CN107206055A - Il‑12组合物和在造血恢复中的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容的方面和实施方式提供了治疗方法和包含白介素12(IL‑12)的组合物,其有用于改进对象中的造血恢复HSCT移植。具体而言,本公开内容提供了示例性方法和包含IL‑12的组合物,其与BMCT一样有效地在致死照射的小鼠中促进血细胞生成并且增加外周血细胞的恢复与存活,其指示rHuIL‑12疗法可以增加HSCT之后的HSC移入。我们认定照射的小鼠骨髓中的表达IL‑12Rβ2的细胞是IL‑12的潜在靶标。施用rMuIL‑12增加小鼠骨髓中表达IL‑12Rβ2的Lin‑细胞的数目,其指示骨髓HSC和隔细胞是rMuIL‑12的直接靶标,并且rMuIL‑12的促血细胞生成活性受HSC上的IL‑12受体介导。最后,我们显示了IL‑12β2在人骨髓lin‑和CD34+细胞上的表达,其指示了IL‑12在人移植中的潜在作用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月31日提交的美国临时专利申请62/073,197的优先权权益,其整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容一般地涉及用于移植的新型方法和组合物。具体而言,用于在干细胞移植之后促进造血恢复的方法和组合物包括给需要其的对象施用治疗有效量的包含IL-12的药物组合物。
背景技术
下列包括在理解本公开内容的多种方面和实施方式中可能有用的信息。这不承认在本文提供的任何信息是现有技术或与当前描述的或要求保护的发明相关,或不承认具体地或隐含地引用的任何出版物或文档是现有技术。
干细胞移植是血液学和肿瘤学的领域中的医疗程序,其可以针对患有血液疾病、骨髓疾病、或某些癌症的人进行。造血干细胞移植仍然是具有许多可能的并发症的有风险的程序,并且在传统上被保留用于患有危及生命的疾病的患者。虽然偶尔实验地用于非恶性和非血液适应症比如严重的致残性自身免疫性疾病和心血管疾病,但是致命性并发症的风险显得太高而难以获得更广泛的接纳。
根据由全球血液和骨髓移植网络(Worldwide Network for Blood and MarrowTransplantation)实施的71个国家中的1327个中心的全球调查,在2006年,报道总计50,417例第一次造血干细胞移植在全世界发生。这些之中,28,901例(57%)是自体的并且21,516例(43%)是同种异体的(11,928例来自家庭供体并且9,588例来自不相关的供体)。移植的主要适应症是淋巴增生性障碍(54.5%)和白血病(33.8%),并且大多数在欧洲(48%)或美洲(36%)发生。在2009年,根据世界骨髓捐赠者协会(world marrow donorassociation),在全世界,提供用于不相关的移植的干细胞产品已经增加至15,399例(3,445例骨髓捐赠,8,162例外周血干细胞捐赠,和3,792个脐带血库(cord blood unit))。
在过去,造血干细胞直接从骨髓采集;然而在当前,这些干细胞可以在患者已经被给予生长因子——其可以引起干细胞从骨髓移动入循环——后直接从他们的血流收集。用于采集干细胞的仪器称为单采血液成分机(apheresis machine)。由于在给予高剂量疗法前干细胞实际上从患者收集,此类型的移植称为自体移植。另一种主要形式的移植称为同种异体移植,其中造血干细胞从供体(通常是兄弟或姐妹或匹配的捐赠者)收集。由于患者基本上正在得到新的免疫系统,同种异体移植具有增加的益处。科学家现在已经认识到正是此新的免疫系统通常能够根除甚至在患者接受高剂量疗法后仍保留的肿瘤细胞。此现象称为移植物抗肿瘤(GVT)效应。
虽然被广泛地使用,但是造血细胞移植——不论是自体的或是同种异体的——仍是高风险的过程。因而造血细胞移植的领域已经在过去五至十年内经历变化。具体而言,当来自供体的免疫效应细胞(T-淋巴细胞)被重新注入患者时,注意到如下现象:在同种异体移植后复发的患者随后能够恢复完全缓解和最终治愈他们的疾病。此信息导致移植领域中的典范转移并且因此导致非清髓性(non-myeloablative)同种异体干细胞移植的诞生,其还被称为其它名称比如:“小同种异体(mini-allo)”移植、“精简版移植(transplantlite)”、“快速(drive-thru)”移植、“降低强度(reduced intensity)”移植、或“混合嵌合体(mixed chimera)”移植。
但是即使引入用于造血细胞移植的小移植(mini-transplant)和新程序,感染和其它并发症的风险仍然很高。主要的并发症是静脉闭塞性疾病、粘膜炎、感染(脓毒症)、移植物抗宿主病和新的恶性肿瘤的发展。因而,可以帮助改进经历造血细胞移植过程的患者的结果的新型药剂是期望的。这样的新型药剂将增加造血恢复的可能性,同时在造血细胞移植之后降低严重的并发症的可能性。
发明内容
因此,对造血干细胞移植(HSCT)之后的造血恢复有用的新型方法和组合物存在需要。
本公开内容提供了方法和治疗剂,其靶向血细胞生成和先天性免疫的多种途径并且可以在治疗上用于广泛范围的临床障碍,所述临床障碍包括造血干细胞移植(HSCT)之后的造血恢复。在一些方面,本公开内容提供了可以改进HSCT之后的造血恢复的方法和治疗剂。
在一个方面,本发明涉及包含重组人白介素-12(rHuIL-12)和/或其小鼠同系物IL-12(rMuIL-12)的组合物,和使用在全身照射(TBI)之前或之后施用的单一的低剂量重建骨髓的那些组合物的使用方法。例如,已经令人惊讶地显示了重组人白介素-12(rHuIL-12)和其小鼠同系物IL-12(rMuIL-12)具有使用在全身照射(TBI)之前或之后施用的单一的低剂量重建骨髓的显著的能力。
在其它方面,本发明涉及施用rHuIL-12刺激血细胞生成的方法,例如,其可以通过rHuIL-12与在HSC和隔细胞上表达的IL-12受体的相互作用发挥作用。在其它方面,本发明涉及使用rHuIL-12作为造血细胞移植的辅助物的治疗方法或用于在移植之后增强HSC移入和骨髓恢复的其它方法。
在一个方面,在对象暴露于电离辐射之后保护对象免于系统、器官、组织或细胞损伤的方法包括:在骨髓清除(myoablation)和未骨髓清除(non-myoablation)之后给对象施用一个剂量的治疗有效量的药物组合物,其包含基本上分离的IL-12。示例性清髓性方法可以包括,例如,辐射、化学疗法和/或辐射与化学疗法。示例性非清髓性方法可以包括,例如,小移植或降低强度调理(conditioning)。
在一个方面,清髓性辐射作为全身照射被接受。
在一个方面,辐射以两个或更多个部分(fraction)作为分次剂量被接受。在另一个实施方式中,辐射作为超分割(hyperfractionation)疗法中的分次剂量被接受。在另一个方面,辐射作为加速分割(accelerated fractionation)疗法中的分次剂量被接受。
在一个方面,IL-12的有效剂量以50至300ng/Kg的一种或多种剂量被给予。IL-12的其它有效剂量在100-200ng/kg的剂量范围中。
在一个方面,在HSCT前给予一种或多种有效剂量的IL-12。在其它方面,在HSCT之前或之后给予一种或多种有效剂量的IL-12。在另一个方面,在HSCT后给予一种或多种有效剂量的IL-12。
在一个方面,一种或多种有效剂量的IL-12被外用地、皮下地、皮内地、静脉内地、腹腔内地、肌肉内地、硬膜外地、肠胃外地、鼻内地、和/或颅内地施用。
在一个方面,作为示例性方法和/或组合物,本公开内容提供了rMuIL-12和骨髓细胞移植(BMCT)在照射的小鼠中的促血细胞生成活性之间的体内比较,并且展现了rHuIL-12的潜在的细胞靶标和IL-12受体在人血细胞生成中的体外作用。
在另一个方面,作为示例性方法和/或组合物,本公开内容展现了给致死照射的小鼠至少一次施用低剂量(10ng/小鼠)rMuIL-12与BMCT一样有效地增加存活和外周血细胞恢复。在一个实施方式中,在辐射之后第12天,使用rMuIL-12处理的小鼠的鼠骨髓表征为存在表达IL-12受体β2亚基(IL-12Rβ2)的髓样祖细胞(myeloid progenitor)、巨核细胞和成骨细胞。
在一个方面,作为示例性方法和/或组合物,施用rMuIL-12还增加小鼠骨髓Lin-细胞中表达IL-12Rβ2的细胞的数目。在一个实施方式中,人骨髓细胞的分析指示多能Lin-细胞和CD34+细胞也表达IL-12Rβ2连同造血干细胞(HSC)的其它标志物。
本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方式,其包括但不限于在此发明内容中陈述或描述或引用的那些。它不意欲是包括一切的,并且本文描述和要求保护的发明不限于在此发明内容中确定的特征或实施方式或被其限制,其出于仅说明而非限制的目的被包括。可以在下面的具体实施方式中公开另外的实施方式。
附图说明
图1描述了rMuIL-12在增加照射的小鼠中的存活(a)和血细胞恢复(b-d)的功效,其与骨髓细胞移植(BMCT)程度相似。动物静脉内接受媒介物、rMuIL-12(10ng/小鼠)或BMCT(1.1×106个细胞)并且监测存活和血细胞计数持续35天。TBI=全身照射。
图2.rMuIL-12增加照射的小鼠中的造血重建。针对未照射的、未处理的小鼠(A),和在TBI之后12天使用媒介物或rMuIL-12(20ng/小鼠)皮下处理的动物显示了进行IL-12Rβ2染色的股骨骨髓的切片。虽然使用媒介物处理的小鼠缺少表达IL-12Rβ2的细胞并且显示没有造血再生的迹象(b),但是使用rMuIL-12处理的小鼠显示了造血重建和存在表达IL-12Rβ2的巨核细胞、髓样祖细胞和成骨细胞(c-d)。在rMuIL-12处理后注意到血细胞生成和表达IL-12Rβ2的干细胞和非干细胞。放大倍数=100×。
图3.巨核细胞岛(island)观察到靠近骨小梁。在24小时前和3天后使用rMuIL-12(20ng/小鼠)皮下处理的小鼠的TBI之后12天进行IL-12Rβ2(橙色)染色的股骨骨髓的切片。放大倍数=100×。
图4.小鼠骨髓Lin-细胞表达IL-12Rβ2。在小鼠骨髓细胞之中免疫磁性地选择Lin-细胞并且在标记有抗IL-12Rβ2的抗体之后使用流式细胞术进行分析。门控(gated)区域(R6)指示表达IL-12Rβ2的子集,总计大约5%的Lin-细胞。
图5.人骨髓Lin-细胞和CD34+细胞表达IL-12Rβ2。人Lin-细胞(a)和CD34+细胞(b、c)标记有抗IL-12Rβ2和CD34的抗体并且使用流式细胞术(a和b)或免疫细胞化学(c)进行分析。使用未染色对照和同种型对照设定象限。R2:IL-12Rβ2+CD34-,R3:IL12Rβ2+CD34+,R5:IL-12Rβ2-CD34+。
图6.人Lin-IL-12Rβ2+细胞和CD34+IL-12Rβ2细胞共表达其它干细胞标志物。Lin-细胞(a)和CD34+细胞(b)共标记有抗IL-12Rβ2的抗体和干细胞的指示的标志物并且使用流式细胞术进行分析。注意,IL-12Rβ2在1-4%的Lin-细胞和6-50%的CD34+细胞上表达。
图7.猕猴在暴露于TBI和在TBI后24小时使用媒介物或rHuIL-12处理之后的存活。
显示了每个处理组在研究时期内的存活的卡普兰-迈耶图。每个剂量组包括18只动物。50ng/kg、100ng/kg、250ng/kg和500ng/kg剂量组对媒介物处理的对照组的时序p-值分别是0.0305、0.0344、0.0404和0.0265。
图8.暴露于致死TBI和在TBI后24小时使用媒介物或rHuIL-12处理的猕猴中随着时间的血球计数(平均数±SEM)。
A)血小板;B)平均血小板体积;C)中性粒细胞;D)淋巴细胞;E)网状细胞。正常范围如下:淋巴细胞,1.85至8.71×109个/L;中性粒细胞,1.21至10.29×109个/L;血小板,252至612×109个/L;平均血小板体积,6.3至9.4×109个/L;网状细胞,29.9至103.9×109个/L。
图9.骨髓再生岛的鉴定。
(A)再生骨髓的组织病理学鉴定。在另外清除的骨髓中出现的细胞群集被记为一个再生岛。左图组,清除的骨髓;中图组,再生骨髓;右图组,未照射的骨髓。(Olympus BX41复显微镜;Infinity Analyze软件v5.0,放大倍数:10×)。(B)个体处理组(左图组,对于500ng/kg组对对照,p<0.01)和组合的rHUIL-12-处理的组对媒介物-处理的对照(右图组,p<0.05)的再生岛的数目的定量。(C)个体处理组(左图组,对于50和500ng/kg组对对照,p<0.05)和组合的rHUIL-12-处理的组对媒介物-处理的对照(右图组,p<0.05)的再生区域的定量。(D)个体处理组(左图组)和组合的rHUIL-12-处理的组对媒介物-处理的对照(右图组)的巨核细胞的定量。
图10.rMuIL-12在致死照射的小鼠中与BMT一样有效地增加百分比存活。使用媒介物、rMuIL-12×1(在TBI前24小时施用10ng)、rMuIL-12×2(在TBI前24小时和TBI后3天施用10ng)、或BMT(在TBI后2小时施用1.1×106个细胞)静脉内处理小鼠。通过Mantel-Cox检验统计学地比较每个组的存活曲线。
图11.使用rMuIL-12和BMT处理的致死照射的小鼠中的血细胞恢复是可比较的。使用rMuIL-12×1(在TBI前24小时施用10ng)、rMuIL-12×2(在TBI前24小时和TBI后3天施用10ng)、或在TBI后2小时施用的BMT(1.1×106个细胞)处理小鼠。在第21、28和35天测定A)中性粒细胞;B)RBC;C)血小板的血球计数。使用学生t检验进行统计学分析。图组A、B和C中的虚线指示小鼠中的正常水平。误差线代表平均值±标准偏差。
图12.人骨髓CD34+细胞表达IL-12Rβ2。A)人CD34+细胞标记有抗IL-12Rβ2的抗体并且使用免疫细胞化学进行分析,分析在Olympus BX41复显微镜,×200(20×物镜和10×目镜)上进行;B)通过流式细胞术分析人骨髓CD34+细胞上的IL-12Rβ2表达(显示了点阵图)。包括每种抗体的同种型匹配的对照。显示了三种独立分析的一个代表性图像。
图13.IL-12Rβ2与其它干细胞标志物在来自正常的人骨髓的CD34+细胞上共表达。CD34+细胞共标记有抗IL-12Rβ2抗体和指示的干细胞标志物并且通过流式细胞术进行分析。A)CD117(ckit);B)CD135(Flt3);C)CD133;D)CD318(CDCP1)。对于每组结果,左图组显示了同种型对照。显示了三种独立分析的一个代表性图像。
具体实施方式
提供了用于移植——包括造血干细胞移植(HSCT)——之后的造血恢复的方法和组合物。造血干细胞移植(HSCT)包括移植源自骨髓、外周血干细胞或脐带血的多能造血干细胞。如本文使用的,HSCT清髓性方法可以包括使用辐射、化学疗法和/或辐射与化学疗法。方法和组合物可以对非清髓性方法比如小移植或降低强度调理有用。
本公开内容的方面和实施方式提供了治疗性组合物和其使用方法,所述治疗性组合物包含包括重组人白介素-12(IL-12)制剂的IL-12,其用于移植——包括造血干细胞移植(HSCT)——之后的造血恢复。
作为示例性组合物和/或方法,重组人白介素-12(rHuIL-12)和其小鼠同系物IL-12(rMuIL-12)显示了具有使用在全身照射(TBI)之前或之后施用的单一的低剂量重建骨髓的显著的能力。这些新的、令人惊讶的和出乎意料的发现提供了如下证据:rHuIL-12直接作用于在HSC和隔细胞上表达的IL-12受体以刺激血细胞生成。另外的临床研究确认了使用rHuIL-12作为造血细胞移植的辅助物用于增强HSC移入和移植之后的骨髓恢复的功效。
本公开内容还涉及可以改进HSCT之后的造血恢复的方法和治疗剂。举例而言,可以在HSCT前施用一种或多种有效剂量的IL-12。在其它实例中,在HSCT之前和之后给予一种或多种有效剂量的IL-12。在另一个实例中,在HSCT后给予一种或多种有效剂量的IL-12。
此外,本公开内容涉及在对象暴露于电离辐射之后保护对象免于系统、器官、组织或细胞损伤的方法,其包括:在骨髓清除和未骨髓清除之后给对象施用一个剂量的治疗有效量的药物组合物,其包含基本上分离的IL-12。清髓性方法可以包括,例如,辐射、化学疗法和/或辐射与化学疗法。示例性非清髓性方法可以包括,例如,小移植或降低强度调理。
本公开内容还涉及清髓性辐射,其可以例如作为全身照射,或通过照射身体的一部分被接受。辐射还可以以两个或更多个部分作为分次剂量被接受。在另一个实施方式中,辐射作为超分割疗法中的分次剂量被接受。在另一个方面,辐射作为加速分割疗法中的分次剂量被接受。
在一个方面,IL-12的有效剂量以100至300ng/Kg的一种或多种剂量被给予。
在一个方面,一种或多种有效剂量的IL-12被外用地、皮下地、皮内地、静脉内地、腹腔内地、肌肉内地、硬膜外地、肠胃外地、鼻内地、和/或颅内地施用。
本发明还涉及用于体内比较重组IL-12和骨髓细胞移植(BMCT)在照射的对象中的促血细胞生成活性,以及展现rHuIL-12的潜在的细胞靶标和IL-12受体在人血细胞生成中的体外作用的方法。
本发明还涉及给致死照射的小鼠至少一次施用低剂量(10ng/小鼠)rMuIL-12与BMCT一样有效地增加存活和外周血细胞恢复。在一个实施方式中,在辐射之后第12天,使用rMuIL-12处理的小鼠的鼠骨髓表征为存在表达IL-12受体β2亚基(IL-12Rβ2)的髓样祖细胞、巨核细胞和成骨细胞。
本发明还涉及施用rMuIL-12以增加小鼠骨髓Lin-细胞中表达IL-12Rβ2的细胞的数目。在一个实施方式中,人骨髓细胞的分析指示多能Lin-细胞和CD34+细胞也表达IL-12Rβ2连同造血干细胞(HSC)的其它标志物。
本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方式,其包括但不限于在此发明内容中陈述或描述或引用的那些。它不意欲是包括一切的,并且本文描述和要求保护的发明不限于在此发明内容中确定的特征或实施方式或被其限制,其出于仅说明而非限制的目的被包括。可以在下面的具体实施方式中公开另外的实施方式。
如本文使用的,IL-12是熟知其在免疫中的作用的异二聚体细胞因子,其包括p40和p35亚基二者。在跨越大约二十年的众多报道中,IL-12已经显示通过调节炎性反应、对感染的先天性抵抗力、和获得性免疫在免疫的先天性和获得性武器(arm)之间的相互作用中具有重要作用。内源性IL-12对抵抗许多病原体以及可移植的和化学诱导的肿瘤是必需的。IL-12在免疫中的标志性作用是其刺激从自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)的能力。进一步,九十年代早中期的几个体外研究报道了IL-12能够与其它细胞因子协同地刺激血细胞生成。由于这些研究使用高度纯化的祖细胞或甚至单细胞,IL-12的促血细胞生成活性似乎是由于对骨髓干细胞的直接作用。IFN-γ在IL-12的造血活性中的作用不清楚,这是由于几个研究将血细胞生成的促进和阻抑二者与IFN-γ关联。
当在暴露于全身辐射之前或之后不久使用时,白介素-12(IL-12)显示具有放射防护功能(Neta等(1994)IL-12protects bone marrow from and sensitizes intestinaltract to ionizing radiation.J Immunol 153:4230-4237;Chen等,(2007)IL-12facilitates both the recovery of endogenous hematopoiesis and theengraftment of stem cells after ionizing radiation,Exp Hematol 35:203-213;此外,US20110206635和US7939058的整个公开内容通过引用并入本文)。在研究中,从致死的全身辐射的有害效应救护小鼠。放射防护效应被报道停留在骨髓中的未知细胞群中,很可能是长期种群恢复造血干细胞。在另一个研究中,IL-12显示在荷瘤小鼠的亚致死的辐射之后提供外周血细胞计数的早期恢复(Basile等(2008)Multilineage hematopoiesisrecovery with concomitant antitumor effects using low dose Interleukin-12inmyelosuppressed tumor-bearing mice.J Transl Med 6:26)。在此后面的研究中,已经显示IL-12在减小肿瘤体积中与辐射协同作用。具体而言,当在辐射暴露之前或之后施用时,IL-12不增加肿瘤体积。
因而,IL-12在全身辐射之后的骨髓的放射防护中具有潜力。然而,早期研究报道了虽然IL-12在骨髓中具有放射防护效应,但是胃肠(GI)系统对辐射损伤敏感(Neta等)。在后面的报道中,IL-12的GI敏感效应被发现依赖于施用的IL-12的剂量(Chen等)。不存在IL-12对除骨髓之外的其它组织或器官的放射防护效应的报道。
本发明基于如下令人惊讶和出乎意料的发现:某些鼠重组IL-12(例如m-HemaMax)和人重组IL-12(例如HemaMax)具有在对象中改进HSCT移植之后的造血恢复的能力。
造血干细胞移植(HSCT)是复原已经被高剂量的化学疗法和/或放射疗法破坏的干细胞的程序。经历用于干细胞移植的全身照射(TBI)的患者具有延长的低计数的血小板的期间。这些低血小板计数引起出血和感染。因此迄今为止,没有药物对用于加速血小板的恢复有效,并且因此输血通常是必需的。
可以通过HSCT治疗的疾病、障碍和/或病症可以包括,例如,多发性骨髓瘤;非何杰金淋巴瘤(NHL);何杰金淋巴瘤;急性髓性白血病;成神经细胞瘤;生殖细胞肿瘤;自身免疫性障碍;淀粉样变性病。
自体HSCT:急性髓性白血病;急性成淋巴细胞性白血病;慢性髓细胞性白血病;慢性淋巴细胞性白血病;骨髓增生障碍;骨髓增生异常综合征;多发性骨髓瘤;非何杰金淋巴瘤;何杰金病;再生障碍性贫血。
同种异体HSCT:纯红细胞再生障碍;阵发性睡眠性血红蛋白尿;范康尼贫血;重型地中海贫血;镰状细胞贫血;严重联合免疫缺陷症(SCID);威斯科特-奥尔德里奇综合征;噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH);先天代谢病。
在某些实施方式中,针对先前认为不适于常规BMT的患者特别研发的BMT程序是降低强度调理(“RIC”)。RIC移植的概念是:为了使患者接受供体的干细胞,高剂量疗法可以不是必需的。这避免了高剂量疗法,使得程序在较大年龄或具有已存在的健康问题的患者中更安全。相反,患者接受相对小毒性的调理疗法。取决于降低程度,调理疗法有时在门诊部给予,而不是将患者接纳至住院部。降低强度调理被设计为充分地阻抑患者的免疫系统,使得其将接受供体干细胞。
在一个方面,骨髓被全身照射或高剂量化学疗法和全身照射的组合完全破坏。这样的极端的治疗的目的是清除可能停留在骨髓中的所有患病细胞(例如白血病细胞或源自实体瘤的转移的肿瘤细胞)。该程序接着是骨髓干细胞/祖细胞的移植。
在一个方面,用于使空的骨腔种群恢复的成人干细胞/祖细胞可以从骨髓(例如,来自后髂嵴),或从外周血直接获得。在后一情况下,供体(例如患者他本人/她本人或近亲)可以使用G-CSF和/或GM-CSF进行预处理以调动骨髓细胞和增强外周血祖细胞的产生。干细胞/祖细胞群可以通过多种方法被富集,例如通过使用磁激活(magnetic-activated)细胞分选以移除单核细胞或T-淋巴细胞,或Ficoll-Hypaque密度梯度离心。在移植之前,干细胞/祖细胞通常储存在液氮的气相中的含有5-20%二甲基亚砜的培养基比如Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove’s modified Dulbecco medium)中。可以使用本领域熟知的用于分离、富集和储存干细胞/祖细胞的任何标准化程序。
前沿的造血支持性护理疗法(EPO)已经响应于其对肿瘤生长的作用收到黑框警告。HemaMax对造血干细胞的作用的直接机制可以与其它熟知的造血生长因子,比如EPO(品牌为Procrit、Aranesp、和Epogen),和G-CSF(品牌为Neulasta和Neupogen),以及TPO模拟物(品牌为Nplate和Promacta)和IL-11(品牌为Neumega)形成对比。EPO样分子在产生红细胞增加的红细胞前体细胞的水平下作用。G-CSF样分子在产生中性粒细胞增加的中性粒细胞前体细胞的水平下作用。TPO模拟物和IL-11在导致血小板增加的巨核细胞的水平下作用。这些造血生长因子的靶细胞群均在造血干细胞的下游,其是HemaMax的靶细胞。
HemaMax和熟知的造血生长因子的作用机制之间没有重叠。HemaMax的作用机制涉及在其它造血因子的活性的上游活化造血干细胞。结果,HemaMax可以在清除之后补充并再生造血和免疫系统,然而这些下游作用因子不能,这是因为它们靶向前体细胞以产生单一的血细胞类型。经由此早期作用(上游)机制,原始造血干细胞的HemaMax的活化可以复原所有主要的血细胞类型。在临床前研究中,考虑到其免疫疗法作用机制,HemaMax具有抗肿瘤效应(INF-γ增加和T细胞与NK细胞的上调)。
HemaMax的鼠对应体(rMuIL-12)促进暴露于亚致死的或致死的全身照射(TBI)的正常和荷瘤小鼠二者中的全谱系(full-lineage)血细胞恢复,其包括白细胞和红细胞和血小板。HemaMax的活性在停留在骨髓腔室(compartment)中的原始细胞(造血和非造血干细胞)的水平下起始。这些原始细胞的活化在由辐射或化学疗法引起的骨髓清除或骨髓抑制之后导致骨髓腔室的再生。
HemaMax在HSCT之前干细胞移植前/后重新定义当前的方法,并且作为HSCT之后的辅助的造血干细胞(HSC)移入增强剂具有独特的作用。HSCT最常用于白血病和淋巴瘤(以及成神经细胞瘤和多发性骨髓瘤)的治疗并且当处于缓解期时是最有效的。HemaMax可以通过刺激早期造血干细胞的更新和分化复原被化学疗法的治疗破坏的干细胞/骨髓(在移植之前使HSC调动并且帮助移植之后的HSC移入)。
出于当前的公开内容的目的,下列定义应当以其全部用于限定技术术语和限定在权利要求中寻求对其保护的物质组合物的范围。
如本文使用的,“对象”指的是为处理、观察或实验的目标的动物。“动物”包括冷血和热血脊椎动物和无脊椎动物比如鱼、有壳的水生动物、爬行动物,并且具体而言,哺乳动物。“哺乳动物”非限制性地包括小鼠;大鼠;兔;豚鼠;狗;猫;绵羊;山羊;牛;马;灵长类,比如猴、黑猩猩、猿,以及出生前的、儿童的、和成年的人。
如本文使用的,“预防”或“防护”意思是完全地或部分地预防,或减轻或控制。
如本文使用的,术语“治疗”指的是治疗性处理和预防性或防护性措施二者,或施用疑似具有治疗潜力的药剂。
如本文使用的,术语“药学上有效量”意思是在组织、系统、动物或人中引发生物或药物反应——其被研究者、兽医、医师或其它临床医生所寻求——的活性化合物或药剂的量,其包括缓解或减轻正在被治疗的疾病的症状。
如本文使用的,关于本公开内容的药物组合物的“有效量”指的是足以具有实用性和提供期望的治疗终点的量。
如本文使用的,全身照射(TBI)之后的辐射诱导的损伤可以影响与下列相关联的器官、组织、系统:骨髓、淋巴系统、免疫系统、粘膜组织、粘膜免疫系统、胃肠系统、心血管系统、神经系统、生殖器官、前列腺、卵巢、肺、肾、皮肤和脑。
如本文使用的,辐射暴露可以与辐射诱导的急性、慢性、和全身性损伤效应相关联。在一个方面,本公开内容提供了治疗组合物和其用于治疗辐射诱导的急性损伤效应的使用方法。示例性损伤效应不总是限于照射光束中的正常组织。示例性损伤效应可以延伸到治疗区域之外并且可以包括,例如,食管炎(吞咽困难);肺中的肺炎(咳嗽、发热、肺积液);肠照射诱导的炎症(腹泻、痉挛、腹痛);恶心和呕吐;疲劳、疲乏、腹泻、头痛、组织肿胀、皮肤红斑、咳嗽、和呼吸困难。示例性损伤效应可以影响皮肤,例如红斑、脱皮;口腔粘膜,例如粘膜炎;鼻咽;口咽;声带;扁桃体;皮肤(鳞状的或癌)的区域。在某些实施方式中,示例性效应可以包括毛细血管扩张、纤维化、脊髓炎、和软骨纤维化。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的损伤效应还可以包括造血器官(骨髓)综合征,其表征为对在最快的速度下分裂的细胞(比如骨髓,脾和淋巴组织)的损伤。示例性症状包括内出血、疲乏、细菌感染、和发热。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的损伤效应还可以包括胃肠道综合征,其表征为对较不快速分裂的细胞(比如胃和肠的衬细胞(lining))的损伤。示例性症状包括恶心、呕吐、腹泻、脱水、电解质失衡、消化能力丧失、出血性溃疡、和造血器官综合征的症状。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的损伤效应还可以包括粘膜炎。在一个实施方式中,辐射诱导的粘膜炎是口腔粘膜炎。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的效应还可以包括中枢神经系统综合征,其表征为对不生殖的细胞比如神经细胞的损伤。示例性症状包括协调障碍、混乱、昏迷、惊厥、休克、和造血器官和胃肠道综合征的症状。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的损伤效应还可以包括由于出生前的辐射暴露造成的对胎儿的影响。胚胎/胎儿对辐射尤其敏感,(胚胎/胎儿细胞正在快速地分裂),特别是在妊娠的前20周中。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的效应还可以包括由于电离照射诱导的活性氧类别(ROS)——包括来自电离照射与氧和水的相互作用的超氧化物、羟基、氧化氮和过氧亚硝酸盐——的产生造成的损伤。
在一个方面,本公开内容提供了治疗组合物和其用于治疗辐射诱导的慢性损伤效应的使用方法。慢性照射效应在所有患者中是至关重要的,但是特别是在接受全身照射(TBI)的那些中。全身照射用于一些癌症疗法,特别是需要骨髓移植的患者。
示例性辐射诱导的慢性损伤效应可以包括,例如,早老症比如须发灰白、皮肤变薄和干燥、形成白内障、早期心肌纤维化、心肌梗死、神经变性、骨量减少/骨软化和神经认知缺陷共有的特征。
在某些实施方式中,示例性辐射诱导的效应还可以包括纤维化(将正常组织替换为瘢痕组织,其导致受影响区域的受限制的移动);对内脏的损伤,其引起腹泻和出血;失忆;不孕和/或致癌作用/白血病生成。
在某些实施方式中,本公开内容的方法和组合物对改进干细胞移植之后的血细胞生成有用。示例性清髓性递送方式/方案可以包括,例如,常规分割疗法、超分割、低分割(hypofractionation)、和加速分割。
在一个实施方式中,治疗方式/方案是超分割疗法。在超分割中,目标是递送较高的肿瘤剂量,同时维持临床上可接受的长期组织损伤的水平。日剂量不变或轻微增加,同时每个分割的剂量减小,并且总体治疗时间保持恒定。
在一个实施方式中,治疗方式/方案是加速分割疗法。在加速分割疗法中,每个分割的剂量不变,同时日剂量增加,并且治疗的总时间减少。
在一个实施方式中,治疗方式/方案是连续超分割加速放射疗法(CHART)。在(CHART)疗法中,在缩短的期间内施用多个日分割的强烈治疗方案。
在一个实施方式中,治疗方式/方案是IMRT。
与化学疗法联合
许多化学治疗剂可以增强放射疗法的作用。在一个方面,本公开内容的方面和实施方式可以被用作与现有的化学治疗方式的联合疗法。联合(连续或同步)疗法可以是共施用或共配制。
“白介素-12(IL-12)”指的是现在已知的或未来研发的,以现在本领域已知的或未来研发的任何方式生产的IL-12分子,其产生本文公开的造血性质中的至少一种,其包括天然IL-12分子、变体IL-12分子和共价修饰的IL-12分子。
IL-12分子可以以基本上分离的形式存在。将理解产品可以与将不干扰该产品的预期目的的载体或稀释剂混合,并且仍被视为是基本上分离的。本发明的产品还可以处于基本上纯化的形式,在该情况下它将通常包含大约80%、85%或90%——包括,例如,至少大约95%、至少大约98%或至少大约99%——的肽或制剂的干质量。
通常,用于本发明的实施方式的IL-12分子的氨基酸序列源自通过本发明的方法处理的特定的哺乳动物。因而,为了说明起见,对于人,通常人IL-12或重组人IL-12将被施用至本发明的方法中的人,并且类似地,对于猫,例如,猫IL-12或重组猫IL-12将被施用至本发明的方法中的猫。
然而,本发明还包括某些实施方式,其中IL-12分子不从为本发明的治疗方法的对象的哺乳动物得到其氨基酸序列。为了说明起见,人IL-12或重组人IL-12可以用于猫哺乳动物。本发明的还其它实施方式包括如下IL-12分子:其中IL-12的天然氨基酸序列由天然序列改变,但是IL-12分子起作用以产生本文公开的IL-12的造血性质。来自IL-12的天然的、物种特异性氨基酸序列的改变包括IL-12的一级序列的变化,并且涵盖对一级氨基酸序列的缺失和添加以产生变体IL-12分子。高度衍生化的IL-12分子的实例是由Maxygen,Inc.(Leong S R等,Proc Nati Acad Sci USA.2003Feb.4;100(3):1163-8.)生产的重新设计的IL-12分子,其中变体IL-12分子通过DNA改组方法产生。还包括修饰的IL-12分子,其也包括在本发明的方法中,比如以在美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中陈述的方式对IL-12分子进行共价修饰,其增加它的保存期限、半衰期、效能、溶解度、递送等,添加聚乙二醇基团、聚丙二醇基团等。通过使IL-12多肽的靶向的氨基酸残基与有机衍生剂——其能够与IL-12多肽的选择的侧链或N-或C-端残基反应——反应,IL-12分子的一种类型的共价修饰被引入分子。IL-12的天然序列和IL-12的氨基酸序列变体二者可以被共价修饰。同样如本文提及的,IL-12分子可以通过本领域已知的多种方法产生,包括重组方法。本公开内容中包括的其它IL-12变体是正规序列被翻译后修饰,例如,糖基化的那些。在某些实施方式中,IL-12在哺乳动物表达系统或细胞系中表达。在一个实施方式中,IL-12通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达产生。
由于通常难以提前预测变体IL-12多肽的特性,将领会将需要回收的变体的一些筛选以选择最佳的变体。评估变体IL-12分子的血液学刺激或增强性质的变化的优选的方法是经由下面公开的致死照射救护方案。通过本领域熟知的方法测定蛋白质或多肽性质——比如氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白质降解的易感性、或与载体聚集或聚集为多聚体的趋势——的其它潜在的修饰。
对于涉及IL-12的一般描述,参见美国专利号5,573,764、5,648,072、5,648,467、5,744,132、5,756,085、5,853,714和6,683,046。白介素-12(IL-12)是通常描述为促炎细胞因子的异二聚体细胞因子,其调节参与免疫反应的细胞的活性(Fitz K M等,1989,J.Exp.Med.170:827-45)。通常,IL-12刺激干扰素-γ(INF-γ)从自然杀伤(NK)细胞和T细胞的产生(Lertmemongkolchai G,Cai等,2001,Journal of Immunology.166:1097-105;Cui J,Shin T等,1997,Science.278:1623-6;Ohteki T,Fukao T等.,1999,J.Exp.Med.189:1981-6;Airoldi I,Gri G等,2000,Journal of Immunology.165:6880-8),有利于T辅助细胞1(TH1)的分化(Hsieh C S等,1993,Science.260:547-9;Manetti R等,1993,J.Exp.Med.177:1199-1204),和在先天性抵抗力和获得性免疫之间形成联系。IL-12也已经显示经由其免疫调节和抗血管生成效应抑制癌症生长(Brunda M J等,1993,J.Exp.Med.178:1223-1230;Noguchi Y等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:11798-11801;Giordano P N等,2001,J.Exp.Med.194:1195-1206;Colombo M P等,2002,CytokineGrowth Factor rev.13:155-168;Yao L等,2000,Blood96:1900-1905)。一旦它们通过遭遇病原细菌、真菌或细胞内寄生虫而被活化,IL-12主要由树突细胞(DC)和吞噬细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)产生(Reis C等,1997,J.Exp.Med.186:1819-1829;Gazzinelli R T等,1994,J.Immunol.153:2533-2543;Dalod M等,2002,J.Exp.Med.195:517-528)。IL-12受体(IL-12R)主要由活化的T细胞和NK细胞表达(Presky D H等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:14002-14007;Wu C Y等,1996,Eur J.Immunol.26:345-50)。
通常,IL-12的产生刺激INF-γ的产生,其又增强IL-12的产生,因而形成正反馈环。在体外系统中,已经报道了IL-12可以与其它细胞因子(例如,IL-3和SCF)协同以刺激早期造血祖细胞的增殖和分化(Jacobsen S E等,1993,J.Exp Med 2:413-8;Ploemacher R E等,1993,Leukemia 7:1381-8;Hirao A等,1995,Stem Cells 13:47-53)。
IL-12的体内施用被观察到降低外周血细胞计数和骨髓血细胞生成(Robertson MJ等,1999,Clinical Cancer Research 5:9-16;Lenzi R等,2002,Clinical CancerResearch 8:3686-95;Ryffel B.1997,Clin Immunol Immunopathol.83:18-20;Car B D等,1999,The Toxicol Pathol.27:58-63)。使用INF-γ受体敲除小鼠,Eng等和Car等展现了高剂量IL-12不诱导常见的毒性效应,即,不存在血细胞生成的抑制(Eng V M等,1995,J.Exp Med.181:1893-8;Car B D等,1995,American Journal of Pathology 147:1693-707)。此观察表明IL-12促进分化的造血细胞的增强的一般现象,如先前报道的,可以通过INF-γ的产生被体内平衡,其以显性的骨髓抑制方式作用。
当前的证据表明示例性IL-12制剂重组人IL-12(例如,HemaMax)在体内引发至少4种水平下的反应(参见图14)。在第1水平反应下,HemaMax促进现存的放射敏感性免疫细胞——即NK细胞、巨噬细胞、和树突细胞——的增殖和活化。HemaMax诱导的IL-15和IL-18的血浆上升还促进NK细胞的成熟,其导致IFN-γ的释放,它又积极地影响内源性IL-12从巨噬细胞和树突细胞和可能从NK细胞的产生。这些事件在HemaMax施用之后马上增强先天性免疫能力。在第2水平反应下,HemaMax促进存活的造血干细胞、成骨细胞、和巨核细胞增殖和分化为确保最佳的血细胞生成的特定的细胞构型。HemaMax诱导的EPO从CD34+、IL-12Rβ2-阳性骨髓细胞的分泌还可以阻抑IFN-γ在骨髓中的局部过量产生,并且因而提供促进造血细胞的表达的环境。骨髓中的造血再生增强先天性和获得性免疫能力二者。在第3水平反应下,HemaMax保护GI干细胞,其导致病原体泄露的减少、食物消耗的增加、和腹泻的减少。在第4水平反应下,HemaMax可能直接增加EPO——一种细胞保护因子——的肾释放,其增强不同组的器官/组织中的细胞生存力。主要从通过病原体和/或EPO活化的树突细胞持续产生内源性IL-12充当正反馈环,并且在维持对外源性HemaMax的初始反应中发挥关键作用,可能在辐射后持续数周。
IL-12的施用方法
本公开内容提供了通过给对象施用一种或多种有效剂量的IL-12持续一段时间以实现期望的治疗效果的治疗方法。对象优选地是哺乳动物,包括但不限于动物比如牛、猪、马、鸡、猫、狗等,并且最优选地是人。
多种递送系统是已知的并且可以用于根据本发明的方法施用IL-12,例如,封装在能够表达IL-12的脂质体、微粒、微胶囊、重组细胞中,受体介导的内吞作用(参见,例如,Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432),构建包含作为逆转录病毒载体或其它载体的一部分的IL-12的基因的核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服途径。
IL-12可以通过任何便利的途径施用,例如通过输注或快速浓注,通过穿过上皮或粘膜皮肤衬细胞(例如,口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收,并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。此外,可以期望的是,通过任何合适的途径将包含IL-12的药物组合物引入中枢神经系统,其包括脑室内和鞘内注射;脑室内注射可以通过脑室内导管——例如,其附连至贮囊(reservoir),比如Ommaya贮囊——被促进。也可以采用肺部施用,例如,通过使用吸入器或雾化器,和具有雾化剂的制剂。可以期望的是,局部地施用包含IL-12的药物组合物至需要治疗的区域;这可以例如和不被限制地通过外部施加、通过输注、借助导管、借助栓剂、或借助植入物实现,所述植入物具有多孔的、非多孔的、或凝胶状的材料,其包括膜,比如硅橡胶膜(sialastic membrane),或纤维。
其它IL-12施用模式涉及以囊泡递送,具体而言是脂质体(参见Langer,Science249:1527-1533(1990);Treat等,in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,New York,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,同上,pp.317-327;通常参见同上)。
IL-12的还其它施用模式涉及以控释系统递送。在某些实施方式中,可以使用泵(参见Langer,同上;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald等,Surgery 88:507(1980);Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。可以另外地使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),CRCPres,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,N.Y.(1984);Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);还参见Levy等,Science 228:190(1985);During等,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等,J.Neurosurg.71:105(1989)),或控释系统可以靠近治疗靶标——即,脑——放置,因而仅需要全身剂量的一部分(参见,例如,Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,同上,vol.2,pp.115-138(1984))。在Langer的综述(Science 249:1527-1533(1990))中讨论了其它控释系统。
IL-12的形式和剂量
用于本发明的实施方式的IL-12的合适的剂型涵盖生理学上可接受的载体,其内在地是非毒性和非治疗性的。这样的载体的实例包括离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白比如人血清蛋白,缓冲物质比如磷酸盐,甘氨酸,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物,水,盐,或电解质比如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质和PEG。用于外用形式或基于凝胶的形式的IL-12多肽的载体包括多糖比如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,聚丙烯酸酯,聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物,PEG,和木蜡醇(woodwax alcohol)。对于所有施用,常规的长效形式被适当地使用。这样的形式包括,例如,微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入形式、鼻喷雾、舌下片剂、和缓释制剂。
缓释制剂的合适的实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质是成型制品的形式,例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、如由Langer等,同上和Langer,同上描述的水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和.γ.乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等,同上)、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等,同上)、降解性乳酸-乙醇酸共聚物比如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)、和聚-D-(–)-3-羟丁酸。虽然聚合物比如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子持续超过100天,但是某些水溶胶释放蛋白质持续较短的时期。当封装的IL-12多肽保留在体内持续长时间时,它们可能由于在37℃下暴露于湿度而变性或聚集,其导致生物活性损失和免疫原性的可能的变化。可以取决于涉及的机制出于稳定性设计合理的策略。例如,如果聚集机制被发现是通过硫-二硫化物互换(thio-disulfide interchange)的分子间S—S键形成,可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂、和研发特异性聚合物基质组合物实现稳定性。
含有IL-12的缓释组合物还包括脂质体包埋的多肽。含有IL-12多肽的脂质体通过本领域已知的方法制备,比如在Eppstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。通常,脂质体是小的(大于200-800埃)单层类型,其中脂质含量大于大约30摩尔%胆固醇,选择的比例被调节用于最佳的Wnt多肽疗法。在美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
对于疾病的治疗,IL-12多肽的适当的剂量将取决于如上面限定的待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和过程、先前的疗法、患者的临床历史和对本文公开的IL-12治疗方法的反应、和主治医师的裁量。根据本发明,IL-12适于一次或在系列治疗内施用至患者。
取决于疾病的类型和严重性,大约10ng/kg至2000ng/kg的IL-12是用于施用至患者的初始候选剂量,无论例如通过一种或多种单独的施用或通过连续输注。人可以安全地耐受大约500ng/kg的重复剂量,但是高至大约200ng/kg的单剂量应当不产生毒性副作用。例如,剂量可以与其它细胞因子比如G-CSF、GM-CSF和EPO相同。对于在数天或更长时间内的重复施用,取决于状况,治疗被持续直到发生疾病症状的期望的阻抑。然而,其它剂量方案可以是有用的。此疗法的进展通过常规的技术和测定容易被监测。
IL-12可以通过直接的共施用或连续施用连同其它细胞因子被施用。当一种或多种细胞因子与IL-12一起被共施用时,可以采用较少剂量的IL-12。合适剂量的其它细胞因子,即除IL-12之外,是大约1μg/kg至大约15mg/kg的细胞因子。例如,剂量可以与其它细胞因子比如G-CSF、GM-CSF和EPO的相同。其它细胞因子(一种或多种)可以在施用IL-12之前、同时或之后被施用。细胞因子(一种或多种)和IL-12可以被组合以形成药物组合物,以便同时施用至哺乳动物。在某些实施方式中,IL-12和细胞因子的量是这样的,以便将IL-12和其它细胞因子施用至其之后,在哺乳动物中发生血细胞的协同种群恢复(或造血细胞的增殖和/或分化的协同增加)。换句话说,两种或更多种药剂(即IL-12和一种或多种细胞因子)关于血细胞的种群恢复(或造血细胞的增殖/分化)的协调作用大于这些分子的个体效应的总和。
通过使具有期望纯度的IL-12与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.,Ed.,(1980))混合,制备IL-12的治疗制剂以便以冻干的饼状物(lyophilized cake)或水溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体没有毒性,并且包括缓冲剂比如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸;抗氧化剂,其包括抗坏血酸;低分子量(小于大约10个残基)多肽;蛋白质,比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖、和其它碳水化合物,其包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂比如EDTA;糖醇比如甘露醇或山梨醇;成盐反离子比如钠;和/或非离子型表面活性剂比如PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
如本文使用的,术语“缓冲剂”表示药学上可接受的赋形剂,其使药物制剂的pH稳定。合适的缓冲剂是本领域熟知的并且可以在文献中发现。药学上可接受的缓冲剂包括但不限于组氨酸-缓冲剂、柠檬酸盐-缓冲剂、琥珀酸盐-缓冲剂、醋酸盐-缓冲剂、磷酸盐-缓冲剂、精氨酸-缓冲剂或其混合物。上面提及的缓冲剂通常以大约1mM至大约100mM、大约5mM至大约50mM和大约10-20mM的量使用。缓冲溶液的pH可以是至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5或至少6.0。缓冲溶液的pH可以小于7.5、小于7.0或小于6.5。缓冲溶液的pH可以是大约4.0至大约7.5、大约5.5至大约7.5、大约5.0至大约6.5、和大约5.5至大约6.5,其含有本领域已知的酸或碱,例如盐酸、醋酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾。如本文使用的,当描述pH时,“大约”意思是加或减0.2pH单位。
如本文使用的,术语“表面活性剂”可以包括药学上可接受的赋形剂,其用于保护蛋白制剂免受机械应力,如搅拌和剪切。药学上可接受的表面活性剂的实例包括聚氧乙烯失水山梨糖醇(polyoxyethylensorbitan)脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)、和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯比如聚山梨醇酯20(以商标Tween售卖)和聚山梨醇酯80(以商标Tween售卖)。合适的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是以名称F68或Poloxamer售卖的那些。合适的聚氧乙烯烷基醚是以商标售卖的那些。合适的聚氧乙烯烷基苯基醚以商标名Triton-X售卖。当使用聚山梨醇酯20(Tween)和聚山梨醇酯80(Tween时,它们通常以大约0.001至大约1%、大约0.005至大约0.2%和大约0.01%至大约0.1%w/v(重量/体积)的浓度范围使用。
如本文使用的,术语“稳定剂”可以包括药物可接受的赋形剂,其保护活性药物成分和/或制剂在制造、储存和应用期间免受化学和/或物理降解。Cleland等,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,70(4):307-77(1993);Wang,Int.J.Pharm.,7S5(2):129-88(1999);Wang,Int.J.Pharm.,203(1-2):1-60(2000);和Chi等,Pharm.Res.,20(9):1325-36(2003)回顾了蛋白质药物的化学和物理降解途径。稳定剂包括但不限于糖,氨基酸,多元醇,环糊精,例如羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精,聚乙二醇,例如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000,清蛋白(albumine),人血清白蛋白(HSA),牛血清白蛋白(BSA),盐,例如氯化钠、氯化镁、氯化钙,螯合剂,例如后面限定的EDTA。如上面提及的,稳定剂可以以大约10至大约500mM的量、大约10至大约300mM的量、或大约100mM至大约300mM的量在制剂中存在。在一些实施方式中,示例性IL-12可以溶解在它在其中稳定的适当的药物制剂中。
IL-12还可以被包埋在微胶囊中,例如,所述微胶囊通过凝聚技术或通过界面聚合(例如,分别地,羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳剂中制备。在Remington’s Pharmaceutical Sciences,同上中公开了这样的技术。
用于体内施用的IL-12必须是无菌的。这通过在冻干和重构之前或之后过滤通过无菌的过滤膜容易地实现。IL-12通常将以冻干形式或以溶液存储。治疗性IL-12组合物通常被放置入具有无菌进入口的容器,例如,具有可通过皮下注射针刺破的塞子的输液袋或瓶。
当外用施加时,IL-12适当地与其它成分比如载体和/或佐剂结合。对这样的其它成分的性质没有限制,只是它们必需是生理学可接受的并且对它们的预期施用有效,并且不能使组合物的活性成分的活性降级。合适的媒介物的实例包括具有或不具有纯化的胶原的软膏、霜剂、凝胶或悬浮液。组合物还可以被浸渍入经皮贴片、膏药和绷带,优选地以液体或半液体形式。
为了获得凝胶制剂,在液体组合物中配制的IL-12可以与有效量的水溶性多糖或合成聚合物比如PEG混合以形成外用施加的适当粘度的凝胶。可以使用的多糖包括,例如,纤维素衍生物比如醚化纤维素衍生物,其包括烷基纤维素、羟烷基纤维素和烷基羟烷基纤维素,例如,甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素;淀粉和分级淀粉(fractionated starch);琼脂;海藻酸和海藻酸盐;阿拉伯树胶(gumarable);支链淀粉(pullullan);琼脂糖;卡拉胶;右旋糖酐;糊精;果聚糖;菊粉;甘露聚糖;木聚糖;阿拉伯聚糖;壳聚糖;碳原;葡聚糖;和合成生物聚合物;以及树胶比如黄原胶;瓜尔胶;槐树豆胶;阿拉伯树胶;黄蓍胶;和梧桐胶;和其衍生物与混合物。本文优选的胶凝剂是如下的一种:其对生物系统是惰性的、无毒的、易于制备、和不过于粘软的或粘性的,并且将不使其内保持的IL-12分子不稳定。
优选地,多糖是醚化纤维素衍生物,更优选地,良好限定的、纯化的、和在USP中列举的一种,例如,甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物,比如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。本文最优选的是甲基纤维素。
对凝胶化有用的聚乙二醇通常是低和高分子量PEG的混合物以获得适当的粘度。例如,当以适当的比率混合以获得糊剂时,分子量400-600的PEG与分子量1500的PEG的混合物将对此目的是有效的。
如应用至多糖和PEG的术语“水溶性”意思是包括胶体溶液和分散液。一般而言,纤维素衍生物的溶解度由醚基团的取代程度确定,并且本文有用的稳定衍生物应当在纤维素链中具有每个葡糖酐单元足够数量的这样的醚基团,以致使衍生物是水溶性的。每个葡糖酐单元至少0.35个醚基团的醚取代程度通常是足够的。此外,纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式,例如,Li、Na、K或Cs盐。
如果在凝胶中采用甲基纤维素,则优选地,它占凝胶的大约2-5%、更优选地大约3%,并且IL-12以每ml凝胶大约300-1000mg的量存在。
例如,治疗性地采用的IL-12的有效量将取决于治疗目标、施用途径、和患者的状况。因此,治疗师必需滴定剂量和根据需要修改施用途径以获得最佳治疗效果。通常,临床医生将施用IL-12,直到达到实现期望效果的剂量。全身治疗的典型剂量可以在大约10ng/kg至高至2000ng/kg或更多的范围内,这取决于上面提及的因素。在一些实施方式中,剂量范围可以是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至大约20;至大约30;至大约50;至大约100;至大约200;至大约300或至大约500ng/kg。在一个方面,剂量小于500ng/kg,在另一个方面,剂量小于300ng/kg。在另一个方面,剂量小于大约200ng/kg。在另一个方面,剂量小于大约100ng/kg。在另一个方面,剂量小于大约50ng/kg。在其它方面,剂量可以在大约10至300ng/kg、20至40ng/kg、25至35ng/kg、50至100ng/kg的范围内。
在一个方面,本文描述的示例性治疗组合物可以联合分割疗法被施用。在一个实施方式中,在每个分割前给予治疗有效剂量。在一个实施方式中,大约在施用每个分割的同时给予治疗有效剂量。在一个实施方式中,在每个分割前给予治疗有效剂量,其在每个分割前5、10、15、20、25、30、35、40、50或60分钟;或每个分割后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时;或每个分割前1、2、3、4、5、6、7天的范围内。在一个实施方式中,在每个分割后给予治疗有效剂量,其在每个分割后5、10、15、20、25、30、35、40、50或60分钟;或每个分割后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时;或每个分割后1、2、3、4、5、6、7天的范围内;或在辐射治疗期间或之后每周、每两周或每两个月一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次。在另一个实施方式中,在使用每种各自的辐射源作为TBI或局部地施用的1至10个剂量/天持续多至30天的分割方案中,在每个辐射剂量之前和之后大约5、10、15、20、30、40、50、60min,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时,1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天处施用一种或多种示例性剂量的IL-12(1至100ng/kg)。
作为可选的总体构想,IL-12受体被配制和以如下剂量递送至靶位点或组织:能够在组织中建立大于大约0.1ng/cc高至有效但不过分毒性的最大剂量的IL-12水平。如果可能的话,此组织内浓度应当通过施用方案被维持,包括通过以经验确定的频率下的连续输注、缓释、外用应用或注射。通过常规的测定监测此疗法的进展。
“在治疗的施用时间附近”指的是在施用治疗之前和/或之后的任何合理的时期——比如大约一个月、大约三个月、大约两周、大约一周、数天、大约120小时、大约96小时、大约72小时、大约48小时、大约24小时、大约20小时、数小时、大约一小时或数分钟——处施用IL-12。在治疗的施用时间附近还可以指的是同时或近似同时施用治疗和IL-12,即,在数分钟至一天内。
“化学疗法”指的是包括医学领域中现在已知或将要研发的天然或合成药剂的任何疗法。化学疗法的实例包括当前可获得的众多癌症药物。然而,化学疗法还包括意欲治疗疾病状态的任何天然或合成药物。在本发明的某些实施方式中,化学疗法可以包括施用意欲治疗疾病状态的几种现有技术的药物。实例包括用于患有头部的局部晚期鳞状细胞癌的患者的使用多烯紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的联合化学疗法(Tsukuda,M.等,Int J ClinOncol.2004June;9(3):161-6),以及顽固性和复发性惰性淋巴瘤中的氟达拉滨和苯达莫司汀(Konigsmann M等,,Leuk Lymphoma.2004;45(9):1821-1827)。
如本文使用的,治疗性或偶发性电离辐射的示例性来源可以包括,例如,α、β、γ、X射线和中子源。
“放射疗法”指的是其中任何形式的辐射被用于治疗疾病状态的任何疗法。产生用于放射疗法的辐射的仪器是当前可获得的或未来可获得的那些仪器。
“高剂量治疗方式”指的是为高亚致死的或近似致死的治疗。高剂量治疗方式意欲具有取得治疗终点的增加的能力,但是通常具备增加的相关联的毒性。进一步,与常规的治疗方式相比,高剂量治疗方式通常展现出增加的造血损伤。用于高剂量治疗方式的方案是当前使用的或未来将使用的那些。
如本文使用的,放射疗法“治疗方式”可以包括电离和非电离辐射源二者。示例性电离辐射治疗方式可以包括,例如,体外放射疗法(external beam radiotherapy);强度调制放射疗法(IMRT);图像引导放射疗法(IGRT);X照射(例如光子束疗法);电子束(例如β照射);光子照射;高线性能量转移(LET)颗粒;趋实体性放射外科;伽玛刀;直线加速器介导的无框架趋实体性放射外科;机械手控制的X照射递送系统;用于器官特异性或癌细胞特异性摄取的放射性同位素放射疗法;放射性同位素结合至单克隆抗体用于肿瘤靶向放射疗法(或放射免疫疗法,RIT);近距离放射疗法(间质或腔内)高剂量率辐射源植入;用于器官特异性剂量递送的永久性放射性粒源植入。
“剂量密集(dose dense)治疗方案”通常是如下治疗方案,其中与常规的治疗方案相比,该治疗以加速的方式被连续地重复以取得期望的治疗结果。本发明的方法通过降低或减轻治疗的相关联的造血毒性来促进剂量密集治疗方案的使用,从而允许利用剂量密集治疗方案和增加治疗特定疾病状态中的成功率。(通常参见,Hudis C A,Schmits N,SeminOncol.2004June;31(3Suppl8):19-26;Keith B等,J ClinOncol.2004Feb.15;22(4):749;author reply 751-3;Maurel J,et al,Cancer.2004Apr.1;100(7):1498-506;Atkins CD,J Clin Oncol.2004Feb.15;22(4):749-50.)。
“化学防护或放射防护”指的是保护免受意欲靶向疾病状态的治疗的相关联的造血毒性,或意欲靶向疾病状态的治疗的相关联的造血毒性的明显降低。
如本文使用的,“急性辐射综合征(ARS)”(也称为辐射毒性或辐射病)表征为通过在非常短的时期(例如几分钟)内接受高剂量的贯穿辐射对全身(或大部分的身体)的致死或亚致死照射而引起的急性病。遭受ARS的人的实例是广岛和长崎原子弹的幸存者、在1986年的切尔诺贝利核电站事件后第一批响应的消防员、和无意识暴露于杀菌照射器的一些人。在某些实施方式中,与急性辐射综合征相关联的辐射剂量通常很大(即,大于0.7戈瑞(Gy)或70拉德)。在某些实施方式中,可以在低至0.3Gy或30拉德的剂量下观察到轻微的症状。
如本文使用的,“急性损伤效应”和“损伤效应”可以包括由于急性致死和近似致死辐射剂量引起的辐射诱导的损伤。
“实体瘤”通常指的是存在除血液、骨髓或淋巴系统之外的身体组织的癌症。
“造血障碍(癌症)”通常指的是存在源自造血系统的癌性细胞。
“改善缺陷”指的是造血缺陷的减少,即,改进缺陷,或部分或完全复原由当前医疗实践限定的正常状态。因而,造血缺陷的改善指的是血细胞生成的刺激、增强或促进的普遍地或特异性地增加。造血缺陷的改善可以观察为普遍地,即,增加两种或更多种造血细胞类型或谱系,或特异性地,即,增加一种造血细胞类型或谱系。
“骨髓细胞”通常指的是停留在哺乳动物的骨髓腔室中和/或源自(home to)哺乳动物的骨髓腔室的细胞。术语“骨髓细胞”中不仅包括造血起源的细胞,其包括但不限于造血种群恢复细胞、造血干细胞和/或祖细胞,而且包括可以源自骨髓的任何细胞,比如内皮细胞、间质细胞、骨细胞、神经细胞、支持细胞(基质细胞),其包括但不限于这些和其它细胞类型或谱系的相关联的干细胞和/或祖细胞。
“造血细胞类型”通常指的是多种类型的分化的造血细胞,但是也可以包括具体的造血细胞类型源自其的造血祖细胞,比如涉及与血细胞产生相关的所有细胞类型的多种母细胞,其包括干细胞、祖细胞、和多种谱系细胞,比如髓样细胞、淋巴样细胞等。
“造血细胞谱系”通常指的是分化的造血细胞的特定的谱系,比如髓样细胞或淋巴样细胞,但是也可以指的是更分化的谱系比如树突细胞、红系细胞等。
“IL-12促进的细胞的增殖”指的是血细胞生成的增加、刺激或增强,其至少部分地归因于通常停留在哺乳动物的骨髓中或源自哺乳动物的骨髓的细胞的扩展或增加,比如造血祖细胞和/或干细胞,但是包括包含骨髓小生境(niche)的微环境其它细胞。
“血细胞生成的刺激或增强”通常指的是一种或多种造血细胞类型或谱系的增加,并且在哺乳动物在一种或多种造血细胞类型或谱系中具有缺陷的情况下,尤其涉及一种或多种造血细胞类型或谱系的刺激或增强。
“造血长期种群恢复细胞”通常是骨髓中的最原始的血细胞;它们是负责提供多种血细胞类型和谱系的终身产生的血液干细胞。
“造血干细胞”通常是血液干细胞;存在两种类型:如上面定义的“长期种群恢复”,和可以产生“祖细胞”持续短时期(数周、数月或甚至有时数年,这取决于哺乳动物)的“短期种群恢复”。
“造血祖细胞”通常是由血液干细胞分化(成熟)的第一种细胞;它们然后分化(成熟)为多种血细胞类型和谱系。
“造血支持细胞”是骨髓的非血细胞;这些细胞为血细胞产生提供“支持”。这些细胞还称为骨髓基质细胞。
“骨髓保护”意思是已经被辐射、化学疗法、疾病或毒素损伤的骨髓由此被维持在其正常的或近似正常的状态下的过程;“骨髓恢复”意思是已经被辐射、化学疗法、疾病或毒素损伤的骨髓由此被复原至其正常的、近似正常的状态,或其中获得了任何可测量的骨髓功能的改进的过程;骨髓功能是适当水平的多种血细胞类型或谱系由造血(血液)干细胞产生的过程。
“骨髓衰竭”是如下病理学过程:其中已经被辐射、化学疗法、疾病或毒素损伤的骨髓不能够复原至正常,并且因此不能产生足够的血细胞以在哺乳动物中维持适当的血细胞生成。
实施例
现在参考下列实施例描述本发明。这些实施例仅出于说明的目的被提供,并且本发明不限于这些实施例,而是涵盖由于本文提供的教导显而易见的所有变化。
在本文描述的实验之前,不存在允许包含IL-12——包括重组人白介素-12(IL-12)制剂——的组合物和方法用于在HSCT之后改进造血恢复的公布的方案。
本公开内容的方面和实施方式起源于如下出人意料的发现:当在HSCT移植之后给对象施用时,某些IL-12制剂具有令人吃惊和出乎意料的实用性和功效。
举例而言,研发了制备治疗上有效的IL-12制剂的方法。
实施例1:
材料和方法
rMuIL-12、小鼠BMCT和人骨髓CD34+细胞。
专属于Neumedicines的rMuIL-12(重组小鼠IL-12)来自Peprotech(目录#210-12)(Rocky Hill,NJ,USA)或SBH Sciences(LS#45(Q4))(Natick,MA,USA)。小鼠和小鼠源骨髓细胞中的研究利用rMuIL-12。通过使用25G5/8针以PBS从正常C57/BL6小鼠的股骨和胫骨冲洗出骨髓细胞来制备BMCT。细胞过滤通过40μm细胞渗滤器,使用含有10%FBS的RPM1进行清洗和冷藏在液氮中。表达CD34的人骨髓细胞购自Lonza Group,Ltd,(Walkersville,MD)。
小鼠
雌性(BMCT研究)或雄性(骨髓研究)C57BL/6小鼠获得自Jackson Laboratories(Sacramento,CA)。鼠研究在BATTS Laboratories(Northridge,CA)中实施。小鼠在开始研究之前被维持在隔离检疫中持续至少一周。研究中使用的小鼠是8至10周龄并且称重为大约20g,没有疾病的迹象。所有程序被BATTS Laboratories实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)审查和批准,其由国际实验动物评估和认可委员会(Association for the Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care)(AAALAC)和美国实验动物协会(American Association ofLaboratory Animal Care)认可。在研究期间,动物的护理与使用根据由美国国立卫生研究院(US National Institutes of Health)(出版号:85-23,1996修订)出版的实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)中概述的原则。
实施例2:
使用rMuIL-12和BMCT治疗的照射的小鼠中的存活研究
在第0天,雌性C57BL/6小鼠(n=40)在特别建造的“圆形分格盒(pie-box)”中使用具有137Cs源的40(Theratronics,Ontario,Canada)经受8.2Gy的致死剂量下的TBI以保持小鼠在辐射器的中央,以便辐射均匀分布。小鼠在TBI(n=10)前24小时或TBI(n=10)前24小时与TBI(n=10)后3天接受10ng/小鼠的剂量下的静脉内注射的媒介物(n=10)或rMuIL-12。第四组的小鼠(n=10)在照射后2小时接受BMCT(1.1×106个细胞)。小鼠被监测存活直至第35天。在此时期期间,小鼠可以自由采食无菌的食物和酸化的水。使用卡普兰-迈耶存活分析评估存活的组间差异,接着是用于存活时间的Mantel-Cox测试和用于百分比存活的皮尔逊卡方检验。在第28天从每组中的一半动物收回血液样品和在第21与35天收回另一半,并且通过自动血液分析仪进行分析(Hemavet;Drew Scientific Inc.,Waterbury CT)。通过方差分析(ANOVA)分析血细胞计数的组间差异。
实施例3:
小鼠骨髓免疫组织化学
雄性C57BL/6小鼠(n=2/组)经受8.0Gy下的TBI并且随后在照射后24小时以一个剂量或在照射后24小时和2天以两个剂量皮下地接受媒介物或rMuIL-12(20ng/小鼠)。小鼠在照射后12天被处死,并且分离股骨,在福尔马林中固定并且随后通过Cyto-PathologyDiagnostic Center,Inc.(Duarte,CA,USA)制备为石蜡包埋的切片组织。
切片组织使用二甲苯进行脱蜡,使用降低浓度的乙醇进行再水化,和经受热诱导的表位修复(HIER)以恢复抗原。使用0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶30分钟(VWR;SanFrancisco,CA),并且使用Background Sniper(Biocare Medical,LLC;Concord,CA)封闭背景染色。组织切片然后使用兔抗小鼠IL-12Rβ2(Sigma;St Louis,MO)进行培育。组织切片使用过氧化物酶缀合的抗兔IgG(ImmPRESS;Vector Laboratories;Burlingame,CA)进行清洗和培育。在使用AEC底物(ImmPACT AEC;Vector Laboratories;Burlingame,CA)培育之后使过氧化物酶标记的细胞的橙色着色显影。组织使用CAT苏木精(Biocare Medical,Concord,CA)进行复染。组织切片被浸入Vectamount(Vector Laboratories;Burlingame,CA),使用盖玻片覆盖,使用透明的指甲油进行密封,并且使用Olympus复显微镜(Olympus America,Inc.;Center Valley,PA)在20×-100×放大倍数下可视化。
实施例4:
人CD34+细胞上的IL-12Rβ2的免疫组织化学分析
获取自Lanza Group,Ltd,(Walkersville,MD)的人骨髓CD34+细胞被接种在使用5μg/mL纤连蛋白处理的载玻片上,在-20℃下在冷甲醇中固定10分钟,并且在使用Background Sniper(Biocare Medical;Concord,CA)处理后,使用抗IL-12Rβ2的兔多克隆抗体(Sigma;St Louis,MO)进行标记,接着使用与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG(ImmPRESS reagent;Vector Laboratories;Burlingame,CA)进行培育。载玻片使用InimPACT AEC过氧化物酶底物(Vector Laboratories;Burlingame,CA)培育30分钟并且在CAT苏木精(Biocare Medical,LLC;Concord,CA)中进行复染。阴性对照包括使用没有初次兔多克隆抗体的相同试剂固定和处理的细胞。使用Olympus复显微镜拍摄照片。
实施例5:
小鼠造血Lin-和Lin-IL-12Rβ2+细胞以及人造血Lin-细胞的制备
小鼠骨髓获得自Bioreclamation(Liverpool,NY)或BATTS Laboratories。细胞使用MACS缓冲液(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)进行稀释并且过滤通过70μm细胞渗滤器(VWR;San Francisco,CA)。细胞然后在MACS缓冲液中进行清洗并且使用特异于谱系标志物——即,CD3e、CD4、CD5、CD8b、CD8a、B220、CD11b、Grl和Ter(80)——的生物素缀合的单克隆抗体(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)进行培育。细胞然后被清洗并且使用抗生物素微珠进行培育。通过使细胞穿过放置在QuadroMACS分离器(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)的磁场中的MACS柱使Lin+细胞被耗尽。磁力标记的Lin+细胞保留在柱上,而未标记的Lin-细胞被收集作为流出物。在选择研究中,使用HAM10B9抗体(BD Biosciences;San Jose,CA),小鼠骨髓Lin-细胞在MoFlow细胞分选仪(Beckman Coulter;Indianapolis,IN)上经由流式细胞术被分选以产生IL-12Rβ2+细胞群,所述HAM10B9抗体与小鼠IL-12受体复合体的独特的β2亚基(IL-12Rβ2)反应。
人骨髓细胞获得自Lonza Group,Ltd,(Walkersville,MD)。细胞使用MACS缓冲液(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)进行稀释并且过滤通过70μm细胞渗滤器(VWR;SanFrancisco,CA)。使用Ficoll-Paque(GE Lifesciences;Piscataway,NJ)通过密度梯度离心(4℃下455g持续35分钟)分离骨髓单核细胞。在200g下额外离心10分钟之后,从单核部分移除血小板。得到的细胞沉淀物被重悬在MACS缓冲液中并且使用特异于谱系标志物CD2、CD3、CD 11b、CD14、CD15、CD I6、CD19、CD56、CD123和CD235a(血型糖蛋白A)的生物素缀合的单克隆抗体(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)进行培育。在如早前提及的通过磁珠移除Lin+细胞之后收集Lin-细胞。
实施例6:
如何进行小鼠和人造血细胞的细胞计量分析
小鼠和人骨髓Lin-细胞在室温下使用别藻蓝蛋白-缀合的抗人/小鼠IL-12Rβ2,克隆#305719(APC-IL-12Rβ2)抗体(R&D systems;Minneapolis,MN)培育30分钟。包括未染色的对照和同种型对照。在选择研究中,人骨髓Lin-细胞和CD34+细胞还标记有APC-IL-12Rβ2抗体和缀合的单克隆藻红蛋白(PE)-CD34抗体,克隆#563(BD Biosciences;San Jose,CA);异硫氰酸荧光素(FITC)-ckit,克隆#104D2(Abcam;Cambridge,MA);FITC-KDR,克隆#89106(R&D systems;Minneapolis,MN);PE-CD133,克隆#EMK08(eBioscience;San Diego,CA);PE-Flt-3,克隆#4G8(BD Biosciences;San Jose,CA)、PE-CDI50,克隆#A12(BDBiosciences;San Jose,CA);PE-CDCP1抗体,克隆#309121(R&D systems;Minneapolis,MN)。使用APC-IL-12Rβ2和PE-CD34抗体类似地培育人骨髓CD34+细胞。细胞然后被清洗,重悬在DPBS中,并且使用MoFlow流式细胞仪(Beckman Coulter;Brea,CA)进行分析。每次分析评估至少三种不同的供体。
实施例7:
结果
rMuIL-12在致死照射的小鼠中与BMCT一样有效地增加存活和促进血细胞恢复
为了开始展现rHuIL-12用于临床HSC移植环境的潜力,在35天的时期内、在致死照射的小鼠中,静脉内施用一次(TBI前24小时)或两次(TBI前24小时和TBI后3天)的rMuIL-12(10ng/小鼠)的存活和促血细胞生成效果与TBI后2小时施用的BMCT(1.1×106个全骨髓细胞)的那些进行比较。由于以大体上相同的程度照射,BMCT和两种给药方案下的rMuIL-12减少死亡(图1a)。媒介物组中的存活的总百分数是0%,BMCT组中是70%,一次rMuIL-12组中是60%,和两次rMuIL-12组中是90%(图la)。当与媒介物组(P<0.005)比较时,百分比存活的组间差异是显著的。对于BMCT和rMuIL-12组,存活的组间差异不是统计学上显著的。
照射的小鼠中的血细胞计数的分析展现了BMCT和一次或两次rMuIL-12施用二者以相似的程度增加外周血细胞计数(图lb-d)。对于BMCT和rMuIL-12组,血细胞计数的组间差异不是统计学上显著的。然而,对于BMCT、rMuIL-12给药一次、和rMuIL-12给药两次组,在恢复中存在轻微的差。显著地,两次给药rMuIL-12组的血小板恢复比BMCT组更早达到正常的血小板水平(图1d)。
实施例8:
rMuIL-12促进照射的小鼠骨髓中的血细胞生成
IL-12功能由它与它的受体IL-12R,β2亚基(IL-12Rβ2)——其是受体的独特的组分——的相互作用驱动。我们假定rMuIL-12在致死照射的小鼠中的再生能力由其受体mIL-12R在造血干细胞(HSC)上的表达驱动。我们通过来自使用rMuIL-12治疗的致死照射的小鼠的鼠股骨骨髓切片的表型分析进一步评估了rMuIL-12的促血细胞生成活性。对来自在TBI后24小时和TBI后3天使用rMuIL-12(20ng/小鼠)或媒介物皮下治疗的小鼠的致死辐射后12和30天的股骨骨髓进行IL-12Rβ2染色。来自照射的、rMuIL-12-处理的小鼠的骨髓表征为存在表达IL-12Rβ2的成骨细胞、祖细胞、具有由细胞质的窄边缘环绕的分叶细胞核(lobulated nuclei)的未成熟的巨核细胞、具有分叶细胞核和大量细胞质的成熟的巨核细胞(图2a)。相比之下,来自照射的、媒介物-处理的小鼠的骨髓表征为在照射之后12天造血再生的最小征兆和完全缺乏表达IL-12Rβ2的细胞(图2b)。分别使用Sca-1和骨钙蛋白标志物通过免疫组织化学分析来分析髓样祖细胞和成骨细胞细胞类型(数据未显示)。成骨细胞已经显示在同种异体环境中促进小鼠中的造血移入(EI-Badri NS等“OsteoblastsPromote Engraftment Of Allogeneic Hematopoietic Stem Cells,”Exp Hematol 1998;26:110-116.)和在巨核细胞的归巢和扩展中发挥作用。(Ahmed N等,“Cytokine-InducedExpansion of Human CD34+Stem/Progenitor and CD34+CD41+Early MegakaryocyticMarrow Cells Cultured on Normal Osteoblasts,”Stem Cells 1999;17:92-99;Dominici M等,“Restoration and Reversible Expansion of the OsteoblasticHematopoietic Stem Cells Niche after Marrow Radioablation,”Blood 2009;I 14:2333-2343.)。与此相一致,我们观察到表达IL-12Rβ2的巨核细胞岛与使用rMuIL-12在辐射后24小时和辐射后3天给药两次处理的小鼠的骨髓中的骨内膜表面靠近(图3)。这与正常的、未处理的小鼠形成对比,其中巨核细胞占据窦旁(parasinusoidal)位点。(Dominici M等,同上)。为了确认IL-12Rβ2在形态学上鉴定的HSC上的表达以支持我们的结果,在小鼠骨髓细胞之中免疫磁力地选择Lin-细胞。谱系耗尽的细胞(Lin-)代表由缺少成熟的谱系细胞标志物的原始干细胞和多能祖细胞构成的细胞群。流式细胞术分析展现了大约0.5-7%的小鼠Lin-细胞表达IL-12Rβ2(图4)。
实施例9:
在不存在辐射的情况下,使用rMuIL-12体外处理小鼠直接增加从骨髓Lin-细胞分离的IL-12Rβ2+细胞的数目
mIL-12Rβ2在小鼠HSC、巨核细胞和成骨细胞上的表达,以及由其产生存活和造血恢复的能力——比得上致死照射的小鼠中的BMCT——展现的rMuIL-12的再生能力表明IL-12-介导的造血恢复和再生由其对表达mIL-12Rβ2的细胞的直接作用引发。接着,我们评估了rMuIL-12对小鼠骨髓中表达IL12Rβ2的细胞的体内作用。C57BL/6小鼠或者经由尾静脉注射使用rMuIL-12(10ng/小鼠)进行处理或者不进行处理。对于第一种实验,在使用rMuIL-12处理后21小时采集骨髓,和对于第二种实验,在使用IL-12处理之后25小时采集骨髓。谱系阴性细胞从每个组被分离并且经由流式细胞术分选被进一步分级以产生Lin-IL-12Rβ2+。在处理组或未处理组中存在的Lin-IL-12Rβ2+细胞的相对百分比显示在表1中。使用rMuIL-12的处理在骨髓腔室的谱系阴性细胞之中产生Lin-IL-12Rβ2+细胞的相对数目的增加,并且导致21小时后IL-12Rβ2+细胞的3.5倍增加和25小时后IL-12Rβ2+细胞的5.4倍增加。
实施例10:
人骨髓Lin-细胞和CD34+细胞表达IL-12Rβ2连同已知的HSC标志物
rMuIL-12的造血再生功能、IL12Rβ2在小鼠Lin-细胞上的表达和rMuIL-12对小鼠Lin-IL-12Rβ2+细胞的增殖作用表明rHuIL-12在再生人骨髓中的潜在影响。为了评估rHuIL-12在人移植中的潜在作用,我们阐明了IL-12Rβ2在人骨髓造血干细胞/祖细胞上的表达。我们通过标记有抗IL-12Rβ2和CD34的抗体的Lin-细胞和CD34+细胞的流式细胞术分析评估了IL-12Rβ2在人骨髓细胞上的表达。CD34细胞被选择,这是由于它们在临床环境中一直是纯化造血干细胞以便移植的公认标志物选择。在Lin-细胞之中,大约0.5%至4%的细胞表达IL-12Rβ2+(平均值±SD:1.89±1.21),而不论CD34表达状况(图5a)。然而,在CD34+细胞之中,IL-12Rβ2的表达是高度供体依赖性的,并且在6%至57%的细胞(平均值±SD:19.59±17.52)上被检测到(图5b)。如通过流式细胞术分析检测的,使用抗IL-12Rβ2的不同抗体,通过人骨髓CD34+细胞的免疫细胞化学染进一步展现了IL-12Rβ2在CD34+细胞上的存在(图5c)。使用相同的试剂制备而不使用抗IL-12Rβ2的初次抗体进行培育的阴性对照没有产生染色(数据未显示)。
也通过人骨髓中的流式细胞术分析评估IL-12Rβ2与HSC的其它细胞表面标志物的共表达。Lin-细胞和CD34+细胞每种共标记有抗IL-12Rβ2和CD34、c-kit、KDR、CD 133、Flt-3、CD 150或CDCPI——其已知在原始骨髓细胞的离散群体上表达——的抗体。这些分析揭示了大约50%的Lin-IL-12Rβ2+细胞共表达CD34(平均值±SD:53±5)或c-Kit(平均值±SD:51±7),35%共表达KDR(平均值±SD:35±6),和25%共表达CD 150(平均值±SD:23±21)(图6a),类似于Lin-细胞,大约70%的CD34+IL-12Rβ2+细胞共表达c-kit(平均值±SD:68±0.2)、80%共表达CDCP I、和15%共表达KDR(平均值±SD:13±9)(图6b)。
本文提供的实施例明确地展现了示例性IL-12制剂HemaMax IL-12有效地改进HSCT移植之后的造血恢复。
讨论
HSCT被用于在多种血液恶性肿瘤的清髓性化学疗法和/或放射疗法之后治疗癌症患者。影响HSCT移入的成功的主要因素是癌症的类型和阶段、移植的预备方案(preparative regimen)、CD34+细胞的数量和质量、和生长因子的移植后使用。(Ninan MJ等,“Posttransplant Thrombopoiesis Predicts Survival in Patients UndergoingAutologous Hematopoietic Progenitor Cell Transplantation,”Biol Blood MarrowTransplant 2007;13:895-904;Bensinger WI等“Peripheral Blood Stem Cells(PBSCs)Collected After Recombinant Granulocyte Colony Stimulating Factor(rhG-CSF):anAnalysis of Factors Correlating with the Tempo of Engraftment AfterTransplantation,”Br J Haematol 1994;87:825-831;Klumpp TR等“Phase II Study ofHigh-Dose Cyclophosphamide,Etoposide,and Carboplatin(CEC)Followed byAutologous Hematopoietic Stem Cell Rescue In Women With Metastatic or High-Risk Non-Metastatic Breast Cancer:Multivariate Analysis of Factors AffectingSurvival and Engraftment,”Bone Marrow Transplant1997;20:273-281.)。髓样生长因子和红系生长因子的施用被用于治疗移植后嗜中性白细胞减少和贫血。(Held TK等“Pharmacodynamic Effects of Haematopoietic Cytokines:the View of a ClinicalOncologist,”Basic Clin Pharmacol Toxicol 2010;106:210-214.)。然而,这样的药剂不影响血小板再生。为了克服血小板减少,患者依赖于移植后早期血小板输血。(Wandt H等,“New Strategies for Prophylactic Platelet Transfusion in Patients withHematologic Diseases,”Oncologist 2001;6:446-450)。多达17%的癌症患者在初始恢复后可能经历随后的二次移植后血小板减少,其与较高的死亡率显著地相关联。(Ninan,MJ等,同上,在895-904页)。特发性移植后血小板减少和低血小板计数与短期和长期种群恢复CD34+细胞的差的移入相关联,并且由疾病复发预示增加的死亡风险。(同上)。因而,对在移植之后可以提高用于移入的CD34+细胞的数目和增加造血恢复的药物存在需要。当前,也不存在可获得的药剂以减轻移植后血小板减少,其预测降低的总存活。
非人灵长类中的rHuIL-12,或小鼠中的rMuIL-12已经显示增加TBI模型中的存活。(Basile LA,和Ellefson D等“HemaMaxTM,a Recombinant Human Interleukin-12,is aPotent Mitigator of Acute Radiation Injury in Mice and Non-Human Primates,PLoS ONE,”Submitted 2011;Basile LA,和Gallaher TK等“Multilineage HematopoieticRecovery with Concomitant Antitumor Effects Using Low Dose Interleukin-12inMyelosuppressed Tumor-Bearing Mice,”J Transl Med2008;6:26;Chen T等,“IL-12Facilitates Both the Recovery of Endogenous Hematopoiesis and theEngraftment of Stem Cells after Ionizing Radiation,”Exp Hematol 2007;35:203-213.)。几条证据指示骨髓血细胞生成的刺激可以在rHuIL-12的促存活活性中发挥关键作用。(Basile LA,和Ellefson D等,同上)。当体外测试时,rMuIL-12类似于BMCT在致死照射的小鼠中增加外周血细胞恢复和存活。有趣地,血小板的恢复在IL-12处理的小鼠中比在施用的BMCT小鼠中更早地出现。这些发现与我们先前的报道一致,其展现了rMuIL-12和rHuIL-12分别在小鼠和猕猴中的促血细胞生成和促存活活性。(Basile LA和Ellefson D等同上;Basile LA和Gallaher TK等同上,Chen T.等,同上)。也在荷瘤小鼠中观察到这些造血恢复效果。在Lewis肺和EL4淋巴瘤模型二者中,rMuIL-12在亚致死TBI之后提供了早期中性粒细胞、红细胞和血小板恢复。进一步,在淋巴瘤和肺癌鼠模型二者中,IL-12与放射或化学疗法协同地降低了肿瘤负荷。(Basile LA和Gallaher TK等同上)。与我们的发现一致,在患有血液恶性肿瘤的患者中,随着免疫疗法给予的rHuIL-12的施用在外周血干细胞移植之后诱导主要淋巴细胞亚群的体内扩展。(Pelloso D等“Immunological Consequences ofInterleukin 12Administration After Autologous Stem Cell Transplantation,”ClinCancer Res 2004;10:1935-1942.)。
在当前的研究中,要注意rMuIL-12和BMCT在致死辐射的动物中增加血细胞恢复和存活的相似的效力。而且,rMuIL-12的促血细胞生成活性似乎补充BMCT的促血细胞生成活性,这是由于次优的rMuIL-12剂量与低剂量BMCT的组合协同地增加存活,而单独的处理中的任一种不能救护致死辐射的动物。(Chen T.等,同上)。在当前的研究中,与BMCT相比,rMuIL-12处理的小鼠中的血小板恢复是更强健的。rMuIL-12和BMCT的比得上的效力和补充的活性表明rHuIL-12可以是HSCT用于增强移入可能性和HSC的造血恢复——特别是血小板计数的恢复——的辅助物选择。
rMuIL-12增加鼠骨髓血细胞生成的能力指示了原始的、现存的造血细胞上功能性IL-12受体(IL-12R)的存在,其当被IL-12结合时引发起始骨髓再生的事件。为了支持此假设,我们展现了rMuIL-12-处理的鼠骨髓表征为存在表达IL-12Rβ2的干细胞/祖细胞、巨核细胞和成骨细胞,这表明HSC和隔细胞二者可以是rHuIL-12的直接靶标。成骨细胞的活化对造血干细胞和巨核细胞的存活、扩展和归巢至关重要。(Ahmed N等,同上,de Barros AP等,“Osteoblasts and Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell Control HematopoieticStem Cell Migration and Proliferation in 3D in vitro Model,”PLoS One 2010;5:e9093;Hamada T,Mohle R,Hesselgesser J等“Transendothelial Migration ofMegakaryocytes in Response to Stromal Cell-Derived Factor 1(SDF-1)EnhancesPlatelet Formation,”J Exp Med 1998;188:539-548;Hodohara K等“Stromal Cell-Derived Factor-1(SDF-1)Acts Together with Thrombopoietin to Enhance theDevelopment of Megakaryocytic Progenitor Cells,”(CFU-MK).Blood 2000;95:769-775;Kiel MJ等,“Maintaining Hematopoietic Stem Cells in the Vascular Niche,”Immunity 2006;25:862-864;Wang JF等,“The Alpha-chemokine Receptor CXCR4isExpressed on the Megakaryocytic Lineage from Progenitor to Platelets andModulates Migration and Adhesion,”Blood 1998;92:756-764.)。已经显示了暴露于致死剂量的辐射导致成骨细胞小生境扩展,由此抗放射性骨原细胞(osteoprogenitor)的存活池(surviving pool)靠近骨内膜区域增殖。(Dominici M,Rasini V等,同上)。在此研究中,存活的巨核细胞也被观察到靠近骨小梁骨内膜表面而不是在它们的正常的窦旁位点中。巨核细胞释放刺激成骨细胞小生境扩展的因子。(同上)。与这些发现一致,我们的研究中的免疫组织化学检查揭示了小鼠骨髓中的细胞构型,其显示了由靠近骨的成骨细胞小生境、巨核细胞和造血干细胞构成的细胞岛。共同地,这些发现表明rHuIL-12可以经由IL-12受体直接作用以协调安排HSC与隔细胞的活性和刺激血细胞生成。与此概念相一致,IL-12已经被报道在存在辅助性人CD34-细胞的情况下增强5-氟尿嘧啶处理的人外周血CD34+细胞的集落形成。(Grafte S等IL-12“Indirectly Enhances Proliferation of 5-FU-Treated Human Hematopoietic Peripheral Blood CD34+Cells”Am J Hematol 1998;58:183-188.)。
与其在来自照射的、未处理的小鼠的骨髓中的不存在相反,在来自使用rMuIL-12处理的照射的小鼠的骨髓中存在IL-12β2表达表明rMuIL-12可以上调骨髓中的IL-12受体表达并且直接经由HSC和隔细胞上的IL-12受体发挥其促血细胞生成活性。与此假设一致,在不存在辐射的情况下,使用外源性rMuIL-12的处理产生骨髓腔室的谱系阴性细胞之中的Lin-IL-12Rβ2+细胞的相对数目的增加,并且对于采集骨髓的两个不同时间点,导致IL-12Rβ2+细胞的平均4.5倍的增强。这些数据还与在不存在辐射的情况下的我们的BrdU掺入测定一致,其显示了在处理后21小时与未处理的小鼠(7.5%)相比,IL-12-处理的小鼠中的全骨髓中的BrdU阳性细胞的增加(16.5%)(数据未显示)。根据这些数据,我们推断在使用rMuIL-12配体的体内处理之后,在来自骨髓的分离的和选择的lin-IL-12Rβ2+细胞中观察到的增加起因于经由IL-12配体/IL-12受体系统的直接的HSC扩展,其导致荷载IL-12受体的子代HSC的数目的增加。
本公开内容是展现IL-12Rβ2在小鼠和人Lin-细胞和人CD34+细胞——涵盖造血干细胞和祖细胞的两批骨髓细胞——上表达的第一次报道。还通过免疫细胞化学染色确认了IL-12Rβ2在人CD34+细胞上的表达。总之,这些研究展现了1-4%的人Lin-细胞和6-50%的人CD34+细胞表达IL-12Rβ2。相当数目的Lin-IL-12Rβ2+细胞(20%至50%)和CD34+IL-12Rβ2+细胞(15%至80%)也共表达HSC的其它潜在的标志物,主要是c-kit、KDR、CD150或CDCP1(Hawley RG等,“Hematopoietic Stem Cells,”Methods Enzymol 2006;419:149-179;Conze T等“CDCP1is a Novel Marker for Hematopoietic Stem Cells,”Ann N Y AcadSci 2003;996:222-226;Drake AC等“Human CD34+CD133+Hematopoietic Stem CellsCultured with Growth Factors Including Angpt15Efficiently Engraft Adult NOD-SCID I12rgamma-/-(NSG)Mice,”PLoS One 2011;6:e18382;Ziegler BL等“KDR Receptor:a Key Marker Defining Hematopoietic Stem Cells,”Science 1999;285:1553-1558.)。要注意c-Kit,干细胞因子(SCF)的受体,其刺激血细胞生成的活性被小鼠中的rMuIL-12显著地体外增加(7倍)。(Jacobsen SE等,“Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor(Interleukin 12)is a Synergistic Growth Factor for Hematopoietic Stem Cells,”J Exp Med 1993;178:413-418.)。受体c-kit已经显示在HSC的自我更新和维持中发挥重要的体内作用。(Porrata LF等,“Early Lymphocyte Recovery Predicts SuperiorSurvivalAfter Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in MultipleMyeloma or Non-Hodgkin Lymphoma,”Blood 2001;98:579-585.)。c-kit/SCF复合体在干细胞粘附至其在骨髓中的微环境和HSC归巢中发挥重要作用。IL-12和SCF在体外已经显示协同地支持淋巴原始造血祖细胞的增殖。(Hirayama F等,“Synergistic InteractionBetween Interleukin-12and Steel Factor in Support of Proliferation of MurineLymphohematopoietic Progenitors in Culture,”Blood 1994;83:92-98.)。这些出人意料的和令人惊讶的IL-12Rβ2与c-kit的协同效应和共表达进一步展现了IL-12在造血再生和恢复中的作用。与先前的报道一致,CD150表达大部分限制于Lin-细胞,而CDCP1表达主要地限制于CD34+细胞。(Conze T,Lammers等同上;Sintes J等,“Differential Expressionof CD150(SLAM)Family Receptors by Human Hematopoietic Stem and ProgenitorCells,”Exp Hematol 2008;36:1199-1204.)。表达CD150的Lin-细胞已经显示代表长期重建的HSC的亚群。(Buhring HJ等,“CDCP1Identifies a Broad Spectrum of Normal andMalignant Stem/Progenitor Cell subsets of Hematopoietic and NonhematopoieticOrigin,”Stem Cells 2004;22:334-343.)。使用CDCP1反应性单克隆抗体刺激CD34+细胞导致红系集落形成单位的增加。还在与间充质细胞类似的细胞类型上观察到CDCP1表达。(同上)。Lin-细胞和CD34+细胞二者表达KDR,这与先前的报道一致。(Ziegler BL等,同上)。HSC小生境已经显示由表征为CD34-KDR+表型的间充质细胞构成,该CD34-KDR+表型已知在组织噪声中发挥作用,并且随后,KDR+细胞已经显示具备重建功能。IL-12Rβ2与KDR的共表达进一步表明在HSC或骨髓隔细胞上表达的IL-12Rβ2可以在造血恢复中发挥重要作用。共同地,这些发现表明IL-12/IL-12受体途径涉及人骨髓血细胞生成,并且IL-12Rβ2可以代表标示造血干细胞与祖细胞和骨髓隔细胞——其可以被rHuIL-12外源地刺激以扩展——的新一批的标志物,并且从而在骨髓清除之后重建造血组织。
在其在癌症患者中的抗肿瘤活性的背景下,IL-12的功效一直是几种研究的主题。尽管有强烈的兴趣,但是IL-12从未发展为药物并且从未受到美国食品和药品管理局(Foodand Drug Administration)(FDA)批准,这是因为其在高的(300ng/Kg至600ng/Kg)重复给药方案(在重复方案中,5个剂量/周)下中等的临床活性和显著的毒性。(Atkins MB等,“Phase I Evaluation of Intravenous Recombinant Human Interleukin 12inPatients with Advanced Malignancies,”Clin Cancer Res 1997;3:409-417;BajettaE,Del VM,Mortarini R等,Pilot Study of Subcutaneous Recombinant HumanInterleukin 12in Metastatic Melanoma,”Clin Cancer Res 1998;4:75-85;Gollob JA等,“Phase I Trial of Twice-Weekly Intravenous Interleukin 12in Patients withMetastatic Renal Cell Cancer or Malignant Melanoma:Ability to Maintain IFN-Gamma Induction Is Associated With Clinical Response,”Clin Cancer Res 2000;6:1678-1692;Gollob JA等,“Phase I Trial of Concurrent Twice-Weekly RecombinantHuman Interleukin-12Plus Low-Dose IL-2in Patients with Melanoma or Renal CellCarcinoma,”J Clin Oncol 2003;21:2564-2573;Lenzi R等,“Phase I Study ofIntraperitoneal Recombinant Human Interleukin 12in Patients with MullerianCarcinoma,Gastrointestinal Primary Malignancies,and Mesothelioma,”Clin CancerRes 2002;8:3686-3695;Little RF等,“Phase 2Study of Pegylated LiposomalDoxorubicin in Combination with Interleukin-12for AIDS-Related KaposiSarcoma,”Blood 2007;110:4165-4171;Motzer RJ等,“Phase I Trial of SubcutaneousRecombinant Human Interleukin-12in Patients with Advanced Renal CellCarcinoma,”Clin Cancer Res 1998;4:1183-1191;Ohno R等,“A Dose-Escalation andPharmacokinetic Study of Subcutaneously Administered Recombinant HumanInterleukin 12and its Biological Effects in Japanese Patients with AdvancedMalignancies,”Clin Cancer Res 2000;6:2661-2669;Portielje JE等,“Phase I Studyof Subcutaneously Administered Recombinant HumanIinterleukin 12in Patientswith Advanced Renal Cell Cancer,”Clin Cancer Res 1999;5:3983-3989;RobertsonMJ等,“Interleukin 12immunotherapy After Autologous Stem Cell Transplantationfor Hematological Malignancies,”Clin Cancer Res 2002;8:3383-3393;van HerpenCM等,“Intratumoral Administration of Recombinant Human Interleukin 12in Headand Neck Squamous Cell Carcinoma Patients Elicits a T-Helper 1Profile in theLocoregional Lymph Nodes,”Clin Cancer Res2004;10:2626-2635.)。在相对较低的剂量下,使用外源性IL-12的疗法在患有血液恶性肿瘤的患者中良好地耐受:在30ng/Kg至250ng/Kg的范围的剂量下,在外周血干细胞移植后大约2个月给予一次,接着在2周之后以重复方案给予5个每日施用。(Robertson MJ等,同上)。
相比之下,我们已经发现rHuIL-12在动物中在低纳克/千克剂量——其等价于作为人剂量的小于100ng/Kg——下发挥其促造血活性,其在我们的鼠和猕猴研究二者中仅给予一次或两次。而且,在我们的毒理学研究中,我们专有的rHuIL-12在高至七个1000ng/Kg的剂量——其等价于大约300ng/kg的人剂量——后在猕猴中良好地耐受(数据未显示),其中没有明显的毒性迹象。这些发现指示用于造血再生的rHuIL-12剂量将基本上低于先前在癌症患者中使用的IL-12剂量,这表明HSC移植患者中rHuIL-12的更有利的安全概况。
我们的发现展现了rHuIL-12可以通过刺激外周血细胞计数——特别是血小板——的多谱系恢复,潜在地提供额外的治疗价值。IL-12的抗肿瘤和免疫刺激效应进一步增加其在癌症患者中的治疗价值。IL-12/IL-12R因而代表可行的途径,其可以经由施用外源性IL-12被引入以增加经历HSC移植的患者中的缓解。
结论
包含rMuIL-12的示例性方法和组合物与BMCT一样有效地促进血细胞生成,并且增加外周血细胞的恢复和致死照射的小鼠中的存活,其指示rHuIL-12疗法可以增加HSCT之后的HSC移入。我们在照射的小鼠骨髓中鉴定了表达IL-12Rβ2的细胞,其是IL-12的潜在的靶标。施用rMuIL-12增加小鼠骨髓中表达IL-12Rβ2的Lin-细胞的数目,其指示骨髓HSC和隔细胞是rMuIL-12的直接靶标,并且rMuIL-12的促血细胞生成活性受HSC上IL-12受体的介导。最后,我们显示了人骨髓lin-和CD34+细胞上IL-12Rβ2的表达,其指示了IL-12在人移植的潜在的作用。
实施例:
表1.使用媒介物或rMuIL-12处理的小鼠中的骨髓Lin-IL-12Rβ2+细胞的百分数。外源性IL-12增加骨髓腔室的谱系阴性细胞之中的IL-12Rβ2+细胞的相对数目,并且导致IL-12Rβ2+细胞的平均4.5倍的增强。
实施例11
功效展现:单一的低剂量rHuIL-12在暴露于致死辐射的猕猴中复原血细胞生成和增加存活
相对于安慰剂,单一的低剂量的rHUIL-12作为单一药剂在暴露于致死辐射的非人灵长类中显著地增加存活,而不使用支持性护理,rHUIL-12相对于安慰剂降低脓毒症和严重的嗜中性白细胞减少/血小板减少的比率,并且增加骨髓再生。
急性辐射综合征(HSARS)的造血综合征导致暴露于致死全身照射(TBI)的人死亡。重组人白介素-12(rHuIL-12)在FDA动物法规下被研发用于减轻HSARS,其中在适当的动物模型(例如,非人灵长类)中证明了功效并且在人中展现了安全性。使猕猴(9只动物/性别/剂量组)随机化以在TBI(700cGy)后24-25小时接受单次皮下注射的rHuIL-12(0[安慰剂]、50、100、250或500ng/kg),而没有抗生素、输液或输血。第60天的存活率对于安慰剂,50、100、250和500ng/kg rHuIL-12剂量组分别是11%、33%、39%、39%和50%(每种剂量对安慰剂的时序p<0.05)。rHuIL 12也显著地降低严重的嗜中性白细胞减少、严重的血小板减少和脓毒症的发生率。此外,与对照中相比,TBI之后的骨髓再生在使用rHuIL-12处理的猴中显著更大。这些数据展现了在TBI后一天递送的单次注射的rHuIL-12可以显著地增加存活和显著地减少辐射诱导的造血毒性和感染。因此,rHuIL-12作为针对辐射暴露的致死效应的有效的、单独的医学对策是有效的。
急性辐射综合征(ARS)是由全身或大部分身体在短时期内暴露于>1Gy的辐射剂量引起的威胁生命的病痛,如将在核事故或核攻击的事件中发生的。ARS的病理生理学是充分理解的,并且跨越所有哺乳动物是类似的,其涉及对造血系统、胃肠系统、中枢神经系统和皮肤系统的有害作用。在ARS的造血亚综合征(subsyndrome)(HSARS)中,毒性是由于快速的骨髓清除,其导致各类血细胞减小症。取决于辐射暴露水平,由于在2周至2个月的范围内的感染和/或出血,HSARS最终导致死亡。
虽然辐射医学对策(R-MCM)在大规模辐射应急的事件中的可用性对拯救生命至关重要,但是美国食品和药品管理局(FDA)当前没有批准该治疗。HSARS的典型的治疗指南包括短期或长期细胞因子施用,其取决于暴露水平。虽然可获得的细胞因子产品支持一些单个细胞类型的生长(比如用于中性粒细胞的G-CSF)1,但是它们的用途的综述没有显示TBI后总死亡率的一致的降低,并且它们的细胞因子没有被FDA批准用于HSARS适应症。针对由核灾难或意外引起的HSARS的最佳的R-MCM将能够使骨髓腔室的所有谱系再生,并且考虑到期望的逻辑障碍(logistic impediment),当在暴露后数小时至数天——优选地作为单剂量——和在不存在强化的支持性护理的情况下施用应当是有效的。这些需要没有被G-CSF满足,其仅影响粒细胞生成谱系,需要多个每日施用并且已经显示仅与强化的支持性护理联合提高存活。9此外,在辐射暴露的背景下,G-CSF被报道与长期存在的分离的单纯性血细胞减少相关联10,并且甚至延缓涉及肺毒性18和纤维化的副作用(Aeolus参考文献)。
我们先前报道了在不存在抗生素、流体或血液产品的情况下,在照射后24-25小时给予的重组人IL-12(rHuIL-12)的单次施用在鼠HSARS模型和在非人灵长类(NHP)的概念验证、非盲、仅雄性研究二者中提高存活。8这些发现支持在FDA动物法规下rHuIL-12进一步研发为用于HSARS的R-MCM,其中在适当的动物模型(例如,非人灵长类)中证明了功效并且在人中展现了安全性。在本文,我们描述了rHuIL-12在雄性和雌性猕猴的大组中的辐射对策效果的随机的、盲的关键阶段功效研究的结果。在动物法规下,此第2阶段研究推进rHuIL-12得到批准。
方法
动物
猕猴(罗猴)获得自中国Yongfu County Xingui Wild Animal Raising Ltd.。猴(3至5岁,和在开始治疗时3.0至5.7kg)单独地居住并且在照射之前适应≥5周。每天两次提供Harlan Teklad认证的高纤维灵长类饲料#7195C(Harlan Laboratories,Indianapolis,Indiana)。
随机化和盲法(blinding)
在主要研究中,使雄性和雌性动物(每种45只;9只动物/性别/剂量组)随机化,按体重分层,为下列剂量的rHuIL-12:通过SC注射施用的媒介物;50ng/kg、100ng/kg、250ng/kg或500ng/kg(1-5组)。除研究组负责人和参与照射的那些之外的病理学家和研究人员是不知情的。使用随机化为相同剂量的rHuIL-12的单独的动物(2只/性别/组),以盲的方式实施对第12天的骨髓的评估。
全身照射
700cGy(来自Theratron 1000Co60源[Best Theratronics;Ottawa,Ontario,Canada]的60cGy/分钟)的剂量基于来自CiToxLAB North America的可获得的历史数据。如先前描述的,对竖直位置中的动物实施TBI。为了均匀剂量分布,前半份剂量前后方向递送和后半份剂量后前方向递送。使用在每只动物的前部和后部上定位的纳米点芯片(Landauer,Inc.,Glenwood,Illinois,USA),剂量测定被验证在10%的规定剂量内。
rHuIL-12给药
临床等级的rHuIL-12或媒介物在TBI之后大约24-25小时通过SC注射被施用在肩胛骨之间。使用人IL-12ELISA试剂盒(R&D Systems Inc.,Minneapolis,USA),通过intertek Pharmaceutic Services(San Diego,CA)验证每个给药样品中的测试项目的浓度。
评估
每天两次记录临床征兆。每天记录食欲降低(基于食物摄取)和身体活动并且评分如下:1=轻度;2=中度;和3=重度。在给药rHuIL-12之前和其后每周两次进行详细的身体检查。在照射之前和第3-10、12、14、16、18、30、45和60天,或根据临床调整获取体温(耳)。在照射之前和第5、10、12、14、16、18、30、45和60天进行用于外周血计数的血液取样(0.5mL)。在发热性嗜中性白细胞减少(绝对中性粒细胞计数<0.05 109/L,连同直肠体温≥104°F/40.0℃)的情况下和在尸体检查时收集血液用于血培养。
末端程序
如果观察到任何下列标准,在第60天之前处死动物:呼吸窘迫;完全厌食持续3天;在3天时期内失去>20%的初始体重;急剧降低的活动水平(在整个观察期期间横卧或对触摸无反应);急性失去>20%估计的血液体积;全身性癫痫发作;与异常的生命体征相关联的外观异常(姿势、粗外皮(rough coat)、低头、围绕眼和鼻的渗出物、苍白、褶皱的腹部(tucked abdomen)和临床表现)——伴随低温的严重脱水(达到<34.6℃的降低的直肠温度和急剧降低的活动水平)或体温过高(温度>40.1℃和急剧降低的活动水平)。由对动物组别分配不知情的一组技术员和兽医做出安乐死决定。存活的动物在TBI之后第60天被处死。
尸体检查包括外部宏观检查、详细的内部检查、器官重量的评估和肉眼病理学、和收集组织用于组织病理学。如下对主要器官进行存在出血的评分:0=不存在;1=最少;2=轻微;3=中等;4=显著;5=严重。对于组织学检查,组织被包埋在石蜡中,切片和使用苏木精与伊红-根皮红(H&E)进行染色。
对脑、心、肾、肝、双肺和脾实施微生物学分析。对每种器官进行细菌生长评分(0至4)。合计每只动物的总分;计算每个治疗组的平均分。
骨髓组织病理学
在TBI后第12天处死骨髓评估组中的动物。一只动物在第11天经历计划外的处死;所有动物被包括在分析中。在Olympus BX41复显微镜上扫描每只动物的两个H&E切片。在10×的放大倍数下在Infinity Analyze软件v5.0上获取大约40个视野的图像,其涵盖作为整体的每个股骨切片。在每个切片中的每个视野中,通过视觉量化测定骨髓再生岛的数目。使用ImageJ软件,版本1.46,测定骨髓再生的总面积。来自每只动物的两个切片的再生岛的平均数目和平均再生面积被用于统计学分析。在每个股骨切片中可视地测定巨核细胞的数目。
统计学分析
根据性别和针对整个研究群体实施所有统计学比较。使用在每日间隔上应用的卡普兰-迈耶乘积极限法,估算存活函数。使用Mantel时序检验,使对照组与其它处理组中的每个进行比较。在CiToxLAB处进行GLP分析。
使用费舍尔精确检验进行严重的嗜中性白细胞减少(定义为中性粒细胞计数<0.05×109个/L)、严重的血小板减少(定义为血小板计数<0.05×109个/L)、和血培养阳性的发生率的组别比较。如果总体比较是显著的(p≤0.05),使用费舍尔精确检验完成对照组和给药组中的每个之间的成对比较。
使用统计学软件程序Prism第6版(GraphPad,San Diego,CA),通过单边t检验比较骨髓再生数据(再生岛的数目和面积)的组别平均值。具有p<0.05的差异被认为是显著的。
结果
存活
存活数据呈现在图1中。在本实验的条件(无抗生素、输液或输血)下,施用的辐射剂量相当于大约LD90/60(未处理的组中2/18的动物存活)。在第9天和第24天之间发生59例死亡中的58例,其与先前观察到的由于猕猴中的HSARS引起的死亡率和死亡时间一致,并且在第33天发生一例死亡。对于对照组和rHuIL-12-处理的组二者,最高比例的死亡发生在第11天和第21天之间,而且第14天是峰值死亡日。雄性和雌性的死亡频率是相似的。所有死亡,不管原因,均包括在功效的统计学分析中。每个rHuIL-12处理组与媒介物相比显示了存活的统计学显著的增加(时序检验p<0.05)。在媒介物组中,2/18的动物存活(11%,均是雄性),而33%(3只雄性和3只雌性)、39%(4只雄性和3只雌性)、39%(4只雄性和3只雌性)和50%(5只雄性和4只雌性)分别在rHuIL-12处理组2-5中存活。rHuIL-12-处理组之间的成对比较没有显示出显著差异。
第60天之前计划外的死亡的可能的原因主要是感染。而且,在各种器官中观察到出血的宏观和微观证据。
血液学
血小板的血球计数、平均血小板体积、中性粒细胞、淋巴细胞和网状细胞分别呈现在图2A-E中。在对应于基准水平的预辐射时间点处,和其后在5、10、12、14、16和18天的照射后时间点处——其对应于在HSARS模型中可见的严重的血球减少的时期,和在30、45和60天处,完成血液学测量以评估存活的动物中至基准水平的恢复。
血小板
血小板最低点在第12或14天出现,这取决于给药组。显著的血小板减少(<50×109个/L)在10-15天间隔内存在。对照组的最低点平均数是10.1×109个血小板/L,其比处理组中的每个的最低点平均数更低,最低点平均数在rHuIL-12处理组2-5中分别是12.1、15.5、12.7和18.6×109个血小板/L。到第18天,在所有组的幸存者中观察到初始恢复,而且在第30天完全恢复。在第10和18天之间,患有严重的血小板减少(血小板<10×109个/L)的血液样品的比例在对照组中是33%并且在rHuIL-12处理组2-5中分别是34%、20%、22%和12%。对于500ng/kg组,与对照的成对比较是显著的(费舍尔精确检验p=0.0073)。平均血小板体积在第14和18天之间增加,其对应于从恢复的骨髓释放新鲜的血小板。与rHuIL-12处理组2-5中分别为9.21、9.13、9.56和9.17fL相比,平均峰值在对照组中是8.64fL。
中性粒细胞
中性粒细胞最低点在第10和14天之间出现,这取决于给药组。严重的嗜中性白细胞减少(<50×106个/L)在对照组中的100%动物中发生,并且分别在rHuIL-12处理组2-5中的88.9%、77.8%、83.3%和72.2%动物中发生。对照组的最低点平均数是26×106个/L,其比处理组中的每个的最低点平均数更低,最低点平均数在使用50、100、250和500ng/kg的剂量下的rHuIL-12处理的组中分别是34、54、39和78×106个/L。中性粒细胞恢复到第18天起始并且到第30天完成。在第10至18天,与50、100、250和500ng/kg的剂量下分别为46%、35%、46%和31%相比(p=0.0196、0.0005、0.0278,和<.0001,费舍尔精确检验),呈现有严重的嗜中性白细胞减少的血液样品的百分数在对照组中是67%。
淋巴细胞
淋巴细胞最低点在第10和16天之间中出现,这取决于给药组。所有组显示了下降至7-10%的预辐射水平的严重的淋巴细胞减少。淋巴细胞在对照组中的最低点平均数是0.143×109个/L,其比处理组中的每个的最低点平均数更低(在50、100、250和500ng/kg的剂量下,分别为0.163、0.213、0.220、0.239×109个/L)。在第18天,在所有组中观察到从最低点的初始恢复。到第30天,组平均水平仍在30%至近似60%的预辐射水平的范围,而在第45和60天,淋巴细胞计数在正常范围中,但是仍轻微地低于基线水平。对于雄性和雌性一起,没有达到统计显著性,但是在50、250和500ng/kg剂量水平下处理的雌性中(分别地,Sidak调节的t检验p=0.0443、0.0103和0.0211),淋巴细胞最低点在对照和使用rHuIL-12处理的动物之间的差异是统计学上显著的。
红细胞和网状细胞
红细胞最低点在所有组中在第18天出现,其代表从基线的37%降低。红细胞最低点在所有组中是可比较的(数据未显示)。网状细胞最低点在对照组中是7.1×109个/L,并且在50、100、250和500ng/kg rHuIL-12组中分别是8.7×109个/L、12.1×109个/L、9.1×109个/L和9.8×109个/L,这表明rHuIL-12对红细胞生成的刺激作用。然而,差异没有达到统计显著性。
发热性嗜中性白细胞减少
总计15只动物(8只雄性;7只雌性)被报道患有发热性嗜中性白细胞减少,并且大部分(10/15)在两种最高剂量水平的rHuIL-12下被治疗。15只动物中的十只具有阳性血培养并且最常见的细菌是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。发热性嗜中性白细胞减少在所有动物中的持续时间是1天,并且在当天或第二天导致12只动物死亡。15只动物中的三只存活至第60天(1只在250ng/kg组中和2只在500ng/kg组中)。显著地,3只存活的动物中的2只具有阴性血液培养物。
骨髓
在所有动物——其在第30天前死亡——中观察到TBI相关的骨髓细胞过少。来自这些动物的骨髓涂片在所有处理组中显示了类似的骨髓抑制效应。对于存活的动物,细胞过少在所有中到第60天被完全逆转,除一只动物(500ng/kg组)——其在肱骨骨髓中具有残留的显著的造血细胞过少,但是在其它骨髓位点中正常——之外。
在比较研究中,单独组群的动物(2只/性别/组)被暴露于与存活研究中相同的辐射水平,并且使用相同剂量水平的rHuIL-12处理。所有动物在第12天被处死,其代表基于血细胞计数的最低点的时间估算的最大骨髓抑制的天数。骨髓的组织学分析显示了严重的细胞过少以及再生袋(pocket of regeneration)(图3A)。在盲的分析中进行再生岛的数目、再生岛的总面积、以及巨核细胞的数目在每只动物中的量化。与对照相比,再生岛的数目和面积二者在rHuIL-12-处理组中更高,其中所有处理组展示出类似范围的增加值(图3B-C)。对于500ng/kg组以及在合并比较(所有处理组对对照组)中,两种参数的差异达到了统计显著性(对于再生岛的数目和面积,分别为p=0.0272和p=0.0311)。重要地,所有rHuIL-12-处理组的巨核细胞数目也比对照组更高,但是差异不是统计学上显著的(图3D)。
微生物学和病理学
感染
在对照组中,血培养阳性是86%,在rHuIL-12-处理组2-5中分别为65%、65%、47%和44%。对于两种最高剂量,差异是统计学上显著的(对于每个组,p=0.0072)。对于革兰氏阴性菌和革兰氏阴性菌二者,可见感染的流行的减少。在所有动物的尸体检查上进行心、肾、肝、双肺、脑和脾的细菌学分析。与对照相比,在rHuIL-12-处理的动物中的平均细菌生长评分存在降低(表1)。
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是来自器官和血培养物的最常见的分离物。计划外安乐死的16只对照动物中的十二只(75%)对器官培养物中的大肠杆菌是阳性的,而在rHuIL-12处理组2-5中分别为66.7%、63.6%、72.7%和55.6%。计划外安乐死的16只对照动物中的十只(62.5%)对器官培养物中的金黄色葡萄球菌是阳性的,而在rHuIL-12处理组2-5中分别为50.0%、54.5%、54.5%和44.4%。
出血
所有器官的整组平均出血评分,以及胃肠系统的单独的评分显示在表1中。虽然平均评分在对照组中比在所有rHuIL-12-处理组中更高,但是差异没有达到统计显著性,这可能是由于大量的器官与器官和动物与动物变化。显著地,在至少一个器官中具有≥4的出血评分的动物的比例在对照组中比在使用rHuIL-12处理的组中更高,并且仅在对照组的动物(2只动物)中发现了脑出血。
讨论
在此研究中使用的猕猴模型是建立的人HSARS的模型,这是由于TBI的血液学效应和导致的感染和出血的发生在此模型中与针对人报道的那些相似9,10。来自此随机的、盲的、安慰剂对照的研究的数据展现了10倍剂量范围内的单次的、皮下注射的rHuIL-12对此HSARS的猕猴模型中的致死TBI(700cGy;LD90/60)之后的存活的积极和显著作用。显著地,此作用被实现而不使用支持性护理。这些结果与在NHP中的我们的概念验证中发现的rHuIL-12对存活的有益作用一致8。
在当前的研究中,由TBI引起的临床征兆(呕吐、腹泻和体重)通常在所有治疗组之中和在性别之间是类似的(参见补充)。活动和食欲的降低,其在血细胞计数最低点以及最高比率的感染、出血和死亡的时期期间发生,在对照组中最大并且在使用rHuIL-12处理的组中较小。
辐射诱导的骨髓抑制被rHuIL-12减轻:使用rHuIL-12处理的动物组在严重的嗜中性白细胞减少和严重的血小板减少的发生率中显示了统计学上显著的降低,以及减弱淋巴细胞、中性粒细胞、血小板和网状细胞的最低点。相对于对照,平均血小板体积也在使用rHuIL-12处理的动物中增加,这表明了从骨髓释放新形成的血小板。伴随研究(companionstudy)中的骨髓再生袋的定量分析支持如下结论:单独的rHuIL-12对血细胞生成具有刺激作用,其允许骨髓的再生和主要血细胞组分的恢复。显著地,相对于对照,巨核细胞数目在rHuIL-12-处理组中也更高。如此研究中可见,rHuIL-12对多种造血谱系的体内刺激与先前的报道一致,其中IL-12体外刺激造血干细胞和祖细胞的生长(4-6),并且与我们在荷瘤小鼠中的先前的研究一致。11
与严重的嗜中性白细胞减少的降低一致,血液培养物感染阳性的发生率从对照组中的86%显著地降低为分别接受250或500ng/kg的剂量下的rHuIL-12的组中的47%和44%。这些数据展现了在TBI后24小时施用的rHuIL-12在不存在抗生素的情况下降低广谱细菌的感染性。
为了支持我们的发现:降低严重的嗜中性白细胞减少和减少感染和脓毒症,IL-12已知对先天性和获得性免疫具有多种刺激作用,其可能有助于减小感染的发生率。在照射之后的早期阶段,Th1功能由于从抗原呈递细胞的内源性IL-12分泌的阻抑被降低。12,13在照射后施用的IL-12促进存活的NK细胞、巨噬细胞和树突细胞的增殖和活化。14,15NK、巨噬细胞和树突细胞之间的三向交叉干扰(cross talk)进一步促进它们的成熟,其在TBI之后导致Th1功能的复原和早期免疫能力的建立。进一步,来自病原体-激活的树突细胞的内源性IL-12的连续产生充当正反馈环并且在维持对外源性IL-12的初始应答中发挥关键作用。17总的来说,这些IL-12生成的免疫介导的效应可以在很大程度上解释在此研究中观察到的积极的存活益处,其可能源自IL-12的抗感染性质。
与降低严重的血小板减少一致,此研究中的rHuIL-12治疗与动物——其在计划的终止之前死亡或被处死——的较低严重程度的出血相关联。为了支持我们的发现:降低的严重的血小板减少和出血,我们最近报道了在骨髓中,在造血干细胞、巨核细胞和成骨细胞上发现了IL-12受体的β2亚基(IL-12Rβ2)的表达,其对IL-12信号传导是最特异的。IL-12Rβ2受体在这些关键骨髓细胞上的存在表明通过其受体,rHuIL-12可以在辐射暴露之后促进存活的干细胞和巨核细胞的增殖和分化,其增强血小板再生和降低严重的血小板减少。rHuIL-12促进血小板的再生的能力可以在不同于HSARS减轻的适应症中具有临床重要性,这是由于当前不存在可获得的药物以在癌症患者中的骨髓抑制疗法之后促进血小板恢复。
虽然白细胞生长因子被推荐用于辐射的受害者,但是它们没有被FDA批准用于此适应症。仅存在一个公布的研究展现了联合强化的基于触发物的医疗管理(抗生素、静脉内血液产品输注、静脉内补液)的rHuG-CSF-对对照NHP9中的提高的存活。我们最近完成了随机的、盲的研究,其使单次注射的rHuIL-12或媒介物与18次注射的rHuG-CSF在没有支持性护理的NHP模型中进行比较。初步分析确认了rHuIL-12-处理组对媒介物和对G-CSF-处理组更优的存活,而G-CSF与媒介物相比不增加存活(文稿在准备中(manuscript inpreparation))。与动物功效研究同步,依照动物法规,在正常健康对象中测定rHuIL-12的安全性和耐受性。实施第一次人体(FIH)研究以经由剂量递增(在2至20μg的范围内的剂量下)测定安全的和良好耐受的rHuIL-12的剂量,接着是1b阶段扩展研究,其在从FIH研究的12μg的最安全的和良好耐受的剂量下(Gokhale等,准备中)。用于70kg成人的12μg单位人剂量可以使用基于重量的转换被转换为171ng/kg猕猴剂量,并且此剂量在有效的剂量范围内,如在我们的猕猴研究中测定的。
总之,此随机的、安慰剂对照的、盲的研究已经展现了rHuIL-12是理想的一线放射缓解物(frontline radiomitigator),这是由于当在辐射暴露之后24小时施用为单次的低剂量而没有支持性抗生素、流体或血液产品时,其增加存活和使造血系统再生的能力。对于动物法规下的任何药物研发程序,将有效的和安全的剂量从动物模型转化至人是显著的挑战。因而,我们的发现——在NHP模型中,在十倍有效剂量范围的rHuIL-12内可以实现存活的统计学上显著的增加——将为最优的人剂量选择提供明显的优势。
表格
表格1.每只动物的宏观器官出血评分和器官感染评分(平均数±SEM)
a下列组织包括在呈现在此表格中的平均出血评分的计算中:胃、回肠、空肠、十二指肠、结肠、盲肠、直肠、心、脑、肾、肝、肺、膀胱)。出血评分定义如下:0=不存在出血;1=最低程度出血(一处或多处);2=轻微出血(一处或多处);3=中等出血(一处或多处);4=显著出血(一处或多处);和5=严重出血(一处或多处)。在每只动物中,合计所有器官的评分,然后计算每个治疗组的平均评分。
b下列组织包括在GI道出血评分的计算中:胃、回肠、空肠、十二指肠、结肠、盲肠。
c对于感染评分测定,在尸体检查上收集器官样品并且培养(从分析中排除发现死亡的动物),其包括脑、心、肾、肝、双肺和脾。对每个器官进行细胞生长评分(从0到4)。在每只动物中,合计所有器官的评分,然后计算每个治疗组的平均评分。
实施例12:
用于在小鼠中的致死照射后复原血细胞生成的重组白介素-12对骨髓移植以及评估潜在的细胞靶标
除其良好表征的免疫调节作用之外,白介素-12(IL-12)还在复原由照射损伤的骨髓中的血细胞生成中发挥作用。我们先前已经报道了单独的重组鼠IL-12(rMuIL-12)而没有支持性护理,增加致死照射的小鼠的存活。在本文,我们将用于复原暴露于致死照射的小鼠的施用rMuIL-12的两种计划与骨髓移植(BMT)进行比较。每组十只动物接受下列中的一种:媒介物;全身照射(TBI)前24小时给予10ng rMuIL-12;TBI前24小时和TBI后3天给予10ng rMuIL-12;或TBI后2小时输注供体骨髓(1.1×106个细胞)。结果显示了使用rMuIL-12处理的动物中的存活率比得上BMT。此外,两种治疗的中性粒细胞、红细胞和血小板的造血恢复也是比得上的。小鼠中的体内实验显示了相对于媒介物,rMuIL-12增加IL-12受体β2亚基(IL-12β2)在骨髓源谱系阴性(Lin-)细胞——由造血干细胞/祖细胞构成的细胞亚群——上的表达。我们进一步调查了IL-12Rβ2在人造血干细胞/祖细胞(HSC)亚群上的表达。人骨髓源CD34+HSC表达IL-12Rβ2并且IL-12Rβ2与人HSC的其它标志物共表达。这些发现表明造血恢复中的IL-12功能可以通过与骨髓中表达IL-12Rβ2的干细胞相互作用驱动。这些数据激发辅助的重组人IL-12在多重临床环境中用于在骨髓清除之后增强造血恢复的研究。
用于减轻辐射诱导的造血综合征的理想药物将在辐射暴露的受害者之中模拟HSC移植的作用(促进多种骨髓细胞谱系的生长,降低发病率,和提高存活率),当施用至健康对象时将是安全的,并且可以以单一剂量水平施用至所有受害者。我们先前建议促炎细胞因子白介素12(IL-12)作为这样的候选者[1]。除其在免疫中已确定的作用之外[2],IL-12还似乎在保留损伤骨髓中的造血能力中发挥基础性作用。早期体外研究展现了IL-12连同集落刺激因子(CSF)[3]或IL-3和青灰因子(SF;还称为干细胞因子[SCF])[4,5,6]可以诱导髓样干细胞和祖细胞[6]、Lin-/Sca-1+细胞[3]、淋巴造血祖细胞[5]、或混合的红系与髓样集落[4]的增殖。Neta等的体内研究[7]展现了单独的IL-12(1μg/小鼠)保护鼠骨髓免受致死照射的作用,但是增加胃肠系统的放射敏感性。随后,Chen等[8]报道了100ng/小鼠的IL-12剂量在保护骨髓免受致死照射中是有效的,而且不增加胃肠系统的放射敏感性。我们最近已经报道了相对于安慰剂,在致死辐射后24小时施用给小鼠的10至40ng的重组鼠IL-12(rMuIL-12)的剂量增加存活、促进血细胞生成,如由骨髓细胞中IL-12受体β2亚基表达的诱导指示的[1]。进一步,在暴露于致死TBI的非人灵长类中,使用重组人IL-12(rHuIL-12)的治疗相对于安慰剂治疗的动物导致存活的显著增加,并且减弱白细胞和血小板的最低点[1]。
在当前的研究中,我们已经将rMuIL-12在诱导造血恢复和促进存活的能力与致死照射的小鼠中的常规BMT进行比较。此外,为了进一步阐明IL-12的潜在的细胞靶标,我们评估了IL-12受体的β2亚基(IL-12Rβ2)在人骨髓源FISC中的表达。
材料和方法
重组IL-12
rMuIL-12获得自Peprotech(目录#210-12)(Rocky Hill,NJ,USA)或SBH Sciences(LS#45[Q4];Natick,MA,USA)。针对每个动物实验报道的剂量是通过ELISA(小鼠IL-12(p70)ELISA MAXTM Deluxe试剂盒(Biolegend;San Diego,CA))测定的剂量。
体内动物研究
C57BL/6小鼠来自Jackson Laboratories(Sacramento,CA)或HarlanLaboratories(Indianapolis,IN)。在研究开始的同时,小鼠是8至10周龄,称重为大约20g,并且没有疾病的迹象。所有程序被BATT’S(Northridge CA)Laboratories实验动物管理与使用委员会(其由国际实验动物评估和认可委员会和美国实验动物协会认可)审查和批准,并且根据美国国立卫生研究院的指导[9]。
rMuIL-12和BMT对暴露于致死辐射的小鼠的存活的作用的比较
在暴露于致死TBI的40只雌性小鼠中比较rMuIL-12和BMT对存活的作用。每十只小鼠被分配下列静脉治疗中的一种:TBI前24小时施用媒介物(磷酸盐缓冲盐水[PBS];100μL);TBI前24小时施用10ng rMuIL-12(下文称为单剂量rMuIL-12);TBI前24小时和TBI后3天施用10ng rMuIL-12(下文称为重复剂量rMuIL-12);或TBI后2小时施用供体骨髓(1.1×106个细胞)。通过使用25-号5/8-英寸针以PBS冲洗股骨和胫骨从正常雌性C57BL/6小鼠分离用于移植的供体骨髓细胞。细胞过滤通过40μm细胞渗滤器,使用含有10%胎牛血清的RPMI进行清洗,和冷藏在液氮中。在第0天,使用40(137Cs)(Theratronics,Ontario,Canada)使小鼠暴露于8.2Gy的剂量下的TBI(靶向的LD90[1])。小鼠被集中在使用“圆形分格盒”以便辐射均匀的辐射器中。在TBI之后,小鼠可以自由采食无菌的食物和酸化的水,并且被监测存活直至第35天。在第21、28和35天从每个组中的5只动物抽血。通过850(Drew Scientific Inc.;Waterbury,CT)测定血细胞计数。
rMuIL-12对健康雌性C57BL/6小鼠中的Lin-细胞上的IL-12Rβ2受体β-2亚基(IL-12Rβ2)表达的体内作用的流式细胞术分析
小鼠(每个处理组6只)经由尾静脉注射接受rMuIL-12(10ng)或媒介物(PBS)。在rMuIL12处理后21小时采集骨髓。从股骨和胫骨冲洗出的骨髓使用MACS缓冲液(MiltenyiBiotec;Auburn,CA)进行稀释并且过滤通过70μm细胞渗滤器(VWR;San Francisco,CA)。细胞被清洗并且使用抗下列鼠谱系标志物(Lin+)——CD3e、CD4、CD5、CD8b、CD8a、B220、CD11b、Grl和Ter(80)——的生物素缀合的单克隆抗体(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)进行培育。使用抗生物素标记的磁珠培育细胞,并且使其穿过放置在QuadroMACS分离器(Miltenyi Biotec;Auburn,CA)的磁场中的MACS柱。未标记的Lin-细胞被收集作为流出物,并且使用抗小鼠IL-12Rβ2抗体(HAM 10B9,BD Biosciences;San Jose,CA)在室温下培育30分钟。使用未染色的对照和同种型对照在MoFlow细胞计数器(Beckman Coulter;Indianapolis,IN)上分析细胞。使用在rMuIL-12后25小时采集的骨髓重复实验,并且如早前提及的,对Lin-细胞进行IL-12Rβ2表达分析。
人骨髓CD34+细胞中IL-12Rβ2的免疫细胞化学检测
人骨髓源CD34+细胞商购自All Cells(Emeryville,CA)。细胞被接种在5μg/mL纤连蛋白载玻片上,并且在冷甲醇中固定10分钟(20℃)。使用0.3%H2O2处理固定的细胞持续30分钟以消除内源性过氧化物酶染色,并且然后使用Background Sniper(BiocareMedical;Concord,CA)处理20分钟以消除非特异性染色。处理的细胞标记有抗人IL-12Rβ2的兔多克隆抗体(Sigma;St Louis,MO),接着使用与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG(ImmPRESS reagent;Vector Laboratories;Burlingame,CA)进行培育。载玻片使用InimPACT AEC过氧化物酶底物(Vector Laboratories;Burlingame,CA)培育30分钟并且在CAT苏木精(Biocare Medical,LLC;Concord,CA)中进行复染。阴性对照包括在没有初次抗体的情况下标记有与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG的细胞。使用Olympus BX41复显微镜(Olympus,America,Inc;Center Valley,CA)和Infinity分析软件v5.0获取图像。使用来自三个独立供体的CD34+细胞一式三份地完成分析。
人骨髓源干细胞/祖细胞上IL-12Rβ2的表达的流式细胞术分析
如上面描述的,商购人骨髓源CD34+细胞。CD34+细胞被清洗并且在室温下使用LIVE/DEAD可固定死细胞染料(Invitrogen;Grand Island,NY)——其是存活力标志物——培育30分钟。细胞被清洗并且使用下列造血干细胞标志物中的每个的抗体进行培育:异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的cKit/CD117(克隆#YB5.B8;BD Biosciences;San Jose,CA)、藻红蛋白(PE)-缀合的CD133(克隆#293C3;BD Biosciences)、PE-Flt-3/CD135(克隆#4G8;BDBiosciences)、PE-Slam/CD150(克隆#Al2;BD Biosciences)、PE-VegfR2/KDR(克隆#89106;R&D systems;Minneapolis,MN)、PE-CDCP1/CD318(克隆#309121;R&D systems)、FITC-CD34(克隆#AC136;Miltenyi Biotec;Auburn,CA)。平行分析上面列举的每种抗体的同种型匹配的对照以测定背景荧光。细胞被清洗并且使用BD Cytofix/Cytoperm固定/透性化试剂盒(BD Biosciences;San Hose,CA)进行固定和透性化。使用抗人IL-12Rβ2的别藻蓝蛋白-缀合的(APC)抗体(克隆#305719;R&D systems;Minneapolis,MN)测定细胞内IL-12Rβ2。平行分析IL-12Rβ2抗体的同种型匹配的对照。使用位于University of Southern California-Health Science Campus的Broad CIRM Center的特别订购的研究产品(Special OrderResearch Product)(SORP)BDTM LSRII数字流式细胞仪(BD BioScience;San Jose,CA;License#H47300022)——其装备有三个高功率的固体激光器(488nm、635nm和近似UV的波长)——分析细胞。此细胞计数器专门用于获取具有高至10种荧光参数的数据。使用Flow.Jo版本9.5.2(TreeStar,Ashland,USA)分析数据。门控策略如下:标绘前向散射对侧向散射以选择CD34细胞,侧向散射对活/死细胞染色用于排除死细胞,高度对面积散射以排除双联体(数据未显示)和IL-12Rβ2对干细胞标志物。基于同种型匹配的抗体对照设定象限门(Quadrant gate)。使用来自三个独立供体的CD34+细胞一式三份地完成分析。
统计学分析
使用Cox-Mantel检验在统计学上比较所有处理组的存活曲线。通过学生t检验分析所有组的血细胞恢复。当可适用时报道平均值与标准偏差。
结果
rMuIL-12与BMT一样有效地增加暴露于致死辐射的健康小鼠的存活和促进血细胞恢复
在暴露于致死TBI的C57BL/6小鼠中,BMT和单剂量或重复剂量的rMuIL-12显示了与媒介物相比增加存活的类似的能力(图I),其中第35天时,媒介物组中的总存活(OS)是0%,BMT组中是70%,单剂量rMuIL-12组中是60%,和重复剂量rMuIL-12组中是90%。使用rMuIL-12的OS比得上使用BMT的OS。使用Cox-Mantel检验,rMuIL-12组和BMT组中的每个中的OS显著地高于媒介物组(对于每次比较,P<0.005)。在第21天,BMT组中的中性粒细胞水平显著地高于单剂量rMuIL-12(p<0.05)(图2A)。重复剂量rMuIL-12组中的中性粒细胞水平不在统计学上不同于BMT组。在第28天和第35天,所有处理组中的中性粒细胞水平在统计学上是比得上的。在第21天,BMT组中的RBC水平显著地高于两个rMuIL-12组(p<0.005)(图2B)。在第28天和第35天,所有处理组的RBC水平是比得上的。在第21天,重复剂量rMuIL-12组与单剂量rMuIL-12(p<0.005)和BMT(p<0.05)相比的血小板水平显著更高(图2C)。在第28天和第35天,所有处理组中的血小板水平在统计学上是可比较的。误差线代表平均值±SD。总之,到第35天,使用rMuIL-12的中性粒细胞、血小板、和红细胞(RBC)的恢复比得上BMT。
使用rMuIL-12的体内治疗增加骨髓源谱系耗尽的(Lin-)细胞上IL-12受体β-2亚基(IL-12Rβ2)的表达
为了阐明IL-12Rβ2在鼠骨髓中的表达,我们使用单次的、静脉内的10-ng剂量的rMuIL-12(n=6)或媒介物(n=6)经由尾静脉注射处理健康雌性C57BL/6小鼠,并且检查IL12Rβ2在从骨髓分离的Lin-细胞中的表达。来自两个实验的结果显示了在处理后21至25小时rMuIL-12诱导Lin-细胞上IL-12Rb2的表达的3.5倍至5.4倍增加(平均值(±SD)-4.45±1.3)(表1)。Lin-细胞代表由造血干细胞/祖细胞构成的细胞群并且耗尽成熟的造血细胞和定型前体祖细胞。我们的数据显示IL-12增加鼠骨髓中的Lin-细胞上的IL-12Rβ2表达。此数据与IL-12的造血恢复功能表明IL-12Rβ2可以在HSC上表达。
人骨髓CD34+细胞表达IL-12Rβ2
我们接下来阐明了表达人骨髓CD34的HSC上的IL-12Rβ2表达。首先,使用免疫细胞化学染色,我们展现了商购的人骨髓CD34+细胞上IL-12Rβ2的存在(图3A)。其次,我们通过流式细胞术量化了人CD34+细胞上IL-12Rβ2的表达。在来自被测试的三个独立供体的CD34+细胞之中,表达IL-12Rβ2的平均(±SD)百分数是89±2(图3B)。
人骨髓CD34+细胞共表达IL-12Rβ2和其它已知的造血干细胞/祖细胞(USC)标志物
我们接下来试图检查IL-12Rβ2与HSC标志物CD117、CDI33、CD135和CD318共表达以进一步支持我们的如下观察:IL-12Rβ2在CD34+细胞上表达。选择这些标志物,因为它们已经被显示代表具有移入潜力的HSC群体[18,23,24,25,26,27]。IL-12Rβ2在人骨髓CD34+细胞上与CD 117、CD133、CD135和CD318共表达。共表达IL-12β2与CD117、CD133、CD135和CD318的CD34+细胞的平均百分数分别是70±11%、63±7%、57±4%和61±9%(表2和图4A到4D)。显著地,表达大多数的CD 117、CD133、CD135和CD318的CD34亚群显示了IL-12Rβ2表达。这些结果表明了IL-12Rβ2经由骨髓中的HSC群体在IL-12介导的造血恢复中的潜在作用。
讨论
当前的研究比较致死照射的小鼠中由使用rMuIL-12或BMT的治疗引起的体内造血活性和存活益处。结果展现了与媒介物对照相比,使用BMT或一个或两个10ng剂量的rMuIL-12治疗的照射的小鼠具有显著增加的存活。三种积极治疗组之中的存活曲线彼此没有显著地不同。到第35天,在所有三种积极治疗组中观察到中性粒细胞、RBC和血小板的比得上的恢复。与支持IL-12/IL-12R在血小板恢复中的作用的BMT相比,重复剂量rMuIL-12中的血小板水平在较早的时间点第21天显著更高。这些数据确认和拓展了辣子我们实验室[1]和来自其它调查者[7,8]的先前的数据。我们也已经在荷载Lewis肺和EL4淋巴瘤肿瘤的亚致死照射的小鼠中观察到rMuIL-12对血细胞恢复的类似的作用[10]。
rMuIL-12促进存活和照射的鼠骨髓中的血细胞恢复的能力表明功能性IL-12受体(IL-12R)存在于骨髓细胞上。IL-12受体是异二聚体跨膜蛋白,其由与IL-23受体复合体共有的β1亚基(IL-12Rβ1)[11]和IL-12受体特异性β2亚基(IL-12Rβ2)[2]构成。使用免疫组织化学分析,我们先前报道了IL-12Rβ2在小鼠的骨髓细胞上表达[1]。因为鼠骨髓免疫组织化学数据表明IL-12治疗促进造血骨髓细胞的增殖和分化,在当前的文章中,我们检查正常小鼠中的rMuIL-12治疗是否将影响Lin-群体——其代表造血干细胞/祖细胞群——中的IL-12Rβ2表达。结果显示相对于对照小鼠,使用rMuIL-12治疗的那些显示了IL-12Rβ2在骨髓源Lin-细胞上的表达的3至5倍增加。
我们进一步试图测定IL-12Rβ2是否在人骨髓中表达。免疫细胞化学显示了IL-12Rβ2在人骨髓源CD34+细胞中的存在,并且流式细胞术分析揭示了CD34+细胞表达12Rβ2。当前的研究是第一次显示IL-12Rβ2在人CD34+细胞——其代表骨髓中造血干细胞和祖细胞的混合群体——上表达。我们在87-90%的正常人骨髓源CD34+细胞——其代表具备长期重建潜力并且在临床环境中用于骨髓移植的细胞群——中认定了IL-12Rβ2表达[12,13,14]。进一步,表达标志物CD117(c-Kit)、CD133、CD135(Flt3)和CD318(CDCP1)——其全部已经被用于鉴定HSC群体——的CD34细胞的亚群共表达IL-12β2。CD 117是SCF的受体,其已经显示起参与HSC的扩展的造血生长因子的作用[15]并且已经涉及HSC的动员[5,15]。有趣地,IL-12和SCF已经显示协同地支持淋巴造血祖细胞的增殖[5]。CD133已经被报道在神经和造血干细胞/祖细胞中表达[16],并且CD34+/CD133+细胞可以在NOD/SCID小鼠中移入[17]。受体酪氨酸激酶家族的成员CD135在造血稳态的维持中发挥至关重要的作用,并且已经涉及造血祖细胞的扩展[18]。Flt3-受体已经显示在骨髓HSC的扩展中与IL-12和其它细胞因子与生长因子协同[19]。CD318+细胞已经显示当在NOD/SCID小鼠中移入时具备多谱系分化潜力[20]。总的来说,来自鼠和人骨髓的IL-12Rβ2表达数据表明表达IL-12Rβ2的HSC可以是IL-12的造血活性的潜在靶标。
IL-12刺激血细胞生成和促进具有致死损伤骨髓的动物的存活的明显的能力表明IL-12在损伤骨髓的状况下可以是有用的疗法,无论是临床诱导的,作为移植前的方案的一部分,或作为辐射事故或灾难的结果。HemaMaxTM(Neumedicines Inc.;Pasadena,CA),一种重组人白介素-12制剂(rHuIL-12),正在FDA动物法规被研发用于治疗急性辐射综合征的造血综合征(HSARS)。我们最近已经报道了在暴露于致死辐射后24小时施用的单次的低剂量(100ng/kg或250ng/kg)的HemaMaxTM可以在非人灵长类(NHP)中重建骨髓和增加存活[1]。此外,我们的数据显示了rHuIL-12减弱致死照射的NHP中的白细胞和血小板的最低点[1]。
关于肿瘤学环境中的BMT,IL-12的造血性质可以适用为辅助疗法。骨髓干细胞动员的改进技术,研发单采血液成分术方法用于它们的收集,和使用新策略用于降低毒性已经改进了HSC移植的结果并且将其治疗价值拓展至更广泛的癌症患者群体[21,22,23]。然而,HSC移植的成功主要受造血系统的长期重建需要的细胞的数目限制。常规移植采用CD34+细胞,其通过使用生长因子比如G-CSF的动员被分离,但是多轮的G-CSF处理以分离足够数量的CD34+细胞的需要可以是免疫抑制性的[24,25]。髓样和红系生长因子被用于治疗移植后嗜中性白细胞减少和贫血[26],但是不影响血小板再生。因而,为了克服移植后血小板减少,其可以在多达17%的患者——其患有癌症和具有显著增加的死亡风险——中发生[27],患者必须依赖于移植后早期血小板输血[28]。如在当前的研究以及在我们先前的研究中观察到的,在暴露于致死辐射的小鼠中,在IL-12治疗后观察到增加水平的血小板[1,10],这表明IL-12可以有利于在人中促进移植后血小板恢复。
虽然众多临床试验已经评估了IL-12在癌症患者中作为抗肿瘤剂,但是该药剂由于其中等的临床活性和显著的毒性——当作为重复的高剂量(300ng/kg至600ng/kg)方案(每周5个剂量)施用时——还没有被研发为疗法[29,30,31,32,33,34,35,36,37]。相比之下,在外周血干细胞移植后大约2个月作为单剂量给予并且然后在2周后持续连续5天的30至250ng/kg的IL-12剂量在患有高风险血液恶性肿瘤的患者中显示了可接受的耐受性[37]。如上文记载的,rHuIL-12,如其鼠对应体,当给暴露于致命TBI的猕猴施用仅一次或两次时,在100至250ng/kg的剂量下发挥其造血促进活性[1]。这些剂量等价于小于100ng/kg的人剂量。在我们当前的1期人安全性研究中,rHuIL-12已经良好耐受并且没有鉴定出安全问题(Neumedicines,Inc.,未公布的数据)。这些发现表明造血再生需要的rHuIL-12剂量将基本上低于先前在癌症患者中使用的IL-12剂量,并且应当在ARS和用于癌症的HSC移植二者的环境中导致更有利的rHuIL-12的安全概况。
结论
我们已经展现了rMuIL-12等价于BMT,用于在暴露于致死辐射的小鼠中促进造血恢复和存活,并且rMuIL-12治疗增加IL-12Rβ2表达在从正常小鼠分离的Lin-细胞中的水平。进一步,来自正常人骨髓的CD34+细胞被发现表达IL-12Rβ2。观察到IL-12Rβ2还与其它已知的HSC标志物共表达。这些发现开始公开IL-12/IL-12R系统对干细胞生物学和再生医学的重要性,并且表明此途径代表用于在经历HSC移植或在核灾难中遭受致死辐射暴露的作用的患者中增加复原和存活的治疗靶标。因而,临床研究被批准评估辅助的rHuIL-12疗法在这些环境中的安全性和功效。
表1.rMuIl-12对从鼠骨髓分离的Lin-细胞中IL-12Rβ2的表达的作用
注:分别在实验1和2中,使用在使用rMuIL-12的治疗后21小时或25小时收集的骨髓Lin细胞实施流式细胞术分析。
*数据代表6只小鼠/治疗组/实验的平均值。
表2.共表达IL-12Rβ2和其它造血干细胞标志物的人骨髓-CD34+细胞的百分数
注:数据代表基于来自三个不同的健康生物供体的细胞的概括统计
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Claims (28)
1.用于复原血细胞生成和减少感染并发症的药物组合物,其中:
(a)所述药物组合物包括IL-12,并且
(b)使用所述药物组合物复原血细胞生成和减少感染并发症的方法包括在清髓性疗法之后、清髓性疗法之前、或清髓性疗法之前和之后施用一种或多种有效剂量的所述药物组合物。
2.用于复原血细胞生成的药物组合物,其中:
(a)所述药物组合物包括IL-12,并且
(b)使用所述药物组合物复原血细胞生成的方法包括在清髓性疗法前、清髓性疗法后、或清髓性疗法之前和之后施用一种或多种有效剂量的所述药物组合物,其中血细胞生成经由骨髓中的造血细胞上IL-12受体的活化被复原。
3.权利要求1或2所述的药物组合物,其中在所述清髓性疗法中使用放射疗法。
4.权利要求1或2所述的药物组合物,其中在所述清髓性疗法中使用化学疗法。
5.权利要求1或2所述的药物组合物,其中所述清髓性疗法是放射疗法和化学疗法的组合。
6.权利要求1-5中任一项所述的药物组合物,其中血细胞生成经由骨髓中增加数目的祖细胞被复原。
7.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物,其中血细胞生成在外周血中被复原。
8.权利要求7所述的药物组合物,其中外周血计数增加。
9.权利要求7或8所述的药物组合物,其中血小板增加。
10.权利要求7-9中任一项所述的药物组合物,其中白细胞增加。
11.权利要求7-10中任一项所述的药物组合物,其中网状细胞增加。
12.权利要求7-11中任一项所述的药物组合物,其中红细胞增加。
13.权利要求2-12中任一项所述的药物组合物,其中所述造血细胞包括隔细胞和干细胞。
14.权利要求13所述的药物组合物,其中所述隔细胞包括成骨细胞。
15.权利要求2-12中任一项所述的药物组合物,其中血细胞生成在巨核细胞上的IL-12受体的活化之后被复原。
16.权利要求15所述的药物组合物,其中所述巨核细胞是未成熟的。
17.权利要求2-14中任一项所述的药物组合物,其中血细胞生成在骨髓中的成骨细胞、巨核细胞和造血干细胞上IL-12受体的活化之后被复原。
18.权利要求1-17中任一项所述的药物组合物,其中所述清髓性疗法在自体移植之前。
19.权利要求1-17中任一项所述的药物组合物,其中所述清髓性疗法在同种异体移植之前。
20.权利要求1-19中任一项所述的药物组合物,其中造血干细胞的动员和收集在清髓性疗法之前完成。
21.权利要求20所述的药物组合物,其中造血干细胞的动员和收集产生低的CD34+细胞计数。
22.权利要求1-21中任一项所述的药物组合物,其中给予所述清髓性疗法以治疗造血恶性肿瘤,其选自慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、低度非何杰金淋巴瘤、急性髓性白血病、中度淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和何杰金病。
23.权利要求1或2所述的药物组合物,其中所述疗法是非清髓性的。
24.权利要求23所述的药物组合物,其中给予所述非清髓性疗法以治疗造血恶性肿瘤,其选自慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、低度非何杰金淋巴瘤、急性髓性白血病、中度淋巴瘤、多发性骨髓瘤、和何杰金病。
25.权利要求23所述的药物组合物,其中给予所述非清髓性疗法以治疗实体恶性肿瘤。
26.权利要求23所述的药物组合物,其中所述非清髓性疗法包括小移植。
27.权利要求23所述的药物组合物,其中所述非清髓性疗法包括降低强度调理(RIC)。
28.权利要求1-27中任一项所述的药物组合物,其中所述IL-12是重组人IL-12。
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