CN107110817A - 使用纳米孔和标签的核酸分子检测 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法和系统。测定靶核酸分子的存在的方法包括促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极在靶核酸分子移动穿过所述纳米孔时检测电流或电流变化。靶核酸分子如果存在的话可具有在其末端偶联的标签，该标签增加靶核酸分子在纳米孔中的停留时间。通过电流或电流变化测量基于靶核酸分子停留时间的增加来测定样品中靶核酸分子的存在。

Description

使用纳米孔和标签的核酸分子检测

背景技术

可以使用例如基于热循环的方法(例如聚合酶链反应(PCR))或等温方法(例如环介导的等温扩增)来扩增核酸分子。可在核酸分子扩增的同时或之后检测扩增产物。这可以允许鉴定感兴趣的核酸序列，如单核苷酸多态性(SNP)、序列突变(包括例如缺失、插入、复制和易位)、罕见核酸分子/序列和样品中其他感兴趣的序列。此外，可以使用核酸扩增来制备用于核酸测序的核酸分子。

发明内容

尽管目前存在可用于核酸扩增和序列鉴定的方法和系统，但各种限制与这类方法相关联。一些核酸序列鉴定方法是昂贵的，并且可能不会在预期应用所需的时间框架内和/或准确度下足够快速地生成序列信息。在此认识到对能够进行序列鉴定的用于鉴定核酸扩增反应产物的改进方法存在需求。

本公开内容提供了用于容易地测定生物样品中靶核酸序列或分子的存在或不存在的系统和方法。在一些实施方案中，可以在不获得靶核酸分子的核酸序列的情况下从信号(例如，电流或其变化)的连续测量检测靶核酸分子。

本公开内容的一方面提供了一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法，该靶核酸分子在该靶核酸分子的末端与标签偶联。所述方法包括(a)促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当靶核酸分子不与所述标签偶联时，靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的电流或其变化检测所述样品中的靶核酸分子，从而测定所述样品中靶核酸分子的存在。

在一些实施方案中，所述标签是核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。

在一些实施方案中，该标签是包含可检测标记的分子。例如，该标签分子可以选自荧光素亚酰胺(FAM)和六氯荧光素(HEX)。在一些实施方案中，该标签是多肽。在一些实施方案中，该标签不是光学可检测的。

在一些实施方案中，该标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，该温度高于或等于约85℃。在一些实施方案中，该温度高于或等于约90℃。在一些实施方案中，该温度高于或等于约94℃。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在上文提及的步骤(a)之前进行以下步骤：(i)提供反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为靶核酸分子的前体的生物样品，与该模板核酸分子互补的至少一种引物，和聚合酶，以及(ii)在产生所述样品中的靶核酸分子的条件下使所述反应混合物经历核酸扩增反应。在一些实施方案中，所述标签与所述至少一种引物偶联。在一些实施方案中，所述样品包含靶核酸分子，并且其中该靶核酸分子是作为所述扩增反应的扩增产物的多个拷贝中的拷贝。在一些实施方案中，所述引物是通用引物、人工引物或肽核酸。在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是等温扩增。在一些实施方案中，该等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。在一些实施方案中，所述至少一种引物包括至少两种引物。

在一些实施方案中，上文提及的步骤(b)包括测量电流变化，该变化指示所述靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，该电流变化是电流相对于时间的一阶导数(firstmoment of current with time)。

在一些实施方案中，在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量电流。在一些实施方案中，所述标签与靶核酸分子不可逆地偶联。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。在一些实施方案中，该横截面尺寸为约2nm至15nm。

在一些实施方案中，所述膜是固态膜。在一些实施方案中，该固态膜包含半导体或非金属。在一些实施方案中，该固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。在一些实施方案中，该固态膜由石墨烯形成。

在一些实施方案中，所述膜是脂双层。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。在一些实施方案中，该成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。在一些实施方案中，所述促使包括跨所述至少一个纳米孔施加电位。在一些实施方案中，该电位是可逆的。在一些实施方案中，该电位相对于参比为约1V至10V。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括跨所述至少一个纳米孔施加至少一个电位脉冲，以将靶核酸分子引导至和/或穿过所述至少一个纳米孔。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔邻近或靠近附加电极。在一些实施方案中，靶核酸分子通过以下步骤进行检测：(i)在所述样品流过至少一个纳米孔时测量电流或其变化，以及(ii)将该电流或其变化与参考值进行比较。

在一些实施方案中，所述标签在所述标签与所述至少一个纳米孔相互作用后增加停留时间。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。在一些实施方案中，所述多个纳米孔是可单独寻址的。在一些实施方案中，在所述样品流过所述至少一个纳米孔时，在没有获得靶核酸分子的核酸序列的情况下，根据电流或其变化的连续测量检测靶核酸分子。在一些实施方案中，在指示存在靶核酸分子的停留时间时检测电流或其变化。

在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少10个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少20个连续的核苷酸碱基。

在一些实施方案中，靶核酸分子是单链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

另一方面提供了一种用于在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的系统，该靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基。所述系统包含：邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，其中该电极适于在样品流过所述至少一个纳米孔时检测电流；与所述至少一个纳米孔流体连通且适于保持所述样品的至少一个样品支持体；以及计算机处理器，其可操作地耦合至所述电极并被编程为(i)促使所述样品从所述至少一个样品支持体流过所述至少一个纳米孔，(ii)测量单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的停留时间，以及(iii)当所述停留时间落入参考阈值之内时，将所述单个核酸分子鉴定为靶核酸分子。

在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为测量所述单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的第一停留时间，并且如果第一停留时间长于当靶核酸分子不与标签在靶核酸分子的末端偶联时，靶核酸分子在所述至少一个纳米孔中或穿过所述至少一个纳米孔的第二停留时间，则将所述单个核酸分子鉴定为靶核酸分子。一些实施方案中，该标签是核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是选自FAM和HEX的分子。在一些实施方案中，该标签是多肽。在一些实施方案中，该标签不是光学可检测的。在一些实施方案中，所述标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。

在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少10个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少20个连续的核苷酸碱基。

在一些实施方案中，靶核酸分子是单链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是DNA或RNA。

在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为在没有获得所述单个核酸分子的核酸序列的情况下，将所述单个核酸分子鉴定为靶核酸分子的至少一部分。

在一些实施方案中，所述样品具有小于1摩尔/升(M)的Mg²⁺浓度。在一些实施方案中，该浓度小于0.1M。在一些实施方案中，该浓度小于0.01M。在一些实施方案中，该浓度小于0.001M。

在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为(a)测量电流或其变化，以及(b)根据该电流或其变化确定停留时间。在一些实施方案中，相对于基线测量电流或其变化。在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量电流或其变化。在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为在将所述电流或其变化与参考值进行比较后确定停留时间。

在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。在一些实施方案中，该横截面尺寸为约2nm至15nm。

在一些实施方案中，所述膜是脂双层。在一些实施方案中，所述膜是固态膜。在一些实施方案中，该固态膜包含半导体或非金属。在一些实施方案中，该固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。

在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。在一些实施方案中，该成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。

在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为跨所述纳米孔施加电位。在一些实施方案中，该电位是可逆的。在一些实施方案中，该电位相对于接地电极为约1V至10V。

在一些实施方案中，所述纳米孔邻近或靠近附加电极。在一些实施方案中，该附加电极是参比电极。

在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。在一些实施方案中，所述多个纳米孔是可单独寻址的。

在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔是芯片的一部分。在一些实施方案中，所述计算机处理器是具有所述电极的电路的一部分。在一些实施方案中，所述计算机处理器与具有所述电极的电路分开。在一些实施方案中，所述计算机处理器为专用集成电路(ASIC)。在一些实施方案中，所述计算机处理器是移动电子设备的一部分。

基于仅示出和描述了本发明的说明性实施方案的以下详述，本发明的其他方面和优点将变得对本领域技术人员而言显而易见。将会认识到，本发明能够包括其他不同的实施方案，并且能够在各个明显的方面对其若干细节进行更改，所有这些均不背离本公开内容。相应地，附图和说明书将被视为在本质上是说明性的，而非限制性的。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图(本文中也称为“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1示出了用于检测靶核酸分子的一般工作流程。

图2示出了包含具有纳米孔的膜的纳米孔传感器。

图3A示出了包含具有纳米孔的膜的纳米孔传感器，以及邻近该膜的、在其末端具有标签的靶核酸分子；图3B示出了穿透图3A的纳米孔的靶核酸；图3C示出了与纳米孔或膜相互作用以减慢或停止靶核酸分子穿过该纳米孔的流动的标签。

图4示出了由纳米孔传感器测量的随时间变化的电流(i)的图。

图5示出了被编程或以其他方式被配置用于实现本文提供的方法的计算机控制系统。

具体实施方式

尽管本文中已经示出并描述了本发明的多个实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

本文所用的术语“膜”通常是指将至少两个体积的流体隔开的结构。膜的实例包括但不限于固态膜和脂双层。膜可以是有机膜如脂双层，或合成膜如由固态材料(例如，半导体、金属、半金属或非金属)或聚合材料形成的膜。

本文所用的术语“纳米孔”通常是指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。纳米孔可设置成邻近或靠近传感电路或与传感电路耦合的电极，例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中，纳米孔具有0.1纳米(nm)至约1000nm数量级的特征尺寸(例如横截面、宽度或直径)。一些纳米孔是蛋白质。α溶血素是蛋白质纳米孔的一个实例。

本文所用的术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可包含一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的亚单位。核苷酸可包含A、C、G、T或U，或其变体，包括但不限于肽核酸(PNA)。核苷酸可包含能够掺入到生长中的核酸链内的任何亚单位。这样的亚单位可以是A、C、G、T或U，或对于一个或多个互补A、C、G、T或U是特异性的或与嘌呤(即，A或G，或其变体)或嘧啶(即，C、T或U，或其变体)互补的任何其他亚单位。亚单位可以使单个核酸碱基或成组碱基(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶对应物)能够得到解析。在一些示例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物。核酸可以是单链或双链的。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。

本文所用的术语“聚合酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的示例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可以是聚合反应酶。

本文所用的术语“标签”通常是指与核酸分子在其末端偶联(例如，附接)的任何原子或分子物质。标签可以与核酸分子的末端直接偶联或通过连接体间接偶联。标签可以是核酸分子(例如，多核苷酸)、多肽、蛋白质(例如，酶)、聚合材料或可与纳米孔或膜相互作用以减慢核酸分子穿过该纳米孔的行进的其他部分。例如，该标签可以是具有至少5、10或20个连续核苷酸碱基的核酸分子。该标签可以是质量标签。该标签可以是荧光染料或荧光团。标签的实例包括但不限于蛋白质、荧光素亚酰胺(FAM)、六氯荧光素(HEX)、生物素、四氯荧光素(TET)、四甲基罗丹明(TAMRA)、花青染料(例如Cy3或Cy5)、磺基罗丹明101酰氯(德克萨斯红)、黑洞猝灭剂(BHQ)和4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸(Dabcyl)。该标签可以不是光学可检测的。

所述标签的横截面尺寸可以大于纳米孔的横截面尺寸。在一些情况下，标签与纳米孔或膜相互作用以减慢核酸分子穿过该纳米孔的行进。该相互作用可以是可逆的或不可逆的。

本文所用的术语“受试者”通常是指动物或其他生物体，如哺乳动物物种(例如，人)、禽类(例如，鸟)物种或植物。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿类、人类、农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是患有或疑似患有某种疾病或有患该疾病的倾向的个体，或者需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。

本文所用的术语“样品”通常是指含有或疑似含有核酸分子的任何样品。例如，受试者样品可以是含有一种或多种核酸分子的生物样品。该生物样品可从受试者的身体样品获得(例如，提取或分离)，该身体样品可选自血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。该身体样品可以是受试者的体液或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些示例中，该样品获自受试者的无细胞体液，如全血。在这样的情况下，该样品可包含无细胞DNA和/或无细胞RNA。在一些其他示例中，该样品是环境样品(例如，土壤、废物、环境空气等)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)和食物样品(例如，奶制品、植物产品和肉制品)。

本文所用的术语“基因组变异”通常是指受试者的核酸样品或基因组中的变体或多态性。变体的实例包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、置换、重复、可变长度串联重复、侧翼序列、结构变体、颠换、重排和拷贝数变异。

测定靶核酸分子的存在

本公开内容的一方面提供了用于测定样品中靶核酸分子的存在的方法和系统。靶核酸分子可以具有用于预期应用的感兴趣的核酸序列，该应用包括但不限于物种鉴定、环境测试、法医分析以及一般研究和疾病表征。

可使用传感器检测样品中靶核酸分子的存在。该传感器可以具有被配置用于检测电流或电流随时间的变化的一个或多个纳米孔的阵列。可以通过测量电流(C)或电流随时间的变化(或电流相对于时间的一阶导数，dC/dt)，并且在一些情况下通过将这样的测量值与参考值(或基线)进行比较来检测靶核酸分子。

样品可以包含一种或多种分子，其中至少一些分子可以是靶核酸分子。任何分子在纳米孔中或穿过纳米孔的停留时间(或滞留时间)可以指示样品中靶核酸分子的存在。在一些情况下，靶核酸分子具有可检测的在纳米孔中的停留时间，其可以大于样品中的其他分子。通过测量电流或电流随时间的变化并确定停留时间，可在样品中检测靶核酸分子(如果存在)。

