CN107041125B - 氧化铁纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途 - Google Patents

氧化铁纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途 Download PDF

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Abstract

本发明内容是关于Fe3‑δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途。Fe3‑δO4纳米粒子可专一标的至难辨梭状芽孢杆菌孢子，并破坏其结构。相较于其他已知具有杀菌功效的纳米粒子，Fe3‑δO4纳米粒子具有更为显著的杀孢子活性。因此，本发明内容的Fe3‑δO4纳米粒子可用以作为一种杀菌剂，或者更具体来说，一种用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的杀孢子剂。

Description

氧化铁纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途
技术领域
本发明内容是关于抑制难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)。更具体来说，本发明内容是关于Fe3-δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途。
背景技术
部分细菌会通过形成孢子存活于诸如紫外光照射、干燥、高温、极冷及化学消毒剂处理等严峻及养份缺乏的环境中。一旦环境转换，孢子可再活化为营养状态(vegetativestate)。因此，芽孢杆菌(Bacillus)及梭状芽孢杆菌等会形成孢子的病原体乃为临床疾病治疗及预防的一重大挑战。难辨梭状芽孢杆菌是一种会对健康产生危害的病原体，难辨梭状芽孢杆菌感染(C.difficile infection,CDI)会造成抗生素治疗相关腹泻、伪膜性肠炎(pseudomembranous colitis)、腹痛、发烧及死亡。目前仅有少数抗生素可用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染。然而，第一线抗生素的失效率及治疗后的复发率往往偏高。有鉴于此，难辨梭状芽孢杆菌于感染后30天的死亡率约为6.9％，感染1年后的死亡率则约为16.7％。
难辨梭状芽孢杆菌的孢子是造成难辨梭状芽孢杆菌感染的主因之一。相较于对氧气敏感的营养细菌(vegetative bacteria)，难辨梭状芽孢杆菌孢子可于严峻的环境下存活数个月。已知肠道中的正常菌丛会抑制难辨梭状芽孢杆菌，并以此抑制难辨梭状芽孢杆菌感染。然而，长期使用抗生素的病患通常是感染难辨梭状芽孢杆菌的主要族群，且其感染源多是源自医疗人员身上的孢子。一旦孢子进入人类的肠胃道，并接触到牛胆酸盐(taurocholate)或其衍生物后，该些孢子会发芽(germinate)，进而群聚于结肠。难辨梭状芽孢杆菌的毒性多是取决定tcdA及tcdB基因的表现，其会分别表现毒素A(toxin A，一种肠毒素)及毒素B(toxin B，一种细胞毒素)。二种毒素皆会造成肠道发炎，并促使嗜中性球(neutrophil)侵润至感染部位。
有鉴于感染率逐年增加，如何有效控制难辨梭状芽孢杆菌感染已变成一亟需解决的重要议题。已知包含甲硝唑(Metronidazole)、万古霉素(Vancomycin)及非达霉素(Fidaxomicin)等不同的抗生素可用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染。该些抗生素虽可减缓或阻断难辨梭状芽孢杆菌感染所造成的症状，然其也会导致具有抗性的难辨梭状芽孢杆菌增生。此外，对化学消毒剂具有抗性的孢子会加重临床上难辨梭状芽孢杆菌感染处理的难辨性。某些胆酸盐(cholate)衍生物或可治疗难辨梭状芽孢杆菌感染，然其多属临床前研究阶段。次氯酸钠(sodium hypochlorite)为一种消毒剂，具有显著的抗菌活性，正因为该显著的抗菌活性次氯酸钠也同时会对组织产生腐蚀性及刺激性等副作用。
基于目前已知的治疗无法有效治疗难辨梭状芽孢杆菌感染，相关领域研究人员正亟力研发可用以解决此健康议题的方法。在该些研究中，纳米粒子已证实可通过产生自由基(reactive oxygen species)、破坏细胞膜、释放毒性离子及/或与硫基结合等不同机制产生抗菌功效。该些具有抗菌功效的纳米粒子包含银(Ag)、氧化锌(ZnO)、二氧化钛(TiO2)及零价铁(zero-valent iron)纳米粒子。然而，多数抗菌纳米粒子仅对营养细胞(vegetative cell)具有生物毒杀活性，而不会对孢子产生杀孢子功效。
有鉴于此，相关领域亟需一种有效且具生物兼容性的孢子抑制剂，以此控制孢子的发芽并治疗难辨梭状芽孢杆菌感染。
发明内容
发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本发明内容是关于Fe3-δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途，其中δ为一介于0到0.3之间的数值。据此，Fe3-δO4纳米粒子可用以制备一种用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的药物。
本发明内容的第一实施例因此是关于一种于活体外抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的方法。该方法包含将难辨梭状芽孢杆菌的孢子与一有效量的Fe3-δO4纳米粒子共同培养，其中δ为一介于0到0.3之间的数值。
依据本发明内容某些实施方式，纳米粒子为一截角八面体粒子(truncatedoctahedron nanoparticle)；其中，截角八面体的各边长度约为5到25纳米。在一实施方式中，各边长度约为14纳米。在另一实施方式中，各边长度约为22纳米。
依据本发明内容某些实施方式，纳米粒子的有效量至少为每毫升5微克；较佳的情况是，约为每毫升5到500微克。
本发明内容也提供一种用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的医药组合物及/或用以治疗一罹患或疑以患有难辨梭状芽孢杆菌感染的个体的方法。据此，该组合物包含一有效量的Fe3-δO4纳米粒子，其中δ为一介于0到0.3之间的数值；以及一药学上可接受的载体。依据本发明内容某些实施方式，该纳米粒子为一截角八面体粒子，且八面体的各边长度约为5到25纳米。在一较佳实施方式中，各边长度约为14纳米。在另一特定实施方式中，各边长度约为22纳米。
该方法包含投予该个体一治疗有效量的本发明组合物，以此减缓难辨梭状芽孢杆菌感染的病征。依据本发明内容某些实施方式，约投予该个体每公斤体重0.4到4毫克的Fe3-δO4纳米粒子；较佳的情况是，约投予该个体每公斤体重2到4毫克的Fe3-δO4纳米粒子。
依据本发明内容某些实施方式，可以口服、鼻腔或非口服方式投予本发明Fe3-δO4纳米粒子。一般来说，非口服方法可以是经由肌肉注射、静脉注射、皮下注射或腹腔注射来投予。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
第1图是依据本发明内容实施例1.1所绘示的难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽动态，其中该孢子是分别以(A)氧化锌(ZnO)纳米粒子，(B)银(Ag)纳米粒子，(C)三氧化二铁(Fe2O3)纳米粒子，(D)四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子，(E)非氧化铁核-金壳层纳米粒子(以下简称为Fe@Au纳米粒子)，及(F)本发明Fe3-δO4纳米粒子进行处理；
图2是依据本发明内容实施例1.2所绘示的难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽动态，其中该孢子是分别以每毫升500微克的22纳米的Fe3-δO4(▲)、每毫升500微克的14纳米的Fe3-δO4(■)、每毫升50微克的22纳米的Fe3-δO4(□)、每毫升50微克的14纳米的Fe3-δO4(△)及3％漂白剂(●)进行处理；
图3是依据本发明内容实施例1.3所绘示的难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽动态，其中菌株CCUG 19126(A)及ATCC BAA-1805(B)是分别以每毫升500微克的Fe3-δO4(▲)、每毫升50微克的
Figure GDA0002362201830000041
每毫升5微克的Fe3-δO4(△)及3％漂白剂(●)进行处理；
图4是依据本发明内容实施例1.4所绘示的细胞存活柱状图，其中难辨梭状芽孢杆菌营养细胞(vegetative cell)是分别以控制组、Fe3-δO4纳米粒子及漂白剂进行处理；
图5是依据本发明内容实施例2所绘示的难辨梭状芽孢杆菌孢子的电子显微照片，其中该难辨梭状芽孢杆菌孢子是分别以对照组(未经处理的孢子)、每毫升50微克的Fe3-δO4及每毫升500微克的Fe3-δO4进行处理；上方照片是以10,000倍的放大倍率拍摄，下方照片则是以30,000倍的放大倍率拍摄；
图6是依据本发明内容实施例2所绘示的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)照片，其是关于未经(第1-3蛋白条)或经(第4-6蛋白条)Fe3-δO4纳米粒子处理的难辨梭状芽孢杆菌孢子的胞外蛋白(上图)及胞内蛋白(下图)表现量；
图7A是依据本发明内容实施例3.1所绘示的柱状图，其是关于经难辨梭状芽孢杆菌孢子感染的小鼠的平均体重改变量，其中白色柱状代表接受Fe3-δO4纳米粒子处理的小鼠，而黑色柱状则代表未接受Fe3-δO4纳米粒子处理的小鼠；
图7B是依据本发明内容实施例3.1所绘示的柱状图，其是关于经难辨梭状芽孢杆菌孢子感染的小鼠的盲肠重量，其中白色柱状代表接受Fe3-δO4纳米粒子处理的小鼠，而黑色柱状则代表未接受Fe3-δO4纳米粒子处理的小鼠；
图7C是依据本发明内容实施例3.1所绘示的盲肠的发炎状态，该些盲肠是分别取自接受及未接受Fe3-δO4纳米粒子处理的小鼠，并利用活体影像系统(In Vivo ImagingSystems，IVIS，左图)侦测后，以柱状图分析表示(右图)；
图7D是依据本发明内容实施例3.1所绘示的结肠组织病理照片，该些结肠是分别取自经难辨梭状芽孢杆菌孢子感染，且接受(右图)或不接受(左图)Fe3-δO4纳米粒子治疗的小鼠；照片是以物镜20倍或40倍的放大倍率拍摄；
图7E是依据本发明内容实施例3.1所绘示的柱状图，其是关于特定发炎基因的RNA相对表现量，其中该些RNA是分别取自经难辨梭状芽孢杆菌孢子感染，且接受(黑色柱状)或不接受(白色柱状)Fe3-δO4纳米粒子治疗的小鼠的结肠；以及
图8是依据本发明内容实施例3.2所绘示的盲肠的发炎状态，该些盲肠是分别取自经难辨梭状芽孢杆菌感染，且分别以每公斤体重0、2或4毫克的Fe3-δO4纳米粒子治疗的小鼠，并利用活体影像系统(上图)侦测后，以柱状图分析表示(下图)。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，以相同或相似的组件符号来表示相似的组件/部件。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，「约」通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所发明的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时也涵盖该名词的单数型。
在本说明书中，「非化学计量」(nonstoichiometric)一词是用以阐述一具有元素组成的化学化合物，其中该元素组成无法以明确定义的自然数比例来表示，因此违反定比定律。也即，一非化学计量化合物在重量上不包含完全相同比例的元素。
「治疗」(treating)一词包含部份或完全预防、改善、减轻及/或处理难辨梭状芽孢杆菌感染的相关病征(symptom)、次要病征(secondary disorder)或症状(condition)。「治疗」(treating)一词于本说明书中也指应用或投予本发明内容的Fe3-δO4纳米粒子及/或其医药组合物至一个体，其是患有难辨梭状芽孢杆菌感染的相关病征、次要病征或症状，以达到部份或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一或多个癌症的相关病征、症状、或次要病征的发生。难辨梭状芽孢杆菌感染的相关病征、次要病征及/或症状包含，但不局限于，腹泻、腹痛、发烧、粪便味道异常、伪膜性肠炎及死亡。在此「治疗」(treating)也可以是施用至患有早期该些病征或症状的个体，以降低该个体发展成为难辨梭状芽孢杆菌感染的相关病征、次要病征及/或症状的风险。在此「治疗」(treating)为可以有效地减少一个或多个病征或临床标记。换句话说，在此治疗也可以是降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展。
「有效量」(effective amount)在此处是指一药物的用量足以产生所欲的疗效反应。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。有效量也指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克(g)、毫克(mg)或微克(μg)为单位)，或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。也或是，有效量可以医药组合物中活性成份的浓度来表示，例如莫耳浓度(molar concentration)、重量浓度(mass concentration)、体积浓度(volumeconcentration)、重量莫耳浓度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(massfraction)及混合比例(mixing ratio)。本领域普通技术人员可依据动物模式的剂量来计算药物(如本发明内容的纳米粒子)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，习知技艺者可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告的「估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量」(Estimatingthe Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。
「个体」(subject)一词是指包含人类的动物，其是依据本发明内容的方法，能接受本发明内容的纳米粒子的治疗。除非特定指出，否则「个体」(subject)一词同时意指男性及女性，且可以是任何年龄，例如儿童或成人。
本发明是关于Fe3-δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的用途，其中δ为一介于0到0.3之间的数值。据此，Fe3-δO4纳米粒子可用以治疗难辨梭状芽孢杆菌感染。
本发明内容的一实施例是关于一种活体外抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的方法。该方法包含将难辨梭状芽孢杆菌的孢子与一有效量的Fe3-δO4纳米粒子共同培养，其中δ为一介于0到0.3之间的数值，以此抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽。相较于Fe3O4(即磁铁矿，magnetite)或γ-Fe2O3(即磁赤铁矿，maghemite)，本发明内容的Fe3-δO4为一部份氧化且非化学计量的纳米粒子，其δ为一介于0到0.3之间的非正数数值。
可利用任何习知技艺人士所熟知的方法来制备本发明Fe3-δO4。举例来说，可以利用本发明内容实施例所述的方法来进行制备。一般来说，该方法包含：
(1)将乙酰丙酮铁(iron acetylacetonate)溶于油酸(oleic acid)及三辛胺(trioctylamine)中，以形成一混合溶液；
(2)于惰性环境(例如真空或包含氮气或氩气的环境)中，分馏步骤(1)的混合液约30分钟；
(3)以磁铁收集步骤(2)的沉淀物；
(4)以甲苯(toluene)洗涤步骤(3)所收集的沉淀物；
(5)以磁铁收集步骤(4)所洗涤的沉淀物；
(6)将步骤(5)收集的沉淀物加至包含聚苯乙烯顺丁烯二酸(poly(styrene-alt-maleic acid))的氯仿溶液中，以形成Fe3-δO4纳米粒子；以及
(7)以磁铁收集步骤(6)中的Fe3-δO4纳米粒子。
依据上述方法所制得的Fe3-δO4纳米粒子为一截角八面体(truncated octahedronnanoparticle)粒子，其中截角八面体的各边长度约为5到25纳米。举例来说，该截角八面体的各边长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25纳米。在一实施方式中，Fe3-δO4纳米粒子的边长约为14纳米。在另一实施方式中，Fe3-δO4纳米粒子的边长约为22纳米。
依据本发明内容某些实施方式，不论边长为14纳米或22纳米，二种Fe3-δO4纳米粒子皆可有效抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽。在一实施例中，该难辨梭状芽孢杆菌孢子是源自CCUG 37780菌株。在另一实施例中，该难辨梭状芽孢杆菌孢子是源自CCUG 19126菌株。在再另一实施例中，该难辨梭状芽孢杆菌孢子是源自ATCC BAA-1805菌株。
依据其他实施方式，本发明内容的Fe3-δO4纳米粒子具有杀孢子活性，而不会干扰正常菌落中营养细胞的生长。
在本发明内容的实施方式中，相较于氧化锌纳米粒子、银纳米粒子、Fe2O3纳米粒子、Fe3O4纳米粒子及Fe@Au纳米粒子，Fe3-δO4纳米粒子更可有效地抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽。
依据本发明内容一实施方式，Fe3-δO4纳米粒子可直接结合至难辨梭状芽孢杆菌的孢子表面，以此破坏孢子的内部结构，造成孢子内蛋白的释出。
依据本发明内容某些实施方式，为抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽，需投予每毫升至少5微克的纳米粒子至标的位置；较佳的情况是，约投予每毫升5到500微克的纳米粒子。在一实施例中，纳米粒子的有效量为每毫升50微克；在另一实施例中，纳米粒子的有效量为每毫升500微克。
本发明内容的另一实施例是关于一种用以治疗一罹患或疑以患有难辨梭状芽孢杆菌感染的个体的方法。该方法包含投予该个体一治疗有效量的Fe3-δO4纳米粒子，以减缓难辨梭状芽孢杆菌感染的相关症状；其中该Fe3-δO4纳米粒子为一部份氧化的纳米粒子，且δ为一介于0到0.3之间的非整数数值。
依据本发明内容某些实施方式，Fe3-δO4纳米粒子的治疗功效并不局限于由特定难辨梭状芽孢杆菌菌株(例如CCUG 37780、CCUG 19126或BAA-1805菌株)的孢子所引起的感染，而是可治疗由任何难辨梭状芽孢杆菌菌秼的孢子所引发的感染。
适用于投予至个体的Fe3-δO4纳米粒子为一边长为5到25纳米的截角八面体粒子；举例来说，该边长可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25纳米。在本发明内容一实施方式中，Fe3-δO4纳米粒子的边长约为14纳米；在另一实施方式中，Fe3-δO4纳米粒子的边长约为22纳米。
依据本发明内容某些实施方式，可利用口服、鼻腔或非口服等方式将Fe3-δO4纳米粒子投予至个体；投予的剂量约为每公斤体重0.4到4毫克；也即，投予的剂量可以是每公斤体重0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1,2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0毫克。较佳的情况是，投予的剂量约为每公斤2到4毫克。
可于难辨梭状芽孢杆菌感染时及/或感染后投予本发明内容Fe3-δO4纳米粒子。在一实施方式中，是于难辨梭状芽孢杆菌感染时投予本发明Fe3-δO4纳米粒子；在该情况下，投予每公斤2毫克的Fe3-δO4纳米粒子即足以减缓由难辨梭状芽孢杆菌感染所引发的症状。在另一实施方式中，是于难辨梭状芽孢杆菌感染后投予本发明Fe3-δO4纳米粒子；在该实施方式中，不论是投予每公斤2毫克或每公斤4毫克的Fe3-δO4纳米粒子皆可有效治疗难辨梭状芽孢杆菌感染。
在某些实施方式中，是利用非口服的方式将Fe3-δO4纳米粒子投予至个体，其中非口服的方式包含，但不限于，肌肉注射、静脉注射、皮下注射及腹腔注射。在其他实施方式中，则是利用口服方式来投予Fe3-δO4纳米粒子。
本发明内容提供了一种用以解决难辨梭状芽孢杆菌感染及相关临床医疗问题的方法。下文提出多个实验例将用以阐述Fe3-δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽及/或治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的用途。在本发明内容较佳的实施方式中，Fe3-δO4纳米粒子可用以减缓难辨梭状芽孢杆菌孢子所引发的结肠炎。该些实验例仅为说明本发明的某些实施方式，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信习知技艺者在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
实施例
材料及方法
培养细菌及纯化孢子
由歌德堡大学的菌种保存中心(
Figure GDA0002362201830000111
瑞典)购买难辨梭状芽孢杆菌CCUG37780及CCUG19126，由美国菌种保存中心(Manassas,VA)购买ATCC BAA1805。所有菌种皆是培养于包含0.5％酵母萃(yeast extract,212750,BD Difco)及0.1％L-半胱胺酸(7048046,Amresco,Solon,HO)的补充脑心浸液(supplemented brain heart infusionmedium,BHIS；237500,BD Difco,Franklin Lakes,NJ)中，并培养于37℃厌氧环境下。依据先前研究方法(“Bile Salts and Glycine as Cogerminants for Clostridium dificileSpores.“J Bacteriol 2008,190:2505-2512)，并佐以些微的修改来制备及纯化孢子。简单来说，加入新鲜BHIS培养液来稀释培养于BHIS培养液中的难辨梭状芽孢杆菌，至到其光学密度600纳米(optic density 600nm,OD600)的数值达0.2。将900微升的稀释细胞悬浮液加至包含BHIS洋菜胶的6孔盘中，并将其培养于37℃的厌氧罐(O-HP011A,Thermo Oxoid,Oxoid Ltd.,Basingstoke,英国)中4天。以1毫升的冰无菌水收集6孔盘中的细胞，而后置于4℃至隔日。以冰无菌水洗涤5次后，加入3毫升的冰无菌水。于一离心管中加入10毫升的50％(重量/体积)蔗糖溶液(409704,J.T.Baker Chemical Co.,Phillipsburg,PA)后，将悬浮液加至该蔗糖溶液的上方，以3,500g的转速离心20分钟，将孢子与营养细胞分离。以冰无菌水洗涤位于离心管底部的纯化孢子5次，以此移除蔗糖。将纯化的孢子置于4℃保存，以供后续分析使用。
孢子发芽
本发明是利用2至10mM的牛胆酸盐来检测难辨梭状芽孢杆菌CCUG 37780的孢子发芽反应。相较于其他种菌株，CCUG 37780由于缺乏tcdA及tcdB基因，往往被视为较为安全的菌株。本发明即是利用CCUG 37780菌株来测试纳米粒子于抑制孢子发芽的活性。相较于其他浓度，以10mM的牛胆酸盐处理后的难辨梭状芽孢杆菌孢子可观察到最为显著的发芽曲线(p<0.0001,杜克多重比较试验(Tukey’s Multiple Comparison test))。因此，后续的分析即以10mM的牛胆酸盐来预处理难辨梭状芽孢杆菌孢子。
制备纳米粒子
本发明是利用热分解(thermal decomposition)来制备Fe3-δO4纳米粒子。简单来说，将1.42克的乙酰丙酮铁(iron acetylacetonate,517003,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、0.57毫升的油酸(oleic acid,27726,Sigma-Aldrich)及20毫升的三辛胺(trioctylamine,T81000,Sigma-Aldrich)均匀混合。在含氩的环境中，以325℃分馏溶液30分钟。将溶液冷却至室温后，以磁铁收集沉淀物，并以甲苯洗涤3次。以磁铁收集Fe3-δO4纳米粒子后，将其转置于包含每毫升0.4毫克的聚苯乙烯顺丁烯二酸(662631,Sigma-Aldrich)的氯仿溶液(UN1888,Merck,Whitehouse Station,NJ)中作用2小时。收集Fe3-δO4纳米粒子，并以纯水洗涤3次。
以下述方法来制备Fe@Au纳米粒子。将包含6克溴化十六烷基三甲铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB,H6269,Sigma-Aldrich)的2.4毫升FeSO4(0.5M,31236,Riedel-de
Figure GDA0002362201830000131
Seelze,德国)、5克1-丁醇(1-butanol,33065,Sigma-Aldrich)、15克辛烷(octane,296988,Sigma-Aldrich)及2.4毫升的1.0M NaBH4(71320,Sigma-Aldrich)均匀混合于纯水中，作用5分钟以形成铁纳米粒子溶液。将1.8毫升的0.44M HAuCl4(16961-25-4,Alfa Aesar,Ward Hill,MA)及1.8毫升的1.6M NaBH4加至铁纳米粒子溶液中，持续搅拌30分钟。以99.9％乙醇(800605,J.T.Baker Chemical Co.)及磁铁洗涤该Fe@Au纳米粒子。
利用化学浴沉淀系统(chemical bath depositionsystem)来制备氧化锌纳米粒子。将0.1M的六水合硝酸锌(zinc nitratehexahydrate,263-00335,Wako,Osaka,日本)、0.1M的六亚甲四胺(hexamethylenetetramine,081-00332,Wako)与Si(100)受质(WaferWorks Corporation,台湾)于95℃作用8小时。之后，以无菌水洗涤氧化锌纳米粒子5次。
依据下述方法制备银纳米粒子。简单来说，将3.4mM的硝酸银(s6506,Sigma-Aldrich)及0.46mM的柠檬酸钠(sodium citrate tribasic dihydrate,s4641,Sigma-Aldrich)于室温持续搅拌以均匀混合。将8.8mM的硼氢化钠(sodium borohydride)加至混合液中，并于室温持续搅拌10分钟。之后将合成的银纳米粒子保存于99.9％乙醇中。
由台湾圆点纳米技术(Taiwan Advanced Nanotech,
Figure GDA0002362201830000141
USPIO-101)购买6纳米的Fe3O4纳米粒子。
以光学密度600纳米来测量孢子发芽
在进行相关测试前，先将孢子悬浮液置于60℃的环境中30分钟，以去除营养细胞。将该些热处理后的孢子置于冰上。将包含孢子的悬浮液调至OD600为0.5的浓度后，与不同及/或不同浓度(每毫升5到500微克)的纳米粒子共同培养于含有BHIS的96孔盘中20分钟。在本实验中，是以3％漂白剂(197-02206,Wako)处理孢子作为正对照组，而以培养于BHIS的孢子作为负对照组。经共同培养后，加入10mM的牛胆酸盐(T4009,Sigma)，引发孢子发芽。于室温下，利用分光亮度计(16039400,TECAN,
Figure GDA0002362201830000142
Austria)来观测孢子的OD600读值，每分钟观察1次，持续观察12分钟。依据不同时间点所观察到的OD读值来绘示孢子发芽的动力曲线图。
发芽动力试验
将纯化且经热处理后的孢子在有或无Fe3-δO4(每毫升50微克)处理的情况下，培养于包含BHIS的96孔盘中20分钟；之后，分别以2、5、10、20、40或50mM牛胆酸盐进行处理。在本实验中，是以3％漂白剂作为抑制发芽的正对照组。加入牛胆酸盐后立即检测OD600的读值。
孢子结合试验
将OD600读值为0.5的难辨梭状芽孢杆菌BAA1805孢子与Fe3-δO4纳米粒子(每毫升500微克)共同培养于包含BHIS的96孔盘中20分钟。无添加Fe3-δO4纳米粒子的孢子是作为本实验的对照组。利用磁铁与各检体作用5分钟，以移除各检体的上清液。以1倍生理食盐水分别洗涤会与磁铁作用的检体及其上清液，各3次。将检体溶于无菌的去离子水中。利用穿透式电子显微镜(transmission electron microscope,TEM,JEM-1400,JEOL,日本)来观察孢子及纳米粒子。
蛋白渗漏试验(Protein leakage assay)
将OD600读值为0.5的孢子与Fe3-δO4纳米粒子(每毫升500微克)共同培养于包含无菌水的96孔盘中20分钟。以3,500g的转速离心检体10分钟。移除上清液后，回溶沉淀物并进行音波振荡处理。利用离心(8000g,4℃,10分钟)的方式收集细菌的溶解产物，以此测量孢子内的蛋白含量。之后，以15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染套组(17-1150-01,Amersham Biosciences,Sppsala,瑞士)分析各细菌孢子的蛋白含量。
活体内难辨梭状芽孢杆菌感染
本实验动物是饲养于无菌空间，所有试验皆是在成功大学动物实验管理委员会许可下进行。各小鼠在试验起启阶段的体重约为25克。
为直接检测结肠的发炎反应。本实验是利用NF-κB-相关报导小鼠来进行，其中该小鼠包含利用NF-κB来调控转录表现的荧光素酶(luciferase)转殖基因(NF-κB-RE-荧光素酶)；并以难辨梭状芽孢杆菌孢子来进行感染。在喂食孢子前，先将抗生素混合液(每毫升0.4毫克的康霉素(kanamycin)、每毫升0.035毫克的建它霉素(gentamicin)及每毫升0.057毫克的柯利霉素(colistin))加至小鼠饮用水中48小时；之后每24小时置换一次新鲜抗生素混合液，共置换2次。每12小时灌食小鼠200微升的质子泵抑制剂(proton pumpinhibitor,PPI,每毫升2毫克)一次，共进行2天；之后，感染难辨梭状芽孢杆菌孢子。
分别以CCUG 19126及BAA-1805二种难辨梭状芽孢杆菌孢子来感染小鼠。在感染CCUG 19126的组别中，是分别将2x 105菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的难辨梭状芽孢杆菌孢子CCUG 19126与包含或不包含每毫升500微克的Fe3-δO4的100微升无菌水共同培养20分钟；之后喂食小鼠(约每公斤体重2毫克)。在孢子与Fe3-δO4纳米粒子共同培养的同时，先灌食小鼠50微升的质子泵抑制剂(每毫升2毫克)，并以腹腔注射的方式注入氯林丝菌素(clindamycin,每公斤4毫克)。在感染难辨梭状芽孢杆菌孢子后，将包含抗生素混合液的饮用水置换为一般饮用水。
在感染BAA-1805的组别中，先灌食小鼠50微升的质子泵抑制剂(每毫升2毫克)，并以腹腔注射的方式注入氯林丝菌素(每公斤4毫克)；之后，喂食小鼠难辨梭状芽孢杆菌孢子BAA-1805(2x 105CFU)。24小时后，分别投予各小鼠100微升的每毫升0、500及1000微克的Fe3-δO4纳米粒子(每公斤体重约为0、2及4毫克)；每24小时投予一次，共2天。
通过观察小鼠的腹泻、体重变化、驼背姿势及死亡来量测难辨梭状芽孢杆菌感染后的病症。感染72小时后，以腹腔注射方式注入每公斤150毫克的荧光素酶受质－荧光素(luciferin,Xenogen,PerkinElmer,Waltham,MA)，以此引发NF-κB活化所导致的发光表现。利用异氟醚(isoflurane)/氧气麻醉小鼠后，以活体影像系统(In Vivo Imaging Systems,IVIS,Xenogen)进行观察。通过活体影像软件(
Figure GDA0002362201830000161
software,Xenogen)来分析结果，荧光素酶活体是以质子/秒/平方公分/立体弧度(p/s/cm2/sr)来表示。得到IVIS影像后，以TRI试剂(T9424,Sigma)来萃取结肠RNA。再利用实时聚合酶链锁反应(real-timePCR,StepOnePlus,Applied Biosystems)来分析发炎基因的表现量。为评估难辨梭状芽孢杆菌感染率，收集粪便，通过DNA萃取套组(11814770001,Roche)纯化其中DNA。利用PCR来侦测小鼠粪便中的tcdB基因。
组织病理分析
利用组织病理分析来评估经难辨梭状芽孢杆菌感染后，黏膜的损伤情况及发炎反应。以4％甲醛(以生食盐水稀释)固定结肠组织后，再将其包埋于石蜡中。制作厚度为6微米的检体切片，将其去石蜡后，以苏木精(hematoxylin)及伊红(eosin)进行染色，再利用显微镜进行组织病理分析。孢子组及经Fe3-δO4处理的孢子组皆是随机选取10个视野来计数视野中的嗜中性球数量。
统计分析
利用GraphPad Prism 5.01版本进行统计分析。本研究所有的实验皆是三重复，并以平均值±标准偏差(means±standard error of the mean(SEM))来表示。在孢子发芽曲线分析中，是利用单向ANOVA(one-way ANOVA)及杜克多重比较试验(Tukey’s MultipleComparison test)来计算；在其他感染抑制的试验中，则是利用Student’s t-test来分析。二种统计方法皆是以P<0.05、0.01或0.001来表示显著性。
实施例1 Fe3-δO4纳米粒子的杀孢子活性
本实施例将评估Fe3-δO4纳米粒子于抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽的功效。
1.1 Fe3-δO4纳米粒子对于难辨梭状芽孢杆菌孢子的毒杀活性
已知不同的纳米粒子具有杀菌特性，而不会对周遭组织造成伤害。然而，纳米粒子与细菌孢子发芽间的关联性仍尚待研究厘清。为了解孢子发芽与杀菌纳米粒子间的作用，本研究将分别测试氧化锌纳米粒子、银纳米粒子、Fe2O3纳米粒子、Fe3O4纳米粒子、Fe@Au纳米粒子及Fe3-δO4纳米粒子的毒杀功效。以漂白剂处理孢子20分钟以去除其活性是为本实验的正对照组。将细菌孢子与每毫升5、50或500微克的纳米粒子共同培养20分钟后，加入10mM牛胆酸盐引发孢子发芽。
图1的结果指出，包含氧化锌(第1A图)、银(图1B)及Fe3O4(第1D图)等已知具有杀菌功效的纳米粒子，仅能产生些微的抑制孢子发芽功效。此外，本研究也发现，难辨梭状芽孢杆菌CCUG 37780不会对完全氧化的Fe2O3纳米粒子(第1C图)及Fe@Au纳米粒子(第1E图)产生反应。虽然每毫升5微克的Fe3-δO4纳米粒子也仅产生微量的抑制功效，然而，每毫升50及500微克的Fe3-δO4纳米粒子可明显观察到抑制孢子发芽的功效(第1F图)。特别是每毫升500微克的Fe3-δO4纳米粒子，其所产生的抑制功效与漂白剂正对组组所产生的抑制效果在统计上并无显著的差异(p>0.5，杜克多重比较试验，第1F图)。
该些结果指出，相较于已知的杀菌纳米粒子，本发明内容的Fe3-δO4纳米粒子具有优越的杀孢子活性；不论是每毫升50或500微克的Fe3-δO4纳米粒子皆可有效抑制孢子形成具有活性的营养细胞。
1.2不同大小的Fe3-δO4纳米粒子的杀孢子活性
有鉴于Fe3-δO4纳米粒子可合成为具有不同边长(由5到25纳米)的截角八面体粒子，本实施例将进一步了解不同大小的Fe3-δO4纳米粒子在抑制孢子发芽时所产生的功效。据此，利用二种Fe3-δO4纳米粒子(边长分别为14及22纳米)来治疗CCUG 37780孢子的感染。图2的结果显示，二种纳米粒子于抑制孢子发芽的活性并不具有显著的差异(每毫升500微克浓度的差异为p＝0.5195，每毫升50微克浓度的差异则为p>0.99，利用杜克多重比较试验来分析统计)。因此，相较于纳米粒子的大小，Fe3-δO4纳米粒子的浓度在抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子发芽时扮演着更为关键的角色。
1.3Fe3-δO4纳米粒子于抑制不同菌株的难辨梭状芽孢杆菌孢子时所产生的杀孢子活性
本实施例将检测Fe3-δO4纳米粒子对于具有tcdA及tcdB基因的难辨梭状芽孢杆菌(即CCUG 19126及ATCC BAA-1805)所产生的抑制活性。据此，分别将CCUG 19126及ATCCBAA-1805与不同浓度(即每毫升5、50及500微克)的Fe3-δO4纳米粒子共同培养20分钟后，以10mM牛胆酸盐进行处理。结果绘示于图3。
如图3所示，每毫升500微克的Fe3-δO4纳米粒子对于CCUG 19126(第3A图)及ATCCBAA-1805(第3B图)具有相似的抑制功效；而CCUG 19126则会对每毫升50微克以下的Fe3-δO4纳米粒子具有抗性(图3A)。
该些结果显示，Fe3-δO4纳米粒子对于孢子发芽的抑制活性并不局限于特定的难辨梭状芽孢杆菌菌株。换言的，Fe3-δO4纳米粒子可有效抑制不同的难辨梭状芽孢杆菌菌株。
1.4 Fe3-δO4纳米粒子对难辨梭状芽孢杆菌的营养细胞的杀菌活性
除了抑制孢子发芽的功效，本实施例将进一步利用不同的难辨梭状芽孢杆菌菌株，来了解Fe3-δO4纳米粒子对营养细胞的杀菌活性。以每毫升500微克的Fe3-δO4纳米粒子处理营养细胞20分钟后，将其涂布于BHIS洋菜胶盘，并进行后续的菌落形成单位分析。如第4图所示，以Fe3-δO4纳米粒子处理后的细胞与负对照组细胞具有相似的生长量；相较的下，以3％漂白剂处理后的细胞则几乎完全死亡。
总结上述，本发明内容Fe3-δO4纳米粒子可有效抑制包含CCUG 37780、CCUG 19126及ATCC BAA-1805等各种难辨梭状芽孢杆菌菌株的孢子，而不会影响其营养细胞的生长。
实施例2Fe3-δO4纳米粒子对难辨梭状芽孢杆菌孢子的抑制机制
为了解Fe3-δO4纳米粒子与孢子间的作用，本实施例利用穿透式电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)来检测经Fe3-δO4纳米粒子处理后的孢子。结果显示，每毫升50微克的Fe3-δO4纳米粒子即会与孢子结合。随着浓度的增加(如每毫升500微克的Fe3-δO4纳米粒子)，过量的Fe3-δO4纳米粒子会完全覆盖孢子表面(第5图)。也即，Fe3-δO4纳米粒子与难辨梭状芽孢杆菌孢子的结合量是与纳米粒子的浓度呈正相关。
为进一步了解Fe3-δO4纳米粒子的结合是否会对孢子产生损害，进而破坏孢子的结构，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析经Fe3-δO4纳米粒子处理或未经Fe3-δO4纳米粒子处理的孢子，其渗漏蛋白的量。图6绘示出该结果。
相较于未经处理的孢子，以Fe3-δO4纳米粒子处理的孢子可明显观察到二蛋白带(第6图，第1到3蛋白条与第4到6蛋白条)。该结果指出，一旦Fe3-δO4纳米粒子结合至孢子，会造成孢子结构的损伤，进而导致蛋白渗漏至上清液。
整体来看，该些结果指出本发明内容的Fe3-δO4纳米粒子可直接结合至难辨梭状芽孢杆菌孢子，并损伤其结构。
实施例3Fe3-δO4纳米粒子于治疗难辨梭状芽孢杆菌感染的用途
在本实施例中，将依据「材料及方法」所述的步骤，利用NF-κB-相关报导小鼠来检测Fe3-δO4纳米粒子于治疗活体感染难辨梭状芽孢杆菌的疗效。在实施例3.1中，是以难辨梭状芽孢杆菌孢子CCUG19126感染小鼠，图7绘示该治疗功效。实施例3.1则是以难辨梭状芽孢杆菌孢子BAA-1805感染小鼠，图8绘示相关结果。
3.1感染CCUG 19126
如图7A所示，感染难辨梭状芽孢杆菌后的小鼠体重会显著下降，以Fe3-δO4纳米粒子治疗(每公斤体重2毫克)则可有效减缓体重的减少(p＝0.0119,Student’s t-test)。此外，还检测小鼠盲肠的重量来确认观察到的治疗功效；结果显示，相较于对照组，经Fe3-δO4纳米粒子治疗的小鼠的盲肠会较重且较为健康(p＝0.0024,Student’s t-test,第7B图)，并呈现较轻微的发炎反应(p＝0.0406,Student’s t-test,第7C图)。组织病理照片则指出，相较于照组，经Fe3-δO4纳米粒子治疗的小鼠，其结肠组织中嗜中性球浸润的数量会明显减少(图7D)。另外，在基因表现上，实时聚合酶链锁反应的分析结果显示，经Fe3-δO4纳米粒子治疗后，小鼠结肠内包含肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)及介白素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等发炎基因的表现皆会显著地低于对照组小鼠结肠内的基因表现(TNF-α的p＝0.0088，IFN-γ的p＝0.0276，而IL-1β的p＝0.0097，Student’s t-test，以上皆是与未经处理的孢子组进行比较分析，图7E)。相对于对照组，Fe3-δO4纳米粒子治疗可减少难辨梭状芽孢杆菌的感染率(对照组为66％，治疗组为33％)(结果未显示)。
该些结果证明每公斤2毫克的Fe3-δO4可有效减缓由难辨梭状芽孢杆菌孢子CCUG19126所引发的发炎反应。
3.2感染BAA-1805
本实施例将检测Fe3-δO4纳米粒子对另一种难辨梭状芽孢杆菌孢子－BAA-1805的治疗功效。为更进一步模拟临床状况，先以孢子BAA-1805感染小鼠24小时后，再以每公斤0、2或4毫克的Fe3-δO4纳米粒子进行治疗。
依据图8的结果，对照组小鼠(即未经处理的孢子组)结肠中的发炎反应会较Fe3-δO4纳米粒子治疗组更为严重(p<0.05)。不论是投予每公斤2或4毫克的Fe3-δO4纳米粒子皆可有效抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子BAA-1805所引发的发炎反应。
因此，可于难辨梭状芽孢杆菌感染时或感染后投予本发明Fe3-δO4纳米粒子，且不论投予的时间点为何，皆可有效抑制由难辨梭状芽孢杆菌感染所引发的相关症状。
总结上述，Fe3-δO4纳米粒子可抑制难辨梭状芽孢杆菌的胞子发芽。相较于其他具有杀菌活性的纳米粒子，Fe3-δO4纳米粒子具有显著的杀孢子活性。更重要的是，Fe3-δO4纳米粒子的抑制功效并不局限于特定的难辨梭状芽孢杆菌菌株，而是可有效抑制各种难辨梭状芽孢杆菌菌株的孢子的发芽及/或感染。此外，低剂量(例如活体外的每毫升5微克，及活体内的每公斤2毫克)的Fe3-δO4纳米粒子即足以抑制难辨梭状芽孢杆菌孢子的发芽，并治疗感染难辨梭状芽孢杆菌的病患，而不会影响正常菌落中营养细胞的生长。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更改与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

Claims (11)

1.一种于活体外抑制难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的孢子发芽的方法，包含将难辨梭状芽孢杆菌的孢子与一有效量的Fe3-δO4纳米粒子共同培养，其中δ为0到0.3的数值。
2.如权利要求1所述的方法，其中该纳米粒子为一截角八面体粒子。
3.如权利要求2所述的方法，其中该截角八面体的各边长度为5到25纳米。
4.如权利要求3所述的方法，其中该截角八面体的各边长度为14纳米。
5.如权利要求3所述的方法，其中该截角八面体的各边长度为22纳米。
6.如权利要求1所述的方法，其中该纳米粒子的有效量为每毫升5到500微克。
7.一种Fe3-δO4纳米粒子的用途，其可用以制备一种用以治疗一罹患或疑以患有难辨梭状芽孢杆菌感染的个体的药物，其中δ为0到0.3的数值，且该药物抑制难辨梭状芽孢杆菌的孢子发芽。
8.如权利要求7所述的用途，其中该纳米粒子为一截角八面体粒子。
9.如权利要求8所述的用途，其中该截角八面体的各边长度为5到25纳米。
10.如权利要求9所述的用途，其中该截角八面体的各边长度为14纳米。
11.如权利要求9所述的用途，其中该截角八面体的各边长度为22纳米。
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