CN107250367B

CN107250367B - 用于减轻木质素和可溶性酚类对酶促纤维素转化的抑制作用的方法

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Publication number: CN107250367B
Application number: CN201580076618.9A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·拉尔夫·莱迪施; 金英美
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: MA40922A; US20180023107A1; CN107250367A; EP3242951A4; EP3242951A2; US10745726B2; MX2021015881A; US11371069B2; US20200392549A1; MX2017008940A; WO2016111830A2; WO2016111830A3

Abstract

在此披露了用于通过阻止纤维素与木质素的结合来改善从生物质来源生产乙醇的方法。

Description

用于减轻木质素和可溶性酚类对酶促纤维素转化的抑制作用的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请涉及并要求于2015年1月7日提交的美国临时专利申请序列号62/100,740的优先权权益，其中所述申请的内容通过引用以其全文结合于本披露。

政府利益的声明

本发明是在美国能源部(United States Department of Energy)(DE-AC36-98GO10337；DE-FC36-08GO18103；和DE-FG02-06ER64301)授予的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本披露涉及生物质到生物乙醇的转化，特别是涉及通过阻止纤维素与木质素的结合来改善从生物质来源生产乙醇的方法。

背景技术

本部分介绍了可能有助于更好地了解本披露的方面。因此，这些陈述将从这个角度进行理解，并且这些陈述不应被理解为对于什么是现有技术或什么不是现有技术的承认。

水热预处理(例如液体热水预处理、蒸汽爆炸和稀酸预处理)通过增溶生物质的半纤维素部分来提高木质纤维素的纤维素分解水解转化。由于半纤维素和纤维素的预处理最适条件有明显不同，与实现戊糖和己糖两者的最大回收相比，多阶段预处理提供了优于单阶段预处理后的优点。在多阶段预处理中，可以优化第一预处理以除去大部分半纤维素，同时使半纤维素的降解最小化并且使由降解衍生的胡敏素的再沉淀最小化。随后的预处理更有针对性地产生对纤维素酶具有增强的敏感性的纤维素。

单独的半纤维素的去除程度不是预测预处理混合硬木的酶水解的可靠参数。即使在液体热水预处理期间从木质纤维素中除去大部分初始木聚糖，在预处理后的硬木材料中存在很大程度的纤维素转化产率的可变性。

鉴于细胞壁结构的综合性质[67]，改变一种性质的预处理也会影响其他性质。因此，在对木质纤维素进行液体热水预处理期间，半纤维素和一些木质素的去除也将改变影响纤维素水解性的其他底物特征。纤维素原料的酶水解的容易性可能受到几种底物特性的影响，例如纤维素对纤维素酶的可及性(其是聚合度(degree of polymerization，DP)的函数)、结晶度、木质素和半纤维素的含量和结构、以及粒度。

研究已经调查了溶胀、DP、纤维尺寸、酶的可及面积、结晶度、组成和木质素的存在对各种木质纤维素材料的酶水解的影响。然而，大多数研究涉及测量木质纤维素原料的底物特性，这些木质纤维素原料是通过不同的预处理技术进行预处理或是在预处理条件的有限范围内进行预处理。

因此，存在减轻木质素和可溶性酚类的抑制作用、以确保纤维素的稳健和经济的酶转化的策略的未满足的需要。

发明内容

在一个方面，提出了一种用于改善木质纤维素的酶消化率的方法。该方法包括对木质纤维素原料进行预处理和在木质纤维素原料中增溶半纤维素。在另一方面，木质纤维素原料的组成为约30％至约60％纤维素、约20％至约40％半纤维素、约15％至约30％木质素，余量为提取物和灰分，总计为100％。在又另一方面，该方法进一步包括分离和洗涤预处理后的固体，从而通过在预处理期间释放的可溶性低聚糖和酚类化合物来消除抑制。在又另一方面，该洗涤步骤进一步包括使用约0.5至约15倍生物质重量的水。在又另一方面，该水是循环水。在又另一方面，该方法进一步包括使用蒸馏塔残渣(distillation columnbottom)。

在又另一方面，该洗涤步骤在室温下进行的。在又另一方面，该洗涤步骤在高达100℃的温度下进行。在又另一方面，该方法进一步包括在高达140℃的温度下进行的压力冲洗。

在又另一方面，该洗涤步骤分至少两个阶段进行。在又另一方面，该洗涤步骤进一步包括首先使用约50℃至约100℃之间温度的水，然后使用15℃至50℃温度的水。

在又另一方面，该洗涤分多个阶段进行，其中来自一个阶段的洗涤后的固体与来自前一阶段的洗涤水逆流接触。在又另一方面，该预处理步骤包括单阶段预处理。在又另一方面，该预处理步骤在高于140℃的温度下进行。

在又另一方面，该预处理步骤包括两阶段预处理。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于180℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于190℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于195℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于200℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于205℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于210℃的温度下进行。

在又另一方面，该预处理步骤包括三阶段预处理。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤和第三预处理步骤在高于180℃的温度下进行。

在又另一方面，该预处理步骤包括多阶段预处理。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且随后的预处理步骤在高于210℃的温度下进行。

在又另一方面，该方法进一步包括将至少一半的半纤维素增溶为低聚木糖。在又另一方面，该方法还包括将浆料维持在使水处于液体状态的压力下。纤维素载量在约0.5至约40FPU/克葡聚糖之间。

在又另一方面，该方法还包括阻止木质素与具有非特异性结合蛋白的纤维素蛋白进行结合。用1至20体积水/体积木质纤维素来洗涤预处理后的固体。在又另一方面，该非特异性结合蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。在又另一方面，该预处理步骤在高于180℃的温度下进行。

在又另一方面，该木质纤维素原料包括以下项目中的任何一种或其组合；硬木、玉米秸秆、麦秆、柳枝稷、甘蔗渣、高粱残留物、玉米果皮、大豆壳、大豆残留物、干草和/或软木。

在又另一方面，提出了一种包括增溶半纤维素从而改善木质纤维素的酶消化率的方法。增溶步骤是通过液体热水预处理完成的。在又另一方面，该液体热水预处理在高于180℃的温度下进行。在又另一方面，该液体热水预处理分多个阶段进行，使得大部分半纤维素被保存为低聚木糖。在又另一方面，该液体热水预处理包括单阶段预处理。在又另一方面，该液体热水预处理在高于180℃的温度下进行。

在又另一方面，该液体热水预处理包括两阶段预处理。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于180℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于190℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于195℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于200℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于205℃的温度下进行。在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤在高于210℃的温度下进行。

在又另一方面，该预处理步骤包括三阶段预处理。

在又另一方面，第一预处理步骤在高于140℃的温度下进行，并且第二预处理步骤和第三预处理步骤在高于180℃的温度下进行。

在又另一方面，该方法进一步包括将至少一半的半纤维素增溶为低聚木糖。在又另一方面，该方法进一步包括将浆料维持在使水处于液体状态的压力下。

在又另一方面，该方法还包括纤维素酶载酶量，其中在预处理已经完成并且温度降低至低于70℃之后，该纤维素载酶量为约0.5至约20FPU/克葡聚糖。在又另一方面，该方法还包括纤维素酶载酶量，其中在预处理已经完成并且温度降低至低于60℃之后，该纤维素载酶量为约0.5至约20FPU/克葡聚糖。在又另一方面，该方法还包括纤维素酶载酶量，其中在预处理已经完成并且温度降低至低于50℃之后，该纤维素载酶量为约0.5至约20FPU/克葡聚糖。

在又另一方面，该方法还包括阻止木质素与具有非特异性结合蛋白的纤维素蛋白进行结合。在又另一方面，该非特异性结合蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

附图说明

图1是显示在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，剩余木聚糖的百分比与纤维素水解产率之间的相关性的图。水解：20FPU(＝32mg蛋白)/g葡聚糖，50℃，200rpm，pH为4.8。预处理条件在表1中给出。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。改编自Kim等人的图4。数字指示表1中给出的不同的预处理条件。UT指示未处理的木材、未处理的Avicel和Solka Floc。

图2显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，通过保水值(waterretention value，WRV)测量的底物孔隙率与纤维素水解产率之间的相关性。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

图3A显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，通过Simon染色技术测量的孔隙率(总表面面积)与纤维素水解产率之间的相关性。图3A显示了吸附的橙色和蓝色染料；数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。数字指示表1中给出的不同的预处理条件。UT指示未处理的木材、未处理的Avicel和Solka Floc。

