CN107189962B - 一种含氮杂环化合物降解菌及其应用 - Google Patents

一种含氮杂环化合物降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含氮杂环化合物降解菌及其应用，所述含氮杂环化合物降解菌分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ‑7，属于革兰氏阳性菌类。其已于2017年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.14162。本发明的阿氏芽孢杆菌FAQ‑7作为含氮杂环化合物降解菌降解性能稳定，降解底物范围较广，同时具有降解吡啶及其衍生物甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉及其衍生物甲基喹啉，72 h内总降解率分别达到92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%。可耐受300 mg/L的含氮杂环化合物浓度，尤其适用于含氮杂环化合物废水的生物处理。

Description

一种含氮杂环化合物降解菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种含氮杂环化合物降解菌及其应用。
背景技术
含氮杂环化合物是主要的杂环化合物，多数气味恶臭且毒性大，不仅对人体健康与生态环境造成威胁，还对微生物产生抑制作用。其通常被用作医药和农药的结构单元，是焦化废水有机污染物质的主要组分，占总有机组分的 20-30%，含量超过 200 mg/L，广泛存在于染料废水、医药废水、农药废水等工业废水及木材防腐处理场地周围的土壤和地下水中，易于进行结构修饰，可方便地引入各种功能基。
废水处理中常见的含氮杂环化合物主要有吡咯、吡啶、喹啉、甲基喹啉及其衍生物等。由于吡啶与喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，又是大量复杂含氮杂环化合物的基本结构单元，而且这两类化合物均属于难降解有机物，在普通生物处理单元中不易彻底去除，同时吡啶与喹啉对许多微生物还会产生毒害作用，从而影响其它化合物的去除效果。另外这些物质在环境中长期积累，不仅污染环境，而且影响人类生活，损害人体健康。
含吡啶环的氮杂环化合物( 简称吡啶类化合物) 数目尤其庞大，且易溶于水，化学性质稳定，极易通过扩散进入地下水系统导致水环境的污染。呈中度急性毒性，有明显的致畸变性，神经系统有致毒作用，对人类的健康构成潜在的威胁。另外吡啶对微生物呈强烈抑制作用，并且难于被空气氧化，因而给地面水的自净及污水的无害化处理过程造成困难，是造成这类废水难生物降解的主要原因。喹啉是一种典型的含氮杂环化合物，在化工工业、医药及农药生产中经常用作溶剂和原材料。炼焦企业生产过程产生的焦化废水中含有喹啉类杂环化合物，是典型的有毒难降解污染物，也是造成其出水不能达标的关键因素。因此，随着工业生产中废水的排放，喹啉已成为土壤、地表水及地下水中常见的污染物。
与脂肪族或芳香族化合物相比，含氮杂环化合物不易受到代谢过程的破坏，其生物降解性能也很差，并且此类物质中许多有致癌、致畸、致突变的性质，对环境和人体健康会产生潜在的危害，因此很多研究者对含氮杂环化合物的生物降解特性展开了研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种含氮杂环化合物降解菌及其应用，所述阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7在好氧条件下降解吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种含氮杂环化合物降解菌，其分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7，其已于2017年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.14162。所述阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7能以含氮杂环化合物为唯一碳源、氮源。
本发明所得菌株筛选自农药废水和焦化废水处理池的活性污泥，经过含吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉混合污染物的富集培养基富集培养，再以含氮杂环化合物为唯一碳源、氮源的无机盐培养基分别驯化培养、筛选、分离、纯化获得。具体方法如下：
1) 取农药废水和焦化废水处理池活性污泥10 mL，加入到100 mL含氮杂环化合物浓度300 mg/L无机盐液体培养基中，于30℃、160 r/min条件下富集培养。以10%接种量转入到新的含氮杂环化合物无机盐液体培养基中，富集转接4次，获得富集液；
2) 取富集液1 mL进行梯度稀释，取10-1~10-8稀释后的液体0.2 mL涂布于含氮杂环化合物固体培养基，挑取单菌落分离纯化。所述无机盐培养基组成：每1 L培养基含K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g 以及 1 mL 微量元素溶液，pH = 7.0，121℃灭菌 20 min。固体培养基为在无机盐培养基基础上加2.0%的琼脂。
该菌株为革兰氏阳性、具有运动性，菌落圆形、平滑、呈淡黄色、直径2-3mm，能够在10℃-37℃、pH 6-10蛋白胨琼脂培养基上生长，耐受11.6%的盐，从各种碳源中产酸并且利用一些糖类、氨基酸和其它碳物质作为唯一的碳源。
所述菌株能以吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉为唯一碳源、氮源和能源生长，在无机盐培养基中，当吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的浓度300 mg/L时，接种阿氏芽孢杆菌能明显促进含氮杂环化合物的降解，72 h内吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率分别为92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%。
所述菌株的培养方法：将所述菌株在LB培养基上进行活化。挑取单菌落接种于5mLLB培养基中，于30℃、160 r/min震荡培养至对数期。按2%接种量接种于无机盐培养基中于30℃、160 r/min震荡培养得到相应菌剂。所述LB培养基组成：每1 L培养基含NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，固体培养基加2%琼脂。无机盐培养基组成：每1 L培养基含 K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1 g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g 以及 1 mL 微量元素溶液，pH =7.0。121℃灭菌 20 min。
所述含氮杂环化合物降解菌在降解氮杂环化合物中的应用。
所述含氮杂环化合物降解菌在修复含氮杂环化合物污染土壤或者水体中的应用。
将阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7在LB培养基中培养到对数期，然后接种至氮杂环化合物培养基或者含氮杂环化合物污染土壤或者水体中，进行降解反应。
所述降解反应过程的温度为20℃-30℃，优选为30℃，pH 5.0-7.0，优选为pH7.0。
所述含氮杂环化合物为单杂环化合物中的六元杂环或者稠杂环化合物。
所述含氮杂环化合物为吡啶及其衍生物甲基吡啶和甲基哌嗪等，或者喹啉及其衍生物甲基喹啉等。
所述阿氏芽孢杆菌能以含氮杂环化合物为唯一碳源、氮源，可以直接将菌液加入到待处理的土壤或污染水中，降解污染物。
有益效果：
本发明所述阿氏芽孢杆菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于含氮杂环化合物污染土壤及水的生物修复。本发明所所述菌株能使焦化厂废水中喹啉等含氮杂环化合物的降解率达到95%以上。在无机盐培养基中，当吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的浓度300 mg/L时，接种阿氏芽孢杆菌能明显促进含氮杂环化合物的降解，72 h内吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率分别为92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%，降解效率高。
附图说明
图1阿氏芽孢杆菌菌落形态图；
图2阿氏芽孢杆菌株对含氮杂环化合物的降解率图；
图3温度对阿氏芽孢杆菌降解效率的影响；
图4 pH对阿氏芽孢杆菌降解效率的影响。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1 阿氏芽孢杆菌的分离与鉴定
现场采集农药废水和焦化废水处理池的活性污泥各5mL，加入到100 mL含氮杂环化合物总浓度300 mg/L的无机盐培养基中，在30℃、160r/min条件下进行富集培养。以10%接种量转入到新的含氮杂环化合物无机盐液体培养基中，经过4次连续转接，获得富集液。取富集液1 mL进行梯度稀释，取10-1~10-8稀释后的液体0.2 mL涂布于含氮杂环化合物固体培养基，挑取单菌落分离纯化，得到纯菌，纯菌再接种至液体培养中验证其降解含氮化合物能力。最后得到一株能够高效降解含氮化合物的菌株，如图1所示。经过16s rDNA鉴定为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7；所述无机盐培养基组成：每1 L培养基含K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g 以及 1 mL 微量元素溶液，pH = 7.0，固体培养基再加2.0%的琼脂，121℃灭菌 20 min。
该菌株为革兰氏阳性、具有运动性，菌落圆形、平滑、呈淡黄色、直径2-3mm，能够在10℃-37℃、pH 6-10蛋白胨琼脂培养基上生长，耐受11.6%的盐，从各种碳源中产酸并且利用一些糖类、氨基酸和其它碳物质作为唯一的碳源。
实施例2阿氏芽孢杆菌降解含氮化合物能力实验
将上述鉴定为阿氏芽孢杆菌的菌株FAQ-7以6%接种量分别接种至含有300 mg/L含氮杂环化合物吡啶、甲基吡啶、哌嗪、喹啉和甲基喹啉培养基中，在30℃、160 r/min条件下摇床中培养。72 h后分别测定含氮化合物含量。由图2可知72 h内，降解率分别达到92.19%、100%、100%、92.68%和93.27%。
实施例3 温度对降解效率的影响
将在LB培养基中培养到对数期的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7的菌株，以6%的接种量接到含有300 mg/L的培养基中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃，160 r/min摇床上，72 h后测定含氮杂环化合物的含量，如图3所示。在20℃-30℃范围内降解率在不断上升，在30℃时，降解率几乎都达到100%；当温度为35℃和37℃时，降解率下降。以上结果表明含氮杂环化合物的最适降解温度都为30℃。
实施例4 pH对降解效率的影响
将在LB培养基中培养到对数期的阿氏芽孢杆菌FAQ-7的菌株，以6%的接种量接到含有300 mg/L的培养基中，pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，160 r/min摇床上，72 h后测定含氮杂环化合物的含量，如图4所示。在pH 5.0-7.0范围内阿氏芽孢杆菌对吡啶、甲基吡啶、哌嗪、喹啉和甲基喹啉的降解率在不断上升，在pH 7.0时，降解率几乎都接近100%；当pH 8.0-9.0时，降解率明显下降。以上结果表明含氮杂环化合物的最适降解pH都为pH 7.0。
实施例5 阿氏芽孢杆菌对污染水体中含氮杂环化合物的降解
取广东省某焦化污水厂的活性污泥5g加入100 mL无机盐培养基中，测定其中喹啉、吡啶等含氮杂环化合物的含量，并且以6%接种量接种阿氏芽孢杆菌FAQ-7菌株。置于30℃、160 r/min条件下摇床中培养。72h后再次测定其中喹啉、吡啶等含氮杂环化合物的含量，降解率达到95%以上。所述无机盐培养基组成：每1 L培养基含 K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 1g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.02 g 以及 1 mL 微量元素溶液，pH = 7.0，121℃灭菌 20 min。

Claims (6)

1.一株含氮杂环化合物降解菌，其分类命名为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.14162；所述含氮杂环化合物为吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉或者甲基喹啉。
2.权利要求1所述含氮杂环化合物降解菌在降解含氮杂环化合物中的应用，所述含氮杂环化合物为吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉或者甲基喹啉。
3.权利要求1所述含氮杂环化合物降解菌在修复含氮杂环化合物污染土壤或者水体中的应用，所述含氮杂环化合物为吡啶、甲基吡啶、甲基哌嗪、喹啉或者甲基喹啉。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，将阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7在LB培养基中培养到对数期，然后接种至含氮杂环化合物培养基或者含氮杂环化合物污染土壤或者水体中，进行降解反应。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降解反应过程的温度为20℃-30℃，pH5.0-7.0。
6.一种含有权利要求1所述阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）FAQ-7的菌剂。
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