CN107184994A - 一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 - Google Patents
一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107184994A CN107184994A CN201710418737.9A CN201710418737A CN107184994A CN 107184994 A CN107184994 A CN 107184994A CN 201710418737 A CN201710418737 A CN 201710418737A CN 107184994 A CN107184994 A CN 107184994A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liver cancer
- ultrasonic
- endoglin
- dspe
- dppe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 claims abstract description 22
- QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QFMZQPDHXULLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 9
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000012085 Endoglin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960004065 perflutren Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 22
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- -1 Palmitic acid acyl phosphatidyl-ethanolamine Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N n-hexadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000002607 contrast-enhanced ultrasound Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/227—Liposomes, lipoprotein vesicles, e.g. LDL or HDL lipoproteins, micelles, e.g. phospholipidic or polymeric
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肝癌超声诊断靶向试剂,该试剂为Endoglin靶向微泡,该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯,所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。其中,所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成;所述气体内芯为生物惰性气体,进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。本发明设计的一种肝癌超声诊断靶向试剂,可以通过静脉注射使靶向微泡穿过肿瘤血管,进入肿瘤组织间隙,与成体血管内皮细胞和间质细胞特异性结合,从而在肿瘤部位有效富集以及停留延长,通过聚集成像清晰区分病变组织和周围的正常组织,应用非线性谐波成像技术,达到肝癌的靶向分子显影。
Description
技术领域
本发明涉及超声诊断用靶向试剂,具体涉及一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法。
背景技术
肝癌在亚洲是一种可引起高死亡率的侵袭性癌症,早期诊断和治疗对于提高肝癌患者的存活几率非常重要。超声检查由于其无创无辐射、操作方便、价格低廉、对设备场地要求低等优势,是临床诊断肿瘤的重要手段,然而,由于超声诊断自身局限性,较小的肝癌组织难以检测出来。
随着各种新型超声造影剂的出现和超声显像技术的不断发展,微泡造影剂(如国内临床采用Braco公司生产的Sonovue造影剂)开始应用于恶性肿瘤的检查,但其敏感性较低,特异性不高,是一种无定向选择作用的全身性造影剂。此外,尚有采用全氟溴辛烷等氟碳制备纳米造影剂的报道(张华娟等.一种全氟碳化合物脂质体纳米球及其制备方法.中国专利,申请号201210549252.0),从而克服微泡造影剂无法达到血管外肿瘤组织成像的。但是,早期肝癌病人的临床症状相对隐蔽,这为肝癌的诊断带来了很大的困难。
国内外近几年已经开始了靶向超声造影剂的相关研究,通过通过靶向超声造影剂,使其聚集于靶组织,达到特异性增强显影效果。与普通超声造影剂相比,靶向超声造影通过特异性作用于病变区生物分子组成成分,来突出显示病变部位,从而提高超声诊断的准确性与敏感性。通常是将靶向超声造影剂是将特异性抗体或配体与微泡表面连接,静脉注射后,使其能够较长时间定向地聚积于靶组织或器官,使靶区超声图像特异性增强或进行靶向治疗。
现有技术中,将特异性抗体或配体与微泡表面连接方式通常采用将特异性抗体或配体生物素化,而后再添加亲和素,然后通过亲和素和生物素的连接作用使得特异性抗体或配体与微泡进行连接,然而上述连接作用存在一定问题,由于抗体或配体生物素化后可能影响其生物活性,同时受血流剪切力的影响,靶向超声造影剂与靶组织不能紧密吸附,从而使得靶向定位功能降低,这在肝癌的造影剂中表现尤为明显。
发明内容
针对上述现有技术的不足,发明人经过长期的技术与实践探索,提供一种肝癌超声诊断靶向试剂,并提供一种构建肝癌超声诊断靶向试剂的方法,以及该肝癌超声诊断靶向试剂在医学诊断中的应用。
为实现上述目的,本发明涉及以下技术方案:
一种肝癌超声诊断靶向试剂,该试剂为Endoglin靶向微泡,该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯,所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
优选的,所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、聚乙二醇1500(PEG1500)混合制成;
所述气体内芯为生物惰性气体,进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法,包括如下步骤:
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500(PEG1500)按质量比1:4~7:3溶于氯仿中制成悬浮液,将所述悬浮液混匀,在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜;
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液,室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳;
