CN107184956A - Metrnl蛋白或基因在防治脓毒血症方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Metrnl蛋白或基因在防治脓毒血症方面的应用。本发明通过给予内毒素诱导脓毒血症小鼠模型，发现脓毒血症动物血液中的Metrnl蛋白水平升高；采用Metrnl基因敲除小鼠，内毒素或盲肠结扎穿孔术诱导脓毒血症模型，检测模型动物死亡率，证明了Metrnl蛋白能降低脓毒血症死亡率，提高存活率。因此Metrnl蛋白可作为脓毒血症新的生物标志物用于早期诊断，以及作为防治脓毒血症新的更有效的药物和/或靶点。

Description

Metrnl蛋白或基因在防治脓毒血症方面的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药领域，具体地说，涉及Metrnl蛋白或基因以及它们的调节剂在防治脓毒血症方面的应用。

背景技术

Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，由metrnl基因编码，大小为30kDa左右。人Metrnl蛋白的氨基酸序列见NP_001004431.1。

中国专利申请CN200980137344.4，发明名称为“生长因子METRNL的治疗用途”，申请公布号：CN102164611A，公开了METRNL是一种具有神经元保护和/或神经发生作用的神经生存和生长因子，可用于治疗神经系统的疾病、疾患或损害；中国专利ZL201310525184.9，公开了Metrnl蛋白在制备降血糖药物或保健食品中的应用；中国专利ZL201310525181.5，公开了Metrnl蛋白在制备降血脂药物或保健食品中的应用。

然而，关于Metrnl在脓毒血症治疗和/或预防方面的作用目前还未见任何报道。

脓毒血症是由病原微生物侵入血液后，在其中大量繁殖，引起的全身炎症反应综合征，由于宿主对感染反应失调，导致致命性器官功能衰竭的综合征。当循环系统出现急性衰竭时，称为感染性/中毒性/脓毒症休克。脓毒血症病情凶险，病死率高，也是严重创伤、烧伤、中暑、休克、大手术后等常见并发症，是导致重症患者死亡的主要原因之一。然而，近二十年医疗技术的发展未能对脓毒血症产生新的特异性治疗方法，也没有获得实质性进展。发展新的预防和治疗脓毒血症药物以及新的生物标志物，一直是药物开发和临床诊断中的热点和重点。

目前国内外尚无有关Metrnl蛋白在防治脓毒血症方面的文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Metrnl蛋白或基因的一种新用途。

在本发明的第一方面，提供了Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂在制备防治脓毒血症的药物中的应用。

作为一种优选实施方式，所述的增效剂可选自激动剂、上调剂或稳定剂等。

在本发明的第二方面，提供了Metrnl蛋白或基因作为脓毒血症生物标志物中的应用。

在本发明的第三方面，提供了检测血清中Metrnl蛋白水平的试剂在制备脓毒血症诊断试剂中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选防治脓毒血症的潜在物质的方法，包括以下步骤：

a)将候选物质与含有Metrnl蛋白或基因的体系接触；

b)观察候选物质对于Metrnl蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进Metrnl基因表达或提高Metrnl蛋白活性，则所述候选物质是防治脓毒血症的潜在物质。

本发明优点在于：本发明通过给予内毒素诱导脓毒血症小鼠模型，发现脓毒血症动物血液中的Metrnl水平升高；采用Metrnl基因敲除小鼠，内毒素或盲肠结扎穿孔术诱导脓毒血症模型，检测模型动物死亡率，证明了Metrnl能降低脓毒血症死亡率，提高存活率。以上结果表明Metrnl蛋白可作为脓毒血症新的生物标志物用于早期诊断，并可作为防治脓毒血症新的更有效的药物和/或靶点。本发明为脓毒血症的诊断和防治提供了一种新方法，且由于Metrnl蛋白本身是一种人体的内源性蛋白质，其对人体可能的副作用很小，因此作为潜在药物的安全性很高。

附图说明

图1.腹腔注射内毒素LPS升高了血清Metrnl蛋白的浓度(每点小鼠n＝4-5)。*表示Metrnl蛋白的血液浓度与溶剂对照相比，有显著统计学差异(P<0.05)；**表示Metrnl蛋白的血液浓度与溶剂对照相比，有非常显著的统计学差异(P<0.01)。

图2.注射内毒素LPS后Metrnl全身敲除小鼠的存活率降低(每组小鼠n＝9-10)。

图3.盲肠结扎穿孔术后Metrnl全身敲除小鼠的存活率降低(每组小鼠n＝10)。

具体实施方式

Metrnl蛋白及基因

本文中，术语“Metrnl蛋白”等同于“Metrnl多肽”，二者可互换使用。

本文中，所用的Metrnl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离纯化自哺乳动物。此外，所述Metrnl蛋白也可以是人工制备的，比如根据常规基因工程技术来制备得到。任何合适的Metrnl蛋白均可适用于本发明。所述Metrnl蛋白包括全长的Metrnl蛋白或其生物活性片段。作为一种具体实施方式，所述Metrnl蛋白可以是一种人Metrnl蛋白，大小为30kDa，氨基酸序列见NP_001004431.1。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Metrnl蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。Metrnl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影响其活性或保留了其部分活性。适当替换氨基酸是本领域内的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变已知分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必需氨基酸区域改变单个氨基酸并不会改变生物活性。

任何一种Metrnl蛋白的生物活性片段均可以应用到本发明中。在这里，Metrnl蛋白的生物活性片段的含义是指一种多肽，其仍然能保持全长的Metrnl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％、60％至99％或者100％的全长Metrnl蛋白的活性。

本发明也可以采用经修饰或改良的全部或部分氨基酸的Metrnl蛋白，比如，可以为了促进半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Metrnl蛋白。所述经过修饰或改良的Metrnl蛋白可以是一种Metrnl蛋白的共轭物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Metrnl蛋白或基因可以与天然Metrnl蛋白或基因有一定的不同点，但也具有本发明所述的功能，且不会带来其它不良反应或毒性。也就是说，任何不影响Metrnl蛋白的生物活性或者说是基因的生物学功能的变化形式都可用于本发明中。

Metrnl增效剂及其用途

所述的“Metrnl增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何可提高Metrnl的活性、提高Metrnl的稳定性、上调Metrnl的表达、增加Metrnl有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，蛋白水平的，也可以是上调Metrnl表达的病毒产品等。

药物组合物

依据本发明的方法，可以制备防治脓毒血症的药物组合物，所述的药物组合物可由药物活性成分Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂和药学上可接受的载体组成。

所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型。当用于腹腔注射时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射液。在各种制剂中，活性成分的重量含量为0.01％～99.9％。

所述的药物组合物可以用于治疗脓毒血症。可以按剂型通过腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、淋巴结内注射、粘膜用药等途径应用于需要治疗的个体。个体可以是人或动物。

诊断试剂

依据本发明的方法，可以通过测定血清中Metrnl蛋白含量来诊断脓毒血症或预后，因此任何可以测定血清中Metrnl蛋白含量的试剂均可用作脓毒血症的诊断试剂。血清中Metrnl蛋白含量的测定方法包括紫外分光光度法、凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝染色法、银染法、免疫学方法等。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中，正常型小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。野生型小鼠和Metrnl全身敲除纯合子小鼠为Metrnl敲除杂合子的同窝后代(可参考期刊文献：Diabetes 2015；64:4011-4022)。

实施例1：Metrnl血清水平在内毒素诱导的脓毒血症模型中升高

细菌脂多糖(LPS，sigma公司，货号L2880)腹腔注射12周龄小鼠，剂量为1.3mg/kg，分别在给溶剂对照(生理盐水)或给LPS后0.5、1、2、4、8小时，取血，检测血清中Metrnl蛋白的浓度。血清浓度通过ELISA检测试剂盒(R&D systems，货号DY6679)检测。结果详见表1与图1。可见脓毒血症早期Metrnl血清水平明显升高。

表1.LPS刺激后Metrnl血清浓度的变化

实施例2：Metrnl敲除增加LPS诱导的脓毒血症动物模型的死亡率

对约12周龄的正常野生型小鼠和Metrnl全身敲除小鼠均使用相同剂量的LPS，给药方法为腹腔注射，具体方法如下：12周龄的野生型小鼠和Metrnl全身敲除小鼠，腹腔注射LPS，剂量为10mg/kg。随后监测小鼠死亡情况。结果详见表2与图2。可见腹腔注射LPS后Metrnl全身敲除小鼠的存活率显著低于野生型小鼠。

表2.Metrnl敲除恶化了LPS诱导的脓毒血症死亡

实施例3：Metrnl敲除增加盲肠结扎穿孔术诱导的脓毒血症动物模型的死亡率

对约12周龄的正常野生型小鼠和Metrnl全身敲除小鼠均实施盲肠结扎穿孔术，具体方法如下：在麻醉小鼠的腹壁正中切口，轻轻拉出盲肠，并轻轻地挤压盲肠上端粪便，使盲肠末梢充盈，分离肠系膜表面血管；用无菌4号丝线在盲瓣与盲肠中点进行结扎，并用21G无菌针头在结扎部位与盲肠顶端的中点处贯通穿刺盲肠壁，造成穿孔；轻轻挤压盲肠，挤出少许内容物以确保穿孔通畅，将挤出的内容物擦净，然后把盲肠推回腹腔，关闭腹腔，逐层缝合；手术后用生理盐水进行液体复苏并应用丁丙诺啡止痛。随后监测小鼠死亡情况。结果详见表3与图3。可见Metrnl全身敲除小鼠的存活率显著低于野生型小鼠。

表3.Metrnl敲除恶化了盲肠结扎穿孔术诱导的脓毒血症死亡

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂在制备防治脓毒血症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的增效剂选自激动剂、上调剂或稳定剂。

3.Metrnl蛋白或基因的用途，其特征在于，作为脓毒血症的生物标志物。

4.检测血清中Metrnl蛋白水平的试剂在制备脓毒血症诊断试剂中的应用。

5.一种筛选防治脓毒血症的潜在物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将候选物质与含有Metrnl蛋白或基因的体系接触；

b)观察候选物质对于Metrnl蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进Metrnl基因表达或提高Metrnl蛋白活性，则所述候选物质是防治脓毒血症的潜在物质。