CN107281221B - 深海矿物质浓缩液、制备方法及在酒精性肝损伤中的应用 - Google Patents

深海矿物质浓缩液、制备方法及在酒精性肝损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种深海矿物质浓缩液及其制备方法，以及深海矿物质浓缩液在制备保护酒精性肝损伤的药物或保健品中的应用。本发明的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：镁>50000ppm；钠<8000ppm；钾<8000ppm；钙<200ppm。

Description

深海矿物质浓缩液、制备方法及在酒精性肝损伤中的应用
1、技术领域
本发明属于预防保健领域，涉及一种深海矿物质浓缩液及其制备方法，以及深海矿物质浓缩液在制备治疗和/或预防酒精性肝损伤的药物或保健品中的应用。
2、背景技术
海洋是一座资源宝库，它不但拥有大量的矿藏、能源，同时还拥有其它众多的宝贵资源，深海矿物质正是海洋深层水(deep-sea water，DSW)中的天然矿物质。DSW作为一种新的天然资源正在受到世人的瞩目。
DSW通常是指阳光照射不到，不能进行光合作用，约200m以深的海水，研究表明，DSW具有不少有别于海洋表层水(surface-sea water，SSW)的优良性质，如低温恒定性、矿物元素丰富且稳定及无菌情节性等特性。
酒精性肝病(Alcoholic Hepatitis)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其主要临床特征是恶心、呕吐、黄疸、可有肝脏肿大和压痛。并可并发肝功能衰竭和上消化道出血等。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。酒精性肝病是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康。
3、发明内容
本发明的目的是在以深层海水为基础原料，提供一种深海矿物质浓缩液，该深海矿物质浓缩液制备简单、安全、含有有益的矿物质元素，以及在制备治疗和/或预防酒精性肝损伤的药物或保健品中的应用
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明要求保护一种深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：
镁>50000ppm；
钠<8000ppm；
钾<8000ppm；
钙<200ppm。
优选的，所述的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：
镁50000ppm～80000ppm；
钠2000ppm～3500ppm；
钾1000ppm～5000ppm；
钙20ppm～30ppm。
优选的，所述的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：
镁50000ppm～76000ppm；
钠2000ppm～3100ppm；
钾1500ppm～4700ppm；
钙20ppm～30ppm。
更优选的，所述的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：镁50779ppm、钠3050ppm、钾4650ppm、钙28ppm。
进一步的，本发明还要求保护一种深海矿物质浓缩液还可以包括以下矿物质元素及浓度：锶40mg/L～50mg/L，锌45μg/L～55μg/L。
优选的，所述的深海矿物质浓缩液包括以下矿物质元素及浓度：镁75366ppm、钠2150ppm、钾1520ppm、钙24ppm、锶49mg/L、锌50μg/L。
本发明还要求保护一种深海矿物质浓缩液的制备方法：海平面600m预定深度下的深层海水经反复纳滤膜过滤装置后分离出浓水，然后将浓水经反复反渗透装置后再进行减压蒸馏除去氯化钠得到浓缩液，再进行减压浓缩，使其体积浓缩至原体积的1.0～3.0％，即得。
本发明进一步要求保护一种深海矿物质浓缩液在制备保护酒精性肝损伤的药物或保健品中的应用。
本发明所述的深海矿物质浓缩液可以升高急性酒精中毒小鼠肝脏过氧化物歧化酶和、还原型谷胱甘肽含量，降低急性酒精中毒小鼠肝脏丙二醛含量，减少肝细胞内脂滴。
本发明所述的深海矿物质浓缩液可以减少亚急性酒精肝损伤小鼠肝脂肪变性、减轻炎症。
本发明的深海矿物质浓缩液具有以下优点：
(1)本发明的深海矿物质浓缩液含有有益的矿物质元素镁、钠、钾、钙。
(2)本发明的深海矿物质浓缩液安全无毒副作用。本发明的深海矿物质浓缩液对急性酒精中毒模型小鼠和亚急性酒精性肝损伤模型小鼠的体重和一般健康情况均无不良影响。