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中,并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体,震荡制备超声微泡;
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(4×PE,pH7.4)中,将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中,将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合,37℃孵育,超滤得单链抗体;
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜,用离心漂浮法清洗3~4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体,得到Endoglin靶向微泡。
优选的,所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500(PEG1500)的质量比为1:5:3;
优选的,所述步骤3)中震荡频率为2000~3000次/分钟(进一步优选为2500次/分钟),震荡时间为20~40秒(进一步优选为30秒)。采用上述震荡频率和震荡时间,能够有效控制得到的超声微泡的粒径小于600nm,从而使得微泡更易进入肿瘤组织间隙,使得Endoglin单克隆抗体能够与肿瘤中成体血管内皮细胞和间质细胞中的Endoglin结合,从而使得实验结果更加准确;同时发明人发现,加大震荡频率或延长震荡时间只能使得坏泡率升高,并不能进一步减小微泡粒径。
本发明还公开了上述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
优选的,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为5~10MHz,机械指数(MI)0.3~0.6,增益为-20dB。
进一步优选的,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为10MHz,机械指数(MI)0.5,增益为-20dB。
本发明检测肝癌的Endoglin靶向微泡,其中所述的超声微泡与Endoglin单克隆抗体的连接是利用微泡表面的顺丁烯二酰亚胺键和单克隆抗体打开后的巯基反应形成稳定的硫醚键,从而将单克隆抗体片段连接在微泡上,不仅使单克隆抗体的分子量减半,暴露保守段中的巯基,而且不影响抗体的抗原识别效能,由于未进行生物素化等操作,并不影响单克隆抗体的生物活性,从而使得靶向生物活性更高。
本发明技术原理:Endoglin,即CD105,是一种同源二聚体跨膜糖蛋白,包含561个氨基酸残基,是TGFβ受体复合物中的重要组分。Endoglin在成体血管内皮细胞和间质细胞中表达,现有技术中报道了Endoglin在肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌的重构的或新生的血管里过量表达,但是Endoglin在早期肝癌组织细胞中是否过量表达,能否作为靶向造影剂的靶向材料尚未报道。发明人通过试验研究发现,Endoglin能够与与肝癌微血管特异性结合,通过构建Endoglin靶向微泡,从而用于肝癌肿瘤血管新生的诊断即提供一种有效的早期肝癌的诊断手段。
本发明的有益效果:
本发明设计的一种肝癌超声诊断靶向试剂,可以通过静脉注射使靶向微泡穿过肿瘤血管,进入肿瘤组织间隙,与成体血管内皮细胞和间质细胞特异性结合,从而在肿瘤部位有效富集以及停留延长,通过聚集成像清晰区分病变组织和周围的正常组织,应用非线性谐波成像技术,达到肝癌的靶向分子显影;同时,为了使得微泡能够更加方便进入肿瘤组织间隙,发明人通过调整试验参数,从而使得微泡(约占总量的95%)粒径小于等于600nm,从而使得微泡进入肿瘤组织间隙更加便捷;而且本发明中的超声微泡与Endoglin单克隆抗体的连接是利用微泡表面的顺丁烯二酰亚胺键和单克隆抗体打开后的巯基反应形成稳定的硫醚键,采用非共价键的结合方式,使得连接更为紧密,从而防止在超声造影过程中单克隆抗体与微泡脱落分离,影响试验效果;而且由于本发明中并不额外添加生物素修饰,使得单克隆抗体的生物活性完全不受影响,使得试验结果更加准确。
附图说明
图1为以微气泡为靶点的超声成像示意图,其中(A)微气泡注射前;(B)注射后,血管中结合的和游离的微气泡都能被超声检测到;(C)连续性破坏性脉冲破坏了成像平面中所有的微气泡(包括结合的和流动的),之后循环中仍存留的微气泡再次循环到成像平面。因此,强度的变化代表了结合的微气泡的程度。
图2为皮下荷瘤(HCC)裸鼠靶向Endoglin的超声分子成像图。其中,图(A)在破坏性脉冲(灰色区域)结束后,感兴趣的追踪区域的超声信号强度图;左侧是破坏前,右侧是破坏后。破坏性脉冲导致的强度的变化是特异性结合微气泡多少的指标。破坏性脉冲之前的线性信号代表血液中结合到内皮细胞和游离的微气泡,以及组织信号,破坏性脉冲之后的线性信号对应着仍然存在于血液循环中的微气泡和剩余组织回声,而不代表结合过程。从破坏性脉冲之前的平均强度扣除之后的平均强度,即获得了dTE的计算机数据。图(B)为参量成像,图的右角显示了dTE的比例尺;图(C)为靶向Endoglin的微气泡和对照组同型微气泡的dTE。dTE=TEad-TEbd.n=4;**P<0.001.TE:targeted enhancement,定向增强,dTE:differential targeted enhancement,差异性定向增强,ad:after destruction,破坏后,bd:before destruction,破坏前。
图3为裸鼠肝脏和HepG2皮下移植肿瘤中Endoglin的表达。利用Endoglin抗体对裸鼠肝脏(A)和HepG2移植肿瘤(B)进行免疫染色。箭头指向色阳性的血管;(C)Endoglin mRNA的相对表达量,n=4;**P<0.001;(D)免疫印迹技术检测Endoglin蛋白表达。
图4为用培养HepG2细胞的条件培养液处理HUVECs后对Endoglin表达的影响。
用培养HepG2细胞的条件培养液处理HUVECs后,检测Endoglin的mRNA和蛋白水平。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,现有技术中针对肝癌超声造影靶向性不高;
有鉴于此,本发明的一种典型实施方式中,提供一种肝癌超声诊断靶向试剂,该试剂为Endoglin靶向微泡,该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯,所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
本发明的又一种典型实施方式中,所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成;
本发明的又一种典型实施方式中,所述气体内芯为生物惰性气体,进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
本发明的又一种典型实施方式中,一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法,包括如下步骤:
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:4~7:3溶于氯仿中制成悬浮液,将所述悬浮液混匀,在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜;
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液,室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳;
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中,并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体,震荡制备超声微泡;
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(PE,4×,pH7.4)中,将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中,将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合,37℃孵育,超滤得单链抗体;
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜,用离心漂浮法清洗3~4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体,得到Endoglin靶向微泡。
本发明的又一种典型实施方式中,所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500的质量比为1:5:3;
本发明的又一种典型实施方式中,所述步骤3)中震荡频率为2000~3000次/分钟(进一步优选为2500次/分钟),震荡时间为20~40秒(进一步优选为30秒)。采用上述震荡频率和震荡时间,能够有效控制得到的超声微泡的粒径小于600nm,从而使得微泡更易进入肿瘤组织间隙,使得Endoglin单克隆抗体能够与肿瘤中成体血管内皮细胞和间质细胞中的Endoglin结合,从而使得实验结果更加准确;同时发明人发现,加大震荡频率或延长震荡时间只能使得坏泡率升高,并不能进一步减小微泡粒径。
本发明的又一种典型实施方式中,提供了一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法,包括如下步骤:
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:5:3溶于氯仿中制成悬浮液,将所述悬浮液混匀,在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜;
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液,室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳;
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中,并将将西林瓶中的空气置换成全氟丙烷气体,震荡制备超声微泡,震荡频率为2500次/分钟,震荡时间为30秒;
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(PE,4×,pH7.4)中,将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中,将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合,37℃孵育,超滤得单链抗体;
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜,用离心漂浮法清洗3~4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体,得到Endoglin靶向微泡。
本发明的又一种典型实施方式中,还公开了上述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
本发明的又一种典型实施方式中,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为5~10MHz,机械指数(MI)0.3~0.6,增益为-20dB。
本发明的又一种典型实施方式中,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为10MHz,机械指数(MI)0.5,增益为-20dB。
下面进一步以具体实施例进行阐述。
实施例
实验步骤
1.动物模型BALB/c裸小鼠,3~4周龄,雄性,体质18~22g,SPF级环境中饲养,取对数期HepG2肝癌细胞,制备单细胞悬液,调节细胞浓度为1×107/ml,于每只裸鼠腹部皮下接种0.1ml悬浮液,待三周后进行造影观察;
2.超声仪器参数设置采用二次谐波显像模式,显像频率为10MHz,机械指数(MI)0.5,增益为-20dB;
3.采用常规免疫组化,qRT-PCR,Western blot对裸鼠的肝脏组织和移植的肝癌组织进行分析;使用HepG2肝癌细胞培养液对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)进行培养。
实验结果
靶向超声成像
所有实验动物都接受超声对比成像,没有发现明显的急性毒副反应。为了证实MBEndoglin结合的特异性,注射MBIsotype(MBIsotype即仅有超声微泡,不连接有Endoglin)以排除非特异性结合的干扰。在用veov2100系统(VisualSonics,Toronto,Canada)收集超声图像后,用内装的软件自动分析MBEndoglin和MBIsotype的差异性靶向增强信号。先前研究表明,Endoglin是血管新生良好的生物标记物。在本研究中,我们把Endoglin的单克隆抗体连在微气泡上,去靶向裸鼠皮下移植肝癌血管内皮细胞表面过表达的Endoglin分子。超声波照射之前的图像代表结合的和血液中流动的微气泡以及组织信号。超声波照射之后的图像对应着仍然存在于循环中的微气泡和残留的组织回声,但与过程无关。超声波照射前后信号强度相减就是结合状态微气泡的强度。靶向Endoglin的微气泡的差异性靶向增强信号(thedifferential targeted enhancement,dTE)显著强于isotype。
裸鼠肝脏和移植肝癌中Endoglin的表达
用免疫组化,qRT-PCR,Western blot对裸鼠的肝脏组织和移植的肝癌组织进行分析。肝癌组织微血管内皮上检测到Endoglin表达,但在正常肝组织和血管中未检测到。qRT-PCR结果表明,Endoglin mRNA表达量显著高于正常肝组织(n=4,P<0.001)。Western blot在肝癌提取蛋白中检测到了Endoglin表达,在肝组织中却没检测到。
HepG2肝癌细胞培养液对HUVECs中Endoglin表达的影响
当体外培养的内皮细胞处于增殖和活化阶段时,能检测到Endoglin高表达。为了模拟肿瘤血管的微环境,收集HepG2细胞的培养上清后处理HUVECs。12小时后,HUVECs中Endoglin的mRNA水平显著上调(P<0.001)。并且Western blot结果表明,用HepG2培养液上清处理后还显著上调了HUVECs中Endoglin的蛋白表达。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肝癌超声诊断靶向试剂,其特征在于,所述试剂为Endoglin靶向微泡,该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯,所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种肝癌超声诊断靶向试剂,其特征在于,所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成。
3.如权利要求1所述的一种肝癌超声诊断靶向试剂,其特征在于,所述气体内芯为生物惰性气体,进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
4.权利要求1-3任一项所述肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:4~7:3溶于氯仿中制成悬浮液,将所述悬浮液混匀,在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜;
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液,室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳;
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中,并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体,震荡制备超声微泡;
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(4×PE,pH7.4)中,将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中,将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合,37℃孵育,超滤得单链抗体;
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜,用离心漂浮法清洗3~4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体,得到Endoglin靶向微泡。
5.如权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500的质量比为1:5:3。
6.如权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述步骤3)中震荡频率为2000~3000次/分钟,震荡时间为20~40秒。
7.如权利要求6所述制备方法,其特征在于,所述震荡频率为2500次/分钟,震荡时间为30秒。
8.权利要求1-3任一项所述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
9.如权利要求8所述应用,其特征在于,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为5~10MHz,机械指数(MI)0.3~0.6,增益为-20dB。
10.如权利要求9所述应用,其特征在于,所述应用中超声成像参数为:采用二次谐波显像模式,显像频率为10MHz,机械指数(MI)0.5,增益为-20dB。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710418737.9A CN107184994A (zh) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | 一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710418737.9A CN107184994A (zh) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | 一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107184994A true CN107184994A (zh) | 2017-09-22 |
Family
ID=59877097
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710418737.9A Pending CN107184994A (zh) | 2017-06-06 | 2017-06-06 | 一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107184994A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115487321A (zh) * | 2022-09-21 | 2022-12-20 | 青岛市肿瘤医院 | 一种用于宫颈癌超声造影的造影剂及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102008441A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-13 | 赵永祥 | Endoglin抗体偶联的脂质体及其制备方法和应用 |
CN105617410A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-06-01 | 深圳市人民医院 | 一种双靶向超声造影剂及其制备方法 |
CN105664188A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-06-15 | 袁哲 | 一种子宫输卵管腔道超声造影剂及其制备方法 |
CN105727320A (zh) * | 2016-01-30 | 2016-07-06 | 山西大学 | 检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用 |
-
2017
- 2017-06-06 CN CN201710418737.9A patent/CN107184994A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102008441A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-13 | 赵永祥 | Endoglin抗体偶联的脂质体及其制备方法和应用 |
CN105617410A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-06-01 | 深圳市人民医院 | 一种双靶向超声造影剂及其制备方法 |
CN105727320A (zh) * | 2016-01-30 | 2016-07-06 | 山西大学 | 检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用 |
CN105664188A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-06-15 | 袁哲 | 一种子宫输卵管腔道超声造影剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
张俊松 等: "CD105、CD133在人肝癌细胞株HepG-2的表达情况及生物学性状的体外研究", 《肝胆外科杂志》 * |
李骞 等: "原发性肝癌患者CD105、VEGF及TGF-β表达及临床意义", 《山东医药》 * |
赵妉勃 等: "VEGF及CD105在结直肠癌中的表达及其意义", 《中国厂矿医学》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115487321A (zh) * | 2022-09-21 | 2022-12-20 | 青岛市肿瘤医院 | 一种用于宫颈癌超声造影的造影剂及其制备方法 |
CN115487321B (zh) * | 2022-09-21 | 2023-10-31 | 青岛市肿瘤医院 | 一种用于宫颈癌超声造影的造影剂及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Köse et al. | Molecular ultrasound imaging | |
Pochon et al. | BR55: a lipopeptide-based VEGFR2-targeted ultrasound contrast agent for molecular imaging of angiogenesis | |
Xie et al. | In vivo assessment of inflammation in carotid atherosclerosis by noninvasive photoacoustic imaging | |
Punjabi et al. | Ultrasound molecular imaging of atherosclerosis with nanobodies: translatable microbubble targeting murine and human VCAM (vascular cell adhesion molecule) 1 | |
Willmann et al. | US imaging of tumor angiogenesis with microbubbles targeted to vascular endothelial growth factor receptor type 2 in mice | |
CN1980699B (zh) | 利用白蛋白-结合蛋白作为靶标的治疗方法 | |
Lyshchik et al. | Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast‐enhanced high‐frequency ultrasonography | |
CN104159618B (zh) | 治疗剂及其用途 | |
Lee et al. | Relationship between retention of a vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2)‐targeted ultrasonographic contrast agent and the level of VEGFR2 expression in an in vivo breast cancer model | |
Yan et al. | A lipopeptide-based αvβ3 integrin-targeted ultrasound contrast agent for molecular imaging of tumor angiogenesis | |
Yan et al. | Imaging tiny hepatic tumor xenografts via endoglin-targeted paramagnetic/optical nanoprobe | |
Leguerney et al. | Molecular ultrasound imaging using contrast agents targeting endoglin, vascular endothelial growth factor receptor 2 and integrin | |
Li et al. | Targeted Fe-doped silica nanoparticles as a novel ultrasound–magnetic resonance dual-mode imaging contrast agent for HER2-positive breast cancer | |
CN105727320A (zh) | 检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用 | |
Wischhusen et al. | Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer | |
CN108245688A (zh) | 肝细胞癌诊断试剂及其制备方法 | |
Wang et al. | Nanobubbles as ultrasound contrast agent for facilitating small cell lung cancer imaging | |
Morokov et al. | Noninvasive ultrasound imaging for assessment of intact microstructure of extracellular matrix in tissue engineering | |
CN103491983B (zh) | 与心血管成像相关的材料及方法 | |
Zeng et al. | Functional probes for cardiovascular molecular imaging | |
Stammes et al. | The necrosis-avid small molecule HQ4-DTPA as a multimodal imaging agent for monitoring radiation therapy-induced tumor cell death | |
Chung et al. | Circulation time-optimized albumin nanoplatform for quantitative visualization of lung metastasis via targeting of macrophages | |
Mossenta et al. | Novel nanotechnology approaches to overcome drug resistance in the treatment of hepatocellular carcinoma: glypican 3 as a useful target for innovative therapies | |
Morine et al. | Accurate estimation of functional liver volume using Gd-EOB-DTPA MRI compared to MDCT/99mTc-SPECT fusion imaging | |
Liu et al. | Immuno-PET imaging of PD-L1 expression in patient-derived lung cancer xenografts with [68Ga] Ga-NOTA-Nb109 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170922 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |