CN1072261C - 以适合用作碘化物氧化酶的含铜氧化酶生产碘的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种碘化物氧化的方法，该方法包括在一种水溶液中，在足以使离子型碘化物在酶作用下转化成磺的一段时间和条件下将一种含铜氧化酶和一种离子型碘化物(I-)源相接触。含铜酶可以是，例如，一种漆酶或一种胆红素氧化酶。

Description

以适合用作碘化物氧化酶的含铜氧化酶生产碘的方法
发明领域
本发明涉及一种碘化物氧化的方法。更确切地说，本发明涉及含铜氧化酶、特别是漆酶，在碘化物的氧化中的应用。
发明背景
许多年以来碘(I2)就已被用作许多场合下的消毒剂。皮肤清洁剂、伤口消毒、接触透镜的清洗和饮水卫生只是使用碘的几个用途。此外，碘也适用于催化剂中，用作一种动物饲料添加剂。适用于药物中和作为聚合物前体添加剂。尽管碘基消毒体系是极其有效的，一些因素限制了碘直接应用的范围。尤其是，碘的生产、储存、运输和处理是极其危险的，这里由于生产中所涉及的化学品以及即使是在中等浓度时碘自身的毒性所造成的。通常，碘是从天然来源，如盐水，通过使用强无机酸，氯气和其它危险药品的方法制得的。已经开发了作为I2载体的碘递体来替代普通的I2溶液用于工业和家庭消毒。此外，能够从一种I-盐和一种化学氧化剂中产生I2的二元体系也是可得到的。这两种体系需要对大量潜在毒性副产物的处理。对工业规模大量生产I2和将I2用作消毒剂来说，在过氧化物酶基产生I2中已发现了另一种可供选择的方法(美国专利第4,282,324；4,617,190；4,588,586；4,937,072；5,055,287；5,227,161；5,169,455；4,996,146；4,576,817号)。这类方法包括使用过氧化物酶，氧化剂H2O2，和一种离子型碘化物源。令人遗憾的是，这种方法具有需要危险的和挥发性的过氧化物或过酸的缺点，该物质不得不经过运输或者通过额外的酶催化或化学步骤就地生成，因此使得该体系更复杂和/或更昂贵。
因此仍然需要一种碘的生产方法，这种方法避免了必须在工厂或就地处理有害药品而又能有效地产生足够量的所需产品。现在本发明提供了达到这一点的手段。
发明概述
本发明涉及一种生产碘的方法，该方法包括在一种水溶液中，在足以使离子型碘化物在酶作用下转化成碘的一段时间和条件下将一种含铜氧化酶和一种离子型碘化物(I-)源相接触。在一个优选的实施方案中，酶可以是漆酶或胆红素氧化酶。在另一优选的实施方案中，该方法也可以在有一种对含铜酶具有高亲合性的底物存在下来实施。底物在反应中担当介体，即，穿梭电子，由此增加发生I-氧化反应的速度。在使用漆酶或胆红素氧化酶时，在氧化过程中底物ABTS是特别适用的介体。
附图的简要说明
图1说明了重组体嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(r-MtL)催化的I-氧化反应的双重倒数图。(A)在不同pH下使用14μMr-MtL起始速率和I-浓度的关系。(B)Km和Vmax(从图1A中求出的)对pH的依赖性。
图2说明了ABTS辅助的，rMtL-催化的I-氧化反应。(A)起始I-氧化反应速率对ABTS和r-MtL(nM)浓度的依赖，(B)用2.4nMr-MtL和10μmABTS时起始I-氧化反应速率的pH分布型。
发明详述
已经有许多文件证明，一些卤化物分子能够抑制漆酶。具体地说，已经叙述了氟化物(F-)对树木和真菌漆酶的抑制作用(koudelka和Ettinger，生物化学学报(J.Biol.Chem.)263:3698-3705,1988)，以及溴化物(Br-)和氯化物(Cl-)对真菌漆酶的抑制作用(Naki和Varfolomeev,Biokhimya 46:1694-1702.1981)。可以假定这些卤化物与漆酶Ⅱ型铜位点相互作用导致从Ⅰ型位点到二氧位点电子转移的中断。以前没有任何关于漆酶与碘化物(I-)相互作用的报道。由于卤化物抑制作用能力是与离子半径尺寸成反比关系，可以预期，具有最大离子半径的碘I-会具有很弱的漆酶抑制作用。然而，非常惊人地发现，事实上通过放弃一个电子给Ⅰ型铜I-起到一种底物的作用。
