CN107115320A - 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法 - Google Patents

一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107115320A
CN107115320A CN201710242377.1A CN201710242377A CN107115320A CN 107115320 A CN107115320 A CN 107115320A CN 201710242377 A CN201710242377 A CN 201710242377A CN 107115320 A CN107115320 A CN 107115320A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pamam
tmz
cooh
temozolomide
targeted nano
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710242377.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107115320B (zh
Inventor
蒋冠
侯晓阳
李荣花
唐建琴
庞雁宇
辛勇
刘彦群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Original Assignee
Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University filed Critical Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Priority to CN201710242377.1A priority Critical patent/CN107115320B/zh
Publication of CN107115320A publication Critical patent/CN107115320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107115320B publication Critical patent/CN107115320B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0004—Osmotic delivery systems; Sustained release driven by osmosis, thermal energy or gas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/028—Polyamidoamines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法，该靶向纳米粒的通式为HA‑PAMAM‑COOH‑TMZ，其中HA为透明质酸，PAMAM为树枝状聚合物；COOH为羧基，TMZ为替莫唑胺。本发明采用聚酰胺‑胺树状大分子作为载体，使用丁二酸酐来对PAMAM进行修饰，将PAMAM表面的大部分氨基变为更加安全的羧基，同时将HA包裹在载体表面，降低了PAMAM的正电荷毒性，同时增加了药物的稳定性，包封在内部的药物释放较缓慢，可以长时间缓释药物，维持体内血药浓度稳定，减少给药次数。

Description

一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米生物医学技术领域，具体而言，涉及一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法，尤其涉及一种以树枝状聚合物作为载体的靶向纳米粒子及其制备方法。
背景技术
黑素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的皮肤肿瘤，恶性程度极高，预后较差，其病死率占皮肤肿瘤死亡病例的80％左右。近年来发病率不断增加，年增长率为3～5％，且具有年轻化的趋势(Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016.CA Cancer JClin.2016,66(1):7-30.)。临床上治疗黑素瘤常用的化疗药物有达卡巴嗪、替莫唑胺(TMZ)、铂类、紫杉醇、福莫司汀等，然而疗效并不令人满意。其中，占主导地位的达卡巴嗪有效率仅为7.5％～12.2％，患者中位生存期5～6月(Gogas H J,Kirkwood J M,Sondak VK.Chemotherapy for metastatic melanoma.Cancer.2007,109(3):455-464.)。替莫唑胺是一种新型的第2代口服烷化剂，因其可口服，生物利用度高，能透过血脑屏障，对脑转移有治疗和预防作用，被很多国家推荐用于黑素瘤一线治疗(Agarwala S S,Kirkwood JM.Temozolomide,a novel alkylating agent with activity in the central nervoussystem,may improve the treatment of advanced metastatic melanoma.Theoncologist.2000,5(2):144-151.)。TMZ通过DNA链甲基化，引起DNA单链或双链断裂，阻断DNA复制，最终导致肿瘤细胞死亡。然而，同其它化疗药物一样，TMZ的疗效有限，且由于缺少靶向性，TMZ在杀伤肿瘤细胞的同时对其他非肿瘤细胞也有杀伤作用，引起毒副作用。药代动力学显示口服TMZ后血浆药物浓度于1h内达峰，之后消除迅速，平均半衰期为1.8h。TMZ在生理环境下很容易降解，在肿瘤部位的酸性环境中反而较稳定(郑蓉,蒋德锡,廖心丹，等.温度及pH对替莫唑胺溶液稳定性的影响.华西药学杂志.2012,(05):550-551.)。此外，TMZ作用机制会启动细胞内修复机制，上调O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)基因表达，后者通过自身活性中心的半胱氨酸残基与O6-甲基鸟嘌呤上的烷基基团共价结合并将其移除，从而使损伤的DNA修复，导致肿瘤细胞对TMZ耐药(Bradbury PA,Middleton MR.DNArepair pathways in drug resistance in melanoma.Anti-Cancer Drugs.2004,15(5):421-426.)。因此，如何提高TMZ的稳定性和敏感性，增强其靶向性从而降低其副作用是目前研究的热点与难点，也是提高黑素瘤整体疗效的关键。
近年来，纳米技术在肿瘤的诊断和治疗上的研究发展快速，越来越多的研究人员将研究焦点放于纳米技术的生物医学应用上，利用纳米粒独特的结构和理化性质为恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的策略和手段。目前研究较多的用作药物载体的纳米材料有脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物、二氧化硅、金纳米粒等，其中聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)是一种人工合成的纳米级大分子化合物。Tomalia等(Tomalia D,Baker H,DewaldJ,et al.A New Class of Polymers:Starburst-Dendritic.Polymer Journal.1985,17(1):117-132.)首次研究的树枝状高分子PAMAM，是以乙二胺为核，通过Michael加成反应和对酯基的酰胺化反应这两个重复的步骤合成的。但是PAMAM表面的正电荷对细胞具有一定的细胞毒性和溶血毒性(Imae T,Hamaguchi S.Network of sodium hyaluronate withnano-knots junction of poly(amido amine)dendrimer[J].Carbohydratepolymers.2012,88(1):352-360.)，因此需要进一步修饰才能更好的发挥作用。Kim等(KimT,Seo H J,Choi J S,et al.PAMAM-PEG-PAMAM:novel triblock copolymer as abiocompatible and efficient gene delivery carrier.Biomacromolecules.2004,5(6):2487-2492.)用PEG修饰PAMAM来降低其正电荷毒性，细胞活力实验证明修饰PEG后的PAMAM毒性明显降低。然而，PEG的存在会导致纳米粒的粒径急剧增大(Jiang G,Li R,TangJ,et al.Formulation of temozolomide-loaded nanoparticles and their targetingpotential to melanoma cells.Oncology reports,2016.)，影响纳米载体的被动靶向性和肿瘤渗透性。另外，经PEG修饰后的载体会在一定程度上降低药物的释放，且对PAMAM本身的酸敏感性及质子海绵效应造成一定的影响，这将降低药物的抗肿瘤效果。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种毒性小、抗肿瘤效果显著的、以树枝状聚合物作为载体的靶向纳米粒子及其制备方法。
为了实现上述技术目的，本发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种PAMAM靶向纳米给药载体，该靶向纳米给药载体的通式为HA-PAMAM-COOH，其中HA为透明质酸，PAMAM为树枝状聚合物；COOH为羧基。
另一方面，本发明还提供了一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒，该靶向纳米粒的通式为HA-PAMAM-COOH-TMZ，其中HA为透明质酸，PAMAM为树枝状聚合物；COOH为羧基，TMZ为替莫唑胺。
进一步优选地，如上所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其中的树枝状聚合物为以乙二胺为核的第1-10代聚酰胺-胺树状大分子。
再进一步优选地，所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其中的树枝状聚合物为以乙二胺为核的第4-6代聚酰胺-胺树状大分子。再进一步优选地，所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其中的树枝状聚合物为以乙二胺为核的第5代聚酰胺-胺树状大分子。
再一方面，本发明还提供了一种上述负载替莫唑胺的靶向纳米粒的制备方法，该方法包括如下2个步骤：
(1)PAMAM-COOH的合成；该步骤可以采用现有的常规方法；
