线采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线，具体过程如下：
①多个APS光纤生物传感器的检测端浸没在PBS缓冲液中30-100s进行平衡；
②平衡后的多个光纤传感器的检测端分别浸没在0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的美沙酮标准品溶液中60-100s进行梯度标准品的检测，根据检测结果，绘制标准曲线，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，即美沙酮标准曲线。
3.如权利要求1所述的一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于APS光纤传感器再生平衡过程是将APS光纤生物传感器的检测端浸没在甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生；再生后的光纤传感器的检测端浸没在PBS缓冲液中30-100s进行平衡。
4.如权利要求1或2或3所述的一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于所述的APS光纤生物传感器的制备过程如下：
1)采用0.5M APS乙醇溶液浸泡普通空白的光纤生物传感器检测端12小时并干燥；其中处理后传感器的检测端表面能通过蛋白的氨基固定蛋白分子；
2)将上述处理后传感器的检测端浸没在美沙酮-BSA溶液中，室温静置20-30min；
3)将上述处理后传感器的检测端浸没在质量含量为10％的BSA溶液中，室温静置20-30min；
4)将上述处理后传感器的检测端浸没在蔗糖溶液中，室温静置20-30min；
5)室温晾干，置于2～8℃干燥保存；
美沙酮-BSA为美沙酮完全抗原，即在BSA表面偶联了美沙酮分子。
5.如权利要求4所述的一种基于生物膜干涉技术的美沙酮检测方法，其特征在于美沙酮-BSA溶液浓度为50-100μg/mL。
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