图3B显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，通过Simon染色技术测量的孔隙率(总表面面积)与纤维素水解产率之间的相关性。图3B显示了总染料吸附、以及吸附的橙色染料与蓝色染料的比例。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。数字指示表1中给出的不同的预处理条件。UT指示未处理的木材、未处理的Avicel和Solka Floc。

图4A显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，通过蛋白(纤维素酶，BSA)吸附测量的孔隙率(酶的可及表面面积)与纤维素水解产率之间的相关性。图4A显示了spezyme CP吸附。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

图4B显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，通过蛋白(纤维素酶，BSA)吸附测量的孔隙率(酶的可及表面面积)与纤维素水解产率之间的相关性。图4B显示了BSA吸附。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

图5显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，纤维素粒度(外表面面积)和纤维素水解产率之间的相关性。数据是一式三份分析的平均值。粒度的减小与较高的转化率相关。误差条表示95％CI。

图6显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木中，纤维素聚合度(DP)和纤维素水解产率之间的相关性。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

图7A显示了BSA处理对经各种条件下预处理的混合硬木的低剂量纤维素酶(2FPU＝3mg蛋白/g葡聚糖)水解的影响(见表1，对应于每个编号的预处理条件)。针对每个相应的预处理条件，相对于不含BSA的高剂量纤维素水解产率对低剂量纤维素酶水解产率(含或不含BSA)进行作图。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

图7B显示了在预处理后的热水洗涤后的混合硬木(表1中的样品9)中，纤维素酶与总蛋白(BSA+纤维素酶)的比例变化对水解的影响。数据是一式三份分析的平均值。误差条表示95％CI。

具体实施方式

为了促进对本披露的原理的理解，现在将参考附图中所示的实施例，并且将使用特定语言来描述本披露的原理。然而，应当理解，不意图由此限制本披露的范围。

响应于未满足的需要，在此披露了一种通过阻止纤维素与木质素的结合来改善从生物质来源生产乙醇的方法。为了证明在此所述的原理，在各种严格度下对常规原料进行预处理，以检查底物特性及其针对水解容易性的属性。这使得能够对在不同条件下的液体热水预处理期间的木质纤维素的物理化学变化进行研究，并确定由酶对纤维素进行有效转化的合适预处理条件。了解在预处理过程中，木质纤维素的结构和物理化学变化以及它们对酶促木质纤维素转化效率的影响对于开发稳健和成本效益的预处理技术至关重要。

如在此披露的，液体热水预处理通过增溶半纤维素(因此打开了酶可及的孔)来改善木质纤维素的酶消化率。然而，单独将半纤维素完全去除并不能保证有效的纤维素水解。木质纤维素材料在液体热水预处理期间必须经历结构和物理变化，以产生对纤维素酶催化水解不那么顽固的预处理后的纤维素。在液体热水预处理中改变的混合硬木的这种底物特征包括孔隙率(内表面面积)、粒度(外表面面积)和纤维素DP。对于从单阶段预处理获得的预处理后的混合硬木固体水解来说，酶可及孔和内表面面积是主要的产率决定因素。在高于180℃的高温下进行预处理是有益的，因为它在相等严格度因素的较低温度下比预处理产生了更多的纤维素酶可及孔。当预处理分多个阶段进行以增溶和保存大部分呈低聚木糖的半纤维素、同时不引起显著的糖降解时，酶可及孔隙率或内表面面积不再是决定产率的限制因素。对于多阶段预处理后的固体，纤维素酶和纤维素DP容易进入的外表面对于确定水解容易性起着主要作用，而内部孔隙率在广泛范围的预处理条件下保持相对恒定。

单阶段或多阶段预处理需要高于200℃的高温预处理，以通过产生具有增加的外部和内部表面面积(酶和低纤维素DP可及)的纤维素底物来实现有效的纤维素水解，所有这些对于克服木质纤维素对酶水解的顽固性来说都是有利的特征。

当应用低剂量纤维素酶(3mg蛋白/g纤维素)时，保留于预处理后的木材中的木质素以非特异性方式进行抑制，且该抑制基本上使纤维素酶远离纤维素底物，是纤维素的成本效益水解的主要障碍。木质素的存在限制了可用于纤维素水解的纤维素酶的量。木质素对纤维素酶的负面影响加剧，因为纤维素酶载量接近上有经济吸引力的水平。由于水热预处理(例如液体热水、蒸汽爆炸和稀酸预处理)保留了预处理后的固体中的大部分初始木质素，并在该过程中释放了可溶性酚类化合物，因此制定减轻木质素和可溶性酚类的抑制作用、以确保纤维素的稳健和经济的酶转化的策略至关重要。

如下面进一步描述的，显示了液体热水预处理后的木质纤维素的有效水解的关键要素，包括：1)半纤维素的大量增溶，同时使糖损失降至最低；2)分离和洗涤预处理后的固体以消除在预处理期间释放的可溶性低聚糖和酚类化合物的抑制；3)预处理条件严格到足以引起有利于酶水解的底物特征的显著变化，例如高的酶和低纤维素DP可及的内部和外部表面面积；4)最小化纤维素酶蛋白与保留在预处理后的木质纤维素中的木质素的相互作用。

为了说明在此所述的原理，在实例中描述了通过各种分析测定和方法测量的酶消化率和预处理后的木材的底物特性变化之间的相关性。在与木质纤维素对酶水解的顽固性相关的不同底物特征的数据中，我们测量了纤维素孔隙率和酶可及表面、纤维素粒度和纤维素DP，这些都是主要的产率决定因素。在本披露中没有考虑到结晶度，因为在许多研究中已经显示，结晶度对木质纤维素的酶水解的效率没有直接影响。此外，液体热水或稀酸预处理增加了纤维素的结晶度，因为半纤维素和一些木质素在预处理期间增溶，影响了结晶度测量。这使得将结晶度与酶水解的容易性相关联变得复杂且困难。还讨论了木质素对水解的抑制，并且还报道了在低酶剂量下阻止木质素与纤维素酶相互作用对水解产生的影响。

如在此进一步披露的，在一个实施例中提供了用于改善木质纤维素的酶消化率的方法。该方法包括对木质纤维素原料进行预处理和在木质纤维素原料中增溶半纤维素。在另一方面，木质纤维素原料的组成为约30％至约60％纤维素、约20％至约40％半纤维素、约15％至约30％木质素，余量为提取物和灰分，总计为100％。在又另一方面，该方法进一步包括分离和洗涤预处理后的固体，从而通过在预处理期间释放的可溶性低聚糖和酚类化合物来消除抑制。在又另一方面，该洗涤步骤进一步包括使用约0.5至约15倍生物质重量的水。在又另一方面，该水是循环水。在又另一方面，该方法进一步包括使用蒸馏塔残渣。

在又另一个实施例中，提出了一种包括增溶半纤维素从而改善木质纤维素的酶消化率的方法。增溶步骤是通过液体热水预处理完成的。在又另一方面，该液体热水预处理在高于180℃的温度下进行。在又另一方面，该液体热水预处理分多个阶段进行，使得大部分半纤维素被保存为低聚木糖。在又另一方面，该液体热水预处理包括单阶段预处理。在又另一方面，该液体热水预处理在高于180℃的温度下进行。

实例：

材料与方法：

材料：

锤磨混合硬木细木条(长度和厚度的平均尺寸为0.5×0.1cm)，由新罕布什尔州的黎巴嫩(Lebanon,NH)的麦斯科玛公司(Mascoma Corporation)提供。Avicel PH101和

300FCC分别从密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO)的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)和俄亥俄州厄巴纳(Urbana，Ohio)的国际纤维素有限公司(International Fiber Corporation)购得。Spezyme CP(50FPU/mL，82mg蛋白/mL，比活度：0.61FPU/mg蛋白)由美国加州帕洛阿尔托(Palo Alto，CA)的丹尼斯科分部(DaniscoDivision)杰能科(Genencor)提供。诺维信188(780CBU/mL，152mg蛋白/mL)购自西格玛公司(Sigma)(目录号C6150)。由北卡罗来纳州富兰克林顿(Franklinton，NC)的诺维信北美公司(Novozyme,North America Inc.)捐赠Cellic^TM Ctec 2(120FPU/mL，190mg蛋白/mL，比活度：0.63FPU/mg蛋白)。如Hames(1981)所述，通过三氯乙酸(TCA)沉淀后的总氮分析来测定酶的蛋白浓度。所有其他试剂和化学品，除非另有说明，均购自密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO)的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。

组成分析：

生物质固体的组成由NREL(National Renewable Energy Laboratory，国家可再生能源实验室)的LAP标准分析程序确定[21-23]。分析的成分是葡聚糖、木聚糖/半乳聚糖、阿拉伯聚糖、木质素、灰分和乙酰基。使用LAP 014分析预处理后的木质纤维素的液体部分的可溶性单糖和寡糖[24]。如下所述通过HPLC分析糖。所有测量一式三份进行。

预处理：

在此应用用于液体热水(LHW)预处理的条件和装置(如Kim等人[1]总结)以预处理枫木原料。反应在1英寸OD×0.083英寸(2.54cm×2.1mm)的壁厚下进行，316不锈钢管在任一端用1英寸(2.54cm)的Swagelok管端部配件(印第安纳州印第安纳波利斯的世伟洛克公司(Swagelok,Indianapolis,IN))加盖。每个管的长度为4.5英寸(11.4厘米)，总体积为45mL。将样品体积保持在33.7mL，以在加热至目标温度期间提供约25％的顶部空间以用于液体膨胀。混合硬木细木条的水性预处理包括将底物与15％固体载量(w/w，g干固体/g总物质)的DI水混合，并在140℃下预热10分钟，然后在140℃和230℃之间的温度加热5分钟至19小时(包括5分钟升温时间)。预处理是以单阶段预处理或两阶段或三阶段预处理进行的。对于多阶段预处理，过滤来自前一阶段的预处理后的浆料，并在下一次预处理之前进行热水洗涤。仅将固体部分用于随后的预处理中。在此披露的预处理条件对应于4.12至4.81的严格度因素(Log R₀)，并总结在表1中。预热和预处理过程都在设定为目标温度的

SBL-1流化砂浴器(伊利诺伊州弗农山(Vernon Hills，IL)的科尔-帕默公司(Cole-Parmer))中进行。在预处理期间，浆料处于保持水处于液体状态压力下。

每个预处理后，通过在水中淬火10分钟来冷却包含木条浆料的反应器管。使用

No 1滤纸将预处理后的浆料真空过滤，以回收液体和固体部分用于进一步分析。预处理后的固体的预处理后洗涤如下进行。将预处理后的固体在80℃至90℃(热)的去离子水中以5％w/w的干固体混合。混合10分钟后，将浆液通过Whatman No.1滤纸过滤。收集预处理后的热洗涤后的固体、来自每次预处理的预处理液体和洗涤物(washate)，并如上所述分析它们的组成。所有预处理一式三份进行。

酶水解：

高酶剂量(20FPU/g葡聚糖)：将各种严格度因素的未处理的、预处理后的固体和纯纤维素(Avicel PH101和Solka Floc)通过20FPU Cellic Ctec 2/g葡聚糖(＝32mg蛋白/g葡聚糖)进行72小时的酶水解。水解完成后，将水解产物煮沸10分钟以使酶失活。

低酶剂量(2FPU/g葡聚糖)：将未处理的、预处理后的固体和含有或不含牛血清白蛋白(BSA)预温育的纯纤维素通过2FPU Spezyme CP(＝3mg蛋白/g葡聚糖)和10CBUNovozym 188(相当于2mg蛋白)/g葡聚糖进行168小时的水解。BSA处理程序描述于2.6部分中。

酶剂量随BSA变化：将表1中的预处理后的热洗涤的固体样品9以组合BSA和纤维素酶的不同总蛋白载量(10至100mg总蛋白/g葡聚糖)进行水解。在每个固定的总蛋白载量下，Spezyme CP的量发生变化，以提供纤维素酶与总蛋白的各种比例。在所有实验中，以10BCU/g葡聚糖来添加Novozym 188。将水解进行168小时。

所有水解过程都在培养箱-摇床中，以1％w/v葡聚糖载量、pH 4.8至5.0、50℃和200rpm，一式三份地进行。在水解结束时取样，以通过HPLC进行分析。误差条表示平均值的95％CI。

Simon染色：

木质纤维素的Simon染色按照Chandra等人所述的进行[25]。

通过同时求解以下两个方程式(1)和(2)(用于二进制混合物的朗伯-比尔定律(Lambert-Beer law))来确定离心管(CO，CB)上清液中橙色染料(DO)和蓝色染料(DB)的浓度)：

A_455nm＝ε_o/455LC_o+ε_B/455LC_B (1)

A_624nm＝ε_o/624LC_o+ε_B/624LC_B (2)

其中A_455nm、A_624nm：该混合物在455nm、624nm的吸光度；ε：在各波长下各组分的消光系数(mL/mg·cm)；L：1厘米(比色皿宽度)；C：浓度(mg/mL)。通过制备每种染料的标准曲线并测量它们在455nm和624nm处的吸光度的斜率来确定消光系数。高分子量橙色染料的消光系数ε在455nm处为51.5，在624nm处为0.243。对于蓝色染料，在455nm处和在624nm处的消光系数分别为2.62和14.5。所有测量一式三份进行。

纤维素酶和BSA吸附：

将商业纤维素酶(Spezyme CP)或BSA以150mg蛋白/g葡聚糖添加到2.5g/L葡聚糖的未处理的、预处理后的、和纯的纤维素溶液(在pH为4.8、50mM的柠檬酸钠缓冲液中)中，并在往复振荡培养箱中以100rpm、在25℃下温育1小时。将混合物以10,000rpm离心5分钟，并使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(伊利诺伊州洛克福德(Rockford，IL)的赛默飞世尔科技(Thermo Scientific)，商品号23225)测量上清液中的蛋白浓度。在不添加纤维素样品的情况下制备酶和BSA空白。底物空白仅包括底物和缓冲液。考虑到底物对照的吸光度贡献，将蛋白吸附量计算为蛋白的添加量与温育后上清液中残留的蛋白之间的差异。所有测量一式三份进行。

纤维素的平均聚合度(DP)：

由全纤维素样品的特性粘度来估算纤维素DP。首先，如Hubbell和Ragauskas[26]所述来制备全纤维素样品。将2.5g(o.d.wt)等分风干的木质纤维素分散在200mL DI水中。然后，向混合物中添加1.5mL冰乙酸和1.5g亚氯酸钠(1.5g)。将混合物在70℃下在振荡水浴中加热2小时。每2小时添加1.5mL新鲜乙酸和1.5g亚氯酸钠，引入持续6小时。6小时后，使用玻璃纤维过滤器过滤固体残余物(全纤维素)，并用去离子水充分洗涤，直到滤液pH为中性。将回收的全纤维素风干，测量含水量。使用Canon-Fenske玻璃毛细管粘度计，根据ASTMD1795[27]测定风干的全纤维素的特性粘度。然后根据下列方程式(3)测量的全纤维素的特性粘度来估算纤维素DP：

其中[η]是全纤维素的特性粘度(cm³/g)，H和G分别是含木质素样品中的半纤维素和葡聚糖的质量分数。所有测量一式三份进行。

湿粒度的测定：

湿的预处理后的和未处理的细木条的平均粒度通过筛网筛分来进行测定，其中筛网的筛孔尺寸在2(开口尺寸6mm)至尺寸88(0.04mm)的范围之间。该筛分在水中进行，以保持材料的湿润。回收每个筛网上收集的湿固体，并在105℃的烘箱中干燥过夜，并测量干重。根据方程式(4)来计算平均粒度：

∑_dp d_p·wt(d_p)％ (4)

其中d_p是平均颗粒直径[cm]，计算为(筛网开口尺寸、上筛网开口尺寸、下筛网开口尺寸)/2，wt(d_p)％是d_p的粒度的重量百分数。一式两份进行所有测量。

进行TAPPI方法(TAPPI Useful Method)UM 256[29]来测定样品的保水值。在100mL DI水中，将从未干燥的材料的样品(相当于1g烘干(o.d.)重量)进行混合，过滤，并在24℃下以900×g离心30分钟，然后在105℃烘箱中干燥3小时。保水值如下方程式(5)所定义：