(3)本发明的深海矿物质浓缩液具有良好的抗氧化功能，对急性酒精性肝损伤有一定的预防作用。在成功建立的急性酒精中毒小鼠模型上，发现本发明的深海矿物质浓缩液肝脏GSH含量和SOD活力显著高于模型组，MDA含量显著低于模型组。且与模型组相比，肝脏病理评分显著降低。
(4)本发明的深海矿物质浓缩液对亚急性酒精性肝损伤有良好的预防作用。在亚急性酒精性肝损伤小鼠的模型上，与模型组相比，本发明的深海矿物质浓缩液肝脏病理评分明显降低。
(5)本发明的深海矿物质浓缩液制备工艺简单，没有引入化学物质，适合工业化生产且利于环保。
4、附图说明
图1为深海矿物质浓缩液对急性酒精中毒小鼠的肝脏病理改变(冰冻切片，苏丹III染色，放大倍数400)，上左图为空白组，上中图为模型组，上右图为阳性组，下左图为A5组，下中图为A10组，下右图为B5组；
图2为深海矿物质浓缩液对亚急性酒性肝损伤小鼠的肝脏病理改变(HE染色，放大倍数400)，上左图为空白组，上中图为模型组，上右图为阳性组，下左图为A5组，下中图为A10组，下右图为B5组。
5、具体实施例
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实验动物：SPF级雄性昆明小鼠，购自四川省医院实验动物研究所，实验动物生产合格证号SCXK(川)2013-15。饲养于四川大学华西公共卫生学院屏障级动物房，合格证号SCYK(川)2013-011。动物房内保持安静、清洁、通风和适宜光照状态，温度保持在(23±2)℃，湿度为40％～70％，明暗交替周期为12h，同时保证动物自由饮水和充分进食，饮水和饲料均经无菌处理。正式实验前适应性喂养1周。
主要试剂与仪器：见下表1-2。
表1对照物与试剂
表2主要仪器
统计方法：结果数据使用SPSS 20.0统计软件包进行分析，计量资料采用方差分析，先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，各组数据见差异无显著性；F值≥F0.05，各组数据间有显著差异，进一步使用两两比较方法进行统计分析。对非正态或方差不齐数据进行变量转换后采用方差分析，若变量转换后仍未达到正态或方差分析，则用秩和检验进行统计分析。计数资料使用卡方检验。
实施例1本发明的深海矿物质浓缩液的制备方法
海平面600m预定深度下的深层海水经反复纳滤膜过滤装置后分离出浓水，然后将浓水经反复反渗透装置后再进行减压蒸馏除去氯化钠得到浓缩液，再进行减压浓缩，使其体积浓缩至原体积的1.0～3.0％，即得本发明深海矿物质浓缩液。
实施例2本发明的深海矿物质浓缩液
本发明的深海矿物质(Deep Sea Water,DSW)由实施例1制得，即配方A(以下简称DSW-A)和配方B(以下简称DSW-B)均为经脱盐处理的淡黄色液体。所含的主要离子浓度如表3所示。
表3深海矿物质浓缩液主要离子浓度
1L去离子水中加入6ml的DSW-A浓缩液或4ml的DSW-B浓缩液，稀释为硬度为1200的液体，为推荐的人饮用实际浓度(即1倍浓度)。
实施例3本发明的深海矿物质浓缩液对急性酒精中毒小鼠的作用
急性酒精中毒模型建立：
SPF级雄性昆明种小鼠32只(20～25g)，适应性喂养一周后随即分为4组，每组8只。禁食12小时，各组小鼠分别灌胃0.13、0.14、0.15、0.16ml/10g.bw的56°红星二锅头。观察各组小鼠的醉酒表现，并记录醉酒动物数和死亡动物数等，确定最适醉酒剂量(即小鼠全部或大部分出现翻正反射小时且无死亡的剂量)。
实验内容：
SPF级雄性昆明小鼠109只(18～22g)，适应性喂养一周后随机分为7组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、DSW-A 1倍浓度组(A1)、DSW-A 5倍浓度组(A5)、DSW-A10倍浓度组(A10)、DSW-B 5倍浓度组(B)。阳性组每日灌胃0.075g/ml浓度的海王金樽水溶液，灌胃体积0.2ml/10g.bw，即人体推荐剂量的10倍。各试验组自由引用含相应浓度受试物的水。正常对照组与模型对照组饮用去离子水。给予各组动物相应的处理14天，第14天傍晚开始禁食，第15天上午除正常对照组外，其余6组动物灌胃给予最适醉酒剂量的56°红星二锅头后6h后处死。
处死后取部分肝脏以冰生理盐水作为匀浆介质，在手动玻璃匀浆管中进行充分研磨，制备10％的组织匀浆，制备好的匀浆经2500r/min离心10min，上清液样本在-80℃保存，检查肝组织过氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量。
各组小鼠处死时，收集血液，分离血清，检测血清中甘油三酯(TG)水平和谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活力。
取肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹III染色。每张切片随即观察6个400倍视野(2个中央静脉区、2个汇管区、2个中央静脉区及汇管区见区)，观察脂滴在肝脏的分布范围和面积，按照《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法》中的评分标准对每个视野进行评分，每个样本的评分取6个视野评分的平均值。
实验结果：
1、最佳醉酒剂量
如表4所示，在剂量为0.15ml/10g.bw时，大多数小鼠醉酒(即翻正反射消失)且无死亡，故本次实验选择0.15ml/10g.bw作为最佳醉酒剂量。
表4不同剂量56°红星二锅头对小鼠醉酒的影响
2、一般情况和体重变化
实验期间各组动物活动正常，生长发育良好，体毛光亮，均未观察到异常体征及动物死亡。实验期间小鼠体重变化见表5。各组小鼠在实验前、给药1周、2周后的体重差异均无统计学意义。
表5不同浓度DSW对急性酒精中毒小鼠体重的影响
3、抗氧化功能
急性酒精中毒小鼠肝脏抗氧化指标的情况见表6。与正常组相比，模型组小鼠肝脏GSH含量显著降低(p<0.01)，模型成立。与模型组相比，阳性组小鼠肝脏GSH含量显著升高(p<0.05)，DSW-A 10倍浓度组小鼠肝脏GSH含量显著升高(p<0.01)，且与阳性组比较无统计学差异(p>0.05)。
与正常组相比，模型组小鼠肝脏SOD活力显著降低(p<0.05)，模型成立。与模型组相比，阳性组小鼠SOD活力显著升高(p<0.01)，DSW-A5倍(p<0.05)、10倍浓度组(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.01)小鼠肝脏活力显著升高，且与阳性组相比较无统计学差异(p>0.05)。
与正常组相比，模型组小鼠肝脏MDA含量显著升高(p<0.01)，模型成立。与模型组相比，阳性组小鼠肝脏MDA含量显著降低(p<0.05)，DSW-A1倍浓度小鼠肝脏MDA含量显著降低(p<0.05)，且与阳性组比较无统计学差异(p>0.05)。
表6不同浓度DSW对急性酒精中毒小鼠肝脏抗氧化指标的影响
*表示与正常组相比，p<0.05，**表示与正常组相比，p<0.01
#表示与模型组相比，p<0.05，##表示与正常组相比，p<0.01
4、血清生化指标
急性酒精中毒小鼠血清生化指标情况见表7。与正常组相比，模型组小鼠血清GOT活力显著升高(p<0.01)；与模型组相比，阳性组小鼠血清GOT活力显著降低(p<0.05)，DSW-A10倍浓度组小鼠血清GOT活力显著降低(p<0.05)，且与阳性组比较无显著差异。各组急性酒精中毒小鼠血清的TG水平和GPT活力无显著差异。
表7不同浓度DSW对急性酒精中毒小鼠血清生化指标的影响
**表示与正常组相比，p<0.01，#表示与模型组相比，p<0.05
5、病理评分
小鼠肝脏冰冻切片，苏丹III染色，在光镜下观察(图1)，正常组肝细胞几乎未见脂滴；模型组和DSW-A1组肝细胞内出现大量脂滴，含脂滴的肝细胞约占视野内肝细胞综上逇1/2～3/4，甚至肝组织全被脂滴代替；阳性组、DSW-A5和DSW-B5组肝细胞内含有轻、中度的脂滴，含脂滴的肝细胞约占视野内肝细胞总数的1/4～3/4；DSW-A10组肝细胞内出现少量脂滴，含脂滴的肝细胞一般不超过视野内肝细胞总数的1/2。
病理评分情况见表8。与正常组相比，模型组小鼠肝脏病理评分显著升高(p<0.01)，模型成立。与模型组相比，DSW-A5倍(p<0.01)、10倍浓度组(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.05)小鼠肝脏病理评分显著降低，且与阳性组病理评分比较无显著差异。
表8不同浓度DSW对急性酒精中毒小鼠肝脏病理指标的影响，M(P25，P27)
**表示与正常组相比，p<0.01
#表示与模型组相比，p<0.05，##表示与模型组相比，p<0.01
实施例4本发明的深海矿物质浓缩液对亚急性酒精肝损伤小鼠的作用
实验内容
SPF级雄性昆明小鼠84只(18～22g)，适应性喂养一周后随机分为7组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、DSW-A 1倍浓度组(A1)、DSW-A 5倍浓度组(A5)、DSW-A 10倍浓度组(A10)、DSW-B 5倍浓度组(B)。阳性组每日灌胃0.15g/ml浓度的海王金樽水溶液，即人体维持剂量的10倍，灌胃体积0.1ml/10g.bw。各组试验自由引用含相应浓度受试物的水。正常对照组与模型对照组饮用去离子水。给予相应的处理，持续30天。除正常组外，其余6组动物于实验第三周(第15天)起，每日灌胃给予50％的乙醇溶液(10ml/kg.BW)。
实验结束前禁食12h，眼眶取血分离血清，测血清低密度脂蛋白(LDL)、总胆红素(T-BIL)、总胆固醇(TC)的含量。取部分肝组织按常规方法制作石蜡切片，观察记录肝细胞变形(脂肪变形、水样变形、胞浆凝聚、气球样变)、肝细胞坏死和炎症改变等，按照《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法》中的病理评分标准进行评分。
实验结果
1、一般情况和体重变化
实验期间各组动物活动正常，生长发育良好，体毛光亮，均未观察到异常体征及动物死亡。实验期间小鼠体重变化见表9。各组小鼠在实验前、实验中、实验末的体重均无统计学差异。
表9不同浓度DSW对亚急性酒精中毒小鼠体重的影响
2、血清生化指标
亚急性酒精性肝损伤小鼠血清生化指标情况见表10。与正常组相比，模型组小鼠血清LDL浓度显著升高(p<0.01)，模型成立。与模型组相比，阳性组小鼠血清LDL浓度显著降低(p<0.01)，DSW-A5倍(p<0.05)、10倍浓度(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.05)小鼠血清LDL浓度显著降低，且与阳性组比较均无统计学差异(P>0.05)。
与正常组相比，模型组小鼠血清T-BIL浓度显著升高(p<0.01)，模型成立。与模型组相比，DSW-A1倍(p<0.05)、5倍(p<0.01)、10倍(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.01)小鼠血清T-BIL浓度显著降低。
与正常相比，模型组小鼠TC浓度显著升高(p<0.05)，模型成立。与模型组相比，DSW-A5倍(p<0.05)、10倍浓度组(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.05)小鼠血清TC浓度显著降低。
表10不同浓度DSW对亚急性酒精肝损伤小鼠血清生化指标的影响
*表示与正常组相比，p<0.05，**表示与正常组相比，p<0.01
#表示与模型组相比，p<0.05，##表示与模型组相比，p<0.01
3、病理评分
亚急性酒精性肝损伤小鼠肝脏HE染色切片在光镜下观察(见图2)，正常组偶见肝细胞水样变性，未见其他病变；模型组存在严重的肝脂肪变性，并伴有不同程度的肝细胞气球样变、胞浆凝聚、水样变性和炎症灶，少见肝细胞坏死；阳性组和DSW-A1倍剂量组存在中度的脂肪变性，伴有轻度水样变性，偶见炎症灶和坏死；DSW-A5倍、10倍和DSW-B5浓度组存在轻微的脂肪变性和水样变性，偶见炎症灶，几乎无坏死。
病理评分结果见表11。模型组小鼠肝脏病理评分显著高于正常组(p<0.01)，模型成立。DSW-A5倍(p<0.01)、10倍浓度(p<0.01)和DSW-B5倍浓度组(p<0.01)肝脏病理评分显著低于模型组；而阳性对照组与模型组比较无显著差异(p>0.05)。
表11不同浓度DSW对亚急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响，M(P25，P27)
**表示与正常组相比，p<0.01，##表示与模型组相比，p<0.01。

Claims (6)

1.一种深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液在制备治疗和/或预防酒精性肝损伤的药物中的应用；所述的深海矿物质浓缩液矿物质元素及浓度组成为：
2.如权利要求1所述的深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液矿物质元素及浓度组成为：
3.如权利要求1所述的深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液矿物质元素及浓度组成为：镁75366ppm、钠2150ppm、钾1520ppm、钙24ppm、锶49mg/L、锌50μg/L。
4.如权利要求1～3任一权利要求所述的深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液的制备方法为：海平面600m预定深度下的深层海水经反复纳滤膜过滤装置后分离出浓水，然后将浓水经反复反渗透装置后再进行减压蒸馏除去氯化钠得到浓缩液，再进行减压浓缩，使其体积浓缩至原体积的1.0～3.0％，即得。
5.如权利要求1所述的深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液可以升高急性酒精中毒小鼠肝脏过氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽含量，降低急性酒精中毒小鼠肝脏丙二醛含量，减少肝细胞内脂滴。
6.如权利要求1所述的深海矿物质浓缩液，其特征在于，所述的深海矿物质浓缩液可以减少亚急性酒精肝损伤小鼠肝脂肪变性、减轻炎症。
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