CN107224588B - 一种具有磁-pH值双响应的药物载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料合成技术领域，具体公开了一种具有磁‑pH值双响应的药物载体的制备方法，包括如下步骤：S1.将Fe₃O₄纳米粒子与乙醇、水混合，加入原硅酸四乙酯反应，得到Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子；S2.将β‑CD加入硅烷偶联剂进行改性，得到改性β‑CD；S3.将S1中复合纳米粒子与S2中改性β‑CD反应，得到磁性复合纳米材料；S4.将S3中磁性复合纳米材料加入到聚乙二醇溶液中反应，得到复合材料；S5.将β‑CD和S4中复合材料加入溶液中，超声，于4℃条件下静置反应12~24h，清洗，离心，收集沉淀，干燥后得到药物载体。本发明制备的药物载体可在外加磁场下，靶向定位炎症病灶部位；在人体正常组织保持稳定，能够在炎症部位快速释放药物，实现药物对内环境pH的响应及控制释放。

Description

一种具有磁-pH值双响应的药物载体的制备方法

技术领域

本发明属于生物材料合成技术领域，更具体地，涉及一种具有磁-pH值双响应的药物载体的制备方法。

背景技术

在缓控释及靶向药物载体发展的基础上，应答式制剂能根据人体生理、病理变化做出响应而释放药物，是新一代智能化药物载体。药物输运体系的智能化要求载体材料具有环境敏感性，即对外部刺激（如磁场、超声、光、热等）或生理环境变化（如pH值、温度、氧化还原环境等）的响应性。双智能化因子的引入，使药物载体能够同时对外部刺激及生理环境做出响应，是应答式制剂开发的有效途径之一。

磁响应材料能够对外部磁场做出迅速响应，通过控制外部磁信号，启动刺激-响应性控制释放模式。Fe₃O₄是常用磁性纳米粒子之一，具有稳定、靶向性强及生物相容性好等特点，且制备方法已相当成熟，在靶向药物载体领域具有广泛的应用前景。

pH响应性载体是在体内偏酸或偏碱的特定情况下，载体性能发生变化，从而响应性地释放药物的一种给药系统。在细菌感染导致的炎症案例中，炎症因子引起神经营养功能障碍以及炎症区血液循环障碍，促使局部组织改变，pH降低，K⁺增多。由于炎症区三大营养物质分解代谢增强，氧化不完全产物增多，pH降低，导致失偿性酸中毒。随着炎症加剧，中心部位H⁺可增加50倍，化脓性炎症的pH可达到6.5-5.6。另一方面，纳米药物通常通过内吞途径进入细胞，而细胞内涵体与溶酶体的环境为酸性（约4-6.5）。使用对内涵体膜具有响应性的 pH 敏感高分子材料制备纳米药物制剂，可有效抑制经由内化途径进入细胞的溶酶体转运模式，这对提高药物特别是易降解的生物大分子的生物利用度和抑制细胞的抗药反应具有重要作用。β-环糊精（β-CD）是一种具有pH响应性的天然高分子：在酸性条件下（pH<5），CD锥形腔体结构被破坏；在碱性条件下（pH>8.5），CD结构往往只变得不规则。利用这一特性，可以实现在体内对某些病灶部位靶向控释的目的。

疏水性药物的生物利用率低，在一定程度限制了其临床应用。β-CD能识别许多带有疏水基团的化合物并与之形成主客体包合物，在药物载体等领域中有着广泛应用。尺寸合适的难溶性药物能进入β-CD疏水空腔，与β-CD形成包合物，增加包合物的润湿性，从而增加疏水性药物的水溶性和生物利用度。

因此，寻求一种能将β-CD与疏水性抗菌药物进行有效包合的药物载体，且同时具备较高的药物包载率和磁-pH响应性，具有极大的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种具有磁-pH值双响应的药物载体的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种具有磁-pH值双响应药物载体的制备方法，包括如下步骤：

S1.将Fe₃O₄纳米粒子与乙醇、水混合，加入原硅酸四乙酯反应，得到Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子；

S2.将β-CD加入硅烷偶联剂进行改性，得到改性β-CD；

S3.将S1中Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中改性β-CD反应，得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD磁性复合纳米材料；

S4.将S3中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD磁性复合纳米材料加入到聚乙二醇溶液中反应，得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料；

S5.将β-CD和S4中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料加入溶液中，超声，于4℃条件下静置反应12~24h，清洗，离心，收集沉淀，干燥后得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD；

