CN107252132A - 酪蛋白‑卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型酪蛋白糖基化产物制备的方法,并且自主装形成新型纳米粒,具体涉及以酪蛋白、一种带电多糖卡拉胶为原料,采用超声干法美拉德反应,将酪蛋白与带电多糖进行接枝反应,再将酪蛋白多糖共聚物在超声环境下得到糖基化自组装纳米微胶囊,并运用于辣椒红色素微胶囊化的食品应用中。新型酪蛋白糖基化产物纳米粒能有效保护PRP提高其热稳定性并延长商品货架期。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖基化酪蛋白自主装纳米微胶囊的制备方法及胶囊化辣椒 红素的制备,属于食品添加剂纳米胶囊技术领域。
背景技术
辣椒红色素作为一种从辣椒中提取出来的天然的红色素,主要成分是辣椒红 素和辣椒玉红素。由于其良好的着色性,色彩鲜艳,广泛用于各种食品添加。辣 椒红色素不会对人体造成副作用,并且具有营养保健、防辐射等特殊功效它不仅 改善了食品的色泽,还具有能够提高人体内类胡萝卜类化合物的含量,比如玉米 黄质、β-胡萝卜素等,具有一定的营养价值和保健功能,已经被美国FAQ、英国、 WHO、EEC及中国认定为无限制使用的天然食品添加剂。
PRP是目前世界上销售最大的天然食用色素。由于人们越来越追求健康和绿 色消费,渐渐将目光投向更安全可靠的辣椒红素等天然色素的使用上,而且我国 辣椒产量丰富、价格低廉,开发应用PRP具有很大的经济效益和广阔的国内外 市场前景。但由于天然辣椒红素为油溶性色素,且在外界的高温、光照及助氧化 剂的条件下不稳定,另外,在食品加工中,很难与其他基料混合均匀。而微胶囊 技术是把少量物质包裹在聚合物薄膜中的技术,现在微胶囊技术已经广泛应用于 药物、食品研发中。微胶囊技术有着极大的优越性:一、微胶囊技术可以改变芯 材的状态,将液体的芯材粉末化,便于储存和运输;二、有效地降低外界环境对 芯材的影响,延长芯材的活性,维持芯材的稳定性,延长产品架货期;三、可以 根据实际的需求,人为地释放芯材。由于微胶囊技术的这些优点,已使之成为 21世纪重点研发的新兴技术,特别是香精香料和油溶性物质研究最为广泛。通 过微胶囊技术可以将液体状的辣椒红色素变成水溶性的粉末,大大提高辣椒红色 素的应用范围。
目前美拉德反应是蛋白改性中最为安全理想的方法,近年来许多科学工作 者,应用美拉德反应,即不添加任何化学试剂基于蛋白质分子中氨基酸侧链的自 由氨基(主要是赖氨酸侧链上的ε-氨基基团)和糖分子还原末端的羟基之间的羰 氨反应。蛋白质-糖共价复合物的形成使其既具有蛋白的乳化能力,又具有多糖 的稳定能力,在胶体体系中具有乳化和稳定双重作用,这种大分子复合物对于环 境条件具有较高的适应性,与蛋白质-多糖非共价复合物相比,其结合不受热或 pH的变化的影响,复合物的蛋白质部分可以有效的吸附在油-水界面上降低界面 张力,同时,共价结合的多糖分子链在吸附膜的周围形成立体网状结构,增加了 膜的厚度和机械强度。有研究指出,在蛋白质中引入多糖形成复合物,蛋白质的 溶解度、抗菌性以及热稳定性等性能都会大大改善,同时多糖的乳化性也会有明显提高。
国内外对蛋白质和多糖进行糖基化接枝的研究方法主要有两种:干法和湿 法。
干法反应常见于蛋白质与多糖之间,这是由于在各种分子内作用力以及疏水 相互作用的影响下,水溶液中的蛋白质分子中一些反应基团被包埋于分子内部而 不利于反应;除此之外,作为碳水化合物的多糖,由于在溶液中的立体效应使得 其化学反应具有强烈的取向性。反应是在低于蛋白质的变性温度条件下进行的, 而且,反应时要求反应体系适当的相对湿度使得在较低的相对湿度下蛋白质中的 氨基处于非聚集的反应状态,从而提供反应基团进行共价结合。
干法糖基化反应将多糖接枝到蛋白上可增加蛋白的亲水性,形成的共聚物是 一种嵌段共聚物,含有疏水性结构和亲水性的多糖,在溶液中自组装成胶束或作 为表面活性剂吸附在油-水界面,亲水性的多糖在表面形成稳定的“毛发”层,“毛 发”层的空间排阻和液滴之间的静电斥力维持胶束的稳定,共聚物具有良好的表 面活性非常适合作为微胶囊及纳米胶囊的壁材,可达到保护性质敏感的营养素并 达到靶向释放的目的。
自组装技术作为制备纳米微胶囊的一种方法,其材料被认为是21世纪材料 科学与工程最重要的领域之一。根据G.W.Whitesides对自主张的概括。自组装 是指在组装单元之间自发形成有序结构的一种现象。由此可见,自组装系统含有 两个基本要素:组装单元和组装单元之间的非共价键的相互作用力。就组装单元 来说,天然生物材料,由于其的绿色、安全、良好的导向性好等特征赋予其得天 独厚的优势。与传统的微胶囊相比,纳米微胶囊具有更好的靶向性和缓释效果。 微胶囊技术在食品中的应用使食品添加剂能更方便、安全地应用,使食品的加工、 新产品的开发更为方便,从而在色香味型营养保健以及安全等方面提升了产品的 质量
发明内容