所有测量一式三份进行。

HPLC：

通过连接到米顿罗微型泵(宾夕法尼亚州艾维兰(Ivyland，PA)的米顿罗公司(Milton Roy Co.))、沃特世^TM 717plus自动进样器和沃特世^TM 2414折射率检测器(加利福尼亚州米尔福德(Milford，MA)的沃特世公司(Waters Corp.))的伯乐Aminex HPX-87H离子交换柱(300mm×7.8mm，加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules，CA)的伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories Inc.))来分析水解样品。使用Empower^TM 2色谱数据软件(加利福尼亚州米尔福德(Milford，MA)的沃特世公司(Waters Corp.))来存储和处理数据。流动相为过滤至0.2μm的蒸馏的去离子水中的5mM硫酸。流动相流速为0.6mL/分钟。通过由埃彭多夫TC-50(纽约州韦斯特伯里(Westbury，NY)的埃彭多夫(Eppendorf))控制的埃彭多夫CH-30柱式加热器将柱温保持在60℃。

结果和讨论：

LHW预处理后的混合硬木的木聚糖含量变化：

我们已经表明，在以相同严格度因素预处理后的材料中，存在水解产率的显著变化，并且相比于预处理严格度，葡萄糖产率与预处理温度更具相关性[6]。此外，我们发现即使在具有相同半纤维素去除程度的预处理后的材料中，酶消化率的变化也很大(参见参考文献[6]中的图4(B))。半纤维素去除是有助于提高液体热水预处理后的木质纤维素的纤维素消化率的主要因素之一[1-3]。然而，显而易见的是，还有除木聚糖去除以外的在液体热水预处理后的纤维素水解期间直接影响葡萄糖产率的物理化学变化。

还如在此所报道的，我们检查了所选择的预处理后的混合硬木固体，以研究直接影响纤维素水解的底物的关键物理化学特性。在Kim等人[6]进行的总共18种不同的预处理条件中，选择了9种不同的导致葡萄糖产率在20％至90％的范围内的预处理条件，并分析了这些条件在不同底物特征中的变化。用于这9种预处理后的底物的样品指定和预处理条件总结于表1中。选择Avicel和Solka Floc作为不含木质素的纤维素对照。通过NREL的LAP组成分析测量，Avicel是100％纤维素，Solka Floc是80％纤维素和20％木聚糖。如Kim等人[6]，原混合硬木和预处理后的固体的组成总结于图1中。在图1，针对未处理的、预处理后的混合硬木固体和纯纤维素底物的葡萄糖产率对底物的木聚糖含量进行作图。具有17％木聚糖含量的未处理的混合硬木产生8％的葡萄糖产率。在140℃和160℃下分别进行19小时和5小时的1阶段预处理(Log R₀＝4.24)，增溶75％至80％的初始木聚糖，导致预处理后的洗涤后的固体中木聚糖含量为7％至8％。葡萄糖产率仅是名义上提高了21％至26％。以相同的严格度因素在180℃以上获得的预处理后的洗涤后固体不含木聚糖(图1中的3，4)，并产生36％至61％的葡萄糖产率。尽管所有木聚糖具有相等的预处理严格度和增溶，但在200℃下预处理产生的物质明显比在180℃下预处理产生的物质更可水解。来自多阶段预处理的预处理后的洗涤后固体也不含可测量的木聚糖，但葡萄糖产率变化很大，从61％到90％变化。未处理的非木质素纤维素底物Avicel和Solka Floc的葡萄糖产率分别为53％和71％。

可以清楚地表明，液体热水预处理后的主要作用是在木质纤维素中增溶和除去木聚糖，这似乎改善了预处理后的材料的纤维素转化率。当预处理后的固体中存在剩余的木聚糖时，较低的木聚糖含量导致较高的纤维素水解。然而，在预处理期间所有木聚糖的增溶不一定对应于任何纤维素转化率的进一步增加。在不具有可测量的木聚糖含量的预处理后的固体中存在葡萄糖产率的显著变化。考虑到木聚糖去除不是影响预处理后的纤维素酶水解的唯一因素，因此这些结果促使我们鉴定出可能与纤维素转化产率相关的底物特性的其他预处理诱导变化。这些预处理后的混合硬木固体的特性及其在不同条件下液体热水预处理过程中的变化讨论如下。

LHW预处理后的混合硬木的孔隙率和纤维素可及表面面积的变化：

纤维素材料是多孔底物。纤维素酶可及表面面积被认为是控制木质纤维素原料酶水解容易性的最重要的底物特征之一，如纤维素酶可及表面面积与纤维素酶水解产率之间的良好相关性所示[10，15，31]。

可以通过几种不同的方法测量纤维素对酶的物理可及体积、表面面积或可及性。如Wang等人[32]总结，这些方法可以分为两类。一类方法涉及探测已知分子量和大小的分子,以直接测量可及那些探测分子的底物的孔体积或表面面积。另一类方法是通过测量底物上已知尺寸的化合物的吸附来间接测定可及性。

如在此所披露的，两类方法都可以用于测量纤维素对酶的可及性。通过保水值(WRV)测量、Simon染色法、和纤维素酶和牛血清白蛋白(BSA)的吸附来评估未处理和预处理后的混合硬木以及非木质素纤维素对照的孔隙率和纤维素酶可及性。保水值测量了与材料的孔隙特性有关的材料的水结合能力和溶胀能力[33]。进行Simons染色(Simons’stain，SS)来测量预处理后的材料的孔隙率和表面面积。纤维素酶吸附决定了纤维素酶对预处理后的材料的可及性。另一方面，BSA吸附指示了可能引起与纤维素酶非特异性结合的木质素的暴露表面面积。

保水值：保水值(WRV)是底物溶胀的量度，其使用水分子作为探针化合物来间接测定试验材料的孔隙率。在确定木质纤维素的孔特性方面，WRV测量的主要缺点是水分子比纤维素酶小得多，因此不能精确地预测纤维素酶可及孔和表面面积[32]。此外，它不提供有关试验材料的孔径分布的任何信息。因此，应该将WRV用于不同底物溶胀能力的比较和相对量度，而不是作为特定材料的纤维素酶可及孔和表面面积的直接估计。

尽管有这些限制，许多研究已经显示了WRV与纤维素水解的敏感性之间的线性相关性[7，13，34，35]。

测量原混合硬木和预处理后的混合硬木的WRV，并对图2中的纤维素水解产率作图，以了解材料的吸水能力(溶胀能力)是否变化，以及与观察到的纤维素的水解产率如何相关。未加工未处理的混合硬木的WRV是试验材料中预期最低的。

LHW预处理明显引起混合硬木的溶胀。预处理后的洗涤后固体比未处理的木材的WRV高1.3-1.4倍。然而，溶胀能力不与纤维素转化率线性相关。WRV只能随着相应的葡萄糖产率值呈线性增加到某一点(WRV＝1.8)并达到稳定。即使对于具有线性相关的WRV与葡萄糖产率的材料来说，这些材料之间的WRV差异也太低，以致于无法被认为具有统计学意义。结果表明，尽管预处理后的固体对酶水解的敏感性具有显著的变化，预处理并没有引起测量的WRV(溶胀)的显著变化。

Simon染色：我们应用Simon染色作为替代方法，以更好地评估混合硬木在预处理过程中的孔隙率变化。Simon染色被广泛用作评估各种木质纤维素原料的孔隙率的测量。Simon染色方法是基于对纤维素的不同尺寸和亲和力的两种染料的竞争吸附[33]。高分子量橙色染料(OD)比蓝色染料(BD)具有更高的纤维素亲和力，并且可以穿透大孔(5nm至36nm)。蓝色染料的直径为1nm，并且只能进入小孔[33，36]。因此，通过取代对纤维素具有较低亲和力的蓝色染料而使橙色染料填充纤维素材料的大孔，而对于橙色染料不能进入的小孔则优选被蓝色染料分子穿透。通过测量在水溶液中吸附到木质纤维素材料上的这两种染料的量，可以容易地估计底物的大孔和小孔的孔隙率和分布。

总染料吸附量限定了内部和外部的总表面面积(孔隙率)。吸附的总染料指示材料的总孔隙率的变化，而橙色与蓝色染料的比例表示测量的总孔隙率的从大到小的孔的分布。尽管总染料吸附的增加表明基底的孔隙率和表面面积的总体增加，但并不一定表示纤维素酶实际可及孔或表面面积。已经确定，用于有效水解木质纤维素材料的孔的限速尺寸为4至9nm(平均5.1nm)，其是纤维素酶的尺寸[31，37-39]。因此，纤维素酶可以穿透所有能被高分子量橙色染料分子进入的孔(5至36nm)，因为这些孔大于纤维素酶(4至9nm)的尺寸。尽管Simon染色不能提供底物的完整孔径分布，但是它可以粗略测量纤维素酶可及孔和表面面积。Chandra等人[33]开发了一种改良的Simon染色技术，该方法在许多研究中显示出水解程度与表面面积之间的正相关[13，14，40，41]。