(2)HA-PAMAM-COOH-TMZ的合成：将PAMAM-COOH与TMZ共溶于去离子水中，得到A液；将TMZ与HA共溶于去离子水中，得到B液；B液置于功率为150-300W的探头超声下，一边超声一边将A液缓慢加到B液中，超声5-20min后，将超声后得到的液体超滤，超滤后用去离子水洗1-4次，冻干，得到负载替莫唑胺的靶向纳米粒HA-PAMAM-COOH-TMZ。
进一步优选地，如上所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒的制备方法，其中步骤(1)PAMAM-COOH的合成步骤为：将PAMAM溶解于甲醇中，旋干，并加入无水DMSO重新溶解，形成反应体系；取丁二酸酐溶于无水DMSO中，滴加入反应体系内，室温搅拌12-24h，使用Mw＝3000-4000Da的透析袋透析2-4天后，冷冻干燥，得到产物PAMAM-COOH。
与现有技术相比，本发明采用聚酰胺-胺树状大分子作为载体，使用丁二酸酐来对PAMAM进行修饰，将PAMAM表面的大部分氨基变为更加安全的羧基，从而降低其毒性。红外光谱和核磁氢谱结果显示，PAMAM表面的氨基成功地被羧基取代，取代率为67％，降低了PAMAM的正电荷毒性，DLS结果显示纳米载体的Zeta电位由40.1mV变为12.3mV，而其粒径大小并没有发生明显的变化。
为了进一步减少纳米载体表面的正电荷，同时提高其稳定性和药物包封的效率，我们将HA包裹在载体表面。DLS和TEM结果表明，HA包封的载体大小均匀，呈单分散状态，Zeta电位进一步减小，变为-6.4mV。紫外吸收法测得TMZ的包封率为44.91％，显著高于现有技术报道的20.87％和10％。释药曲线可以看出，在pH＝7.4和pH＝5.0的模拟液中，72h时TMZ释放率分别约为32％和27％，包封在内部的药物释放较缓慢，可以长时间缓释药物，维持体内血药浓度稳定，减少给药次数。
研究发现光热治疗不仅能够直接杀伤肿瘤细胞，还能够抑制肿瘤细胞转移，增加化疗药物敏感性等。因此将本发明的化疗与现有的热疗结合起来能够增强对肿瘤的杀伤能力；此外热疗产生的过高热还能够引起载药纳米粒中药物的释放，从而起到“控释”的作用，使肿瘤局部药物浓度瞬间增大，提高抗肿瘤能力。为了检验合成的载药纳米粒对人黑素瘤A375细胞的杀伤能力，我们进行了CCK-8实验，结果显示本发明的HPCT组与Control组相比，细胞活力有显著下降(P<0.05)，说明TMZ可以被有效释放出来发挥抗黑素瘤作用，与游离的TMZ相比其细胞毒性明显减弱，表明使用纳米载体负载TMZ能够提高其稳定性，减少其毒副作用。
纳米药物的安全性问题制约着其在生物医学方面的应用。为了进一步评估本发明的纳米药物治疗对机体的影响，我们进行了血生化和重要器官(心、肝、脾、肺、肾)病理检查。结果显示谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、肌酐、尿素氮、尿酸、磷酸肌酸同工酶的值在正常范围内，各器官均未见明显损伤，该结果表明载药纳米粒能有效治疗黑素瘤，且对荷瘤小鼠无系统毒性。
附图说明
图1为PC纳米粒合成和鉴定结果图。A：载药纳米粒的合成过程；B:PAMAM和PC的1HNMR图谱；C:PAMAM、PC和HPC的红外光谱图。
图2为PAMAM、PC、HPCT纳米粒的表征结果图。DLS测定PAMAM(A)、PC(B)、HPCT(C)的水合粒径和Zeta电位；HPCT的透射电镜照片(D)。
图3为TMZ的含量测定结果图。A:TMZ和MTIC的紫外吸收光谱；B:TMZ的标准曲线；C：MTIC的标准曲线。
图4为HPCT在不同条件下的释药曲线结果图。
图5为各组对黑素瘤治疗后肿瘤剥离的照片。
图6为治疗后各组肿瘤生长曲线图。系列1：control组；系列2：TMZ组；系列3：HPCT组。
图7为Normal组和HPCT治疗组各脏器的组织切片(200×)。A：Normal；B：HPCT。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：PAMAM-COOH的合成及表征
PAMAM表面的氨基所带的正电荷使其具有一定的细胞毒性，为了使其具有更好的生物相容性，可对其进行表面修饰。本研究拟使用丁二酸酐来对PAMAM进行改性，将PAMAM表面的大部分氨基变为更加安全的羧基，从而得到PC纳米粒(图1A)。
合成方法为：将1.5mL PAMAM-G5.0(290mg，0.01mmol)的甲醇溶液置于单口烧瓶中，旋干，并加入1mL无水DMSO重新溶解。使丁二酸酐(640mg，6.4mmol)溶于1mL无水DMSO中，滴加入反应体系内，室温搅拌24h。使用Mw＝3500Da的透析袋透析三天后，冷冻干燥，得到产物PAMAM-COOH(PC)。利用傅里叶红外光谱仪分析产物的红外光谱测定聚合物官能团，以固体溴化钾粉末作为稀释剂，压片测试。使用核磁共振仪分析测定聚合物的核磁氢谱(1HNMR)，以D2O为溶剂，TMS为内标。
核磁氢谱结果显示，在2.3ppm处出现了丁二酸酐的-CH2-的质子振动峰。根据峰面积比计算得出丁二酸酐的取代度为67％(图1B)。红外光谱结果显示，与PAMAM相比，PC在1257cm-1处出现了羧基的伸缩振动峰，表明了羧基已被成功修饰到纳米粒表面；为了增加纳米粒的稳定性，提高其对药物的包封能力，我们在其表面修饰HA，合成了HA-PAMAM-COOH(HPC)。红外光谱显示HPC的光谱与PC相比，在1084和1045cm-1处出现了HA上羟基的伸缩振动峰，说明了成功将HA包裹在PC的表面(图1C)。以上结果表明，我们成功合成了PC纳米粒，并且可以实现HA对纳米粒的修饰。
实施例2：HA-PAMAM-COOH-TMZ的合成及表征
将5mg PC(实施例1制备)与2mg TMZ共溶于0.5mL去离子水中，得到A液，将3mg TMZ与5mg HA共溶于2mL去离子水中，得到B液。B液置于功率为180W的探头超声下，一边超声一边将A液滴加到B液中，超声10min后，使用30K超滤管将超声后得到的液体用6000rpm/min的转速超滤，用去离子水洗浓缩液三次后，冻干得到载TMZ的纳米粒(HA-PAMAM-COOH-TMZ,HPCT)。
纳米粒形态使用场发射透射电子显微镜测定。用动态散射粒度仪测定纳米粒水合直径、多分散指数(PDI)和Zeta电位等参数。
我们在PC的基础上分别成功包封TMZ合成HPCT纳米粒(图2)。DLS结果显示PAMAM的平均水合粒径为5.46nm，其Zeta电位为40.1mV，多分散指数(PDI)为0.308(图2A)；PC的平均水合粒径为5.80nm，Zeta电位为12.3mV，PDI为0.27(图2B)；HPCT的平均水合粒径为7.43nm，其Zeta电位为-6.43mV，PDI为0.213(图2C)。该结果表明载药后的HPCT纳米粒较PAMAM和PC在粒径上有轻微的增加，其表面电荷由正值变为负值，进一步说明了HA修饰成功。此外HPCT的PDI值更小，说明了HA能够使纳米粒更均匀的分散在溶液中。TEM结果显示HPCT呈球形，大小较为均匀，呈单分散状态，无明显团聚，与DLS测定结果一致(图2D)。
实施例3：TMZ含量测定
为了精确测定药物TMZ的含量，我们测定了TMZ的降解曲线。将一定量的TMZ溶于pH＝7.4的PBS中，配成50μg/mL的溶液，放于37℃的摇床上，速度为150rpm/min。间隔一定的时间点，取出来200μL液体，测定200-400nm的紫外吸收光谱。
由于TMZ在水溶液中不稳定，会逐渐降解为化合物MTIC(5-(3-甲基三氮烯-1-基)咪唑-4-酰胺)，因此需要建立TMZ和MTIC的测定方法。紫外吸收法测定结果显示TMZ的最强吸收峰位于328nm，其降解产物MTIC的最强吸收波长为266nm(图3A)，而HPCT纳米粒在此波长处无吸收，不会干扰TMZ的测定。因此我们可以使用328nm和266nm波长处的吸光强度作为药物定量的标准。为了进一步研究TMZ的稳定性，我们测定TMZ在不同时间的吸收谱。结果表明，TMZ在6h的时候已经完全转化为MTIC，而6～24h在266nm处的吸光度并未发生明显变化，表明MTIC是比较稳定的。配置一系列浓度的药物，绘制标准曲线，以吸光度A对浓度C进行线性回归处理，得回归方程：A＝0.0591C+0.1243，R2＝0.9988(TMZ)和A＝0.0591C+0.135，R2＝0.9997(MTIC)(图3B、3C)。
实施例4：包封率和载药率的测定
通过紫外可见吸收光谱仪测定上清液中328nm和266nm处的光吸收，然后使用差减法来确定TMZ含量。
纳米粒包封率(EE)和载药率(DL)计算公式如下：
根据公式计算TMZ的包封率和载药率分别为44.91％和16.64％。
实施例5：HPCT在不同条件下对TMZ的释放动力学研究
将含有1.5mg TMZ的溶液使用pH＝2.0的PBS分散为3mL，放入透析袋中(其中pH＝5.0+Haase组的透析袋中加入1mg的HA酶)。将透析袋分别放入50mL离心管中，并在离心管中加入pH＝5.0和pH＝7.4的PBS溶液40mL。将离心管放入37℃，150rpm的摇床上，模拟释药。在不同的时间点取出1mL释放液后，加入1mL新鲜的对应pH的PBS。测定不同时间点所取液体在328nm和266nm处的吸收，计算得到对应时间点的释放量。
释药曲线显示，在72h时，TMZ在pH＝7.4的条件下释放量(32％)略高于在pH＝5.0环境中的释放量(27％)，但是在酸性环境中添加了透明质酸酶之后，TMZ的释放量明显上升，72h时约为38％(图4)。
实施例6：人黑素瘤A375细胞的复苏、培养、传代、细胞计数和细胞冻存
1、细胞复苏
(1)取出冻存于液氮中的人黑素瘤A375细胞冻存管，迅速放入37℃的水浴锅中，使其迅速融化，置于超净工作台中。
(2)无菌条件下打开冻存管，将细胞用移液枪转移至15mL无菌离心管中，加入DMEM高糖培养液4mL，轻轻混匀，1000rpm离心3min。弃上清液，加入5mL含10％FBS的DMEM高糖培养基，悬浮细胞。
(3)将细胞悬液转移至培养瓶中，放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。
(4)次日更换培养基，继续培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况。
2、细胞培养
A375细胞常规培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
3、细胞传代
倒置显微镜下见A375细胞贴壁生长至培养瓶面积80％～90％融合时，去掉原培养基，加入PBS液2mL漂洗细胞两次。加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察待细胞大部分变圆后，吸除消化液，加入培养液终止消化。吸管轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3比率，接种到培养瓶中，加入适量的培养液，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养。
4、细胞计数
细胞培养至饱和密度，消化细胞成单细胞悬液，1000rpm离心3min，弃上清，加入2mL含血清培养基，吹打混匀，20μL移液枪吸取一滴细胞悬液，从计数板边缘滴入。计数4个大方格内细胞数量。根据公式：细胞数目/每毫升悬液＝(4个大方格的细胞数目/4)×104换算。
5、细胞冻存
(1)选取处于对数生长期的A375细胞，冻存前一天换培养液一次。
(2)用0.25％胰蛋白酶消化细胞，置离心管中，1000rpm×3min离心。
(3)弃上清，加入细胞冻存液，轻轻吹打使细胞重悬浮。
(4)每只冻存管内加入细胞悬液1mL，旋紧盖子，并在冻存管上标记。
(5)将冻存管4℃冰箱放置15min，然后迅速移入-20℃冰箱放置20min，最后-80℃冰箱过夜，第二天转移至液氮瓶内。
实施例7：荷瘤模型研究载药纳米粒的治疗作用
BALB/c-nu裸鼠，雌性，6～8周龄，体重约19-21g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。裸鼠饲养于恒温(22～25℃)、恒定湿度的SPF级的屏障系统中。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。
实验分组：Ⅰ：Normal(不接肿瘤)，Ⅱ：Control，Ⅲ：TMZ，Ⅴ：HPCT。取对数生长期A375细胞消化离心后收集，用PBS洗3次，1000rpm×5min，快速置于冰上，与提前解冻的matrigel 1:1混合，配成4×107/mL的混合液，取100μL接种于BALB/c裸鼠右后腿。待肿瘤长至100cm3后将裸鼠随机分成6组，每组5只。进行尾静脉注射药物：Control组注射100μL生理盐水；TMZ组每只注射70mg/kg TMZ；HPCT组每只注射含TMZ 70mg/kg的HPCT。记录肿瘤生长情况，每两天称量体重和测量肿瘤体积，肿瘤体积(mm3)＝长径×短径×短径/2。自给药开始连续观测14天，绘制肿瘤生长曲线。14天后眼球采血进行血生化检测，处死所有裸鼠，剥离移植瘤进行拍照，解剖出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，进行病理切片检测。
肿瘤生长曲线(图6)显示，Control组肿瘤生长迅速，TMZ组肿瘤生长速度被部分抑制，HPCT组肿瘤生长速度较游离TMZ组降低。图5为肿瘤剥离照片，各组肿瘤大小有差异，同肿瘤生长曲线结果一致。
实施例8：载药纳米粒对荷瘤小鼠系统毒性研究
考察了合成的纳米载体治疗后对机体正常组织(心、肝、脾、肺、肾)的毒性，如图7所示。同Normal组(未接种肿瘤)相比，治疗组对各器官均未产生损害。此外，眼球取血后进行了血生化检查(表1)，结果显示谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、肌酐、尿素氮、尿酸、磷酸肌酸同工酶的值均在正常范围内，说明治疗后无明显的系统毒性。以上结果表明载药纳米粒能有效治疗黑素瘤，且对荷瘤小鼠无系统毒性。
表1Normal组和治疗组血生化结果
Group AST(U/L) ALT(U/L) CRE(U/L) BUN(U/L) TBIL(U/L) CK(U/L) UA(U/L)
Normal 141.42±32.93 34.84±5.20 72.69±6.96 4.37±0.63 4.06±0.43 516.22±160.52 121.75±15.10
HPCT 118.37±10.82 30.80±4.63 70.94±6.25 4.24±0.62 3.66±0.90 416.88±114.99 117.81±32.93

Claims (6)

1.一种PAMAM靶向纳米给药载体，其特征在于，该靶向纳米给药载体的通式为HA-PAMAM-COOH，其中HA为透明质酸，PAMAM为树枝状聚合物；COOH为羧基。
2.一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其特征在于，该靶向纳米粒的通式为HA-PAMAM-COOH-TMZ，其中HA为透明质酸，PAMAM为树枝状聚合物；COOH为羧基，TMZ为替莫唑胺。
3.根据权利要求2所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其特征在于，所述的树枝状聚合物为以乙二胺为核的第1-10代聚酰胺-胺树状大分子。
4.根据权利要求3所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒，其特征在于，所述的树枝状聚合物为以乙二胺为核的第4-6代聚酰胺-胺树状大分子。
5.一种根据权利要求2所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)PAMAM-COOH的合成；
(2)HA-PAMAM-COOH-TMZ的合成：将PAMAM-COOH与TMZ共溶于去离子水中，得到A液；将TMZ与HA共溶于去离子水中，得到B液；B液置于功率为150-300W的探头超声下，一边超声一边将A液缓慢加到B液中，超声5-20min后，将超声后得到的液体超滤，超滤后用去离子水洗1-4次，冻干，得到负载替莫唑胺的靶向纳米粒HA-PAMAM-COOH-TMZ。
6.根据权利要求5所述负载替莫唑胺的靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)PAMAM-COOH的合成步骤为：将PAMAM溶解于甲醇中，旋干，并加入无水DMSO重新溶解，形成反应体系；取丁二酸酐溶于无水DMSO中，滴加入反应体系内，室温搅拌12-24h，使用Mw＝3000-4000Da的透析袋透析2-4天后，冷冻干燥，得到产物PAMAM-COOH。