S1中，Fe₃O₄纳米粒子与原硅酸四乙酯的质量体积比为1:(5~15)；反应中Fe₃O₄的质量浓度为0.05~0.15g/l；

S2中，β-CD与硅烷偶联剂的质量体积比为1:(1~3)；β-CD的质量浓度为45~55g/l；

S3中，Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中β-CD的质量比为1:(2~4)；

S5中，β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG的质量比为(8~12):1。

优选地，S1中，Fe₃O₄纳米粒子与原硅酸四乙酯的质量体积比为1:10；反应中Fe₃O₄纳米粒子的质量浓度为0.1g/l。

优选地，S2中，β-CD与硅烷偶联剂的质量体积比为2.5:4；β-CD的质量浓度为50g/l；

S3中，Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中β-CD的质量比为1:2.5；

S5中，β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG的质量比为10:1。

优选地，S1中，Fe₃O₄纳米粒子进行分散后再与原硅酸四乙酯反应，分散处理为将Fe₃O₄纳米粒子放入0.1M的盐酸溶液中进行超声处理，然后清洗。

优选地，S1中原硅酸四乙酯反应前，加入少量氨水。其中，乙醇和水的体积比为4:1。

优选地，S2中具体改性步骤为：将β-CD溶解于二甲基甲酰胺中，加入少量氢化钠，室温搅拌15 min，过滤，加入硅烷偶联剂，在90℃氮气条件下反应4~6h。

更优选地，所述硅烷偶联剂为KH-560。

优选地，S3中加入少量氨水反应10~15h。

优选地，S5中，将Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料加入到β-CD的二甲基甲酰胺饱和溶液中，室温下超声10 min，于4℃静置过夜，施加磁场得到反应物，用二甲基甲酰胺溶液、水、乙醇依次清洗反应物，在3200 r/min 离心10 min，收集沉淀。

优选地，S1中采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子的方法为：将二价铁盐和三价铁盐混合，加入氨水，搅拌，分离，洗涤，再加入水和聚乙二醇，超声混匀，于80℃加热熟化30min。

优选地，采用现有的化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子。

本发明提供的制备方法制备得到的载体，可以与疏水类药物按一定浓度比例混溶，得到包覆该疏水类药物的磁导向药物载体。

所述疏水类药物包括但不限于红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、吉他霉素、乙酰螺旋霉素素。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明制备方法简单、成本低廉，可制备得到具有磁性及pH双响应效果的应答式载药体系。该药物载体可在外加磁场下，靶向定位炎症病灶部位（弱酸性），β-CD结构破坏，药物快速释放；而在人体正常组织（中性pH），β-CD结构稳定，药物释放缓慢，实现药物对内环境pH的响应及控制释放。

附图说明

图1为实施例1~3中磁性纳米材料的傅里叶红外图谱。

图2为实施例3中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD载体的粒径分布和扫描电镜图。

图3为实施例1~2中Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂/β-CD磁性纳米粒子的X射线衍射图。

图4为实施例1~3中磁性纳米材料的磁滞曲线和磁响应效果示意图。

图5为实施例2~3中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD载体的水溶液稳定性效果示意图。

图6为实施例2~3中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD载体在不同pH的PBS溶液中药物释放曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

名称缩写：

Fe₃O₄@SiO₂为SiMNP

Fe₃O₄@SiO₂/β-CD为CDMNP

Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD为CDMNP-PEG-CD

CD为β-CD

实施例1：

采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子。将Fe²⁺和Fe³⁺按物质的量比1:2混合，加入过量氨水，在一定温度下（约50℃）搅拌30min，磁铁分离沉淀，0.5%氨水洗涤，沉淀，加适量去离子水及0.5g聚乙二醇，超声混匀，于80℃加热熟化30 min（600 r/min），去离子水反复洗涤，得黑色磁流体取 Fe₃O₄纳米粒子放入盐酸溶液（0.1M），超声分散，去离子水清洗3次。SiMNP复合纳米粒子的制备。取0.01g洁净的Fe₃O₄纳米粒子，置入100ml乙醇溶液（乙醇与去离子水的体积比4:1），机械搅拌，滴加1ml氨水（25%），再滴加0.1ml原硅酸四乙酯，室温搅拌12 h；施加磁场富集吸出纳米粒子，去离子水和乙醇漂洗3次，于60℃真空干燥12h，得棕黑色SiMNP复合纳米粒子。

实施例2：

CDMNP磁性复合纳米材料的制备。取2.5gβ-CD溶于50ml二甲基甲酰胺，加入0.5g氢化钠，室温搅拌15 min，过滤，得白色透明溶液，加入4ml KH-560，于90 ℃氮气保护下搅拌5h，。冷却至室温，得改性β-CD；加入1gSiMNP，滴加1.5ml氨水（25 %），室温搅拌12h，磁铁富集吸出，依次用二甲基甲酰胺、去离子水和乙醇漂洗3次，于50℃真空干燥12 h，得棕黑色CDMNP磁性复合纳米材料。

实施例3：

CDMNP-PEG-CD载体的制备。取适量CDMNP磁性复合纳米粒子，置于20% 聚乙二醇溶液，室温机械搅拌24h；产物富集吸出，水洗，真空干燥，得CDMNP-PEG复合材料。取0.05gCDMNP-PEG复合材料，置于0.5gβ-CD的二甲基甲酰胺饱和溶液，室温超声10 min，于4℃静置过夜；磁富集吸出，用二甲基甲酰胺、蒸馏水、乙醇清洗各1次,离心10 min（3200 r/min），磁吸附收集沉淀；此过程重复3次，以除去残余的β-CD和CDMNP-PEG复合材料。沉淀真空干燥，封存备用。

实施例4：

针对实施例1~3制备得到的载体进行红外检测，结果见图1所示。其中，a~d分别为MNP，SiMNP，CDMNP和CDMNP-PEG-CD。对比MNP的红外光谱（a），SiMNP（b）在802.6 cm^-1出现Si-O-Si的对称伸缩振动吸收峰，958.4 cm^-1为Si-O-H的特征峰，1097.3 cm^-1为Si-O-Si反对称伸缩振动的吸收峰。结果表明，SiO₂已经成功包覆Fe₃O₄。CDMNP的红外光谱（c）中，799.6 cm^-1、958.4cm^-1及1091.6cm^-1为SiO₂的特征峰；3439.3 cm^-1为-OH的伸缩振动吸收峰，峰强度降低；2926.4 cm^-1和1086.0 cm^-1分别是CD烷烃链中C-H和C-O的伸缩振动峰，表明β-CD已经成功接枝到SiMNP表面。CDMNP-PEG-CD的红外光谱（d）中，2942 cm^-1是CD烷烃链中C-H的伸缩振动峰，2870.0 cm^-1是聚乙二醇端羟基的伸缩振动峰，证实复合材料中引入了聚乙二醇。

实施例5：

采用纳米激光粒度仪对实施例3制备得到的CDMNP-PEG-CD载体（图2a）的粒径分布，粒径约为334 nm，CV为0.56%。图2（b）为CDMNP-PEG-CD载体的扫描电镜图，可见粒径均匀的复合磁性纳米颗粒。

实施例6：

针对实施例1~2制备得到的MNP、SiMNP以及CDMNP复合纳米粒子进行X-射线衍射分析，如图3所示。SiMNP和CDMNP仍保留MNP的特征峰，说明四氧化三铁纳米粒子的晶体结构在包埋前后没有发生明显改变；在2θ=27~29°处的宽峰是核壳结构中无定形SiO₂壳层的特征峰。选取CDMNP的最强衍射峰(311)，由Scherrer公式计算出的平均粒径为78.32nm，与粒度仪测得的粒径数据接近。

D=0.9λ/Bcosθ

式中D为粒子平均直径/nm，0.9为Scherrer常数，λ为X-射线波长0.154nm，B为衍射峰的半高宽，θ为衍射角/rad。

实施例7：

针对实施例1~3制备得到的载体进行磁性分析，结果见图4所示。 MNPS、CDMNP、CDMNP-PEG-CD三种磁性纳米颗粒的磁滞回线（b）均是由磁化曲线和退磁曲线重合而构成的单一曲线，表明本发明后续的改性方法未对材料的磁性产生不利影响，未显示磁滞现象，仍具有典型的超顺磁行为。三者的饱和磁化强度约为46.89 emu/g，磁响应性较好。磁性直观示意图如图4（a）所示。分散良好的CDMNP水溶液，在玻璃瓶壁放置一磁铁，3 min内复合磁性粒子贴壁富集，水溶液变得澄清，表明良好的磁响应性。

实施例8：

针对实施例2~3制备得到的载体的水溶液稳定性进行测试，如图5所示。分别取1gCDMNP和CDMNP-PEG-CD，置于适量蒸馏水，超声30min，静置观察。CDMNP-PEG-CD溶液稳定，40min时依然有良好的分散性，直至3h才沉降较完全。而CDMNP在40min时显著沉降，稳定性较差。由此可知，CDMNP-PEG-CD明显改善了水溶液的稳定性，能更好的应用于人体的体内环境。

实施例9

针对实施例2~3制备得到的CDMNP和CDMNP-PEG-CD载体的载药量进行分析。取一定量CDMNP和CDMNP-PEG-CD载体，加入到1ml 5 mg/ml罗红霉素（ROX）的乙醇溶液，振荡8h，磁铁吸附材料，取上清，用光度法测浓度。结果表明，1mg CDMNP-PEG-CD载体对ROX的包封量为0.132mg，明显高于CDMNP载体对ROX的包封量0.072mg。

针对实施例2~3制备得到的CDMNP（图6a）和CDMNP-PEG-CD（图6b）载体的药物释放进行分析，如图6所示。取负载ROX的载体，投入不同pH的PBS溶液，测定特定时间的药物浓度，绘制药物释放曲线。相比CDMNP载体，CDMNP-PEG-CD载体的最大药物释放量有所提高，且在酸性条件下，20min内载体可释放近80%的药物(图6b)，而碱性条件下药物释放速率受到抑制。如释药30min时，CDMNP-PEG-CD载体在pH=1时的药物释放量为pH=7.4时的1.6倍，为pH=8时的2.0倍；pH=4时药物释放量为pH=7.4的1.3倍，为pH=8时的1.6倍，表明良好的pH响应性，实现药物对内环境pH的响应及控制释放。

Claims (10)

1.一种具有磁-pH值双响应药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将Fe₃O₄纳米粒子与乙醇、水混合，加入原硅酸四乙酯反应，得到Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子；

S2.将β-CD加入硅烷偶联剂进行改性，得到改性β-CD；

S3.将S1中Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中改性β-CD反应，得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD磁性复合纳米材料；

S4.将S3中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD磁性复合纳米材料加入到聚乙二醇溶液中反应，得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料；

S5.将β-CD和S4中Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料加入溶液中，超声，于4℃条件下静置反应12～24h，清洗，离心，收集沉淀，干燥后得到Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG/β-CD；

S1中，Fe₃O₄纳米粒子与原硅酸四乙酯的质量体积比为1:(5～15)；反应中Fe₃O₄的质量浓度为0.05～0.15g/L；

S2中，β-CD与硅烷偶联剂的质量体积比为1:(1～3)；β-CD的质量浓度为45～55g/L；

S3中，Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中β-CD的质量比为1:(2～4)；

S5中，β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG的质量比为(8～12):1；

所述质量体积比为g与mL的关系。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，Fe₃O₄纳米粒子与原硅酸四乙酯的质量体积比为1:10；反应中Fe₃O₄纳米粒子的质量浓度为0.1g/L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，β-CD与硅烷偶联剂的质量体积比为2.5:4；β-CD的质量浓度为50g/L；

S3中，Fe₃O₄@SiO₂复合纳米粒子与S2中β-CD的质量比为1:2.5；

S5中，β-CD和Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG的质量比为10:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，Fe₃O₄纳米粒子进行分散后再与原硅酸四乙酯反应，分散处理为将Fe₃O₄纳米粒子放入0.1M的盐酸溶液中进行超声处理，然后清洗；S1中原硅酸四乙酯反应前，加入少量氨水，乙醇和水的体积比为4:1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中具体改性步骤为：将β-CD溶解于二甲基甲酰胺中，加入少量氢化钠，室温搅拌15min，过滤，加入硅烷偶联剂，在90℃真空氮气条件下反应4～6h。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为KH-560。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中加入少量氨水反应10～15h；S5中，将Fe₃O₄@SiO₂/β-CD@PEG复合材料加入到β-CD的二甲基甲酰胺饱和溶液中，室温下超声10 min，于4℃静置过夜，施加磁场得到反应物，用二甲基甲酰胺溶液、水、乙醇依次清洗反应物，在3200 r/min 离心10 min，收集沉淀。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子的方法为：将二价铁盐和三价铁盐混合，加入氨水，搅拌，分离，洗涤，再加入水和聚乙二醇，超声混匀，于80℃加热熟化30 min。

9.一种权利要求1至8任一所述的制备方法制备得到的具有磁-pH值双响应药物载体。

10.权利要求9所述的具有磁-pH值双响应药物载体在制备药物中的应用，其特征在于：用于包覆疏水类药物，所述疏水类药物包括红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、吉他霉素、乙酰螺旋霉素。

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