观察到的I-能起到一种漆酶底物的作用导致开发一种方法，用这种方法通过使用漆酶或其它含铜氧化酶I-被氧化成元素碘。在水溶液中，提供了一种离子型碘化物源，漆酶缓慢地将I-转化成I2。转化不需要任何危险的或挥发性化学药品如氯气。离子型碘化物源可以是现在已知的任何源，如二元碘消毒剂中的碱金属盐，粗的或开始富含碘的盐水溶液，盐卤，离子型碘化物溶液，其中生硝中的碘酸盐被还原为碘化物，或海草。在对于所用的酶氯化物是抑制性的情况下，在起始物料中剩余的氯化物首先要被减少至低于抑制常数。在毁丝霉属漆酶情况下，抑制常数大约是70mM。
在本发明的方法中所用的酶可以是各种含铜氧化酶中的任一种。如下列实施例所示，尽管在I-氧化反应中漆酶是最具活性的，还有其它相似的酶也能提供性质相似的活性(尽管在许多情况下是以比漆酶低很多的程度)。尤其是胆红素氧化酶表现出与漆酶活性基本相当的活性。然而，试验的其它含铜酶，如酪氨酸酶和血浆铜蓝蛋白，也表现出一定程度的活性，这表明不限于使用漆酶。
含铜氧化酶可以从大量的植物、真菌、细菌和动物源来获得，许多是商业上可得到的。除了上述所列的酶以外，还包括多酚氧化酶、亚铁氧化酶Ⅱ、吩噁嗪酮合酶、甘油氧化酶和细胞色素氧化酶。优选的氧化酶，即漆酶、是可以从许多菌种中得到的，尤其是真菌种，例如，曲霉属、脉孢菌属、柄孢壳菌属、葡萄孢属、金钱属、层孔菌属、香菇属、侧耳属、栓菌属、丝核菌属(美国序号08/172,331在此合并作为参考)、鬼伞属、小脆柄菇属、毁丝霉属(美国序号08/253,781，在此合并作为参考)。小柱孢菌属(美国序号08/253,784，在此合并作为参考)、松蕈属(美国序号08/265,534，在此合并作为参考)、射脉菌属(WO 92/01046)、和草盖菌属(JP2-238885)。此外，胆红素氧化酶可以很容易地从疣孢漆斑菌和Trachyderma tsunodae中得到。
反应是在水溶液中进行的。酶可以是游离的，纯的或粗的形式，或是用在领域中已知的任何方法固定化在一种有机或无机载体上的，这些载体如，聚丙烯酰胺、纤维素、玻璃珠、琼脂糖、葡聚糖，甲基丙烯酸基聚合物或乙烯马来酸共聚物。与固定化酶的反应可以在罐中或柱中进行。反应也可以用能产生酶的微生物细胞来进行。
水溶液被缓冲至能提供所使用的酶最佳活性的pH，因此，溶液优选的pH将随所使用的酶而改变。通过使用适当的缓冲剂将pH保持在优选的范围中。这些缓冲剂包括磷酸钠或钾，葡萄糖酸盐，柠檬酸盐，甲酸盐或乙酸盐缓冲剂。所使用的酶的量也将随所用酶的个性而变化，但通常是在nM至μM范围。在反应混合物中所用的I-量优选地应在或高于mM水平。反应可以在大约15-50℃的温度范围内实施，但优选地是在大约20-30℃的温度下来实施。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，如上所述的反应是在有能加速I-向I2转化的一种介体存在下来实施的。虽然如漆酶的含铜酶确定可氧化I-，但由于较低的亲合性周转通常是很慢的。因此，对酶具有较高的亲合性和通过在酶和I-间穿梭电子起到一种中间体作用的化合物能够改善反应效率。例如，如下面的实施例所示，化合物2,2’-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，是已知的，优良的漆酶和胆红素氧化酶的底物，它能极大地增加I-氧化反应的效率。尽管ABTS可能不适用于增强与其它含铜酶，如酪氨酸酶和血浆铜蓝蛋白，的反应速率，因为它不是这些酶的优良的底物，但是使用这些酶时可以使用更适宜的底物作为可替换的介体。在选择任何给定的酶的可替换介体中，重要的因素是介体是这种酶的一种良好底物。