CN107217047A - 一种回收溶液中纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种回收溶液中纤维素酶的方法；该方法是将pH响应型木质素两性表面活性剂加入到纤维素酶溶液中溶解，再调节溶液的pH 2.5‑10，使pH响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离回收纤维素酶。本发明方法首次提出了利用pH响应型木质素两性表面活性剂回收纤维素酶的方法。本发明方法不仅可以有效地回收溶液中的纤维素酶，操作简单，绿色环保，而且有利于生物质资源的开发利用。

Description

一种回收溶液中纤维素酶的方法
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域，特别涉及利用pH响应型木质素两性表面活性剂回收溶液中纤维素酶的方法。
背景技术
木质纤维素生物炼制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技术之一。在这一炼制过程中，纤维素酶能否高效水解木质纤维素底物是关键的技术瓶颈。同时，纤维素酶因其具有活力低、耗量大和价格贵等特点，直接阻碍了纤维素乙醇的工业化。实现纤维素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途径。由于酶解结束后酶解液中的纤维素酶蛋白的浓度一般低于1g/L，且纤维素酶的组分较多，不同组分的酶有不同的等电点(pI)，所以常见的盐析法和等电点沉降法不适合回收酶解液中的纤维素酶。目前，纤维素酶回收利用技术主要有超滤膜回收、纤维素酶的固定化回收和新鲜底物重吸附法回收。
超滤膜回收可以同时回收纤维素酶中的各种组分，且可以得到较高纤维素酶回收效率，但是超滤膜回收存在着设备贵、超滤膜易堵塞、操作费时、成本高等问题(Bioresource Technology,2013.144:186-193.)。纤维素酶的固定化可以保持纤维素酶的稳定且利于纤维素酶的回收利用，但是固定化酶与纤维素之间存在很大的传质障碍，且固定化过程会严重影响酶活，因此目前仅限于纤维二糖酶的固定化回收再用(Nano,2015.10:2153-2157.)。纤维素酶具有高稳定性和对纤维素的强吸附的特性，使得酶通过新鲜底物吸附回收成为降低纤维素酶成本比例的潜在途径，但是添加新鲜底物回收纤维素酶效率较低，操作过程中容易感染杂菌，且该方法无法回收纤维二糖酶(Biotechnol Biofuels,2015.8(1):5.)。
木质素是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大天然高分子材料，制浆造纸工业每年都会得到5000万吨左右的木质素副产品，但超过95％的木质素仍然主要作为工业制浆的废弃物，造纸黑液的排放不仅造成资源的浪费，同时又污染环境，对其进行综合开发利用对经济的发展和环境保护都具有现实意义。纤维素乙醇工业本身也会产生大量的酶解木质素，若能将其应用于回收纤维素酶将会有巨大的意义。
发明内容
为了克服回收溶液中纤维素酶现有技术所存在的成本高和回收效率低等缺点和不足，本发明的目的在于提供一种只需要简单的调节pH就可以快速地回收纤维素酶，有利于生物质资源的综合利用的利用pH响应型木质素两性表面活性剂回收溶液中纤维素酶的方法。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种回收溶液中纤维素酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将pH响应型木质素两性表面活性剂加入到纤维素酶溶液中溶解，再调节溶液的pH 2.5-10，使pH响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离回收纤维素酶。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述pH响应型木质素两性表面活性剂为工业木质素或木质素的衍生物为原料经过化学反应引入阳离子基团和/或阴离子基团得到的具有pH响应的木质素两性表面活性剂，其中阴离子基团为羧基、磺酸基、硫酸基或磷酸基，阳离子基团为季铵基或胺基。
优选地，所述工业木质素为碱木质素、有机溶剂木质素或生物质炼制木质素，木质素的衍生物为木质素磺酸盐、木质素羧酸盐、木质素磷酸盐、木质素季铵盐或木质素胺盐。
优选地，所述pH响应型木质素两性表面活性剂为磺化季铵化木质素、磺化胺化木质素、硫酸化季铵化木质素、硫酸化胺化木质素、磷酸化季铵化木质素、磷酸化胺化木质素、羧化季铵化木质素或羧化胺化木质素。
优选地，所述pH响应型木质素两性表面活性剂中的阴离子或阳离子基团的含量均大于0.3mmol/g木质素。
优选地，所述纤维素酶溶液的pH为3.5～7.0，离子强度为0～200mmol/L。
优选地，所述纤维素酶为Celluclast 1.5L或Cellic CTec2。本发明对纤维素酶没有特定要求，对于目前普遍使用的Celluclast 1.5L和Cellic CTec2都可以进行回收。所述纤维素酶溶液中纤维素酶蛋白浓度为50-2000mg/L。
优选地，所述的固液分离的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、离心法或这些方法的联合使用。
优选地，所述的pH响应型木质素两性表面活性剂与纤维素酶溶液的质量比为0.05-2:100。
优选地，回收得到的纤维素酶用于制备纤维素酶溶液。所述的回收的纤维素酶能够也能应用于纤维素或木质素纤维素的水解。
本发明pH响应型木质素两性表面活性剂可以根据纤维素酶溶液的具体情况进行优选，使其可以溶解在纤维素酶溶液中并通过调节溶液的pH与纤维素酶一起沉淀出来。本发明调节溶液的pH值最低不超过2.5，最高不超过10.0。过高和过低的pH值都会导致纤维素酶的失活。调节酶解液体中可能用到的酸为有机酸或无机酸(如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、马来酸等)；可能用到的碱为常规的碱(如氢氧化钠，氢氧化钾，氧化钙，氢氧化钙等)。
本发明的机理为：本发明以制浆造纸副产物木质素或酶解木质素为原料，经过化学反应改性成pH响应型木质素两性表面活性剂，使其用于溶液中纤维素酶的回收。由于pH响应型木质素两性表面活性剂的溶解度可以随pH调节，选择合适的pH响应型木质素两性表面活性剂完全溶解于纤维素酶溶液中，当升高或降低溶液的pH时，pH响应型木质素两性表面活性剂析出，由于其与纤维素酶存在一定的相互作用(静电作用、疏水作用、氢键作用)，所以在pH响应型两性表面活性剂析出时会将溶液中的纤维素酶一起沉淀下来。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明用pH响应型木质素两性表面活性剂回收纤维素酶，回收的纤维素酶对微晶纤维素底物的活性可以达到初始纤维素酶活性的41.5-91.6％。
(2)本发明中回收纤维素酶的操作简单、耗时短、不需要额外的设备，只需要简单的调节pH就可以快速地回收纤维素酶。
(3)本发明以工业木质素和木质素衍生物为原料，将其应用于纤维素酶的回收，有利于生物质资源的综合利用。
附图说明
图1(a)是TCSL-N28在纯水中的pH响应情况；(b)是KL-N40在纯水中的pH响应情况。
图2是利用pH响应型木质素两性表面活性剂(pH-LAS)回收纤维素酶的操作示意图，实施例均按此操作完成。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的微晶纤维素型号为PH101(购自西格玛奥德里奇)，纤维素酶是目前被广泛使用的Cellic CTec2。实施例水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(SBA-40E，山东省生物科学研究院)测定的，实施例中微晶纤维素在50℃下水解24h的糖化率代表纤维素酶的活性。
实施例涉及到三种pH响应型木质素两性表面活性剂，一种是由磺化木质素(TCSL，湖南通道神华林木有限公司生产)季铵化得到，等电点小于4.0；一种是由碱木质素(KL，湖南湘江纸业有限公司生产)季铵化得到，等电点大于7.0；一种是由木质素磺酸钠(SL，来源于杨木酸性亚硫酸钠造纸废液，由吉林石岘纸业有限责任公司生产)胺化得到，等电点小于4.0。三种pH响应型木质素两性表面活性剂的具体合成方法如下：
季铵化磺化木质素(TCSL-N x)：配制pH＝12的350g TCSL水溶液(TCSL占溶液质量分数为20％)，倒入500mL的三口烧瓶，控制搅拌速度为350rpm，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将1.0769x g质量分数为65wt％(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液往烧瓶中缓慢滴加，控制滴加速度为1mL/min，滴加5min时加入0.3721x g质量分数为20％的NaOH水溶液，再继续滴加完(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到pH＝3，使产品析出；x为(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵占TCSL的质量分数，x的取值范围为10～80。
季铵化碱木质素(KL-N40)：配制pH＝12的350g KL水溶液(KL占溶液质量分数为20％)，倒入500mL的三口烧瓶，控制搅拌速度为350rpm，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将43.08g质量分数为65wt％(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液往烧瓶中缓慢滴加，控制滴加速度为1mL/min，滴加5min时加入22.91g质量分数为20％的NaOH水溶液，再继续滴加完(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到pH＝7，使产品析出。
胺化木质素磺酸钠(ASL)：配制pH＝12的50g SL水溶液(SL占溶液质量分数为20％)，倒入100mL的三口烧瓶，控制搅拌速度为350rpm，设定水浴锅的温度为80℃，当温度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸点低，温度低加入)，待温度上升到80℃后，加入对应的3.657g二乙胺，在80℃下反应4h，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到pH＝3，使产品析出。
实施例1
将5质量分的TCSL-N25加入到纤维素酶蛋白浓度为200mg/L的5000质量分的溶液中(纯水配置，pH＝7.0)，用盐酸调节溶液的pH至3.0使TCSL-N25和纤维素酶沉淀析出，通过固液分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例2
将25质量分的ASL加入到纤维素酶蛋白浓度为400mg/L的5000质量分的溶液中(纯水配置，pH＝7.0)，用盐酸调节溶液的pH至3.2使ASL和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例3
将5质量分的TCSL-N25加入到纤维素酶蛋白浓度为1000mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝4.8,25mM)，用盐酸调节溶液的pH至2.8使TCSL-N25和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例4
将10质量分的TCSL-N30加入到纤维素酶蛋白浓度为100mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝5.5，5mM)，用盐酸调节溶液的pH至3.5使TCSL-N30和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例5
将10质量分的KL-N40加入到纤维素酶蛋白浓度为100mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝4.0，5mM)，用盐酸调节溶液的pH至7.0使KL-N40和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例6
将50质量分的TCSL-N25加入到纤维素酶蛋白浓度为200mg/L的5000质量分的溶液中(醋酸-醋酸钠缓冲液配置，pH＝6.0，100mM)，用盐酸调节溶液的pH至3.5使TCSL-N30和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例7
将25质量分的TCSL-N28加入到纤维素酶蛋白浓度为400mg/L的5000质量分的葡萄糖溶液中(葡萄糖为100质量分，pH＝7.0)，用盐酸调节溶液的pH至3.2使TCSL-N25和纤维素酶沉淀析出，通过离心分离回收纤维素酶。将回收的纤维素酶加入到5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中，添加100质量分的微晶纤维素，在50℃下酶解24h，通过生物传感分析仪测定酶解液中的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
以上实施例同时做了空白对比例(向与实施例纤维素酶浓度相同的5000质量分50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝4.8)中添加100质量分的微晶纤维素，相同条件下酶解24h)，与采用本发明方法的实施例进行纤维素酶活性(微晶纤维素24h酶解糖化率)的比较。
根据表1中可以看出，木质素两性表面活性剂可以有效地回收溶液中的纤维素酶，回收的纤维素酶对微晶纤维素的酶解保持了较高的活性。实施例7与实施例2相比溶液中含有2％质量分数的葡萄糖，但是纤维素酶的回收没有受到明显的影响，说明该方法在木质纤维素酶解糖化后的溶液中进行纤维素酶回收具有重要的意义。
图1(a)是1g/L TCSL-N28在纯水中的pH响应情况；图1(b)是1g/L KL-N40在纯水中的pH响应情况。说明了TCSL-N28和KL-N40具有灵敏的pH响应性，可用于回收溶液中的纤维素酶。
图2是利用pH响应型木质素两性表面活性剂回收纤维素酶的操作示意图，过程操作简单，不需要额外的设备，能耗低，绿色环保。
表1 木质素两性表面活性剂回收纤维素酶的情况
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种回收溶液中纤维素酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将pH响应型木质素两性表面活性剂加入到含有纤维素酶的溶液中溶解，再调节溶液的pH 2.5-10，使pH响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀析出，通过固液分离回收纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH响应型木质素两性表面活性剂为工业木质素或木质素的衍生物为原料经过化学反应引入阳离子基团和/或阴离子基团得到的具有pH响应的木质素两性表面活性剂，其中阴离子基团为羧基、磺酸基、硫酸基或磷酸基，阳离子基团为季铵基或胺基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述工业木质素为碱木质素、有机溶剂木质素或生物质炼制木质素，木质素的衍生物为木质素磺酸盐、木质素羧酸盐、木质素磷酸盐、木质素季铵盐或木质素胺盐。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述pH响应型木质素两性表面活性剂为磺化季铵化木质素、磺化胺化木质素、硫酸化季铵化木质素、硫酸化胺化木质素、磷酸化季铵化木质素、磷酸化胺化木质素、羧化季铵化木质素或羧化胺化木质素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH响应型木质素两性表面活性剂中的阴离子或阳离子基团的含量均大于0.3mmol/g木质素。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶溶液的pH为3.5～7.0，离子强度为0～200mmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶为Celluclast 1.5L或Cellic CTec2；所述纤维素酶溶液中纤维素酶蛋白浓度为50-2000mg/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH响应型木质素两性表面活性剂与纤维素酶溶液的质量比为0.05-2:100。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固液分离的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、离心法或这些方法的联合使用。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，回收得到的纤维素酶用于制备纤维素酶溶液。
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