图3A和3B显示了通过Simon染色测量的染料吸附与纤维素水解产率之间的相关性。测量吸附的橙色染料和蓝色染料的量以及橙色染料与蓝色染料的比例，并针对水解产率作图。毫不奇怪，对于未处理的混合硬木来说，每单位干质量底物吸附的橙色和蓝色染料的量是最低的(图3A)。因此，对于未处理的材料来说，总染料吸附也是最低的(图3B)。预处理仅在一定程度上增加了吸附的两种染料的量，并且在吸附染料与纤维素水解产率之间没有进一步的线性相关性。混合硬木的孔隙率(总表面面积)从45mg增加到65mg总染料/g干底物，增加高达45％(图3B)。

对于单阶段预处理(对应于严格度因素为4.24下的140℃至180℃的预处理温度)(图3A和3B中的1、2和3)，在预处理后的固体的吸附的染料和酶水解之间发现了正线性关系。然而，对于多阶段预处理(图3A和3B中的4至9)，观察到染料吸附和水解产率之间没有明显的统计学显著相关性。纯纤维素对照、Avicel和Solka Floc吸附的橙色染料的量与预处理后的木条吸附的橙色染料的量处于相似的范围内(36至38mg橙色染料/g干质量)。Avicel和Solka Floc吸附的橙色染料的量没有显著差异，但是水解产率却有显著差异。

总体而言，如图3B所示，将由总染料吸附量表示的总表面面积与纤维素水解程度相关联大多是不成功的。当我们仅考虑吸附的橙色染料的量(这给出了对纤维素酶可及孔和表面面积的估计)时，染料吸附和纤维素水解性之间仍然没有明显的相关性。

Simon染色技术中，吸附的橙色染料与吸附的蓝色染料的比例(即OD:BD)通常被认为是比总染料吸附更好的纤维素的酶可及表面面积的指标[14]。研究表明，对于各种原料，较高的OD:BD比例对应于较高程度的纤维素水解[13，14，40]。然而，意外的是，我们发现OD:BD和纤维素水解产率之间没有明确的相关性。

与其他研究相反，预处理后的固体的OD:BD从2.3降低到1.8，同时它们的产率相应增加(图3B)。

当将OD:BD与纤维素水解程度相关联时，需要考虑每种染料的吸附量。当底物在预处理后表现出降低的OD:BD时，不一定等同于纤维素酶可及孔具有降低的或较低的纤维素对酶的消化率。因此，应结合每种染料的量和总染料吸附两者来解释OB:BD与纤维素水解程度的相关联。可以对底物进行预处理，这导致材料具有较低的OD:BD，同时显示增加的纤维素酶可及孔(增加的橙色染料吸附量)和增加的对纤维素酶的敏感性。这样的实例可发现于当比较未处理的木条和预处理后的固体#5(图3A)时。样品5吸附的橙色染料的量为42mg/g，比未处理的底物高31％。这意味着通过预处理产生了更多的纤维素酶可穿透表面面积。然而，预处理也增加了纤维素酶不能进入的小孔，由吸附的蓝色染料的量所指示。预处理引起的小孔的增加(增加71％，从14mg到24mg/干质量)多于由橙色染料测量的大孔的增加(增加31％，从42mg到42mg/干质量)。结果，预处理后的固体样品5的OD:BD(42mg/24mg＝1.75)比未处理的固体样品5的OD:BD(32mg/14mg＝2.3)更低，而预处理后的固体样品5的水解容易性比未处理的提高了约10倍(葡萄糖产率从7％提高至61％)。

纤维素酶和BSA吸附：另一种进入纤维素酶可及表面面积的方法是通过用已知量的纤维素酶蛋白温育底物来确定底物的纤维素酶吸附能力。其他作者已经显示木质纤维素底物的酶消化率与纤维素酶吸附能力之间具有良好的相关性[10，11，32]。

通过在图4A中将吸附的纤维素酶与纤维素水解产率相关联来确定纤维素酶可及孔(或表面面积)和纤维素酶对纤维素消化率之间的相关性。将混合硬木和非木质素纤维素样品在25℃下与过量的Spezyme CP(150mg蛋白/g葡聚糖)一起温育1小时，并测量上清液中的蛋白以计算吸附的纤维素酶的量。

未处理的混合硬木吸附纤维素酶的量是样品中最低的，为13mg蛋白/g干质量。预处理将纤维素酶吸附量增加了2.2倍(28mg蛋白/g干质量)。再次，对于预处理样品#1至3，发现纤维素酶吸附和纤维素消化率之间呈正线性关系。对于其他预处理后的样品，纤维素酶吸附和水解产率之间没有相关性。对于这些预处理后的样品和Avicel，Spezyme CP吸附量达到26至28mg每单位干生物量的最大值。Solka Floc产生的纤维素酶吸附量(19mg)低于Avicel。Solka Floc具有20％的半纤维素，而Avicel具有0％的半纤维素。尽管Solka Floc的平均粒度(22微米)小于Avicel(50微米)[64]，但Solka Floc具有的较高半纤维素，可能导致较低的吸附。

除木质素纤维素对照(Avicel，Solka Floc)以外的所有样品都含有纤维素酶并且可以与木质素非生产性地结合。通过将样品与非特异性结合蛋白(pH 4.8的牛血清白蛋白(BSA))温育来估计针对木质素与纤维素酶的非生产性结合的表面面积。已知BSA阻止纤维素的非生产性结合并改善纤维素的酶水解[42]。图4B中，BSA吸附对纤维素消化率进行作图。如图4B中的Avicel和Solka Floc所示，BSA不结合纤维素。未处理的原混合硬木表现出非常低的BSA结合能力(2mg/g)。相比之下，预处理使BSA结合量增加到高达15mg/g，比未处理的混合硬木高出近7倍。与纤维素酶吸附相似，仅在样品1至4中发现BSA与纤维素水解性之间呈正线性相关性，其他预处理后的固体的BSA吸附量恒定在13至14mg/g而纤维素水解性显著变化。

与Simon染色结果一致，纤维素酶和BSA吸附均呈现与酶纤维素水解的容易性具有有限的正相关关系。对于预处理后的固体(没有可测量的半纤维素含量)(样品4至9)，纤维素酶可及表面面积似乎处于接近的范围。然而，这些预处理后的固体的酶敏感性的程度广泛变化。

WRV、Simon染色和蛋白吸附的结果表明，通过这些技术测量的液体热水预处理诱导了总纤维素酶和纤维素酶可及面积增加，这对应于增强的纤维素对纤维素酶消化率。我们还发现，单独的液体热水预处理的严格度与酶可及孔隙或表面面积无关。对于单阶段预处理样品(1至4)清楚地显示，所有样品都以相同的预处理严格度(Log R₀＝4.24)制备。在相同的严格度下，较高温度的预处理比较低温度的预处理产生更多的纤维素酶可及孔和表面面积，导致更大程度的纤维素酶水解纤维素。当预处理足够严格到能增溶所有半纤维素时，所得预处理后的底物由酶高度消化，导致大于60％的葡萄糖产率(20FPU/g纤维素(32mg/g))，孔隙度和纤维素酶可及面积没有明显变化，但纤维素水解产率仍有显著差异，在60％到90％的范围之间。我们的研究结果表明，酶可及表面面积或孔隙率仅对于预处理后的样品(仍然保留半纤维素并且表现出较低的酶消化率)是主要产率决定因素。我们发现，孔隙率并不是限制纤维素消化率的唯一因素。当液体热水预处理条件足够严格以增溶大部分半纤维素时，其他底物特征成为产率决定因素，并且所得预处理后的固体显示相对高的酶消化率(使用20FPU/g葡聚糖纤维素酶，测得的产率>60％)。

同样，Ishizawa等人[43]也发现，在不同预处理严格度下产生的稀酸预处理后的玉米秸秆中，纤维素的底物孔隙率和纤维素消化率之间没有显著的相关性。他们应用溶质排除方法(使用纤维素酶尺寸的分子(5nm)和¹H NMR热气孔测量法(thermoporometry))来测定酸预处理后的玉米秸秆的纤维素酶可及孔隙率和表面面积。与我们的数据一致，他们发现酶可穿透孔体积的最大差异发生于未处理和预处理后的玉米秸秆之间。一旦预处理后的玉米秸秆固体变为高度可消化(在同时进行糖化和发酵7天后，用Spezyme CP(20mg蛋白/g纤维素酶)测定的产率为>72％)，他们未能在预处理后的样品中发现酶可及孔体积的显著差异。

LHW预处理后的混合硬木的粒度(外表面面积)变化：

许多研究已经调查了木质纤维素的粒度对纤维素水解的影响，并指示没有进行其他预处理的粒度是纤维素对酶水解敏感性的弱预测[8，44，45]。这表明通过机械预处理减少木质纤维素的粒度不足以诱导有效的纤维素水解[45]。研究主要集中在将底物的粒度与纤维素水解效率相关联。没有文献清楚地显示在不同条件下的水热预处理过程中粒度如何变化及其对预处理后的纤维素的酶敏感性的影响。

较小的平均粒度导致增加的外表面面积，并且酶可以容易地作用于该外表面面积。因此，可以预期在预处理后的纤维素的粒度和酶水解之间可能存在相关性。几项研究发现，粒度和纤维素水解速率之间存在相关性，而其他研究发现它们之间并没有明确的关系。例如，Arantes和Saddler等人[14]报道，通过蒸汽爆炸或乙醇有机溶剂来进行预处理后的木质纤维素材料(玉米秸秆、花旗松、美国黑松、小黑杨)的外表面没有影响酶对预处理后的材料的有效酶消化率的最低要求，而通过Simon染色技术测量的总表面面积显示出明显的正相关性。他们得出结论，基于他们的结果，纤维素纤维的水解通过纤维素酶穿透纤维素材料的大内孔而不是通过酶对纤维素表面的侵蚀或剃刮作用而引起崩解和碎裂。Wang等人[32]还表明外表面对纤维素水解的贡献远小于内表面面积。另一方面，其他研究提供了支持外表面面积对纤维素消化的重要性的证据[18，31]。Laivins和Scallan[46]已经表明，细小纤维比其他纤维部分具有更大的孔体积，其中细小纤维含量与机械纸浆的孔体积之间呈线性相关。

通过染色技术和蛋白吸附测量的孔隙率和纤维素可及表面面积可以表示外部和内部总酶可及面积的组合。另一方面，粒度是外表面面积的指标，并它不一定与总的酶可及表面面积相关。两个具有不同直径和不同外表面面积的颗粒可以显示相同的由总纤维素可及表面面积(由前面讨论的染料或蛋白吸附测定)。不知道预处理后的纤维素的外表面面积如何影响酶消化率使得难以测定内部(孔)与外部表面面积对纤维素水解效率的相对重要性。

测量预处理后的木条和原混合硬木的平均粒度，并于图5中针对水解产率进行作图。在使样品在水中保持湿润以防止材料干燥和收缩的同时进行使用金属丝网筛测量粒度。未处理的混合硬木条的平均粒度为4.2mm。预处理将平均粒度降低30％至70％(取决于预处理严格度)。如图5所示，单阶段预处理后的固体中，样品1至4中平均粒度的差异可以忽略(2.9mm至3.1mm)。与未处理和单阶段预处理后的木材相比，多阶段预预处理后的固体的尺寸大大降低(>50％)。与孔隙率测量(没有显示与纤维素酶消化率有任何关系)不同，在预处理后的固体(没有可测量的木聚糖)(样品4至9)的粒度(外表面面积)和纤维素水解的葡萄糖产率效应之间发现线性负相关。预处理后的固体的较小粒度(对应于较大的外表面面积)导致增强的纤维素水解产率。与预处理后的固体9相比，未处理固体的细小纤维(直径小于0.3mm)量的总质量从4.6％增加到14％。未处理的混合硬木中超过50％的直径大于6毫米，而预处理后的固体9中只有4％的直径大于6毫米。

结果表明，液体热水预处理使木质纤维素分解，降低其平均粒度。在单阶段预处理中，将温度升高到高达200℃，没有引起样品中平均粒度(外表面面积)出现显著差异。然而，在这些样品(1至4)中，通过染色和蛋白吸附测量的孔隙率和纤维素酶可及表面面积显著增加，具有较高预处理严格度比较低严格度导致更多的酶可及表面面积。

这表明，对于单阶段预处理后的固体(样品1至4)，酶可穿透的孔隙率和内表面面积在控制纤维素水解中起主要作用(如图3A、3B、4A和4B所示)。外部表面面积对这些经过单阶段预处理后的样品的纤维素水解效率的贡献有限。

一旦所有的初始半纤维素在第一次预处理期间被增溶，则随后在高于210℃的高温下进行的预处理显著地降低了木质纤维素的粒度。如图3A、3B、4A和4B所示，来自多阶段预处理的预处理后的固体(样品4至9)表现出类似的总的酶可及表面面积(基于孔体积)，而这些底物的外表面面积差别很大。多阶段预处理的更高的组合严格度在预处理后的纤维素中产生较小的平均粒度和较大的外表面面积。多阶段预处理后的纤维素的外表面面积与纤维素水解的容易性有直接关系。

这些结果表明，当预处理严格到足以增溶所有半纤维素时，由酶易于进入的外部表面面积成为纤维素水解的产率控制因素。

高温(220℃)稀酸预处理产生的颗粒非常小，因此相对于180℃至200℃下的预处理，具有更多的外表面面积。混合硬木的高温稀酸预处理的较大外表面积对应于较高的水解产率。与我们的结果一致，这表明在高于200℃的高温下的严格预处理产生较小的颗粒，这些颗粒的外部表面面积较大，并且可能比作为在较低温度下表面面积增加的主要因素的酶可及孔的内表面面积更容易受到攻击。

Burns等人[31]也证明，在酶水解初始阶段，稀酸预处理后的混合硬木的酶大小的孔迅速消失，水解后期的酶可及表面主要来自纤维素纤维的外表面。因此，不仅在水解的初始阶段，而且随着水解的进行，较小的颗粒对水解的阻力较少，导致比具有相似总酶可及表面面积的较大颗粒更高的纤维素转化率。此外，由于更多的顽固性纤维素部分和木质素阻塞的累积，随着水解反应的进行，较大粒度的木质纤维素材料可能比较小的颗粒的木质纤维素材料的水解速率有更大的降低。在纤维素的酶水解过程中，首先对容易进入的纤维素进行水解，同时保留更多抗性纤维素累积量[47，48]。Mooney等人[49]还表明，随着纤维素进行水解而观察到的显著降低的水解产率可能是由木质素限制酶对剩余纤维素的可及性引起的。

我们的研究结果表明，经过严格预处理后的木材的酶可及孔的内表面面积对于纤维素水解速率来说没有经过较不严格预处理后的木材的酶可及孔的内表面面积那样至关重要。对于硬木，在200℃以上的严格预处理，粒度的减小和外表面面积的增加决定了纤维素酶水解的程度。预期更大的外表面面积会导致更高程度的纤维素水解，因为酶不需要扩散到孔中，而对于较不严格的低温预处理后的纤维素来说，酶渗透内孔是必要步骤。

LHW预处理后的混合硬木中的纤维素DP变化：

聚合度(DP)对纤维素分解水解的作用有些不清楚和矛盾。一些研究报道，低DP纤维素的水解速度比高DP纤维素低，其他研究发现DP和纤维素酶水解程度之间没有明确的关系[16,50-52]。Del Rio等人[52]和Puri[16]得出结论，DP在控制纤维素的酶水解中起重要作用，表明各种预处理后的纤维素的DP与纤维素转化率呈负相关。混合硬木在180℃至220℃下的稀硫酸预处理已显示减少纤维素DP[53]。纤维素DP的减少导致纤维素的纤维素水解增加，因为用于结合的纤维二糖水解酶的纤维素链末端的可用性增加以及纤维素链之间的聚合氢键形成的弱化，从而允许纤维素酶更容易进入[54,55]。

相对于未处理的混合硬木纤维素，预处理后的固体中的纤维素的DP值由粘度法测定。对图6中的纤维素转化率进行总结和作图。未处理的混合硬木细木条的粘度平均DP为2930，与报道的各种木材(3000至5000)的粘度DP值相对较接近[54]。液体热水预处理显著降低了纤维素的DP。在180℃下制备1.3小时的预处理后的固体样品3(Log R₀＝4.24)的DP比未处理的硬木的DP低50％。在固定的严格度因素下，当预处理温度升高(样品#2至4)，DP具有明显的线性下降。多阶段预处理导致DP更进一步的降低，并且测量的DP的减小开始趋平于小于0.2(<600至1000)的相对DP。样品9具有最低的DP，这相当于未处理的纤维素DP的16％，并且显示出最高的纤维素产率。Avicel和Solka Floc的平均DP分别为306和1535。报道的Avicel PH101的DP值为230[68]。尽管DP相对较高，Solka Floc比Avicel更易消化。对于纯纤维素(Avicel，Solka Floc)，纤维素DP是高度可变的，并且与纤维素转化率没有很好的相关性，这表明其他因素如结晶度可能在纤维素消化率上起主要作用。Fan等人[65]发现，对于Solka Floc和微晶纤维素，水解速率主要取决于纤维素结晶度而不是表面面积。

纤维素DP是在此检查的唯一底物特征，对于各种变化的预处理条件下的预处理后的样品，纤维素DP与纤维素对纤维素酶的敏感性有明显的相关性。我们从结果可以得出结论，液体热水预处理基本上减少了纤维素DP，并且DP的减少随着预处理温度和严格度而增加，直到达到稳定DP(约500)。相比之下，例如亚硫酸盐木浆的稳定DP在200至400之间[56]。除了如在此讨论的酶可及外部和内部表面面积和孔隙率，纤维素DP似乎是液体热水预处理木材的纤维素转化的主要决定因素之一。

通过BSA阻止木质素对低剂量纤维素水解的影响：

尽管过去十年纤维素酶的有效性和成本有显著的进步，但纤维素酶成本仍然是酶促木质纤维素转化的主要成本因素。有成本效率的纤维素转化无法在酶剂量没有显著降低的情况下实现。在大多数研究中通常使用的酶剂量在5至30FPU/g葡聚糖的范围内，这相当于8至45mg蛋白/g葡聚糖(假定市售纤维素酶为1.5mg蛋白/FPU)。玉米乙醇方法给出品质因数，其中酶剂量为干玉米重量的0.1％至0.2％，对应于1至2mg蛋白质/克干玉米的载量[57]。对于成本效益好的纤维素乙醇方法来说，纤维素酶(蛋白)剂量必须相似。然而，随着纤维素酶载量接近这个低水平，酚类抑制剂与酶蛋白的比例增加，并且可能通过酚类和酶蛋白之间的非生产性结合引起纤维素水解的显著降低[58]。这种酚类纤维素酶抑制剂包括在预处理期间释放的可溶性酚类化合物[58-61]以及保留在预处理后的固体中的木质素[62,63]。通过与酚类化合物形成非生产性结合，β-葡糖苷酶似乎对酚类诱导的抑制特别敏感[58-60]。此外，已知木质素吸附纤维素酶，我们的工作显示在pH为5下，结合可能是非特异性的，其略高于纤维二糖水解酶I的等电pH(pI＝3.6至3.9)(里氏木霉(Trichodermareesei)中最丰富的纤维素酶)[66]。作为减轻酚诱导抑制的一种手段，许多研究使用外源蛋白来阻止木质素与纤维素酶的结合。这些蛋白包括白蛋白、BSA或蛋白胨[42,63]。例如，Pan等人[63]报道，当用牛血清白蛋白(BSA)或蛋白胨处理预处理后的固体时，蒸汽爆炸软木的纤维素转化率比对照过程提高了两倍。

如在此所披露的，使用3mg纤维素酶蛋白(相当于2FPU Spezyme CP)/g葡聚糖(有或没有BSA处理(150mg BSA/g葡聚糖))对预处理后的混合硬木固体的低纤维素酶剂量纤维素进行水解，以评估木质素抑制对低酶剂量水解的影响。图7A中，使用或不使用BSA处理的低剂量纤维素酶水解的葡萄糖产率对高纤维素酶载量水解过程的产率进行作图。如预期的那样，BSA处理不影响非木质素纤维素Avicel和Solka Floc的水解性，因为它们不含有木质素来吸附BSA或纤维素酶蛋白(参见图4B)。

对于最严格的预处理后的混合硬木(样品9)，当达到>90％葡萄糖产率同时具有20FPU(＝32mg蛋白)/g葡聚糖的高纤维素酶载量，当用1/10纤维素酶剂量(3mg蛋白质/g葡聚糖)水解时，产率仅为13％。值得注意的是，在低酶剂量下，葡萄糖产率在预处理后的固体中没有多少变化(8％至13％的产率)，而当使用高剂量的纤维素酶时，水解相同的材料，产率的变化性(20％至90％)很大。这意味着木质素和纤维素酶之间的非生产性结合的抑制作用随着纤维素酶载量的下降而增加，纤维素酶的可用纤维素酶量减少。因此，即使对于纤维素转化显示出有利的底物特征(例如可忽略的木聚糖含量、低纤维素DP、高外部和内部纤维素可及表面面积)的严格预处理后的材料，这也导致低葡萄糖产率(<15％)。结果表明，具有低载酶量的有效纤维素水解将受到保留在预处理后的固体中的纤维素酶和木质素之间的非有利相互作用的限制，即使预处理后的纤维素对纤维素酶可及性显示有利的物理化学特性。当以高剂量使用纤维素酶时，木质素对纤维素水解的抑制作用不是很明显，因为存在足够多的纤维素酶蛋白以克服木质素的抑制作用。

当用BSA处理预处理后的材料以阻止木质素与纤维素酶蛋白结合时，预处理后的材料的纤维素转化率增加高达70％。此外，低纤维素酶剂量水解过程的产率效应与高酶剂量实验的产率效应呈线性关系。即使当通过BSA处理阻止木质素与纤维素酶结合时，表现出较低葡萄糖产率的预处理后的固体(具有较低的酶剂量)也产生了低的产率(以低酶剂量的1/10)。另一方面，当用BSA预培养时，高度可消化的预处理后的固体(具有20FPU/g葡聚糖的纤维素酶)导致产率以酶剂量的1/10显著提高。一旦通过用BSA对预处理后的固体进行预培养以消除了木质素的抑制作用，具有低酶剂量的预处理后的木材的纤维素转化率根据预处理后的固体的结构特征作出反应：纤维素DP，外表面面积，孔隙率和半纤维素含量。上述结果表明，使木质素和酚类化合物的抑制最小化对于使用纤维素酶来实现成本效益好的木质纤维素水解来说是关键要求。

如图7A所示，当用BSA(150mg BSA/g葡聚糖)阻止木质素时，严格预处理后的样品9显示出高产率(约70％)(具有低纤维素剂量(2FPU/g葡聚糖)。如前述部分讨论，如果通过BSA处理消除了非特异性木质素-纤维素酶结合，则预处理后的底物对于纤维素的高酶可及性表现出良好的底物特性。选择样品9以进一步确定BSA和纤维素酶必需的总蛋白载量的最低要求，以获得高产率(>90％)。对于蛋白总量和纤维素酶与木质素阻止非纤维素分解蛋白(如BSA)的比例的估计至关重要，因为这些最终决定了木质纤维素转化过程中蛋白的成本和这些过程的经济可行性。纤维素酶与总蛋白的比例(BSA和纤维素结合)在4种不同的总蛋白水平(10至100mg总蛋白/g葡聚糖)下变化。在每个总蛋白水平，纤维素酶(Spezyme CP)的量被改变以提供纤维素酶与总蛋白的不同比例(纤维素酶/纤维素酶+BSA)。水解产率对纤维素酶与总蛋白的比例作图，如图7B所示。

当只有BSA时，产率只有2％。当只添加纤维素酶不加BSA时(纤维素酶总蛋白比例为1)，产率在13％至97％之间变化，3mg蛋白/g葡聚糖产生最低产率(13％)且100mg蛋白/g葡聚糖导致近100％葡萄糖产率。当纤维素酶载量大于25mg蛋白/g葡聚糖时，即使没有任何BSA处理(参见图7B，比例＝1)，产率接近90％，表明在25mg纤维素酶蛋白/g葡聚糖上，可有效水解的可用纤维素酶蛋白足以通过纤维素酶和木质素之间的非特异性结合来克服纤维素酶蛋白的损失。

对于100mg纤维素酶蛋白/g葡聚糖，用相同量的BSA(纤维素酶载量＝15mg/g葡聚糖，相当于纤维素酶与总蛋白比例＝0.15)代替85mg纤维素酶蛋白与用100mg纤维素酶蛋白/克葡聚糖水解产生相同的产率(97％)。对于3mg纤维素酶蛋白和97mg BSA(纤维素酶与总蛋白比例为0.03)时，产率接近80％。类似地，在总蛋白载量为50mg时，6mg纤维素酶和44mg BSA/g葡聚糖(纤维素酶与总蛋白比例为0.12)导致葡萄糖产率为81％。考虑到当不添加BSA时，需要至少25mg纤维素酶蛋白/g葡聚糖以产生相似程度的纤维素转化，这些表明如果BSA有效阻止了木质素，纤维素酶载量可以大大降低(从25至3mg蛋白/g葡聚糖)。对于100、50和25mg总蛋白/g葡聚糖载量，对应于80％葡萄糖产率的纤维素酶与总蛋白的比例分别为0.03、0.12和0.8。结果表明，需要至少大于50mg BSA/g葡聚糖以大量阻止木质素，以确保低纤维素酶载量(<6mg纤维素酶/g葡聚糖)时的高纤维素转化率(>80％)。

本领域技术人员将认识到，可以对在此描述的具体实现方式进行许多修改。这些实现方式不应该限于所描述的具体限制。其他实现方式也是可能的。此外，在此引用的所有参考文献都表明本领域的技术水平，将其全部通过引用以其全文结合在此。

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Claims

1.一种用于改善木质纤维素的酶消化率的方法，所述方法包括：

用至少一次两步水热预处理来对包含纤维素、半纤维素和木质素的木质纤维素原料进行预处理，以产生预处理后的木质纤维素原料，其中第一水热预处理在高于140℃的温度进行，且第二水热预处理在高于180℃的温度进行，其中所述第一水热预处理和所述第二水热预处理各自选自液体热水处理、蒸汽爆炸处理和稀酸处理及其组合；

将在所述预处理后的木质纤维素原料中的至少50%的半纤维素增溶为低聚木糖的低聚糖；

分离和洗涤所述预处理后的木质纤维素原料的固体，从而消除在预处理期间释放的可溶性低聚木糖的低聚糖和酚类化合物的抑制，其中所述洗涤步骤在至少两个阶段进行，其中第一洗涤阶段包括用具有在50℃和100℃之间的温度的水来洗涤，且第二洗涤阶段包括用具有在15℃和50℃之间的温度的水来洗涤；

向所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料中添加木质素阻止非纤维素分解蛋白，以阻止保留于所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料中的木质素与纤维素酶进行结合，其中所述木质素阻止非纤维素分解蛋白是牛血清白蛋白BSA且以44~97mg BSA/g葡聚糖的量被添加至所述洗涤后的木质纤维素原料，纤维素酶以3-6mg纤维素酶/g葡聚糖的量被添加到所述洗涤后的木质纤维素原料中，其中纤维素酶的量随BSA的量的升高而减少，并且当纤维素酶载量小于6mg纤维素酶/g葡聚糖时，需要至少大于50mg BSA/g葡聚糖以大量阻止木质素。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述木质纤维素原料包括玉米成分。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述洗涤步骤进一步包括使用0.5至15倍生物质重量的水。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述水是循环水。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一洗涤阶段和所述第二洗涤阶段进一步包括使用蒸馏塔残渣。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述第二洗涤阶段在室温进行。

7.如权利要求1所述的方法，其中来自所述第二洗涤阶段的所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料与来自所述第一洗涤阶段的洗涤水逆流接触。

8.如权利要求1所述的方法，其中以至少50mg BSA/g葡聚糖的量向所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料添加所述木质素阻止非纤维素分解蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述增溶是通过在使热水维持液体状态的压力下用液体热水的预处理来完成。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述木质纤维素原料具有如下组成：30%~60%纤维素、20%至40%半纤维素和15%至30%木质素，余量为提取物和灰分，总计为100%。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述预处理后的木质纤维素原料的固体的所述分离和洗涤包括用1至20体积水/体积木质纤维素来分离和洗涤。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述预处理步骤包括至少三步水热预处理，其中第一水热预处理在高于140℃的温度进行，并且第二预水热处理步骤和第三水热预处理在高于180℃的温度进行。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述木质纤维素原料选自下组，所述组由以下各项组成：硬木、玉米秸秆、麦秆、柳枝稷、甘蔗渣、高粱残留物、玉米果皮、大豆残留物、干草和软木、及其组合。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述木质纤维素原料包括玉米秸秆和玉米果皮中的至少一种。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述第一水热预处理和所述第二水热预处理是液体热水处理。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述第一洗涤阶段发生在所述第一水热预处理之后且在所述第二水热预处理之前，且所述第二洗涤阶段发生在所述第二水热预处理之后。

17.一种用于改善木质纤维素的酶消化率的方法，所述方法包括：

以至少一次两步水热预处理来预处理包含纤维素、半纤维素和木质素的木质纤维素原料，以产生预处理后的木质纤维素原料，其中第一水热预处理在高于140℃的温度进行，并且第二水热预处理在高于180℃的温度进行，其中所述第一水热预处理和所述第二水热预处理各自选自液体热水处理、蒸汽爆炸处理和稀酸处理及其组合；

分离和洗涤所述预处理后的木质纤维素原料的固体，从而消除在预处理期间释放的可溶性低聚木糖的低聚糖和酚类化合物的抑制；

形成洗涤后的预处理后的木质纤维素原料的浆料；

向所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料的浆料中添加木质素阻止非纤维素分解蛋白，以阻止保留于所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料中的木质素与纤维素酶进行结合，其中所述木质素阻止非纤维素分解蛋白是牛血清白蛋白BSA且以44~97mg BSA/g葡聚糖的量被添加至所述洗涤后的木质纤维素原料，纤维素酶以3-6mg纤维素酶/g葡聚糖的量被添加到所述洗涤后的木质纤维素原料中，其中纤维素酶的量随BSA的量的升高而减少，并且当纤维素酶载量小于6mg纤维素酶/g葡聚糖时，需要至少大于50mg BSA/g葡聚糖以大量阻止木质素。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述木质纤维素原料包含玉米成分。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤还包括使用0.5至15倍所述预处理后的木质纤维素原料的固体重量的水。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述水是循环水。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述洗涤步骤还包括使用蒸馏塔残渣。

22.如权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤在室温进行。

23.如权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤在高达140℃的温度进行，其中所述洗涤步骤包括压力冲洗。

24.如权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤在高达100℃的温度进行。

25.如权利要求17所述的方法，其中所述洗涤步骤在多个阶段中进行，其中来自第二洗涤阶段的洗涤后的预处理后的木质纤维素原料与来自第一洗涤阶段的洗涤水逆流接触。

26.如权利要求17所述的方法，其中所述预处理步骤包括至少三步水热预处理，其中第一水热预处理在高于140℃的温度进行，且第二水热预处理和第三水热预处理在高于180℃的温度进行。

27.如权利要求17所述的方法，其中所述木质纤维素原料选自下组，所述组由以下各项组成：硬木、玉米秸秆、麦秆、柳枝稷、甘蔗渣、高粱残留物、玉米果皮、大豆残留物、干草和软木、及其组合。

28.如权利要求17所述的方法，其中所述木质纤维素原料包括玉米秸秆和玉米果皮中的至少一种。

29.如权利要求17所述的方法，其中以至少50mg BSA/g葡聚糖的量向所述洗涤后的预处理后的木质纤维素原料添加所述木质素阻止非纤维素分解蛋白。

30.如权利要求17所述的方法，其中在添加步骤期间，将所述浆料的pH维持在4.8至5.0的范围内。

31.如权利要求17所述的方法，其中所述增溶是通过在使热水维持液体状态的压力下用液体热水的预处理来完成。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述木质纤维素原料具有如下组成：30%~60%纤维素、20%至40%半纤维素和15%至30%木质素，余量为提取物和灰分，总计为100%。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述预处理后的木质纤维素原料的固体的所述分离和洗涤包括用1至20体积水/体积木质纤维素来分离和洗涤。

34.如权利要求17所述的方法，其中所述第一水热预处理和所述第二水热预处理是液体热水处理。