并且这种介体具有与I-相似或更高的氧化还原电位。适用于使用除漆酶和胆红素氧化酶以外的酶的反应的其它介体的实例是酚醛塑料、杂环化合物，氢醌化合物、和游离的或配位的螯合的过渡金属离子(如，Fe2+、Fe(二吡啶基)2 2+、Ru(CN)6 4-等。介体的量将随所用的化合物的个性而不同，并且其适用性是基于所要这的有利的特性；对于ABTS来说，当用所述的判断标准来判断时它是漆酶和胆红素氧化酶的一种理想的介体，需要仅很少的量，大约0.1mM，就可使反应比在没有ABTS存在时观察到的结果增加103倍。对于任意给定的介体，所用浓度取决于它对所使用酶的Km，该值可由本领域的普通技术人员按常规确定。
在反应过程中产生的碘可用任何适用的方法来回收，如，过滤/离心、惰性气体吹出、和不溶混的有机溶剂萃取。
通过下列非限制性的实施例进一步说明了本发明。
实施例Ⅰ．材料和方法
A．原料
用作缓冲剂和底物的化学药品至少是试剂级的商业产品。抗坏血酸盐氧化酶(南瓜种)、血浆铜蓝蛋白(猪血浆)、胆红素氧化酶(疣孢漆斑菌)和酪氨酸酶(蘑菇)是从Sigma购买的并可直接使用。冷冻干燥的粉末或溶液中酶的含量用紫外可见吸收和发表的消光系数来确认。抗坏血酸盐氧化酶的所述的活性用抗坏血酸来确认。
B．方法
将重组产生的嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(r-MtL；在共同未决的美国序号08,278,473中有述，其中的内容在此合并作为参考)纯化并用如下的丁香醛连氮和2,2’-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)·(ABTS)氧化反应来确定其活性：丁香醛连氮氧化反应是在一个1厘米石英比色杯中于30℃下进行的。60微升丁香醛连氮储备溶液(50％乙醇中0.28毫摩尔浓度)和20微升样品与0.8毫升预加热的缓冲溶液混合。在530纳米处监测氧化反应5分钟。ABTS氧化反应测定使用0.4毫摩尔ABTS、B&R缓冲剂在各种pH下，于室温下通过监测418纳米处吸收度的变化来完成。用36毫摩尔-1厘米-1的消光系数来计算速率。用分光光度计(Shimadzu UV160)或微板读数器(分子装置)来实施光谱测定。按照标准方案(Quelle,Biochemisches Taschenbuch,H.M.Raven,Ⅱ.Teil,S.93u.102,1964)来制备Britton & Robinson(B&R)缓冲剂。
测定I-氧化反应的酶催化测定是在含有1-20纳摩尔MtL(亚单位浓度)和10至200毫摩尔NaI的B&R缓冲剂中在20℃进行5-10分钟。使用26毫摩尔-1厘米-1的消光系数来计算速率。I-的氧化反应在340或353纳米进行光谱监测，并且发现氧化反应产物的光谱与I3 -的光谱相同(Hosoya，生物化学(东京)53:381,1963)。由速率和浓度数据的非线性回归拟合(Prism,graph Pad)得到速率=Vmax *[底物]/Km+[底物]的方程来求出动力学参数。
在相似条件下也测试了浓度高至微摩尔的抗坏血酸盐氧化酶、血浆铜蓝蛋白、胆红素氧化酶和酪氨酸酶对I-氧化反应的催化。
Ⅱ结果
rMtL和其它含铜酶对I-氧化反应的催化作用-在通气的溶液中，I-能被缓慢地氧化成I2。当I-(以NaI形式)过量时，从I-和I2可逆地形成I3 -产生一个具有集中在353附近的一个条谱带的特征性光谱(Hosoy，见上文)。r-MtL能够加速这一过程；在pH3左右，催化的I-氧化反应可比非酶催化的I-氧化反应快许多倍。
I2形成的起始速率的倒数和I-浓度的倒数表现出典型的线性关系(图1A)。在试验的1-15微摩尔的范围中，最大起始速率是与r-MtL浓度成比例的。在pH3.4时活性最佳。高于pH6时，反应最小。作为一种底物I-表现出一个取决于pH的表观Km。在pH3.4时，发现最小的Km,0.16±0.02摩尔，Vmax的pH依赖性是不太显著的(图1B)。在pH3.4时，发现Vmax为2.7±0.2转换/分钟。作为r-MtL的底物I-不如丁香醛连氮好，丁香醛连氮的Km和Vmax在最佳的pH7时分别是大约10微摩尔和大约400转换/分钟的水平。
在pH5时，浓度高至1.5微摩尔的抗坏血酸盐氧化酶表现出低于0.1转换/分钟的活性。在微摩尔水平时，血浆铜蓝蛋白在pH6时在用0.1摩尔NaI的I-氧化反应中表现出很小的催化作用大约0.1/分钟)。作为一种I-氧化酶。酪氨酸酶具有在pH4.1、5.2、6.0和＞7时相对活性相应地为在pH2.7时活性的-58,33,10和＜59的pH-活性分布型。在其最佳pH2.7时，酪氨酸酶以Km-0.1M和Vmax-0.1/分钟来催化I-氧化反应。在酪氨酸酶浓度在2至20微摩尔时起始I-氧化反应速率与酪氨酸酶浓度成比例。作为一种I-氧化酶，胆红素氧化酶具有在pH2.7,5.2,6.0,7.0,8.2和＞9时相对活性相应地为在pH4.1时活性的～95,91,80,59,32和＜69的pH活性分布型。在其最佳pH4.1时，胆红素氧化酶以Km～0.15±0.03摩尔和Vmax1.7±0.1转换/分钟来催化I-氧化反应。在0.5-5微摩尔的胆红素氧化酶浓度范围内，起始速率与胆红素氧化酶浓度成比例。
对ABTS氧化反应的催化-在pH5.0时，抗坏血酸盐氧化酶在浓度高至1.5微摩尔时表现出对ABTS的氧化反应无活性。在试验的酪氨酸酶的浓度为0.2-2微摩尔的范围中，酪氨酸酶催化的ABTS氧化反应速率与酪氨酸酶浓度成比例。在pH2.7时酪氨酸酶具有最佳的活性，从中发现Km为0.18±0.01毫摩尔和Vmax为3.1±0.1转换/分钟。在试验的血浆铜蓝蛋白浓度为0.1至1微摩尔的范围中，血浆铜蓝蛋白催化的ABTS氧化反应的起始速率与血浆铜蓝蛋白浓度成比例。在pH4时，血浆铜蓝蛋白具有最佳的ABTS氧化酶活性，从中发现Km为0.11±0.04毫摩尔和Vmax为9.3±1.3转换/分钟。在试验的胆红素氧化酶浓度为1-10纳摩尔范围中，胆红素氧化酶催化的ABTS氧化反应的起始速率与氧化酶浓度成比例。pH分布型表明最佳pH为4.1，从中发现Km为0.12±0.01毫摩尔和Vmax为(1310±40)转换/分钟。rMtL具有最佳pH≤2.7的pH活性分布型。在DH4.1时，发现ABTS具有Km为5.6±0.5微摩尔和Vmax为1460±31转换/分钟。
ABTS-辅助催化反应-通过用漆酶预温育制得的氧化的ABTS(ABTS+)很容易氧化I-。在有微量ABTS存在时，漆酶催化的I-氧化反应能被大大地增强(图2A)。动力学分析表明限速步骤在于漆酶对ABTS的氧化。
当ABTS和I-均以足够量存在时，只要I-保持在此ABTS过量就只能检测到I3 -光谱。当全部I-被消耗时，出现氧化了的ABTS光谱。在ABTS-辅助的I-氧化反应酶催化作用中，pH-活性分布型(图2B)与rMtL-催化的ABTS氧化反应的pH-活性分布型是相似的(最佳pH从3.4位移至≤2.7)。从I-氧化反应速率对ABTS浓度的依赖性中求出的表观Km和Vmax(6.4±0.8微摩尔和860±40转换/分钟)是与r-MtL-催化的ABTS本身的氧化反应物表观Km和Vmax相近的。
由于它们的ABTS氧化酶活性差，抗坏血酸盐氧化酶，血浆铜蓝蛋白和酪氨酸酶均表现出对I-氧化反应很小的ABTS-辅助的催化作用。当在胆红素氧化酶催化的I-氧化反应中包括有ABTS时，观察到在pH4.1时活性最大。在该pH时，观察到I-氧化反应表观Km为0.18±0.02毫摩尔和Vmax为600±40转换/分钟。这些动力学参数(接近于氧化酶催化的ABTS氧化反应本身的参数)说明在辅助的催化作用中限速步骤是ABTS的氧化反应。
讨论-此前还未有报告叙述漆酶的I-氧化酶活性或氧化酶催化的I-氧化反应。尽管已知F-和可能还有Cl-和Br-，结合于漆酶中的Ⅱ型铜，观察到的在I-氧化反应中漆酶的催化作用暗示I-必须与Ⅰ型铜相互作用。Ⅰ型铜的氧化还原电位(与标准氢电极(NHE)相比较)对r-MtL和胆红素氧化酶来说是在480至530毫伏(与NHE相比较)的范围；对松蕈属漆酶来说大约800毫伏(Reinhammar,Biochi.Biophys.Acta 275:245-259,1972)。对ABTS+/ABTS电偶来说电位是大约700毫伏。这些电位是接近或高于I3 -/I-电偶(540毫伏)的电位的，因此使得Ⅰ型铜或ABTS+氧化I-在热力学上是可实行的。
尽管I-可能是潜在地比ABTS更强的还原剂，动力学因素使前者对漆酶的反应性弱很多。作为一种底物，与I-相比较ABTS具有小～103倍的Km和大～103倍的Vmax。由于氧化了的ABTS在溶液中明显地与I-自由地交换电子，通过ABTS在I-和漆酶间的电子穿棱极大地增强了漆酶催化的I-氧化反应。由于限速步骤是在ABTS的氧化反应，有可能通过ABTS的浓度或其它适当的介体来调节对I-氧化反应的催化。
在试验的含铜酶中，胆红素氧化酶功能上大致相似于漆酶，而试验的其它酶则表现出对I-直接氧化反应更弱的有效作用。由于ABTS本身对抗坏血酸盐氧化酶，血浆铜蓝蛋白、和酪氨酸酶不是一种优良的底物，预期ABTS在辅助这些酶催化的I-氧化反应中只具有较小的作用。但是，能够用作为这些酶的良好底物的其它物料，如适当的酚醛塑料、氢醌化合物、杂环化合物和游离的或螯合的过渡金属离子作为可选择的介体与这些酶一起用于I-氧化反应中。

Claims (18)

1．一种生产碘的方法，该方法包括：
(a)在足以使离子型碘化物被酶转化为碘的条件下，在水溶液中，使一种含铜氧化酶和一种离子型碘化物(I-)源接触；和
(b)从水溶液中回收碘。
2．权利要求1的方法，其中的酶是漆酶或胆红素氧化酶。
3．权利要求2的方法，其中的酶是真菌漆酶或胆红素氧化酶。
4．权利要求3的方法，其中酶是一种漆酶。
5．权利要求3的方法，其中的酶是选自下列的一种漆酶：毁丝霉属漆酶、小柱孢菌属漆酶、松蕈属漆酶、和丝核菌属漆酶、曲霉属漆酶、脉孢菌属漆酶、柄孢壳菌属漆酶、葡萄孢属漆酶、金钱属漆酶、层孔菌属漆酶、香菇属漆酶、侧耳属漆属、栓菌属漆酶、鬼伞属漆酶、小脆柄菇属漆酶、射脉菌属漆酶、和革盖菌属漆酶。
6．权利要求1的方法，其中酶是毁丝霉属漆酶、小柱孢菌属漆酶、松蕈属漆酶或丝核菌属漆酶。
7．权利要求1的方法，其中酶是毁丝霉属漆酶。
8．权利要求3的方法，其中酶是一种胆红素氧化酶。
9．权利要求3的方法，其中酶是毁丝霉属或Trachyderma胆红素氧化酶。
10．权利要求3的方法，其中酶是毁丝霉属胆红素氧化酶。
11．权利要求1的方法，该方法在一种可加速离子型碘化物被含铜氧化酶转化为碘的介体存在下实施。
12．权利要求11的方法，其中介体是2,2-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。
13．一种生产碘的方法，该方法包括：
(a)在足以使离子型碘化物被真菌漆酶或真菌胆红素氧化酶转化成碘的条件下，在水溶液中，在一种可加速离子型碘化物被真菌漆酶或真菌胆红素氧化酶转化为碘的介体存在下，使一种真菌漆酶或一种被真菌漆酶或真菌胆红素氧化酶和一种离子型碘化物(I-)源接触；和
(b)从水溶液中回收碘。
14．权利要求13的方法，其中介体是2,2’-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。
15．权利要求14的方法，其中酶是一种漆酶。
16．权利要求15的方法，其中酶是毁丝霉属漆酶。
17．权利要求14的方法，其中酶是一种胆红素氧化酶。
18．权利要求17的方法，其中胆红素氧化酶是毁丝霉属胆红素氧化酶。
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