可以使用在靶核酸分子的末端与靶核酸分子偶联(例如附接)的标签来增加靶核酸分子的停留时间。该标签可以减慢靶核酸分子穿过纳米孔的流动。该标签可以是蛋白质如酶、多核苷酸或可与纳米孔或膜相互作用以减少或停止靶核酸分子穿过该纳米孔的流动的其他部分。该标签可以在该标签与纳米孔或膜相互作用后增加停留时间。例如，该标签的横截面尺寸可以大于纳米孔的横截面尺寸。偶联有标签的靶核酸分子被引导穿过纳米孔，并且无法流过该纳米孔。这减少或停止了靶核酸分子穿过该纳米孔的流动。。

标签与纳米孔或膜之间的相互作用可以是可逆的，使得在施加刺激后，该相互作用可被打破或以其他方式解除，并且靶核酸分子可以离开纳米孔。这样的刺激可以是电压，如电压脉冲(例如，10V脉冲)或压降。

靶核酸分子可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其变体。例如，可以通过使靶核酸样品断裂成片段，对靶核酸样品进行处理。靶核酸分子可以是单链或双链的。

靶核酸分子可以包含连续的核苷酸。在一些实例中，靶核酸分子包含至少5、10、30、40、50、100、200、300、400、500或1000个核苷酸。

靶核酸分子可以是样品中的模板核酸分子的扩增产物。在一些情况下，可以通过从受试者获取生物样品并使该样品经历核酸扩增以扩增模板核酸分子的至少一部分来检测靶核酸分子。如果存在感兴趣的核酸序列，那么可在被选择用于扩增模板核酸分子或其一部分的条件下进行核酸扩增。如果存在感兴趣的核酸序列，那么核酸扩增可以产生一种或多种扩增的核酸产物。这样的产物可以包括靶核酸分子。

模板核酸分子可以是DNA、RNA或其变体。例如，可以通过使模板核酸样品断裂成片段，对模板核酸样品进行处理。模板核酸分子可以是单链或双链的。

一旦样品经历了核酸扩增，即可检测到靶核酸分子。这可以使用本文其他地方描述的传感器来进行。可在不进行核酸测序，例如不获得样品中靶核酸分子或其他核酸分子的核酸序列的情况下检测靶核酸分子。例如，可以在不进行合成测序技术(例如，Illumina、Pacific Biosciences of California、Genia或Ion Torrent)的情况下确定靶核酸分子的存在。可在不连续测量指示靶核酸分子的至少1、2、3、4或5个核苷酸的信号(例如，光信号或电流)的情况下确定靶核酸分子的存在。

图1示出了样品处理的工作流程。在第一操作101中，制备生物样品以供检测。例如，可从受试者的体液获取生物样品，并且可从体液中分离核酸分子。该核酸分子可以是用于后续分析的模板核酸分子。在一些情况下，对该核酸分子进行处理以产生模板核酸分子，如进行片段化以产生多个模板核酸分子。

模板核酸分子随后可以经受核酸扩增条件以扩增(即，生成一个或多个拷贝)模板核酸分子。模板核酸分子的扩增产物可以是用于后续分析的靶核酸分子。

在一些情况下，提供一种反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为靶核酸分子的前体的生物样品。该反应混合物还可以包含与模板核酸分子互补的至少一种引物和聚合酶。所述至少一种引物可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50种引物。每种引物可以具有为了特定类型的分析，如检测受试者中的给定疾病或基因组变异而选择的序列。

引物可以与一个标签或多个标签偶联。这样的偶联可以采用直接附接或通过连接体附接的方式。例如，引物可以附接至生物素、FAM或HEX部分。这可以允许用引物扩增模板核酸分子，以产生作为扩增产物的靶核酸分子。靶核酸分子可在靶核酸分子的末端并入标签。然而，作为替代方案，引物不与标签偶联，而是在随后的时间点提供标签。在一些实例中，该引物是人工引物，如锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。该引物可以是通用引物。

接下来，可在产生样品中的靶核酸分子的条件下使反应混合物经历核酸扩增反应。靶核酸分子可以是模板核酸分子的多个拷贝中的拷贝，该拷贝是该核酸扩增反应的扩增产物。

所述反应混合物可以包含完成核酸扩增(例如，DNA扩增、RNA扩增)所需的试剂，这类试剂的非限制性示例包括对靶RNA或靶DNA具有特异性的引物组、由RNA的逆转录产生的DNA、DNA聚合酶、逆转录酶(例如，用于RNA的逆转录)、合适的缓冲液(包括两性离子缓冲液)、辅因子(例如，二价和单价阳离子)、dNTP以及其他酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)等)。在一些情况下，反应混合物还可包含一种或多种报道剂(reporter agent)。该反应混合物还可以包含适合于促进核酸扩增的酶，如聚合化酶(本文中也称为“聚合酶”)。该聚合酶可以是用于扩增DNA的DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以能够以模板结合的方式将核苷酸掺入到DNA链中。DNA聚合酶的非限制性示例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热曲线。

在一些情况下，DNA样品可以由RNA样品生成。这可以采用逆转录酶实现，该逆转录酶可以包括在与RNA模板结合时能够将核苷酸掺入到DNA链中的酶。可以使用任何合适的逆转录酶。逆转录酶的非限制性示例包括HIV-1逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、端粒酶逆转录酶，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。

核酸扩增反应可以包括一个或多个用于生成扩增产物的引物延伸反应。在PCR中，例如，引物延伸反应可以包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下温育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下温育一段延伸持续时间。变性温度可根据例如所分析的具体生物样品、生物样品中靶核酸的具体来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所需的反应条件而变化。例如，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些示例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些示例中，变性温度可为约90℃至约97℃。在一些示例中，变性温度可以为约92℃至约95℃。在另外其他的示例中，变性温度可为至少约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

作为替代方案，在等温扩增中，温度可以是固定的(即，不循环)，并且可以采用引物组和除了复制活性之外还具有较高链置换活性的聚合酶来生成扩增产物。可能适合用于等温扩增的聚合酶的示例为Bst聚合酶。可以将温度固定在约50℃至80℃，或60℃至65℃。在环介导的等温扩增(LAMP)中，例如，可以采用聚合酶和具有至少2、3、4或5种引物的引物组来扩增模板核酸分子。

在核酸扩增期间或之后，可向反应混合物中提供标签。例如，在核酸扩增中使用的引物可以与标签偶联，例如在末端偶联。例如，该标签可以通过直接附接而直接附接至或经由连接体附接至引物的5’端。在一个实例中，引物的5’端附接至生物素、FAM或HEX部分。这可以允许用引物扩增模板核酸分子，以产生作为扩增产物的靶核酸分子，该靶核酸分子在该靶核酸分子的末端并入标签。该标签可以允许使用本公开内容的纳米孔传感器来检测靶核酸分子。在一些情况下，引物偶联至多个标签，如至少2、3、4或5个标签。

继续参见图1，在第二操作102中，在使模板核酸分子经历核酸扩增之后，可以确定作为扩增产物的靶核酸分子的存在。这可以通过检测指示存在靶核酸分子的一种或多种信号来实现，如在使用本文其他地方描述的传感器测量电流或电流随时间的变化时的靶核酸分子的停留时间。接下来，在第三操作103中，对所述一种或多种信号进行分析以确定靶核酸分子是存在还是不存在。还可以对所述一种或多种信号进行分析以确定靶核酸分子的相对量。

模板核酸分子的扩增和靶核酸分子的检测可以在同一系统如器皿中进行。在一些情况下，该系统是配置用于核酸扩增的管，如eppendorf PCR管。作为替代方案，扩增和检测在分开的系统中进行。例如，扩增在eppendorf PCR管中进行，而检测在具有纳米孔传感器的分开的芯片中进行。

纳米孔传感器

本公开内容的另一方面提供了用于检测靶核酸分子的纳米孔传感器。纳米孔传感器可以包含膜中的一个或多个纳米孔的阵列。每个纳米孔可设置成邻近测量电极，该测量电极被配置用于检测电流或电流随时间的变化，在一些情况下参考参比电极进行检测。

所述阵列可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、1000、10000、100000或1000000个传感器。每个传感器可以包含至少1、2、3、4或5个纳米孔。每个传感器可以是可单独寻址的。纳米孔的密度可以是至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰或10¹¹个纳米孔/平方毫米(mm²)。

图2示出了纳米孔传感器200，其包含与导电溶液202(例如盐溶液)接触的第一电极201。传感器200包含接近、邻近或靠近膜205中的纳米孔204的第二电极203。第二电极203与具有用于信号(例如电流或电流变化)测量的电路的电路元件206相邻。膜205与至少部分由壁207限定的室208(例如阱(well))相邻。壁207可由半导体如氧化硅或氧化铝(例如SiO₂)形成。作为替代方案，壁207由聚合材料形成。在一些实例中，壁207是可用于核酸扩增的管的一部分。

纳米孔传感器200可以在被配置用于核酸扩增的容器(例如管)如eppendorf PCR管中。该容器可以包含用于模板核酸分子的核酸扩增的顶部室和用于靶核酸分子的后续检测的底部室。该容器可以是一次性的和/或可重复使用的。

作为替代方案，纳米孔传感器200可以是包含样品支持体(sample holder)的芯片的一部分。该样品支持体可以包含具有或疑似具有靶核酸分子的样品。该芯片可以具有用于信号检测和处理的板上电子器件(例如计算机处理器)。作为替代方案，该板上电子器件可以是芯片外的，如在与芯片相邻并与芯片通信的计算机系统中。该芯片可以是一次性的和/或可重复使用的。电路元件206可以包含使纳米孔传感器200与计算机系统通信的电流流动路径。

例如，纳米孔传感器200是可插入阅读器(未示出)中并可从阅读器中移除的容器或芯片的一部分。阅读器可以包含允许检测具有或疑似具有靶核酸分子的样品中的靶核酸分子的计算机处理器。作为替代方案，计算机处理器在与阅读器分开并与其通信的计算机系统中。阅读器可以包含将样品引导至纳米孔传感器的流体流动系统(例如，泵和致动器)。

纳米孔传感器200可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、1000、10000、100000或1000000个传感器的阵列。每个传感器可以包含至少1、2、3、4或5个纳米孔。

膜205可以是固态膜。膜205可由半导体或非金属形成。在一些实例中，膜205由选自碳、硅、锗和砷化镓的材料形成。例如，膜205可由石墨烯形成。

作为替代方案，膜205可以是脂双层。该脂双层可以包含两层脂质分子。该脂双层可以包含具有亲水头和各两个疏水尾的磷脂。当暴露于水时，这样的磷脂可自身排列成两层薄片(双层)，并且其所有尾均指向薄片的中心。该双层的中心可以含有少量水至无水，并排除分子。该脂双层的外表面可以是亲水性的，而该脂双层的内部可以是疏水性的。

纳米孔204可以是提供穿过膜205的通道的孔。作为替代方案，纳米孔204可以是膜205中的成孔蛋白质。这样的替代方案可在膜205为脂双层的情况下使用。该成孔蛋白质可以是α溶血素或MspA孔蛋白。

纳米孔204可以具有允许流体流过纳米孔204的横截面尺寸。该横截面尺寸可以允许核酸样品流过纳米孔204。该横截面尺寸可以为约0.5纳米(nm)至30nm，或1nm至20nm，2nm至15nm，3nm至10nm，或2.5nm至3.4nm。

纳米孔204可以具有各种形状和尺寸。例如，纳米孔204可以具有矩形、计时沙漏形、凹形、凸形、圆锥形或部分形状或其组合。纳米孔204可以具有跨越膜205的长度。在一些情况下，纳米孔204具有约10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的长度，并且膜205具有约10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的厚度。纳米孔204的长度可与膜205的厚度相同或不同。例如，纳米孔204可以跨越膜205厚度的至少约50％、60％、70％或80％。

膜205包含反侧(trans side)和顺侧(cis side)。顺侧邻近第一电极201。在使用过程中，具有偶联至末端的标签的靶核酸分子被从膜205的顺侧引导至反侧。顺侧与反侧相对。该标签可具有减慢或停止靶核酸分子穿过纳米孔的流动的尺寸，或者被配置为与纳米孔204或膜205相互作用以减慢或停止靶核酸分子穿过纳米孔204的流动。例如，该标签大于纳米孔204的横截面尺寸。作为另一实例，该标签与纳米孔204的通道或边缘的一部分相互作用，以减慢或停止靶核酸分子穿过纳米孔204的流动。

溶液202可以具有电解质。该电解质可以包括一种或多种盐，如NaCl、KCl或AgCl。溶液202可以具有允许使用第一电极201和第二电极203检测电流的盐浓度。在一个实例中，该浓度可以为约0.1摩尔/升(M)至10M，或2M至8M。作为另一个实例，该浓度可以为0.1mM至10mM，或0.5mM至5mM。

溶液202可以包含用于PCR的缓冲液。例如，溶液202可以包含50mM至200mM Tris-HCl(例如，100mM Tris-HCl)、200mM至1000mM KCl(例如，500mM KCl)和0.5mM至5mM MgCl₂。

第一电极201和第二电极203可由一种或多种金属形成。在一些情况下，第一电极201和第二电极203由Au、Ag或Pt形成。例如，第一电极201由Pt形成，第二电极203由Ag形成。作为替代方案，第一电极201由Pt形成，第二电极203由AgCl形成。

在一些情况下，第二电极203由允许在检测期间电化学消耗电极203的材料形成。例如，第二电极203可由AgCl形成。在传感器200的操作期间，AgCl→Ag⁺+Cl^-。可以通过对第二电极203施加反电位以使AgCl沉积到第二电极203上从而逆转消耗来逆转这一情况。

在一些情况下，通过相对于第一电极201对第二电极203施加直流(DC)电压来操作传感器200。电压范围可以为0.5伏(V)至20V，或1V至10V。在这样的直流操作中，电压可以逆转(即，V→-V→V)。作为替代方案，通过相对于第一电极201对第二电极203施加交流(AC)电压来操作传感器。电压范围可以为0.5V至20V，或1V至10V。

在传感器200的操作期间，可在第一电极201与第二电极203之间施加电压时跨纳米孔204提供电场。该电场可被配置为将溶液202中的靶核酸分子引导至纳米孔204。该电场可以帮助靶核酸分子靠近并穿过纳米孔204。作为替代方案或除此之外，可以跨纳米孔204提供压降，这可以帮助靶核酸分子靠近并穿过纳米孔204。在一些情况下，压力衍生的力超过相对的电压衍生的力。可以使用压降和电场的组合来调节靶核酸分子的运动。例如，可通过在从膜205的反侧到顺侧施加电场、同时从顺侧到反侧施加压降，使靶核酸分子的运动减慢。作为替代方案，可通过在从膜205的顺侧到反侧施加电场、同时从顺侧到反侧施加压降，使靶核酸分子的运动加速。

在一些情况下，对压力衍生的力和电压衍生的力进行平衡，以调节(例如，增加或减少)靶核酸分子穿过纳米孔204的移位时间(或停留时间)。可以经由关系式qE＝Fmech从分子上的力平衡推导出电荷，其中“E”是纳米孔204中的电场，其可以是施加在电极201与203之间的电压的函数，而Fmech是来自所施加的压力和/或穿过纳米孔204的流体流动在靶核酸分子上的机械力的总和。

在传感器200的使用期间，电路206提供跨第一电极201和第二电极203的电位。溶液202中的电解质可以通过纳米孔204转运溶液202中的离子。在使用期间，第二电极203可以经历氧化反应以在溶液202中产生第二电极203的离子，该离子可被引导穿过纳米孔移向第一电极201。可以使用溶液202中的离子，在第一电极201处发生还原反应。

在溶液202流过纳米孔204时，可以使用第一电极201和第二电极203检测可测量的电流。该电流可以随流过纳米孔204的流速的变化而变化。例如，在用靶核酸分子阻塞纳米孔204后，流速可以改变，这可以导致由第一电极201和第二电极203所测得的电流的变化。这样的电流变化可与阻塞的尺寸和时间相关。阻塞纳米孔204更长时间段的分子可在更长的时间段产生电流变化，这可与分子在纳米孔中的停留时间成比例。电流变化的强度可与阻塞的尺寸直接相关。例如，与在纳米孔204中或流过纳米孔204的较小分子相比，在纳米孔204中或流过纳米孔204的较大分子可以产生更大的电流变化。

如果靶核酸分子存在于溶液中，它可以以某种方式制备成具有与之偶联的标签，这增加了靶核酸分子在纳米孔204中的停留时间。停留时间的这种增加可赋予电流(C)或电流变化(dC/dt)随时间的变化，这可以通过电极201和203来检测。

电路206可以逆转跨第一电极201和第二电极203的电位的方向。这可以帮助逆转第二电极203的任何消耗。例如，为了在第二电极上沉积来自溶液202的离子，可以逆转跨第一电极201和第二电极203的电位，这可在第二电极203处提供还原反应(例如，Ag⁺+Cl^-→AgCl)。

本公开内容的纳米孔传感器可用于检测靶核酸分子。通过增加靶核酸分子在纳米孔传感器的纳米孔中、与之邻近或靠近的停留时间，从而影响流体穿过纳米孔的流动，可以促进这样的检测。这可在纳米孔传感器的电极处生成可测量的电流或电流变化。可以使用与靶核酸分子的末端偶联的标签来增加靶核酸分子的停留时间。

图3A-3C示意性地示出了使用纳米孔传感器300对靶核酸分子的检测。参见图3A，纳米孔传感器300包含具有纳米孔302的膜301。标签303附接至连接体304，连接体304附接至靶核酸分子305。靶核酸分子305被设置在膜301的顺侧处靠近膜301。靶核酸分子305包含连续的核酸亚单位306(或核苷酸)。纳米孔传感器300包含电极(未示出)，该电极可如本文其他地方所述。通过在电极之间施加电位(V)——这可以提供将靶核酸分子305引导至纳米孔302的电场，靶核酸分子305可被引导至纳米孔302。

标签303可以是被选择为以降低靶核酸分子蛋白质穿过纳米孔302的流速的方式与纳米孔302相互作用的部分。例如，标签303是生物素、FAM或HEX部分。可以选择溶液的条件，使得该部分的活性基本不受影响。标签303可以在高于或等于80℃、85℃、90℃或94℃的温度下是稳定的。在一些情况下，标签303在高于或等于80℃、85℃、90℃或94℃的温度下与靶核酸分子305稳定地偶联。

具有标签303、连接体304和靶核酸分子305的溶液可以具有经选择使得标签303和连接体304的活性基本不受影响的条件。例如，标签303和连接体304在扩增条件下可以不具有降低的或大幅减弱的活性。

在一些实例中，标签303是蛋白质，例如酶。该酶可以是聚合酶或分子马达。该酶可以具有降低的活性或不具有酶促活性。可以选择溶液的条件，使得该酶具有降低的活性或不具有酶促活性。该条件可以选自样品的盐(或离子)浓度和温度。

连接体304可以是包含一个或多个核酸或氨基酸部分的分子，如多核苷酸或多肽。连接体304可以是聚合物。在一些情况下，连接体304是聚合物，如肽、核酸、聚乙二醇(PEG)。连接体304可以具有任何合适的长度。例如，连接体304可以具有至少约1nm、5nm或10nm的长度。连接体304可以是刚性的或柔性的。

纳米孔302可具有约0.5纳米(nm)至30nm，或1nm至20nm，2nm至15nm，3nm至10nm，或2.5nm至3.4nm的横截面尺寸(例如直径)。标签303可具有比纳米孔302的横截面尺寸更大的横截面尺寸(例如直径或有效直径)。作为替代方案，标签303具有比纳米孔302更小的横截面尺寸，但标签303被配置为与纳米孔302相互作用，以减少或停止靶核酸分子305穿过纳米孔302的流动。例如，该标签可以小于纳米孔302，但包括与膜301或纳米孔302中的携带电荷的基团相互作用的携带电荷的基团，这些基团被类似地极化(例如，均带正电荷或带负电荷)，使得这些携带电荷的基团之间的相互作用提供了减少或停止靶核酸分子305穿过纳米孔302的流动的排斥相互作用。

在图3B中，如通过在电极之间施加电位，靶核酸分子305被引导穿过纳米孔302。因为靶核酸分子305的横截面尺寸小于纳米孔302的横截面尺寸，所以靶核酸分子305从膜301的顺侧向该膜的反侧(或反之亦然，在某些情况下)流过纳米孔302。在图3C中，标签303与膜301或纳米孔302相互作用。这样的相互作用可以减慢或停止靶核酸分子305穿过纳米孔302的流动，这增加了靶核酸分子305在纳米孔302中的停留时间。可以通过电极将增加的停留时间检测为可测量的电流(C)或电流变化(dC/dt)随时间的变化。在标签303的帮助下，靶核酸分子305可以被卡在纳米孔302中，这可以生成可测量的电流，该电流可以使得能够从没有与标签偶联的其他核酸分子中检测靶核酸分子305。

在样品流过纳米孔302时，可在没有获得靶核酸分子305的核酸序列的情况下，从电流或其变化的连续测量检测靶核酸分子305。可在指示存在靶核酸分子305的停留时间时检测电流或其变化。例如，从1毫秒(ms)至10ms测得的电流可以指示靶核酸分子305的存在，而在小于1ms时测得的电流可以指示溶液中可能不是靶核酸分子305的其他分子或物质。

可以通过在具有或疑似具有靶核酸分子305的样品流过纳米孔302时测量电流或其变化来检测靶核酸分子305。所测得的电流或其变化可与参考值(例如，基线电流或电流变化)进行比较。作为时间的函数相对于这种参考值的任何差异可以指示靶核酸分子305的存在。

在检测靶核酸分子305之后，可以提供刺激以从纳米孔302移除靶核酸分子305。该刺激可以是压力脉冲、热脉冲、电压脉冲、施加剪切力(sheer force)或其组合。在一些情况下，该刺激打破了标签303与膜301或纳米孔302之间的相互作用。例如，该刺激打破了标签303与靶核酸分子305之间的相互作用，例如，通过破坏连接体304。作为替代方案，该刺激是流动方向的逆转，诸如在施加负压降或电压时。这诱导靶核酸分子305逆转流动方向，并从反侧向顺侧离开纳米孔302。

在一些实例中，所述刺激是由纳米孔传感器的电极之间提供的电压脉冲。该电压脉冲可以包括约0.5V至20V或1V至10V的电压，并提供约500纳秒(ns)至2ms或500ns至1ms的时间段。例如，该电压脉冲是约1ms时间段的5V电位。在一些情况下，脉冲持续时间小于或等于约5ms、4ms、3ms、2ms或1ms。该电压可具有与用来将靶核酸分子305引导至纳米孔302中的极性相反的极性。

可对膜301和/或纳米孔302施加刺激。可在使得膜301和/或纳米孔302不被破坏的条件下将刺激引导至膜301和/或纳米孔302。

例如，如果使用电压V(例如，0.5mV)将靶核酸分子305沿着从膜301的顺侧到反侧的方向引导至纳米孔302，则可使用电压-V引导靶核酸分子305从膜301的反侧到顺侧离开该纳米孔。

作为另一示例，如果使用跨纳米孔302的压降ΔP(例如，1个大气压)将靶核酸分子305沿着从膜301的顺侧到反侧的方向引导至纳米孔302，则可使用压降-ΔP引导靶核酸分子305从膜301的反侧到顺侧离开纳米孔。

一旦靶核酸分子305从纳米孔302中移除，就可使用纳米孔302来检测溶液中另一靶核酸分子的存在。例如，可以跨纳米孔302提供压降(例如，ΔP)和/或电压(V)，以将偶联有标签303的另一靶核酸分子305引导至纳米孔302中。

靶核酸分子305可与一个标签或多个标签偶联。在一些情况下，多个标签(例如，2、3、4或5个标签)可以提供靶核酸分子305在纳米孔302中的某种停留时间，该停留时间可以提供更高的检测灵敏度(例如，大于90％)。多个标签可以与靶核酸分子305直接偶联，或者通过一个或多个连接体间接偶联。

图4示出了使用本公开内容的纳米孔传感器测得的电流测量值(y轴)与时间(x轴，毫秒(ms))的示例图。纳米孔传感器包含具有纳米孔的膜。在检测时间段内，溶液穿过纳米孔的流动减慢或以其他方式被破坏三次，从而产生电流信号401、402和403。电流401-403的每个变化均有停留时间(τ)。将停留时间与参考值进行比较可以导致确定电流信号403与靶核酸分子相关，而信号401和402与靶核酸分子不相关。可以通过测量指示存在被标签停止或停滞在纳米孔中的靶核酸分子的电流变化(例如，ΔC相对于时间，或dC/dt相对于时间)来进行这种确定。例如，根据参考测量值(即，利用具有已知靶核酸分子的样品)，大于或等于5ms的任何停留时间可以归因于靶核酸分子。信号401和402具有约1ms的停留时间，而信号403具有大于5ms的停留时间。

信号403可以持续到对纳米孔和/或膜施加刺激以从纳米孔去除靶核酸分子。在图示的实例中，在时间404时对纳米孔和/或膜施加电压脉冲。

与靶核酸分子不相关的信号401和402可以各自独立于刺激持续给定的时间段。信号403可以持续到在时间404时施加刺激。

信号401、402和403的振幅可以相同或不同。在一些情况下，信号403的振幅与信号401和402的振幅不同。

纳米孔传感器可以连续地或周期性地测量电流。在一些情况下，纳米孔传感器在促使含有具有或疑似具有靶核酸分子的样品的溶液流过纳米孔之后测量电流。

用于形成纳米孔的方法

本公开内容的纳米孔可以经由多种方法形成。例如，可以使用光刻法形成一个或多个纳米孔的阵列，其中在光致抗蚀剂(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯))中限定一个或多个孔的图案，并使用光刻法将该图案转移到基底(例如，硅基底)，该方法可以包括将一个或多个孔的图案暴露于各向异性化学蚀刻剂。

在一些情况下，提供基底并且邻近该基底提供光致抗蚀剂层。该光致抗蚀剂层可由例如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基戊二酰亚胺)(PMGI)、酚醛树脂或基于环氧树脂的负性光致抗蚀剂(例如SU-8)形成。该光致抗蚀剂可在暴露于光如紫外(UV)线后得以显影(developed)。

接下来，可使光致抗蚀剂暴露于电磁辐射或颗粒(例如，光或电子束)的图案，以在暴露基底的光致抗蚀剂中限定孔。曝光可以导致化学变化，该化学变化允许通过洗涤液去除一些光致抗蚀剂，从而留下孔。正性光致抗蚀剂在曝光时可以变得可溶于洗涤液中，而在负性光致抗蚀剂中，未曝光区可溶于洗涤液中。接下来，孔可以暴露于化学蚀刻剂。该化学蚀刻剂可以提供各向异性蚀刻。例如，该化学蚀刻剂可以是氢氧化钾(KOH)。在一些情况下，聚焦离子束和/或时间缓冲氧化物蚀刻(BOE)可用于提供精细蚀刻，如去除残留氧化物。

所述基底可以是半导体或聚合物基底。例如，该基底可由硅、锗、碳(例如石墨烯)或砷化镓或其氧化物或氮化物形成。作为一个实例，该基底由硅、氧化硅或氮化硅形成。作为另一实例，该基底可由诸如铜、镍或铝的金属形成。该基底可以具有约10nm至5000nm或20nm至1000nm或30nm至1000nm的厚度。在一个实例中，该基底具有约50nm至150nm的厚度。

根据本文提供的方法形成的纳米孔可以具有各种电导率。例如，具有约5nm至15nm的横截面尺寸的纳米孔可以具有约20纳西门子(nS)至150nS、50nS至120ns或60nS至110nS的电导率。这样的电导率可以相对于电解质如KCl的流动进行测量。

计算机控制系统

本公开内容提供了被编程为实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图5示出了计算机系统501，其被编程或以其他方式被配置用于检测溶液中靶核酸样品的存在。计算机系统501可以调节本公开内容的纳米孔传感器的各个方面，例如，检测电流或电流随时间的变化。计算机系统501可与可作为芯片的一部分的纳米孔传感器进行通信。计算机系统501可以是固定的或可移动的。在一些实例中，计算机系统501是移动电子设备的一部分。

计算机系统501包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)505，其可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统501还包括存储器或存储位置510(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元415(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口520(例如，网络适配器)以及外围设备525，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器510、存储单元515、接口520和外围设备525通过诸如主板等通信总线(实线)与CPU 505相通信。存储单元515可为用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统501可借助于通信接口520可操作地耦合至计算机网络(“网络”)530。网络530可为因特网、互联网和/或外联网，或与因特网相通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络530为电信和/或数据网络。网络530可包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可支持分布式计算，诸如云计算。网络530，在一些情况下借助于计算机系统501，可实现对等网络，这可使与计算机系统501耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。

CPU 505可执行一系列机器可读指令，该计算机可读指令可体现在程序或软件中。该指令可存储在诸如存储器510等存储位置中。该指令可针对CPU 505，随后可编程或以其他方式配置CPU 505以实现本公开内容的方法。由CPU 505执行的操作的示例可包括提取、解码、执行和回写。

CPU 505可以是诸如集成电路等电路的一部分。系统501的一个或多个其他组件可包括在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。

存储单元515可存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元515可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统501可包括一个或多个附加数据存储单元，所述附加数据存储单元位于计算机系统501外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统501相通信的远程服务器上。

计算机系统501可通过网络530与一个或多个远程计算机系统相通信。例如，计算机系统501可与用户(服务提供者)的远程计算机系统相通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如， iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如， iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可经由网络530访问计算机系统501。

如本文所述的方法可通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统501的电子存储位置上，例如在存储器510或电子存储单元515上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可由处理器505执行。在一些情况下，可从存储单元515检索该代码并将其存储于存储器510上以备由处理器505获取。在一些情况下，可排除电子存储单元515，而将机器可执行指令存储于存储器510上。

所述代码可被预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可在运行期间被编译。该代码可以以编程语言提供，可选择编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。

本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统501，可体现在编程中。本技术的多个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式。机器可执行代码可存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)等电子存储单元或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信，例如，可使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的。携带这类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非受限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可采取许多形式，包括但不限于：有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，例如可用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括导线，该导线包括计算机系统内的总线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的那些电信号或电磁信号或者声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送至处理器以供执行。

计算机系统501可包括电子显示器535或与之通信，电子显示器535包含用于随时间提供例如来自纳米孔传感器的信号的用户界面(UI)540。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开内容的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。算法可在由中央处理单元505执行时通过软件实现。

实施例1

在处理室中用高能粒子辐射半导体基底(例如硅)。该高能粒子可以是氩离子(例如Ar⁺)。使用光刻和蚀刻在半导体基底中生成至少一个纳米孔。例如，可在半导体附近提供掩模，并且暴露与纳米孔相对应的掩模的位置，并去除此位置的掩模以暴露半导体基底的一部分。使半导体基底的暴露部分与蚀刻溶液(例如，HF和HNO₃的混合物)接触，以在半导体基底中蚀刻出纳米孔。半导体基底中的蚀刻阻断层可以终止蚀刻。可在电极附近提供具有纳米孔的半导体基底，以提供纳米孔传感器。

可在effendorf PCR管中，包括用于PCR反应和用于检测的室中，提供纳米孔传感器。具有纳米孔的半导体可以是使两个阱(顺式阱和反式阱)分开的膜。将用于核酸扩增(例如等温扩增)的试剂加入到顺式阱中。用于核酸扩增的试剂可以包括PCR缓冲液、引物、DNA聚合酶和模板核酸样品。LAMP和内切核酸酶可在约65℃的温度下进行，以生成双链靶核酸分子作为模板核酸分子的扩增产物。接下来，内切核酸酶与纳米孔共价交联。在顺式阱与反式阱之间施加电压，并用纳米孔传感器测量电流。

阱之间(跨顺侧和反侧)的电压诱导带负电荷的靶核酸分子进入并电泳穿过纳米孔。靶核酸分子在其末端具有标签，该标签增加靶核酸分子在纳米孔中的停留时间。基于所增加的停留时间，确定靶核酸分子的存在。基于停留时间可以将具有标签的靶核酸分子与不具有标签的其他核酸分子区分开来。

实施例2

将2μm湿热氧化硅薄膜和100nm低压化学气相沉积(LPCVD)低应力(富硅)氮化硅沉积在1-20ohm·cm电阻率的500μm厚P掺杂<100>Si晶片上。通过晶片的各向异性KOH(33％，80℃)蚀刻(其中已通过反应性离子蚀刻在光刻图案化区域中去除薄膜)形成独立的20μm膜。使用聚焦离子束(Micrion 9500)去除独立膜中心的1μm平方面积中的约1.5μm氧化硅。随后的BOE去除约600nm的剩余氧化物，从而在独立氧化物/氮化物膜的中心留下2μm独立氮化硅微膜。在用KOH和BOE处理之后，如通过椭偏测量术和横截面透射电子显微术(TEM)所测量的，该氮化物膜的厚度约为80nm。使用来自JEOL 2010F场发射TEM(JEOL USA，Peabody，MA)的聚焦200keV电子束在该氮化物微膜的中心形成大致沙漏形的纳米孔。纳米孔直径约为10nm。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本文并不打算通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和图示不应以限制性的意义来解释。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此可以设想，本发明还应当覆盖任何这样的替代、修改、更改或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，因此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (90)

1.一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定所述靶核酸分子的存在的方法，所述靶核酸分子在所述靶核酸分子的末端与标签偶联，所述方法包括：

(a)促使所述样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当所述靶核酸分子不与所述标签偶联时，所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及

(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量所述电流或其变化；以及

(c)根据(b)中测得的所述电流或其变化检测所述样品中的所述靶核酸分子，从而测定所述样品中所述靶核酸分子的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，所述标签是核酸分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签是选自荧光素亚酰胺(FAM)和六氯荧光素(HEX)的分子。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签是多肽。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签不是光学可检测的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述温度高于或等于约85℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述温度高于或等于约90℃。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述温度高于或等于约94℃。

13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在(a)之前，(i)提供反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为所述靶核酸分子的前体的生物样品，与所述模板核酸分子互补的至少一种引物，和聚合酶，以及(ii)在产生所述样品中的所述靶核酸分子的条件下使所述反应混合物经历核酸扩增反应。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签与所述至少一种引物偶联。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包含所述靶核酸分子，并且其中所述靶核酸分子是作为所述扩增反应的扩增产物的多个拷贝中的拷贝。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述引物是通用引物、人工引物或肽核酸。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸扩增反应是等温扩增。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种引物包括至少两种引物。

21.根据权利要求1所述的方法，其中(b)包括测量电流变化，该变化指示所述靶核酸分子的存在。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述电流变化是电流相对于时间的一阶导数。

23.根据权利要求1所述的方法，其中在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量所述电流。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签与所述靶核酸分子不可逆地偶联。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述横截面尺寸为约2nm至15nm。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜是固态膜。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述固态膜包含半导体或非金属。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述固态膜由石墨烯形成。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜是脂双层。

32.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。

34.根据权利要求1所述的方法，其中所述促使包括跨所述至少一个纳米孔施加电位。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述电位是可逆的。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述电位相对于参比为约1V至10V。

37.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括跨所述至少一个纳米孔施加至少一个电位脉冲，以将所述靶核酸分子引导至和/或穿过所述至少一个纳米孔。

38.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔邻近或靠近附加电极。

39.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子通过以下步骤进行检测：(i)在所述样品流过至少一个纳米孔时测量所述电流或其变化，以及(ii)将所述电流或其变化与参考值进行比较。

40.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签在所述标签与所述至少一个纳米孔相互作用后增加所述停留时间。

41.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个纳米孔是可单独寻址的。

43.根据权利要求1所述的方法，其中在所述样品流过所述至少一个纳米孔时，在没有获得所述靶核酸分子的核酸序列的情况下，根据所述电流或其变化的连续测量检测所述靶核酸分子。

44.根据权利要求1所述的方法，其中在指示存在所述靶核酸分子的停留时间时检测所述电流或其变化。

45.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述靶核酸分子包含至少10个连续的核苷酸碱基。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述靶核酸分子包含至少20个连续的核苷酸碱基。

48.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子是双链的。

49.一种用于在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定所述靶核酸分子的存在的系统，所述靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基，所述系统包含：

邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，其中所述电极适于在样品流过所述至少一个纳米孔时检测电流；

与所述至少一个纳米孔流体连通且适于保持所述样品的至少一个样品支持体；以及

计算机处理器，其可操作地耦合至所述电极并被编程为(i)促使所述样品从所述至少一个样品支持体流过所述至少一个纳米孔，(ii)测量单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的停留时间，以及(iii)当所述停留时间落入参考阈值之内时，将所述单个核酸分子鉴定为所述靶核酸分子。

50.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为测量所述单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的第一停留时间，并且如果所述第一停留时间长于当所述靶核酸分子不与标签在所述靶核酸分子的末端偶联时，所述靶核酸分子在所述至少一个纳米孔中或穿过所述至少一个纳米孔的第二停留时间，则将所述单个核酸分子鉴定为所述靶核酸分子。

51.根据权利要求50所述的系统，其中所述标签是核酸分子。

52.根据权利要求51所述的系统，其中所述标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。

53.根据权利要求52所述的系统，其中所述标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。

54.根据权利要求53所述的系统，其中所述标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。

55.根据权利要求50所述的系统，其中所述标签是选自荧光素亚酰胺(FAM)和六氯荧光素(HEX)的分子。

56.根据权利要求50所述的系统，其中所述标签是多肽。

57.根据权利要求50所述的系统，其中所述标签不是光学可检测的。

58.根据权利要求50所述的系统，其中所述标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。

59.根据权利要求49所述的系统，其中所述靶核酸分子包含至少10个连续的核苷酸碱基。

60.根据权利要求59所述的系统，其中所述靶核酸分子包含至少20个连续的核苷酸碱基。

61.根据权利要求49所述的系统，其中所述靶核酸分子是双链的。

62.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为在没有获得所述单个核酸分子的核酸序列的情况下，将所述单个核酸分子鉴定为所述靶核酸分子的至少一部分。

63.根据权利要求49所述的系统，其中所述样品具有小于1摩尔/升(M)的Mg²⁺浓度。

64.根据权利要求63所述的系统，其中所述浓度小于0.1M。

65.根据权利要求64所述的系统，其中所述浓度小于0.01M。

66.根据权利要求65所述的系统，其中所述浓度小于0.001M。

67.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为(a)测量电流或其变化，以及(b)从所述电流或其变化确定所述停留时间。

68.根据权利要求67所述的系统，其中相对于基线测量所述电流或其变化。

69.根据权利要求67所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量所述电流或其变化。

70.根据权利要求67所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为在将所述电流或其变化与参考值进行比较后确定所述停留时间。

71.根据权利要求49所述的系统，其中所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。

72.根据权利要求71所述的系统，其中所述横截面尺寸为约2nm至15nm。

73.根据权利要求49所述的系统，其中所述膜是脂双层。

74.根据权利要求49所述的系统，其中所述膜是固态膜。

75.根据权利要求74所述的系统，其中所述固态膜包含半导体或非金属。

76.根据权利要求74所述的系统，其中所述固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。

77.根据权利要求49所述的系统，其中所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。

78.根据权利要求77所述的系统，其中所述成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。

79.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为跨所述纳米孔施加电位。

80.根据权利要求79所述的系统，其中所述电位是可逆的。

81.根据权利要求79所述的系统，其中所述电位相对于接地电极为约1V至10V。

82.根据权利要求49所述的系统，其中所述纳米孔邻近或靠近附加电极。

83.根据权利要求82所述的系统，其中所述附加电极是参比电极。

84.根据权利要求49所述的系统，其中所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。

85.根据权利要求84所述的系统，其中所述多个纳米孔是可单独寻址的。

86.根据权利要求49所述的系统，其中所述至少一个纳米孔是芯片的一部分。

87.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器是具有所述电极的电路的一部分。

88.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器与具有所述电极的电路分开。

89.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器为专用集成电路(ASIC)。

90.根据权利要求49所述的系统，其中所述计算机处理器是移动电子设备的一部分。