本发明提供了一种新型酪蛋白糖基化产物制备的方法,并且自主装形成新型 纳米粒,具体涉及以酪蛋白、一种带电多糖卡拉胶为原料,采用超声干法美拉德 反应,将酪蛋白与带电多糖进行接枝反应,再将酪蛋白多糖共聚物在超声环境下 得到糖基化自组装纳米微胶囊,并运用于辣椒红色素微胶囊化的食品应用中。
本发明采用的技术方案如下:一种酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备 方法,包括下述步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:
将酪蛋白溶于pH=7.4磷酸盐缓冲液中,室温磁力搅拌2.5h,制备成酪蛋白 均匀溶液,超声处理;收集样品后加入一定比例卡拉胶,混合均匀后冷冻干燥 48h,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应容器中并 将反应温度控制在40-80℃,pH为7-8;反应22-26小时后冷却终止反应,即得 酪蛋白糖基化共聚物;
(2)酪蛋白-卡拉胶自组装纳米微胶囊的制备:
将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,并加入一 定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml;将配制好的溶液放在20-30℃水浴磁力 搅拌2.5-3.5小时,之后转移到3-5℃条件下放置8-12h,使糖基化产物颗粒溶胀 充分,在冰浴的条件下,在250w的功率下超声5-7min,则得到糖基化共聚物自 组装纳米微胶囊。
步骤(1)中的磷酸盐缓冲液的pH为7-8,优选为7.4,制备成酪蛋白均匀 溶液的浓度为2mg/ml,超声处理为在250w功率下5s-on,5s-off。
步骤(1)中的酪蛋白与卡拉胶的摩尔比0.3-0.8:1,优选为0.5:1,反应容 器中的相对湿度为70%-80%,优选为79%。
步骤(1)中将酪蛋白糖基化共聚物溶于水,并用截流分子量100,000的超 滤膜反复超滤,收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥,即得酪蛋白糖 基化共聚物。
步骤(2)中的配置的共聚物溶液的终浓度为1.5-2.5mg/ml,优选为2.0mg/ml。
酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法可以用于食品添加剂胶囊化 中。
酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶囊化中的应用, 包括下述步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于P磷酸盐缓冲液中,室温 磁力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,超声处理;收集样品后加入卡拉胶,混合均 匀后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应 容器中并将反应温度控制在40-80℃,pH为7-8;反应22-26小时后冷却终止反 应,即得酪蛋白糖基化共聚物;
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中,使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml, 制得辣椒红素-乙醇悬液;将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共 聚物溶液,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml;在共聚物溶液中 加入等量的辣椒红素-乙醇悬液,充分混匀,冰浴200w下超声5-8min,形成基 于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
本发明的有益效果:本发明的有益效果:通过超声美拉德反应在酪蛋白上接 枝卡拉胶,接枝率达78.05%,再通过自主装得到一种性能更加优良的微胶囊壁 材。采用的超声分散法,可将辣椒红色素包裹在一个封闭的环境中,能够有效地 保护辣椒红色素并可以更加放心地应用于食品药品领域。与蛋白反应后可以明显 提高蛋白的乳化性且有良好的热稳定性、肠胃稳定性、冻干稳定性和储存稳定性。 酪蛋白糖基化共聚物能有效包埋辣椒红色素,具有保护和提高热稳定性作用。所 以用卡拉胶与酪蛋白进行美拉德反应得到的壁材具有广阔的研究价值。
附图说明
图1是底物配比对接枝度的影响示意图;
图2是对湿度对接枝度的影响示意图;
图3是反应温度对干法反应的影响示意图;
图4是反应时间对干法反应的影响示意图;
图5是不同反应时间条件下乳化性的变化结果图;
图6是不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化结果图;
图7是不同糖基化产物浓度对纳米粒径及分布的影响示意图;
图8是不同超声功率对纳米粒径及分布的影响示意图;
图9是超声前后酪蛋白多糖共聚物纳米粒粒径分布示意图;
图10是NaCl对共价聚合物纳米自组装的影响示意图;
图11是乙醇对共价聚合物纳米自组装的影响示意图;
图12是酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的Zeta电位随溶液pH的变化情况;
图13是酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的粒径分布随溶液pH的变化情况;
图14是辣椒红素标准曲线;
图15是纳米粒中辣椒红素包埋量的测定图;
图16是光照对辣椒红色素纳米胶囊的影响示意图;
图17是温度对辣椒红色素纳米胶囊的影响示意图;
图18是食品添加剂对辣椒红色素纳米胶囊的影响示意图;
图19为纳米胶囊在模拟胃液中粒径变化图;
图20为纳米胶囊在模拟胃液中PDI值的变化图;
图21为纳米胶囊在模拟肠液PRP累积释放率的变化示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法包括以下步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,磷酸盐 缓冲液的pH为7,室温磁力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,酪蛋白均匀溶液的 浓度为2mg/ml,在250w功率下5s-on,5s-off下超声处理;收集样品后加入卡 拉胶,酪蛋白与卡拉胶的摩尔比0.3:1,优选为0.5:1,反应容器中的相对湿度 为70%,混合均匀后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱 和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在40℃,pH为7;反应22小时后冷却 终止反应,即得酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选,一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000,因此,将 制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水,并用截流分子量100,000的超滤膜反复超 滤,收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥,即得酪蛋白糖基化共聚物。
(2)酪蛋白-卡拉胶自组装纳米微胶囊的制备:
将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,共聚物溶 液的终浓度为1.5mg/ml,优选为2.0mg/ml,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓 度为0.1mg/ml;将配制好的溶液放在20℃水浴磁力搅拌2.5小时,之后转移到 3-5℃条件下放置8h,使糖基化产物颗粒溶胀充分,在冰浴的条件下,在250w 的功率下超声5min,则得到糖基化共聚物自组装纳米微胶囊。
实施例2
本实施例中酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法包括以下步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,磷酸盐 缓冲液的pH为7.4,室温磁力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,酪蛋白均匀溶液 的浓度为2mg/ml,在250w功率下5s-on,5s-off下超声处理;收集样品后加入 卡拉胶,酪蛋白与卡拉胶的摩尔比0.5:1,反应容器中的相对湿度为79%,混合 均匀后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反 应容器中并将反应温度控制在60℃,pH为7.5;反应24小时后冷却终止反应, 即得酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选,一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000,因此,将 制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水,并用截流分子量100,000的超滤膜反复超 滤,收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥,即得酪蛋白糖基化共聚物。
(2)酪蛋白-卡拉胶自组装纳米微胶囊的制备:
将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,共聚物溶 液的终浓度为2.0mg/ml,优选为2.0mg/ml,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓 度为0.1mg/ml;将配制好的溶液放在25℃水浴磁力搅拌3.0小时,之后转移到 3-5℃条件下放置10h,使糖基化产物颗粒溶胀充分,在冰浴的条件下,在250w 的功率下超声6min,则得到糖基化共聚物自组装纳米微胶囊。
实施例3
本实施例中酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法包括以下步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,磷酸盐 缓冲液的pH为8,室温磁力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,酪蛋白均匀溶液的 浓度为2mg/ml,在250w功率下5s-on,5s-off下超声处理;收集样品后加入卡 拉胶,酪蛋白与卡拉胶的摩尔比0.8:1,反应容器中的相对湿度为80%,混合均 匀后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应 容器中并将反应温度控制在80℃,pH为8;反应26小时后冷却终止反应,即得 酪蛋白糖基化共聚物。
作为优选,一般使用的酪蛋白糖基化共聚物分子量大于100,000,因此,将 制备好的酪蛋白糖基化共聚物溶于水,并用截流分子量100,000的超滤膜反复超 滤,收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥,即得酪蛋白糖基化共聚物。
(2)酪蛋白-卡拉胶自组装纳米微胶囊的制备:
将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,共聚物溶 液的终浓度为2.5mg/ml,优选为2.0mg/ml,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓 度为0.1mg/ml;将配制好的溶液放在30℃水浴磁力搅拌3.5小时,之后转移到 3-5℃条件下放置12h,使糖基化产物颗粒溶胀充分,在冰浴的条件下,在250w 的功率下超声7min,则得到糖基化共聚物自组装纳米微胶囊。
实施例4
上述方法制备的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶 囊化中的应用,包括以下步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,室温磁 力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,超声处理;收集样品后加入卡拉胶,混合均匀 后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应容 器中并将反应温度控制在40-80℃,pH为7-8;反应22-26小时后冷却终止反应, 即得酪蛋白糖基化共聚物;
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中,使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml, 制得辣椒红素-乙醇悬液;将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共 聚物溶液,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml;在共聚物溶液中 加入等量的辣椒红素-乙醇悬液,充分混匀,冰浴200w下超声5-8min,形成基 于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
1.酪蛋白-卡拉胶制备中的影响因素
1.1底物配比对接枝度的影响
反应温度控制在60℃,酪蛋白与卡拉胶的反应时间24h,相对湿度均为79%, pH值7.4。底物配比对接枝度的影响如图1所示。
1.2相对湿度对接枝度的影响
通过不同饱和盐溶液来控制不同的相对湿度,将蛋白多糖混合物,分别置于 不同相对湿度(26%,40%,65%,79%)干燥器中,反应温度控制在60℃,酪 蛋白-卡拉胶反应时间控制在24h,底物配比1:2,pH值7.4。相对湿度对接枝 度的影响如图2所示。
1.3反应温度对干法反应的影响
本研究将Cas-Ca底物配比控制在1:2,相对湿度均为79%,pH值7.4。选取不同温度(40℃,60℃,80℃)的产物检测其接枝度及褐变程度,结果如图3。
1.4 反应时间对干法反应的影响
本研究将Cas-Ca底物配比控制在1:2,相对湿度均为79%,pH值7.4。选取不同时间(6h,12h,24h,36h,48h,72h)的产物检测其接枝度及褐变程度,结果如图4。
1.5不同反应时间条件下乳化性的变化
酪蛋白-卡拉胶在不同反应时间条件下乳化性的变化结果如图5。
1.6不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化
酪蛋白-卡拉胶在不同反应时间和不同pH条件在溶解度的变化结果如图6。
由图1-6可以得出,酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊制备方法的最佳条件, 最佳条件见表1。
表1酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊制备方法的最佳反应条件
2.糖基化产物自组装纳米粒的制备过程的影响因素
2.1分别测试不同糖基化产物浓度、不同超声功率对纳米粒径及分布的影 响,见图7、8,超声前后酪蛋白多糖共聚物纳米粒粒径分布见图9,
2.2NaCl对共价聚合物纳米自组装的影响
取6个相同的碘量瓶,分别加入2mg/ml酪蛋白多糖共聚物溶液20ml,然 后分别称取一定量的NaCl加入到碘量瓶中,使NaCl终浓度为0M,0.05M,0.1M, 1M,2M,3M,充分混合后放置2h,在冰浴条件下,以功率为200w超声6min。 超声后的样品在4℃下放置一段时间测量粒径和浊度,结果如图10。
2.5乙醇对共价聚合物纳米自组装的影响
取6个相同的碘量瓶,分别加入2mg/ml糖基化产物溶液20ml,然后分别 量取一定量的乙醇加入到碘量瓶中,使乙醇终浓度为10%,20%,30%,40%, 50%,60%,充分混合后放置2h,在冰浴条件下,以功率为200w超声6min。 超声后的样品在4℃下放置一段时间测量粒径和浊度,结果如图11。
2.6Zeta电位随溶液pH的变化情况
酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的Zeta电位随溶液pH的变化情况,如图12所 示。
2.7粒径分布随溶液pH的变化情况
酪蛋白多糖共聚物和酪蛋白的粒径分布随溶液pH的变化情况如图13。
3.负载辣椒红素纳米粒的制备及应用
3.1负载辣椒红素超声纳米粒的制备
首先将15ml无水乙醇加入一定量的辣椒红素中,使得辣椒红素的终浓度为 8mg/ml,在功率为200w条件下超声6min,使辣椒红素在无水乙醇中分散均匀, 制得辣椒红素-乙醇悬液,备用。取20ml的糖基化产物溶液,不超声(按照3.3.1 方法配置),在等量的酪蛋白溶液中分别加入已经制备好的辣椒红素-乙醇悬液 10μl,30μl,60μl,100μl,300μl,600μl,充分混匀,冰浴200w下超声6min, 形成包埋有辣椒红素的糖基化产物纳米粒。
3.2步骤
3.2.1红辣椒标准曲线的制作
准确称取0.100g的辣椒红素,溶于正己烷溶液中并定容于100mL,取10.0mL 稀释液定容于100.0mL,即得到浓度0.1mg/mL的辣椒红素标准溶液。
辣椒红素标准曲线的绘制
分别取色素标准溶液0.0,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0mL,于七支10mL 的比色管中,相当于辣椒红素的含量分别为:0.0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mg, 再用正己烷溶液定容至10mL,在460nm波长下测定各组吸光度,以辣椒红素含
3.2.2不同加样量对纳米胶囊的包封率和载药量的影响
计算包封率和载药量需要测定体系中辣椒红素的总量和被包埋的辣椒红素 含量,计算公式如下:
包封率=纳米粒中辣椒红素包埋量/样品中辣椒红素总量×100%
载药量=纳米粒中辣椒红素包埋量/纳米粒的总量×100%
其中样品中辣椒红素总量:
每组取出5ml加有不同量辣椒红素的超声体系样品,加入到25ml小烧杯中, 分别在磁力搅拌条件下,加入相同体积的无水乙醇和500μl 1M氢氧化钠,充分 混合后,加入一定量的正己烷萃取,至水相为无色,合并正己烷,在450nm处, 用UNICO紫外-可见光分光光度计测正己烷相的吸光度值。
纳米粒中辣椒红素包埋量的测定:
将加有不同量的辣椒红素-糖基化纳米溶液过0.45μm滤膜,过膜后的每组 样品取5ml加入到小烧杯中,分别在磁力搅拌条件下,加入相同体积的无水乙 醇和500μl 1M氢氧化钠,充分混合后,加入一定量的正己烷萃取,至水相为无 色,合并正己烷,在450nm处,用UNICO紫外-可见光分光光度计测正己烷相 的吸光度值,结果如图15所示。
从图中可以看出,酪蛋白多糖共聚物对PRP的包埋率均呈现先增大后减小 的趋势。当PRP加入量为200μl时,酪蛋白-卡拉胶纳米粒的包埋率达到87.3% 继续增加PRP加入量,其包封率随之降低。这可能是因为超声之后的PRP乙醇 分散液以分子形式存在,以分子形式的存在的PRP倾向于结合到酪蛋白多糖纳 米胶囊的的疏水微区中。因此随着PRP加入量的增大,溶解在乙醇中的分子形 式的PRP随之增多,结合在纳米胶囊疏水区的量也增多,包埋率也就是随之升 高,而一定量的纳米粒的结合位置有限,继续增加PRP的加入量,因不能继续 与纳米胶囊疏水区结合,导致计算所得包埋率减少。因此在最佳PRP加入量后 继续增加加入量,其呈现下降趋势。
3.2.3光照对辣椒红色素纳米胶囊的影响
取4个相同的容量瓶,分别加入50ml的辣椒红素纳米胶囊溶液,放置在: 室外自然光,室内自然光,室内日光灯,室内避光的条件下储存。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量,并按照上述公式计算保留率。 结果如图16所示。
从图中可以明显,被纳米胶囊包埋后的PRP在光照的条件在更稳定。其保 留率均高于PRP。在室外光照的条件下贮藏6周,分别被酪蛋白卡拉胶所包埋 PRP的保留率为82.1%,而未被包埋的PRP保留率仅剩45.7%。且在室内避光储 存6周后,酪蛋白卡拉胶PRP纳米胶囊保留率为88.0%,而未包埋的PRP存放 6周后包埋率降至为67.8%。说明酪蛋白多糖共聚物对PRP具有光保护作用。可 以明显增加其稳定性。延长其贮藏期限。这种光保护作用是由于酪蛋白可以吸收 和散射大部分光照,避免光对PRP的破坏作用,提高了其稳定性,防止色素长 时间被光照加速分解,提高了色素的生物可给性和利用率。
3.2.4温度对辣椒红色素纳米胶囊的影响
取4个相同的容量瓶,分别加入50ml的辣椒红素纳米胶囊溶液,分别放置 在温度为4℃、25℃、60℃的环境下储存。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳 米胶囊中辣椒红素的含量,并按照上述公式计算保留率,结果如图17所示。
对于热敏性生物活性物质来说,温度对其影响较为显著。正如图4所示,其为在不同温 度下PRP纳米胶囊和PRP保留率变化。在60℃保存6周后,被酪蛋白卡拉胶所包埋PRP的保留率为74.1%,在室温25℃贮藏6周后保留率为83.3%,在冰箱中4℃贮藏6周后保留率可达到为89.2%。而未被包埋的PRP在60℃、25℃和4℃条件在贮藏6周后其保留率分别为38.5%、54.3%、70.02%。结果证明本研究所制备酪蛋白多糖纳米微胶囊可以有效的保护内核 的PRP,防止PRP的热降解的发生,从而能够大大提高PRP的热稳定性,在食品和药品保藏 运用中发挥巨大作用。
3.2.5食品添加剂对辣椒红色素纳米胶囊的影响
每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量,并按照上述 公式计算保留率。加入0.1%的食品级防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠。避光,4℃, 无氧条件下贮藏。每隔1天按照3.2.2中的方法测定纳米胶囊中辣椒红素的含量, 并按照上述公式计算保留率,结果如图18所示。
本研究所制备的PRP纳米微胶囊可应用于食品,图18为常用食品添加剂对 PRP保留率的影响。以不加食品添加剂(苯甲酸钠、山梨酸钾)PRP纳米微胶囊 和未包埋的PRP分别为对照组1和对照组2。图中可以看出相对于对照组1,加 入苯甲酸钠的PRP,其保留率由57.2%降至49.2%,加入山梨酸钾的PRP,其保 留率由57.2%降至50.3%。而加入苯甲酸钠和山梨酸钾的PRP的包埋率与对照组 1的保留率并没有发生明显变化。说明食品添加剂的加入对PRP纳米微胶囊的稳 定性基本无影响。这种保护作用是由于糖基化产物与PRP结合后,内核的PRP 是被保护起来,因而降低了PRP与外界发生化学反应。糖基化产物覆盖在PRP表面,这种物理阻碍作用能防止光、热等介质以及食品添加剂对其产生影响。
4.体外模拟生物利用率
分别将备好的糖基化纳米胶囊(酪蛋白-卡拉胶纳米胶囊,浓度为2mg/ml) 按1:1的比例至于模拟肠液中。混合后进行消化反应4h。取20ml反应后的混合 溶液。5000r/min离心25min后,溶液分为三层,除去顶部油相和下层沉淀物质, 取中间的胶束相溶液,加入正己烷,振荡充分混合,多次萃取至胶束相无色,合 并上层有机相,在450nm处测定吸光值。利用PRP标准曲线计算游离PRP的含 量。
体外模拟生物利用率计算公式如下:
其中,
C1:4h消化反应后中间相中辣椒红素的浓度
C0:0h消化反应溶液中辣椒红素的浓度
如图19-20所示,为纳米胶囊在模拟胃液中粒径(a)和PDI值的变化(b), 图中可以明显看出,物理混合物的粒径和PDI值均随孵育时间的延长迅速增大, 释放前Mix-Cas-Ca的平均粒径和PDI值分别为513.4nm和0.536,3h后其平均 粒径和PDI值分别增大至1025.6nm和1.0。M物理混合物在模拟胃液消中,因 胃蛋白酶的剪切,其结构被破坏,酪蛋白聚集沉淀,导致经体系部分粒径增加, 同时伴随着PRP的大量释放,且使得粒径分布更加不均匀,PDI值增加。而与 物理混合物胶束相比,Cas-Ca-Capsule粒径和PDI值仅有小幅度增加。释放前 Cas-Ca-Capsule的平均粒径和PDI值分别为306.8nm和0.177;在模拟胃液孵育3h后,平均粒径和PDI指数分别为575.9nm和0.471,因而,Cas-Ca-Capsule 在模拟胃液中具有相对较好的稳定性。
如图21所示,为纳米胶囊在模拟肠液PRP累积释放率的变化。图中可以明 显看出混合物(Mix-Cas-Ca)与共聚物纳米胶囊(Cas-Ca-Capsule)在1h内对 PRP存在明显突释现象。1h后其释放逐渐缓慢并趋向于稳定,从结果中可以看 出,共聚物纳米胶囊PRP最终释放总量率高于混合物。Mix-Cas-Ca最终释放 总量为75.9%,Cas-Ca-Capsule最终释放总量达到76.6%。这说明共聚物的形成 及包埋并未对PRP在肠液中得释放产生影响。这归因于羧基端肽键,存在于胰 蛋白酶选择性水解蛋白质中精氨酸或赖氨酸残基。胰蛋白酶首先作用于共聚物纳 米胶囊表面的K-酪蛋白,将其位于116-117位的赖氨酸残基的羧基端肽键切断后形成不同分子量的多肽,导致共聚物结构被破坏,纳米胶囊解体,核内的ɑ- 酪蛋白和β-酪蛋白暴露,进一步与胰蛋白酶作用,最后共聚物被完全水解,核内 PRP得到完全释放。由此可见,纳米胶囊表面所接枝的多糖形成的界面层对胰复 合酶基本无阻碍作用。从而最大限度地保存内核物质的活性,减少外界环境因素 的影响。有效提高了PRP的生物可给性。采用生物大分子构建良好的纳米载体 用于增加营养素的溶解性和稳定性,从而最终提高营养素的生物利用率。
Claims (7)
1.一种酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法,其特征在于包括下述步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:
将酪蛋白溶于pH7.4磷酸盐缓冲液中,室温磁力搅拌2.5h,制备成酪蛋白均匀溶液,超声处理;收集样品后加入一定比例卡拉胶,混合均匀后冷冻干燥48h,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在40-80℃,pH为7-8;反应22-26小时后冷却终止反应,即得酪蛋白糖基化共聚物;
(2)酪蛋白-卡拉胶自组装纳米微胶囊的制备:
将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml;将配制好的溶液放在20-30℃水浴磁力搅拌2.5-3.5小时,之后转移到3-5℃条件下放置8-12h,使糖基化产物颗粒溶胀充分,在冰浴的条件下,在250w的功率下超声5-7min,则得到糖基化共聚物自组装纳米微胶囊。
2.根据权利要求1所述的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法,其特征在于:步骤(1)中的磷酸盐缓冲液的pH为7-8,优选为7.4,制备成酪蛋白均匀溶液的浓度为2mg/ml,超声处理为在250w功率下5s-on,5s-off。
3.根据权利要求1所述的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法,其特征在于:步骤(1)中的酪蛋白与卡拉胶的摩尔比0.3-0.8:1,优选为0.5:1,反应容器中的相对湿度为70%-80%,优选为79%。
4.根据权利要求1所述的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法,其特征在于:步骤(1)中将酪蛋白糖基化共聚物溶于水,并用截流分子量100,000的超滤膜反复超滤,收集相对分子质量大于100,000的组分冷冻干燥,即得酪蛋白糖基化共聚物。
5.根据权利要求1所述的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法,其特征在于:步骤(2)中的配置的共聚物溶液的终浓度为1.5-2.5mg/ml,优选为2.0mg/ml。
6.权利要求1所述的酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法在食品添加剂胶囊化中的应用。
7.一种酪蛋白-卡拉胶自主装纳米微胶囊的制备方法在辣椒红素胶囊化中的应用,其特征在于包括下述步骤:
(1)酪蛋白糖基化共聚物的制备:将酪蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,室温磁力搅拌,制备成酪蛋白均匀溶液,超声处理;收集样品后加入卡拉胶,混合均匀后冷冻干燥,随后将样品磨成粉,并过120目筛,置于含有饱和溴化钾的反应容器中并将反应温度控制在40-80℃,pH为7-8;反应22-26小时后冷却终止反应,即得酪蛋白糖基化共聚物;
(2)将无水乙醇加入辣椒红素中,使得辣椒红素的终浓度为6-10mg/ml,制得辣椒红素-乙醇悬液;将酪蛋白糖基化共聚物溶于pH=7.4的溶液中,配成共聚物溶液,并加入一定量的叠氮化钠使其终浓度为0.1mg/ml;在共聚物溶液中加入等量的辣椒红素-乙醇悬液,充分混匀,冰浴200w下超声5-8min,形成基于糖基化酪蛋白的胶囊化辣椒红素。
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