CN107184994A - 一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌超声诊断靶向试剂，该试剂为Endoglin靶向微泡，该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。其中，所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成；所述气体内芯为生物惰性气体，进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。本发明设计的一种肝癌超声诊断靶向试剂，可以通过静脉注射使靶向微泡穿过肿瘤血管，进入肿瘤组织间隙，与成体血管内皮细胞和间质细胞特异性结合，从而在肿瘤部位有效富集以及停留延长，通过聚集成像清晰区分病变组织和周围的正常组织，应用非线性谐波成像技术，达到肝癌的靶向分子显影。
Description
技术领域
本发明涉及超声诊断用靶向试剂，具体涉及一种肝癌超声诊断靶向试剂及其制备方法。
背景技术
肝癌在亚洲是一种可引起高死亡率的侵袭性癌症，早期诊断和治疗对于提高肝癌患者的存活几率非常重要。超声检查由于其无创无辐射、操作方便、价格低廉、对设备场地要求低等优势，是临床诊断肿瘤的重要手段，然而，由于超声诊断自身局限性，较小的肝癌组织难以检测出来。
随着各种新型超声造影剂的出现和超声显像技术的不断发展，微泡造影剂(如国内临床采用Braco公司生产的Sonovue造影剂)开始应用于恶性肿瘤的检查，但其敏感性较低，特异性不高，是一种无定向选择作用的全身性造影剂。此外，尚有采用全氟溴辛烷等氟碳制备纳米造影剂的报道(张华娟等.一种全氟碳化合物脂质体纳米球及其制备方法.中国专利，申请号201210549252.0)，从而克服微泡造影剂无法达到血管外肿瘤组织成像的。但是，早期肝癌病人的临床症状相对隐蔽，这为肝癌的诊断带来了很大的困难。
国内外近几年已经开始了靶向超声造影剂的相关研究，通过通过靶向超声造影剂，使其聚集于靶组织，达到特异性增强显影效果。与普通超声造影剂相比，靶向超声造影通过特异性作用于病变区生物分子组成成分，来突出显示病变部位，从而提高超声诊断的准确性与敏感性。通常是将靶向超声造影剂是将特异性抗体或配体与微泡表面连接，静脉注射后，使其能够较长时间定向地聚积于靶组织或器官，使靶区超声图像特异性增强或进行靶向治疗。
现有技术中，将特异性抗体或配体与微泡表面连接方式通常采用将特异性抗体或配体生物素化，而后再添加亲和素，然后通过亲和素和生物素的连接作用使得特异性抗体或配体与微泡进行连接，然而上述连接作用存在一定问题，由于抗体或配体生物素化后可能影响其生物活性，同时受血流剪切力的影响，靶向超声造影剂与靶组织不能紧密吸附，从而使得靶向定位功能降低，这在肝癌的造影剂中表现尤为明显。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经过长期的技术与实践探索，提供一种肝癌超声诊断靶向试剂，并提供一种构建肝癌超声诊断靶向试剂的方法，以及该肝癌超声诊断靶向试剂在医学诊断中的应用。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
一种肝癌超声诊断靶向试剂，该试剂为Endoglin靶向微泡，该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
优选的，所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、聚乙二醇1500(PEG1500)混合制成；
所述气体内芯为生物惰性气体，进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500(PEG1500)按质量比1:4～7:3溶于氯仿中制成悬浮液，将所述悬浮液混匀，在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜；
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液，室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳；
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中，并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡制备超声微泡；
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(4×PE,pH7.4)中，将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中，将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合，37℃孵育，超滤得单链抗体；
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜，用离心漂浮法清洗3～4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体，得到Endoglin靶向微泡。
优选的，所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500(PEG1500)的质量比为1:5：3；
优选的，所述步骤3)中震荡频率为2000～3000次/分钟(进一步优选为2500次/分钟)，震荡时间为20～40秒(进一步优选为30秒)。采用上述震荡频率和震荡时间，能够有效控制得到的超声微泡的粒径小于600nm，从而使得微泡更易进入肿瘤组织间隙，使得Endoglin单克隆抗体能够与肿瘤中成体血管内皮细胞和间质细胞中的Endoglin结合，从而使得实验结果更加准确；同时发明人发现，加大震荡频率或延长震荡时间只能使得坏泡率升高，并不能进一步减小微泡粒径。
本发明还公开了上述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
优选的，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为5～10MHz，机械指数(MI)0.3～0.6，增益为-20dB。
进一步优选的，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为10MHz，机械指数(MI)0.5，增益为-20dB。
本发明检测肝癌的Endoglin靶向微泡，其中所述的超声微泡与Endoglin单克隆抗体的连接是利用微泡表面的顺丁烯二酰亚胺键和单克隆抗体打开后的巯基反应形成稳定的硫醚键，从而将单克隆抗体片段连接在微泡上，不仅使单克隆抗体的分子量减半，暴露保守段中的巯基，而且不影响抗体的抗原识别效能，由于未进行生物素化等操作，并不影响单克隆抗体的生物活性，从而使得靶向生物活性更高。
本发明技术原理：Endoglin,即CD105,是一种同源二聚体跨膜糖蛋白，包含561个氨基酸残基，是TGFβ受体复合物中的重要组分。Endoglin在成体血管内皮细胞和间质细胞中表达，现有技术中报道了Endoglin在肿瘤组织如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌的重构的或新生的血管里过量表达，但是Endoglin在早期肝癌组织细胞中是否过量表达，能否作为靶向造影剂的靶向材料尚未报道。发明人通过试验研究发现，Endoglin能够与与肝癌微血管特异性结合，通过构建Endoglin靶向微泡，从而用于肝癌肿瘤血管新生的诊断即提供一种有效的早期肝癌的诊断手段。
本发明的有益效果：
本发明设计的一种肝癌超声诊断靶向试剂，可以通过静脉注射使靶向微泡穿过肿瘤血管，进入肿瘤组织间隙，与成体血管内皮细胞和间质细胞特异性结合，从而在肿瘤部位有效富集以及停留延长，通过聚集成像清晰区分病变组织和周围的正常组织，应用非线性谐波成像技术，达到肝癌的靶向分子显影；同时，为了使得微泡能够更加方便进入肿瘤组织间隙，发明人通过调整试验参数，从而使得微泡(约占总量的95％)粒径小于等于600nm，从而使得微泡进入肿瘤组织间隙更加便捷；而且本发明中的超声微泡与Endoglin单克隆抗体的连接是利用微泡表面的顺丁烯二酰亚胺键和单克隆抗体打开后的巯基反应形成稳定的硫醚键，采用非共价键的结合方式，使得连接更为紧密，从而防止在超声造影过程中单克隆抗体与微泡脱落分离，影响试验效果；而且由于本发明中并不额外添加生物素修饰，使得单克隆抗体的生物活性完全不受影响，使得试验结果更加准确。
附图说明
图1为以微气泡为靶点的超声成像示意图，其中(A)微气泡注射前；(B)注射后，血管中结合的和游离的微气泡都能被超声检测到；(C)连续性破坏性脉冲破坏了成像平面中所有的微气泡(包括结合的和流动的)，之后循环中仍存留的微气泡再次循环到成像平面。因此，强度的变化代表了结合的微气泡的程度。
图2为皮下荷瘤(HCC)裸鼠靶向Endoglin的超声分子成像图。其中，图(A)在破坏性脉冲(灰色区域)结束后，感兴趣的追踪区域的超声信号强度图；左侧是破坏前，右侧是破坏后。破坏性脉冲导致的强度的变化是特异性结合微气泡多少的指标。破坏性脉冲之前的线性信号代表血液中结合到内皮细胞和游离的微气泡，以及组织信号，破坏性脉冲之后的线性信号对应着仍然存在于血液循环中的微气泡和剩余组织回声，而不代表结合过程。从破坏性脉冲之前的平均强度扣除之后的平均强度，即获得了dTE的计算机数据。图(B)为参量成像，图的右角显示了dTE的比例尺；图(C)为靶向Endoglin的微气泡和对照组同型微气泡的dTE。dTE＝TEad-TEbd.n＝4；**P<0.001.TE:targeted enhancement，定向增强,dTE:differential targeted enhancement,差异性定向增强，ad:after destruction，破坏后，bd:before destruction，破坏前。
图3为裸鼠肝脏和HepG2皮下移植肿瘤中Endoglin的表达。利用Endoglin抗体对裸鼠肝脏(A)和HepG2移植肿瘤(B)进行免疫染色。箭头指向色阳性的血管；(C)Endoglin mRNA的相对表达量，n＝4；**P<0.001；(D)免疫印迹技术检测Endoglin蛋白表达。
图4为用培养HepG2细胞的条件培养液处理HUVECs后对Endoglin表达的影响。
用培养HepG2细胞的条件培养液处理HUVECs后，检测Endoglin的mRNA和蛋白水平。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对肝癌超声造影靶向性不高；
有鉴于此，本发明的一种典型实施方式中，提供一种肝癌超声诊断靶向试剂，该试剂为Endoglin靶向微泡，该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
本发明的又一种典型实施方式中，所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成；
本发明的又一种典型实施方式中，所述气体内芯为生物惰性气体，进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
本发明的又一种典型实施方式中，一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:4～7:3溶于氯仿中制成悬浮液，将所述悬浮液混匀，在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜；
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液，室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳；
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中，并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡制备超声微泡；
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(PE,4×,pH7.4)中，将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中，将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合，37℃孵育，超滤得单链抗体；
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜，用离心漂浮法清洗3～4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体，得到Endoglin靶向微泡。
本发明的又一种典型实施方式中，所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500的质量比为1:5：3；
本发明的又一种典型实施方式中，所述步骤3)中震荡频率为2000～3000次/分钟(进一步优选为2500次/分钟)，震荡时间为20～40秒(进一步优选为30秒)。采用上述震荡频率和震荡时间，能够有效控制得到的超声微泡的粒径小于600nm，从而使得微泡更易进入肿瘤组织间隙，使得Endoglin单克隆抗体能够与肿瘤中成体血管内皮细胞和间质细胞中的Endoglin结合，从而使得实验结果更加准确；同时发明人发现，加大震荡频率或延长震荡时间只能使得坏泡率升高，并不能进一步减小微泡粒径。
本发明的又一种典型实施方式中，提供了一种肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:5:3溶于氯仿中制成悬浮液，将所述悬浮液混匀，在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜；
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液，室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳；
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中，并将将西林瓶中的空气置换成全氟丙烷气体，震荡制备超声微泡，震荡频率为2500次/分钟，震荡时间为30秒；
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(PE,4×,pH7.4)中，将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中，将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合，37℃孵育，超滤得单链抗体；
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜，用离心漂浮法清洗3～4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体，得到Endoglin靶向微泡。
本发明的又一种典型实施方式中，还公开了上述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
本发明的又一种典型实施方式中，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为5～10MHz，机械指数(MI)0.3～0.6，增益为-20dB。
本发明的又一种典型实施方式中，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为10MHz，机械指数(MI)0.5，增益为-20dB。
下面进一步以具体实施例进行阐述。
实施例
实验步骤
1.动物模型BALB/c裸小鼠，3～4周龄，雄性，体质18～22g，SPF级环境中饲养，取对数期HepG2肝癌细胞，制备单细胞悬液，调节细胞浓度为1×107/ml，于每只裸鼠腹部皮下接种0.1ml悬浮液，待三周后进行造影观察；
2.超声仪器参数设置采用二次谐波显像模式，显像频率为10MHz，机械指数(MI)0.5，增益为-20dB；
3.采用常规免疫组化,qRT-PCR，Western blot对裸鼠的肝脏组织和移植的肝癌组织进行分析；使用HepG2肝癌细胞培养液对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)进行培养。
实验结果
靶向超声成像
所有实验动物都接受超声对比成像，没有发现明显的急性毒副反应。为了证实MBEndoglin结合的特异性，注射MBIsotype(MBIsotype即仅有超声微泡，不连接有Endoglin)以排除非特异性结合的干扰。在用veov2100系统(VisualSonics,Toronto,Canada)收集超声图像后，用内装的软件自动分析MBEndoglin和MBIsotype的差异性靶向增强信号。先前研究表明，Endoglin是血管新生良好的生物标记物。在本研究中，我们把Endoglin的单克隆抗体连在微气泡上，去靶向裸鼠皮下移植肝癌血管内皮细胞表面过表达的Endoglin分子。超声波照射之前的图像代表结合的和血液中流动的微气泡以及组织信号。超声波照射之后的图像对应着仍然存在于循环中的微气泡和残留的组织回声，但与过程无关。超声波照射前后信号强度相减就是结合状态微气泡的强度。靶向Endoglin的微气泡的差异性靶向增强信号(thedifferential targeted enhancement,dTE)显著强于isotype。
裸鼠肝脏和移植肝癌中Endoglin的表达
用免疫组化,qRT-PCR，Western blot对裸鼠的肝脏组织和移植的肝癌组织进行分析。肝癌组织微血管内皮上检测到Endoglin表达,但在正常肝组织和血管中未检测到。qRT-PCR结果表明，Endoglin mRNA表达量显著高于正常肝组织(n＝4,P<0.001)。Western blot在肝癌提取蛋白中检测到了Endoglin表达，在肝组织中却没检测到。
HepG2肝癌细胞培养液对HUVECs中Endoglin表达的影响
当体外培养的内皮细胞处于增殖和活化阶段时，能检测到Endoglin高表达。为了模拟肿瘤血管的微环境，收集HepG2细胞的培养上清后处理HUVECs。12小时后，HUVECs中Endoglin的mRNA水平显著上调(P<0.001)。并且Western blot结果表明，用HepG2培养液上清处理后还显著上调了HUVECs中Endoglin的蛋白表达。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肝癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述试剂为Endoglin靶向微泡，该靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Endoglin单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种肝癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述脂质外壳由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500混合制成。
3.如权利要求1所述的一种肝癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述气体内芯为生物惰性气体，进一步优选为全氟丙烷气体(C3F8)。
4.权利要求1-3任一项所述肝癌超声诊断靶向试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500按质量比1:4～7:3溶于氯仿中制成悬浮液，将所述悬浮液混匀，在干燥氮气作用下形成磷脂薄膜；
2)在磷脂薄膜中加入Tris缓冲溶液，室温下摇床震荡使得磷脂溶液分散至透明得脂质外壳；
3)将含有脂质外壳的磷脂溶液置于西林瓶中，并将将西林瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡制备超声微泡；
4)取Endoglin单克隆抗体溶于PBS-EDTA缓冲液(4×PE，pH7.4)中，将巯基乙醇溶于PBS缓冲液(pH7.4)中，将所述PBS-EDTA缓冲液和所述PBS缓冲液混合，37℃孵育，超滤得单链抗体；
5)将单链抗体与超声微泡在4℃孵育过夜，用离心漂浮法清洗3～4次除去没有连接在超声微泡上的单链抗体，得到Endoglin靶向微泡。
5.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤1)中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和聚乙二醇1500的质量比为1:5:3。
6.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤3)中震荡频率为2000～3000次/分钟，震荡时间为20～40秒。
7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述震荡频率为2500次/分钟，震荡时间为30秒。
8.权利要求1-3任一项所述肝癌超声诊断靶向试剂在超声肝癌靶向诊断中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为5～10MHz，机械指数(MI)0.3～0.6，增益为-20dB。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述应用中超声成像参数为：采用二次谐波显像模式，显像频率为10MHz，机械指数(MI)0.5，增益为-20dB。
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