CN201710242377.1A 2017-04-13 2017-04-13 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法 Active CN107115320B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710242377.1A CN107115320B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710242377.1A CN107115320B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107115320A true CN107115320A (zh) 2017-09-01
CN107115320B CN107115320B (zh) 2019-11-26

Family

ID=59725262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710242377.1A Active CN107115320B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107115320B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998402A (zh) * 2018-01-17 2018-05-08 四川大学 一种厚朴酚-羧基端聚酰胺缓释剂的制备方法及应用
CN109682967A (zh) * 2018-12-17 2019-04-26 暨南大学 Pamam在制备用于免疫检测的试剂中的应用
CN114588277A (zh) * 2022-04-07 2022-06-07 江苏省苏北人民医院 装载有替莫唑胺和Pep-1的聚多巴胺纳米颗粒的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102429870A (zh) * 2011-12-21 2012-05-02 中国药科大学 一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体
CN105477643A (zh) * 2015-12-19 2016-04-13 杜文红 一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统
US20160346208A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 University Of South Carolina Dual responsive brain targeted nanoparticles and their applications

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102429870A (zh) * 2011-12-21 2012-05-02 中国药科大学 一种喜树碱类药物的新型肿瘤靶向树状聚合物纳米载体
US20160346208A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 University Of South Carolina Dual responsive brain targeted nanoparticles and their applications
CN105477643A (zh) * 2015-12-19 2016-04-13 杜文红 一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998402A (zh) * 2018-01-17 2018-05-08 四川大学 一种厚朴酚-羧基端聚酰胺缓释剂的制备方法及应用
CN109682967A (zh) * 2018-12-17 2019-04-26 暨南大学 Pamam在制备用于免疫检测的试剂中的应用
CN114588277A (zh) * 2022-04-07 2022-06-07 江苏省苏北人民医院 装载有替莫唑胺和Pep-1的聚多巴胺纳米颗粒的构建方法
CN114588277B (zh) * 2022-04-07 2023-04-25 江苏省苏北人民医院 装载有替莫唑胺和Pep-1的聚多巴胺纳米颗粒的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107115320B (zh) 2019-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106139144B (zh) 一种具有协同抗肿瘤特性的透明质酸修饰的金-碳纳米球及其制备方法与应用
CN104758952B (zh) 共递送药物和基因的纳米载体及其制备方法和用途
Wang et al. Multi-stimuli responsive nanosystem modified by tumor-targeted carbon dots for chemophototherapy synergistic therapy
CN106806343A (zh) 一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒及制备方法与应用
CN107412787A (zh) 一种用于光学治疗的光敏剂靶向纳米粒及其制备方法和应用
Li et al. Light-enhanced hypoxia-responsive nanoparticles for deep tumor penetration and combined chemo-photodynamic therapy
Han et al. Tumor microenvironment-responsive Ag2S-PAsp (DOX)-cRGD nanoparticles-mediated photochemotherapy enhances the immune response to tumor therapy
CN104940945B (zh) 一种透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物及其制备方法与应用
Chen et al. Tumor microenvironment-responsive micelles for pinpointed intracellular release of doxorubicin and enhanced anti-cancer efficiency
Xiong et al. Polydopamine-mediated bio-inspired synthesis of copper sulfide nanoparticles for T1-weighted magnetic resonance imaging guided photothermal cancer therapy
Gao et al. AuNRs@ MIL-101-based stimuli-responsive nanoplatform with supramolecular gates for image-guided chemo-photothermal therapy
CN109999197B (zh) 肿瘤靶向的纳米复合物、制备方法及其在声动力介导的肿瘤精准治疗中的应用
CN107115320B (zh) 一种负载替莫唑胺的靶向纳米粒及其制备方法
CN107982533A (zh) 抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备与应用
Chen et al. Wrapping Porphyromonas gingivalis for tumor microenvironment immunomodulation and photothermal immunotherapy
CN107126561A (zh) 一种可实现化疗和ptt/pdt联合治疗的抗肿瘤协同组合物及其应用
Yang et al. Self-assembled multifunctional polymeric micelles for tumor-specific bioimaging and synergistic chemo-phototherapy of cancer
Han et al. Mitochondria-targeted high-load sound-sensitive micelles for sonodynamic therapy to treat triple-negative breast cancer and inhibit metastasis
Ye et al. Microenvironment-responsive chemotherapeutic nanogels for enhancing tumor therapy via DNA damage and glutathione consumption
Gao et al. Self-assembled chitosan/rose bengal derivative nanoparticles for targeted sonodynamic therapy: preparation and tumor accumulation
Hu et al. Fabrication of programmed photosensitizer-conjugated nanoassemblies by dual supramolecular self-assembly for photodynamic therapy of orthotopic hepatoma
CN107158404A (zh) 一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向pH敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法
Xing et al. Engineering near-infrared laser-activated gold nanorod vesicles with upper critical solution temperature for photothermal therapy and chemotherapy
Hu et al. Combination losartan with hyaluronic acid modified diethyldithiocarbamate loaded hollow copper sulfide nanoparticles for the treatment of breast cancer and metastasis
Lu et al. Construction of carboxymethyl chitosan-based nanoparticles of hypoxia response for co-loading doxorubicin and tanshinone IIA

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant