CN107029237A - 产热增强化合物增强去甲肾上腺素类化合物诱导褐色脂肪细胞产热的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产热增强化合物增强去甲肾上腺素类化合物诱导褐色脂肪细胞产热的应用，具体地，本发明提供了一种产热增强化合物的用途，用于制备制剂或组合物，所述制剂或组合物用于增强NE类化合物诱导褐色脂肪细胞的产热效率，其中，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、ATP合成酶抑制剂、或其组合。本发明的产热增强化合物可显著增强去甲肾上腺素类化合物诱导褐色脂肪细胞的产热效率。

Description

产热增强化合物增强去甲肾上腺素类化合物诱导褐色脂肪细胞产热的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及产热增强化合物增强去甲肾上腺素类化合物诱导褐色脂肪细胞产热的方法及其应用。

背景技术

对于绝大多数的鸟类和哺乳动物等恒温动物而言，在各种复杂的环境中维持恒定的体温，需要高效的温度调节系统。体温的恒定源于产热和散热的平衡状态。动物体内的热量来源主要有四种方式：基础代谢、躯体活动、冷刺激引起的产热作用(包括颤抖性产热和非颤抖性产热)以及食物的热效应。

冷刺激时最初的产热机制是颤抖，是通过肌肉组织的颤抖来产生热量，但如果长时间暴露在冷的环境中，那么就要靠非颤抖性产热来维持体温。褐色脂肪组织(brown fat tissue，BAT)是非颤抖性产热的主要热源，特别是在新生儿及冬眠的动物中(Gesta et al.,2007)。褐色脂肪组织，是区别于白色脂肪和米色脂肪的一种脂肪存在形式(Ussar et al.,2014)，主要分布于肩胛下、肩胛间、颈部、胸部、腋下、肋间、主动脉周围、心脏周围、腹股沟、和脊柱背部等区域以及交感神经节上部也有少量分布(Cannon and Nedergaard,2004a)。BAT主要由褐色脂肪细胞组成，细胞核位于中央，周围包绕许多脂滴，线粒体呈球粒状，数目繁多。褐色脂肪细胞间有丰富的毛细血管和大量的交感神经末梢纤维分布，丰富的线粒体和血管使脂肪组织呈现褐色(2009)。动物中BAT的总量和分布随物种不同和动物的不同发育阶段及适应状况呈现出一定差异。

褐色脂肪组织产热是由中枢神经系统调节的，冷刺激信号通过机体的温度感受器传递到大脑引起相应的交感神经释放神经递质(Nakamura and Morrison,2008)，最主要的是去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)。去甲肾上腺素作用于褐色脂肪细胞上的肾上腺素受体激活下游的PKA信号通路，从而激活线粒体内膜上的UCP1(uncoupling protein 1)，使质子电化学势能消耗与ATP合成解偶联，能量以热量的形式释放。

当机体摄取的能量长期超过消耗时,多余的能量就会以脂肪的形式储存在身体内，久而久之造成肥胖，肥胖的治疗也主要集中在两点：减少能量的摄入，增加能量的消耗。之前减肥药物的研究重在减少对能量的摄入，也有一些进展，但是此类减肥的药品都缺乏完整的作用与副作用评估，导致药品使用风险较大。

因此本领域迫切需要开发一种能够增加能量消耗且副作用小的治疗肥胖的潜在药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够增加能量消耗且副作用小的治疗肥胖的潜在药物。

本发明第一方面提供了一种产热增强化合物的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于增强NE类化合物诱导褐色脂肪细胞的产热效率，其中，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述ATP类化合物选自下组：ATP、ATP-γS、BzATP、α,β-亚甲基腺苷三磷酸、2-甲硫腺苷三磷酸、ADP、UTP、UDP、MRS2690、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂选自下组：寡霉素、水蓼辣素、原钒酸盐、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还包括NE类化合物。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于制备预防和/或治疗肥胖、或肥胖相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述肥胖相关疾病选自下组：高血脂、II型糖尿病、脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化、冠心病、胆囊炎、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、肥胖引起的儿童性发育异常、或其组合。

本发明第二方面提供了一种体外非治疗性的增强哺乳动物产热的方法，包括步骤：

在NE类化合物和产热增强化合物存在下，培养褐色脂肪细胞，从而增强哺乳动物的产热，其中，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述ATP类化合物选自下组：ATP、ATP-γS、BzATP、α,β-亚甲基腺苷三磷酸、2-甲硫腺苷三磷酸、ADP、UTP、UDP、MRS2690、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂选自下组：寡霉素、水蓼辣素、原钒酸盐、或其组合。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177或其组合。

在另一优选例中，所述NE类化合物与所述产热增强化合物的摩尔比为1-100：10-1000，较佳地，1-5：50-500，更佳地，1-2：100-200。

在另一优选例中，所述NE类化合物的作用浓度为0.01μmol/L-10μmol/L，较佳地，0.05μmol/L-1μmol/L，更佳地，0.1μmol/L-0.5μmol/L。

在另一优选例中，所述产热增强化合物的作用浓度为0.1-100μg/mL，较佳地，1-50μg/mL，更佳地，5-20μg/mL。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(i)NE类化合物；

(ii)产热增强化合物，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合；和

(iii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

在另一优选例中，所述ATP类化合物选自下组：ATP、ATP-γS、BzATP、α,β-亚甲基腺苷三磷酸、2-甲硫腺苷三磷酸、ADP、UTP、UDP、MRS2690、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂选自下组：寡霉素、水蓼辣素、原钒酸盐、或其组合。

在另一优选例中，所述组分(i)与组分(ii)的摩尔比为1-10：10-1000，较佳地，1-5：50-500，更佳地，1-2：100-200。

在另一优选例中，所述组分(i)和组分(ii)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地，10-95wt％，更佳地，50％-90wt％。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他的增强哺乳动物产热的化合物：辣椒素、CL316243、二硝基苯、或其组合。

本发明第四方面提供了一种药盒，所述药盒包括：

(a)含有NE类化合物的第一制剂；

(b)含有产热增强化合物的第二制剂，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合；和

(c)说明书。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177或其组合。

在另一优选例中，所述(a)和(b)可分别放置不同容器(或包装)或置于同一容器(或包装)。

在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂的剂型是相同或不同的。

在另一优选例中，所述第一制剂和第二制剂的剂型独立地选自下组：胶囊、片剂、栓剂、颗粒剂、口服液、或静脉注射剂(包括冻干制剂)。

在另一优选例中，所述第一制剂中NE类化合物的浓度为0.01μmol/L-10μmol/L，较佳地，0.05μmol/L-1μmol/L，更佳地，0.1μmol/L-0.5μmol/L；

在另一优选例中，所述第一制剂中NE类化合物的浓度为0.01μmol/1000g-10μmol/1000g，较佳地，0.05μmol/1000g-1μmol/1000g，更佳地，0.1μmol/1000g-0.5μmol/1000g制剂。

在另一优选例中，第二制剂中产热增强化合物的浓度为0.1-100μg/mL，较佳地，1-50μg/mL，更佳地，5-20μg/mL；或

在另一优选例中，第二制剂中产热增强化合物的浓度为0.1-100μg/mL，较佳地，1-50μg/mL，更佳地，5-20μg/mL。

本发明第五方面提供了一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，包括步骤：

(a)提供一线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在NE类化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

在另一优选例中，所述的检测褐色脂肪细胞的产热程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：线粒体膜电压变化、胞内pH值的变化、或胞内ATP的浓度变化。

在另一优选例中，所述的褐色脂肪细胞的产热增加表现为：线粒体膜电压下降，胞内pH值上升，胞内ATP的浓度下降减少。

在另一优选例中，所述“显著高于”指产热程度Q1/产热程度Q2之比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥2.5。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了FAD和NADH的已知的吸收(虚线)和荧光光谱。

图2显示了温敏染料罗丹明B甲酯及罗丹明800的在褐色脂肪细胞中定位。其中，A:罗丹明B甲酯细胞定位(红色)；B:罗丹明800的线粒体定位(绿色)；C:细胞的DIC；D:两种染料在细胞内有良好的线粒体共定位，小图为局部放大图；E:荧光强度的比值显示的细胞内的线粒体温度分布。

图3显示了NE诱导的褐色脂肪细胞的产热。其中，A:0.1μM NE引起的单个细胞的产热反应，76％的细胞产热，并且每个细胞的产热幅度不尽相同(n＝150个细胞，5次实验)；B:对照细胞(加等量的水)的产热反应(n＝97个细胞，三次实验)；C:0.1μM NE能引起原代褐色脂肪细胞的产热反应，整体荧光强度比值的变化只有不足20％；D：具有代表性的单次实验的细胞DIC图；E：0.1μM NE处理前细胞的热成像；F：0.1μM NE处理20分钟时细胞的热成像，部分细胞没有明显的产热响应；G和H：β3受体特异激动剂CL316243和β受体广谱激动剂Isoprenaline都仅能引起部分原代褐色脂肪细胞的产热反应。

图4显示了褐色脂肪细胞中NE受体的表达。将第6天的的原代细胞用trizol法提取RNA，反转录为cDNA,用设计好的引物进行短片段的PCR，30个循环。然后将产物进行琼脂糖凝胶电泳。由电泳图可以看出α2受体的表达量极低。

图5显示了SR 59230A抑制NE引发的产热反应。其中，A:1μM的SR59230A作为NE受体的广谱抑制剂可以抑制0.1μM NE引起的细胞的产热反应(n＝97个细胞，三次实验)；B：在1μM的SR 59230A存在的条件下0.1μM NE刺激细胞没有产热反应。

图6显示了β1受体在产热中起到的作用。其中，A:β1受体抑制剂70nMCGP-20712预处理30分钟后0.1μM NE引发的细胞的产热反应，(n＝40个细胞)；B:,β1受体抑制之后，能够产热的细胞减少(42％，n＝180个细胞，5次实验)，并且产热反应不能持续，呈现“钟形”曲线；C-E：NE处理前(C)、20分钟(D)、45分钟(E)时细胞的热成像，部分产热的细胞在第45分钟时温度有所下降。

图7显示了NE受体抑制剂降低P-HSL(Ser563)磷酸化。其中，A：1,负对照；2，0.1μM NE处理30分钟；3，1μM SR59230A预处理30分钟，NE处理30分钟；4，70nM CGP-20712预处理30分钟，0.1μM NE处理30分钟；B：抑制剂存在的条件下P-HSL(Ser563)的相对磷酸化程度(n＝3，均值±SEM)。

图8显示了高浓度NE诱导的褐色脂肪细胞的产热。其中，A-B:HSL-563的磷酸化随浓度增加而增加，(n＝3，均值±SEM)；C：10μM NE引起的单个细胞的产热反应(n＝110个细胞，5次实验)，81％的细胞是产热；D：10μM NE引发比0.1μM NE略强的细胞产热反应。

图9显示了褐色脂肪细胞的UCP1定位及表达。其中，A:褐色脂肪细胞UCP1免疫荧光染色；B:褐色脂肪细胞线粒体蛋白细胞色素C免疫荧光染色；C:UCP1与细胞色素C双通道重叠图，可见UCP1与细胞色素C有着很强的共定位；D：UCP1与细胞色素C共定位局部放大图，可见清晰的棒状及球状线粒体；E：40x倍镜下细胞UCP1免疫荧光染色图，所有细胞都有UCP1的表达；F：与E图对应的细胞色素C免疫荧光染色图；H：UCP1与细胞色素C双通道重叠图；H：细胞的DIC图。

图10显示了ATP与NE共同作用增强褐色脂肪细胞产热。其中，A：0.1μMNE与10μM ATP共同作用引发的单个细胞的产热反应，95％的细胞是产热的(n＝158个细胞，五次实验)；B：与NE引发的产热比较，ATP与NE共同作用使细胞的整体产热明显增加，而ATP本身则只有较微弱的反应；C：ATP与NE共同作用使产热细胞的平均产热幅度有显著增加(均值±SEM)；D和E：ATP-γS与NE共同作用使产热细胞的平均产热显著增加(均值±SEM)。

图11显示了0.1uM NE引发褐色脂肪细胞胞浆钙的升高，细胞胞浆内的钙用染料fura-AM来测量，将细胞放入5μM的Fura-AM tyrode溶液，37℃培养箱中染色30分钟，细胞取出置于tyrode溶液中进行观察。其中，A：0.1μM NE引起的单个细胞的胞浆钙反应(n＝54个细胞，三次实验)；B：归一化的单个细胞的钙变化，有一个急剧的上升，而后下降并维持在一定的水平；C：所有细胞的整体钙变化；D：Fura2-AM 340nm激发荧光；E：Fura2-AM 380nm激发荧光；F-G：两通道重叠图，0.1μM NE处理前(D)、处理15分钟时(F)。

图12显示了NE引起细胞内线粒体的钙增加。原代褐色脂肪细胞分离出来之后进行电转，第3-7天实验观察。其中，A：pcDNA-4mtD3cpv cpVenus173荧光；B：NE处理时，单个细胞的线粒体的钙变化；C：NE处理时所有细胞的线粒体钙变化(n＝16个细胞，四次实验)。

图13显示了NE引发细胞内质网钙的释放。其中，A：pcNDA-D1ER Citrine荧光；B：NE处理时，单个细胞的内质网的钙变化；C：NE处理时所有细胞的内质网钙变化(n＝18个细胞，四次实验)。

图14显示了褐色脂肪细胞产热消耗细胞内的还原势。其中，A：440nm激发产生的FAD荧光；B：340nm同时激发FAD和NADH产生的共同荧光信号；C：NE处理前细胞的氧化还原状态；D：NE处理后15分钟时细胞的氧化还原状态；E：NE刺激时细胞的氧化还原状态的改变(n＝60个细胞，四次实验)；F：单次实验单个细胞的氧化还原状态(n＝20个细胞)；G：归一化的数据显示细胞整体的氧化还原状态的变化。

图15显示了NE处理引发细胞内ATP的变化。其中，A：AT1.03YFP荧光；B：NE处理时，单个细胞的胞浆ATP变化，NE加入时，细胞内的ATP骤然下降；C：NE处理时所有细胞的胞浆ATP变化(n＝29个细胞，四次实验)。

图16显示了NE与ATP引发细胞内线粒体ATP的变化。其中，A：mt-AT1.03YFP荧光；B：NE处理时，单个细胞的线粒体内ATP变化，NE加入时，线粒体内的ATP变化有较大的波动；C：NE处理时所有细胞的线粒体ATP变化(n＝26个细胞，四次实验)。

图17显示了0.1μM NE处理时线粒体膜电压、胞内pH值的变化与产热关系。其中，A：0.1μM NE处理细胞时，细胞的膜电压的变化，55.6％的细胞线粒体膜电压下降(n＝150个细胞，五次实验)；B：线粒体膜电压变化与细胞最终产热状态的散点图，线粒体膜电压下降的细胞都是产热的，而线粒体膜电压上升的细胞则只有部分细胞是产热的；产热和膜电压的变化呈明显的负相关(r＝-0.73)；C：0.1μM NE处理细胞时，在提前有(实心点)或者没有(空心点)加入10μg/mL寡霉素条件下，细胞的膜电压的变化与胞内pH值变化的散点图。

图18显示了鱼藤酮对NE诱导的褐色脂肪细胞产热和膜电压的影响。其中，A：提前30分钟tyrode溶液中加入5μM鱼藤酮，再加入0.1μM NE后，细胞产热反应明显，并且几乎所有的细胞都产热，但产热反应并没有持续；B:细胞的整体反应(n＝22)；C：细胞的膜电压的变化。

图19显示了寡霉素对NE诱导的褐色脂肪细胞产热和膜电压的影响。其中，A：提前30分钟tyrode溶液中加入10μg/mL寡霉素，再加入0.1μM NE后，细胞产热反应明显，并且所有的细胞都产热；B:细胞的整体反应(n＝25)；C：细胞的膜电压的变化，所有细胞的膜电压均有降低。

图20显示了ATP对NE增强作用机制探究。其中，A：0.1μM NE及10μMATP处理褐色脂肪细胞30分钟；B：NE与ATP共同刺激时细胞的氧化还原状态的改变与NE单独刺激时比较(四次实验)；C：NE与NE+ATP线粒体膜电压下降与产热的比率。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种增强去甲肾上腺素类化合物(NE类化合物)诱导褐色脂肪细胞的产热效率的一类产热增强化合物。具体地，该产热增强化合物包括ATP类化合物和/或ATP合成酶抑制剂，本发明的产热增强化合物可显著增强去甲肾上腺素类化合物(NE类化合物)诱导褐色脂肪细胞的产热效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“线粒体复合物V/ATP合成酶”、“线粒体复合物V”、“ATP合成酶”可互换使用，指线粒体内膜上合成ATP的酶。

如本文所用，“MRS2690”指焦磷酸1-α-D-吡喃葡萄糖基酯2-[(4'-甲基硫代)尿苷-5”-基]酯二钠盐(Diphosphoric acid 1-α-D-glucopyranosyl ester2-[(4'-methylthio)uridin-5”-yl]ester disodium salt)。

如本文所用，“BRL37344”指(R*，R*)-(±)-4-[2-[(2-(3-氯苯基)-2-羟乙基)氨基]丙基]苯氧乙酸((R*,R*)-(±)-4-[2-[(2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl)amino]propyl]phenoxyacetic acid)。

如本文所用，“CL316243”指5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-2,2-二羧酸(5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3-benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid)。

如本文所用，“GR265162X”指文献(Mouse beta 3a-and beta3b-adrenoceptors expressed in Chinese hamster ovary cells displayidentical pharmacology but utilize distinct signalling pathways，Br JPharmacol.2002Apr；135(8):1903-14.)中提到的化合物GR265162X。

如本文所用，“L755507”指4-[[(己胺)羰基]氨基]-N-[4-[2-[[(2S)-2-羟基-3-(4-羟基苯氧基)丙基]氨基]乙基]苯基]-苯磺酰胺基(4-[[(Hexylamino)carbonyl]amino]-N-[4-[2-[[(2S)-2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl]amino]ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide)。

如本文所用，“SB251023”指4-[4-[2(S)-羟基-3-[3-(4-羟基苯氧基)丙基氨基]环戊基甲基]苯氧基甲基](苯基)膦酸(4-[4-[2(S)-Hydroxy-3-[3-(4-hydroxyphenoxy)propylamino]cyclopentylmethyl]phenoxymethyl](phenyl)phosphonic acid)。

如本文所用，“CGP12177”指4-[3-[(1,1-二甲基乙基)氨基〕-2-羟基丙氧基]-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮盐酸盐(4-[3-[(1,1-Dimethylethyl)amino]2-hydroxypropoxy]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one hydrochloride)。

产热增强化合物

如本文所用，术语“产热增强化合物”指的是ATP类化合物、ATP合成酶抑制剂、或其组合。此外，所述的产热增强化合物还可以与NE类化合物以及含有药学上可接受的载体组合成为具有增强褐色脂肪细胞产热活性的药物组合物。

适用于本发明的所述ATP类化合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：ATP、ATP-γS、BzATP、α,β-亚甲基腺苷三磷酸、2-甲硫腺苷三磷酸、ADP、UTP、UDP、MRS2690、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、或其组合。

适用于本发明的所述ATP合成酶抑制剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：寡霉素、水蓼辣素、原钒酸盐、或其组合。

适用于本发明的所述NE类化合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

本发明的产热增强化合物与NE类似物组合使用时，产热增强化合物与NE类似物之间的比例没有任何限制。通常，各组分应当满足其最低的有效浓度。在一优选例中，所述产热增强化合物与NE类似物的最低有效浓度如下所示：

典型地，在本发明中，所述产热增强化合物的最低有效浓度为0.1-100μg/mL，较佳地，1-50μg/mL，更佳地，5-20μg/mL。

典型地，在本发明中，所述NE类化合物的最低有效浓度为0.01μmol/L-10μmol/L，较佳地，0.05μmol/L-1μmol/L，更佳地，0.1μmol/L-0.5μmol/L。

通常，所述产热增强化合物与NE类似物的摩尔比为1-100：10-1000，较佳地，1-5：50-500，更佳地，1-2：100-200。

本发明所述的产热增强化合物可显著增强NE类化合物诱导褐色脂肪细胞的产热效率，通常可提高约50％或更高，使得总产热效率平均达到约75％或更高(如90％)。

筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法

本发明还提供了一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，包括步骤：

(a)提供一ATP合成酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在NE类化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的Q1和Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

在一优选实施方式中，所述的方法还包括步骤(d)：将步骤(c)中所确定的增强褐色脂肪细胞产热的化合物施用于动物，并测定其对动物产热的影响。

在一优选实施方式中，所述方法还包括用温敏染料成像法测定产热程度的一个或多个指标(如线粒体膜电压变化、胞内pH值的变化、和/或胞内ATP的浓度变化)。

在另一优选例中，所述温敏染料成像所用的染料包括罗丹明800和罗丹明B甲酯的组合。

制剂和药物组合物

本发明还提供了一种制剂或组合物，它们包括所述的产热增强化合物和NE类化合物以及任选的其它载体或赋形剂。

优选地，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。

以药物组合物为例，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量两类活性成分：(i)所述的产热增强化合物和(ii)NE类化合物。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的载体”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-100mg/kg动物体重(较佳地0.0001mg-10mg/kg动物体重，更佳地0.001mg-1mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于(i)增强褐色脂肪细胞的产热效率；(ii)预防和/或治疗肥胖等相关疾病。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现产热增强化合物(如ATP类化合物、和/或ATP合成酶抑制剂)可显著增强NE类化合物诱导的褐色脂肪细胞的产热效率，产热效率能够达到75％或更高。

(2)本发明首次发现可将产热增强化合物(如ATP类化合物、和/或ATP合成酶抑制剂)与NE类化合物联来预防和/或治疗肥胖等相关疾病。

(3)本发明首次提出线粒体膜电压、胞内pH值、胞内ATP浓度、细胞温敏染料显示的细胞温度等指标的变化可以用于筛选利用褐色脂肪产热进行肥胖症治疗的药物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法和相关材料

1.褐色脂肪细胞原代培养

所用材料及试剂

3-4周小鼠(C57，雄，西普尔-必凯)，长丝滴管(粗细两种)，培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NCS)、PBS(pH7.4)和青霉素链霉素(Pen Strep)都是购自美国Thermo Fisher公司，胶原酶II和胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)购自美国Sigma-Aldrich公司，Matrigel购自美国BD Biosciences公司，玻片Coverslips购自美国Thermo Fisher公司。

具体试验方法

1)将老鼠4℃冻过夜，不禁食水。一般三只老鼠做8个dish；

2)取两个6cm dish分别加入37℃预热的10mL的PBS和4％NCS DMEM；

3)将老鼠断颈处死，在消毒酒精浸泡10min，在此期间将手术剪刀和镊子用消毒酒精消毒，放于灭过菌的水中；

4)将小鼠背部剪开取出肩胛骨处的褐色脂肪组织，放于PBS中；

5)在PBS中将白色脂肪组织去除，将褐色脂肪组织放于4％NCS的DMEM中；

6)将组织吸到EP管中，用剪刀剪碎，大概1mm左右的小块；

7)再次转移到15mL离心管中，10mL 4％NCS DMEM洗一次，吸掉上清；

8)1mL 1％胶原酶II(PBS中)，加入到4mL 4％NCS DMEM中(胶原酶II用PBSpH7.4配制，分装，-20℃保存，避免反复冻存)，过滤，加入组织中；

9)37℃，30min，将小水浴锅放在左右摇摆的摇床上，速度为10，在此期间，将长丝滴管口用酒精灯烧到圆润，细口的烧到大概0.5mm左右；

10)将消化液吸掉，4％NCS DMEM洗一次；

11)2mL 4％NCS DMEM，用粗口滴管吹打5次左右，将上清1吸掉，重新加上分离液，粗口滴管吹打5-7次，再用细口滴管吹打大概7次左右；

12)将第二次的上清吸出到新的离心管中，剩余的沉淀如果多的话可以进行三次吹打，以得到尽量多的细胞；

13)离心900g，9min，得沉淀细胞；

14)将沉淀用5％FBS DMEM重悬，铺到盖玻片上；

15)2-3小时后加入5％FBS DMEM 2mL；

16)第二天换液，用含4μM ARA-C的5％FBS DMEM半换液(抑制前体细胞的生长)；

17)以后每2天用5％FBS DMEM半换液一次，一般第二次换液的时候可以将细胞表面轻轻吹打将杂质去除，可以看到分离的分化的脂肪细胞已经牢牢的贴在盖玻片上，此时的细胞可以拿来做实验啦，一般3-8天的细胞做实验是没问题的，时间再长，脂滴就会融合变大。

2.褐色脂肪细胞转染

实验材料和仪器

1)高质量的质粒：260:280>1.8，浓度大于1mg/mL(所用质粒及来源见表1)；

2)电转仪：BTX公司ECM830方波电转系统；

3)电转液：20mM Hepes,135mM KCl,2mM MgCl₂,0.5％Ficol 400,1％DMSO，pH 7.6；

4)20mM ATP:50mM Glutathione储存液(pH～7.4).100x；

5)0.4cm电转杯。

电转步骤

电转作用一切试剂及材料都经灭菌处理，所需溶液放至室温。

1)将分离出来的小鼠原代脂肪细胞用PBS洗涤一次，900g离心9分钟，电转的细胞密度需达到1～1.5x 10⁶个细胞每毫升；

2)将100x的ATP与Glutathione储存液加入到电转液中；

3)加入10-40μg质粒到电转液中；

4)用大约420μl的电转液重悬细胞；

5)将含有质粒及细胞的电转液加入到0.4cm电转杯中，混匀，盖上盖子；

6)迅速进行电击，条件为10ms,115V square wave,2次脉冲,时间间隔1s；

7)加入2mL 10％NCS DMEM,混匀，900g离心9分钟；

8)用正常培养基600ul重悬，100μl/盖玻片；

9)每个培养皿(3.5cm)加入2mL培养基，培养箱培养24小时，半换液，加入ARA-C至终浓度2μM。

实施例的质粒为常规质粒，来源见表1。

表1

3.免疫荧光染色

免疫荧光染色实验材料和仪器

实验用真空泵(Cat No：gi-802)和摇床(Cat No：ts-8)均购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

免疫荧光染色所用溶液和试剂如下：

1)固定液FSB：Formaldehyde,10％,methanol free,Ultra Pure购自Polyscience Inc(Cat No：04018)，其他试剂均购自Sigma公司；

2)用1XPBS配制含4％formaldehyde，4％sucrose的FSB；

3)封闭液：1X PBS中加入0.5％的Triton X-100和5％山羊血清；

4)封片剂：Fluoromount-G购自Southern Biotech公司(Cat No：0100-01)；

5)一抗：anti-UCP1(#U6382，Sigma，多抗)，anti-Phospho-HSL(Ser563,#4139,CST多抗)，anti-细胞色素C(#556432，BD Pharmingen单抗)；

6)荧光二抗：购自Thermo Fisher公司。

免疫荧光染色实验方法

免疫荧光染色实验步骤如下：

1)用真空泵吸干净培养皿中的培养基，用PBS洗三次；

2)每个培养皿中加入1mL的固定液FSB，在摇床上室温固定30分钟，然后用PBS洗三次；

3)每个培养皿中加入1mL封闭液，在摇床上室温封闭30分钟；

4)用封闭液按1:400的比例稀释一抗，在摇床上4℃摇晃过夜；

5)用PBS洗三次，用含2％血清和0.5％Triton X-100的PBS稀释荧光二抗，稀释比例为1:400；

6)在载玻片中央滴一滴封片剂，用镊子夹起盖玻片，用吸水纸吸净残夜，轻轻倒扣于载玻片上，不要留气泡，用透明指甲油将盖玻片边缘封住。

4.染料装载及细胞成像

活细胞图像采集所用溶液为Tyrode：NaCl，8.4738g，KCl，3mL(1mol/L)，HEPES，2.383g，葡萄糖，1.8g，溶于1L ddH₂O中，pH7.4。所用试剂均购自Sigma公司。罗丹明B(RhB)、罗丹明800(Rh800)和CCCP购自美国Sigma-Aldrich公司，去甲肾上腺素(NE)购自美国Santa Cruz公司，SR-59230A购自英国Abcam公司，CGP-20712购自英国Tocris Bioscience公司。

细胞在含有30nM的罗丹明B甲酯与罗丹明800的tyrode溶液中，33℃共染1小时。高分辨率图像则用50nM染料共染。罗丹明B甲酯通道设置的伪彩为红色(559nm激发，575-620nm收光)，罗丹明800通道赋予的伪彩为绿色(635nm激发，655-755nm收光)，时间连续图像的拍摄用40×/0.95物镜512×512点分辨率，高分辨率图像的获得则用100×/1.4O物镜1600×1600点分辨率(图像数据为12比特)。

5.胞内pH成像

胞内pH成像使用5μM SNARF-1AM(购自美国Thermo Fisher公司)37℃染30min，tyrode溶液洗一次，置于2mL tyrode溶液，33℃恒温。559nm激发，655-755nm收光与575-620nm收光的比值为pH相对值。时间连续图像的拍摄用40×/0.95物镜512×512点分辨率(图像数据为12比特)。

6.氧化还原比率值及钙成像

氧化还原势与胞浆钙成像使用正置显微镜，购自奥林巴斯。Fura2-AM购自美国Thermo Fisher公司。

钙成像使用5μM Fura2-AM 37℃染30min，tyrode溶液洗一次，置于3.5cm培养皿中，4mL tyrode溶液，33℃恒温。恒温水浴及加药系统均为自制。

氧化还原势的测量则是根据细胞内FAD与NADH具有不同的激发及发射波长：通常情况下NADH的激发在350nm处激发，发射光谱的最大值在450nm到470nm之间。FAD的激发光为450nm，发射光谱的最大值在520nm左右(图1)。实验时，由于340nm处激发，450nm到470nm收光有限，不能很好的进行后续数据的处理，因此扩大收光的范围，将部分在340nm处激发的FAD的荧光也收到了一起。利用FAD/(FAD+NADH)的荧光比值来反映细胞内代谢状态的改变。时间连续图像的拍摄用40×/0.8水镜512×512点分辨率(图像数据为16比特)。

表2细胞成像所用仪器和软件及作用

仪器/软件	用途	来源
			奥林巴斯FW1000 IX81	热成像、转染及染色成像	日本，奥林巴斯公司
恒温孵育槽	加热及降温	日本，奥林巴斯公司
			Axon MiniDigi digitize	温度探测及数据收集	美国，美谷分子仪器
正置显微镜BX61WI	钙成像、氧化还原势	日本，奥林巴斯公司
			恒流蠕动泵	恒温水浴	美国，吉尔森
Image J	数据处理	美国,NIH
			MATLAB	数据处理	美国，Mathworks

表3细胞成像所用参数

7.数据收集及处理

成像时细胞均保持在33℃恒温，成像的时间间隔为30s，在第11张加NE处理，抑制剂则在拍照前20分钟加入。

扣除背景之后，将需要处理两个通道(热成像Rh800/RhB-ME、钙成像340/380、氧化还原势FAD/(FAD+DANH)、fret CFP/CFP)的数值做点对点做比值，为了减少噪音，信号值与噪音值的比值小于1.5的点去除，剩余的进行5×5的平均。根据3-sigma规则，比值的极端值(99.7％的容许区间)去掉。每个细胞的比值均为此细胞上所有点比值的平均值。用处理前的数值表示细胞的稳定状态来做数值的归一化处理，那么细胞的反应值Δr可以用公式Δr＝(r_t-r₀)/r₀来计算，此公式中r_t是反应最后五分钟的平均值，r₀是加药前的起始状态的平均值。

本发明所用数据均为平均值±s.d，在图中则使用平均值±s.e.m。

8.免疫印迹

免疫印迹(western blot)实验材料和仪器

Triton X-100、脱氧胆酸钠(DOC)、蛋白及磷酸酶抑制剂Protease InhibitorCocktail、Phosphatase Inhibitor Cocktail 2和Phosphatase InhibitorCocktail 3都是购自Sigma公司，蛋白浓度检测试剂盒购自康为世纪BCA蛋白定量试剂盒(Cat No：CW0014)，12％预制胶购自文渊阁生物科技有限公司(Cat No：P05)，page凝胶电泳loading为康为世纪的SDS-PAGE Loading Buffer(还原,5x)(Cat No：CW0027A)，蛋白marker为fermentas公司的PageRuler PrestProtein Ladder(Cat No：26616)，Western blot用0.2μm NC膜购自PE公司(CatNo：nba083g001ea)，曝光用X光片为X-OMAT BT X光片(Cat No：XBT-1)，显色液为Pierce ECL Western Blotting Substrate(Cat No：32109)，细胞培养皿购自nunc公司，page凝胶电泳仪购自Bio-Rad公司，VE 180微型垂直电泳槽购自天能公司，转膜仪为Thermo Fisher公司的XCell II^TMBlot Module(Cat No：EI9051)，冰冻离心机为Heal Force公司Neofuge 23R。

使用抗体：

一抗：anti-Phospho-HSL(Ser563,#4139,多抗)和anti-HSL(#4107,多抗)购自Cell Signaling Technology(CST)公司。Anti-actin(#264267，abmart，单抗)。

二抗：兔二抗购自GE公司(#NA934-1ML)，鼠二抗购自CST公司(#7076S)。

Western blot实验所用溶液如下，其中所用试剂均购自sigma公司。

1)1XPBS：KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄1.44g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，pH至7.4，ddH₂O定容至1L；

2)10X TBS：NaCl 80g，KCl 2g，Tris 30g，pH 7.4，ddH₂O定容至1L；

3)10X转膜液：Tris 29.027g，甘氨酸144.1344g，ddH₂O定容至800mL，用时每1L加200mL甲醇；

4)10X电泳buffer：Tris 30g，甘氨酸144g，SDS 10g，pH 8.4，ddH2O定容至1L；

5)TBST：每1L TBS加500μl Tween20；

6)100X PMSF：1.74g PMSF溶解于100mL异丙醇，溶解后分装保存；

7)裂解液：含1％Triton X-100和1％DOC的1XTBS；

8)10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1mL ddH₂O中。

免疫印迹(western blot)实验方法

免疫印迹(western blot)实验步骤如下：

1)将3-7天的褐色脂肪细胞进行加药处理。抑制剂一般预加20分钟，NE处理30分钟；

2)加入1mL/3.5cm dish灭菌的PBS洗涤细胞2次；

3)在PBS洗涤过的细胞培养皿中加入150μl细胞裂解液(实验前加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)，置冰上裂解30分钟，期间多次摇动细胞培养皿，保证裂解液均匀覆盖细胞并裂解充分；

4)将细胞培养皿中裂解充分的裂解液对号转入1.5mL Eppendorf管；

5)4℃，13000rpm高速离心30分钟；

6)收集上清转入新的Eppendorf管，用BCA法检测蛋白浓度，并调整各个样品的浓度一致；

7)将蛋白与loading buffer混匀，100℃金属浴煮样10分钟，待蛋白冷却后于4℃，13000rpm高速离心15分钟，取变性蛋白上样，120V，电泳时间1小时；

8)事先准备大小合适(能覆盖目标蛋白区域，膜比滤纸稍大)的NC膜，滤纸，浸泡于转膜液备用；

9)将电泳完的SDS PAGE胶从玻璃板取出，切除上下端多余胶，在ThermoFisher转膜盒内按负极到正极海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序装好转膜“三明治”；

10)在电泳/转膜盒内正确装好转膜装置，倒入转膜液，300mA恒流转膜90分钟；

11)拆开转膜装置，取出转移膜，立即夹入(防止转膜后膜面温度高，迅速干掉)事先准备好的TBST中，在TBST中5分钟/次，洗涤三次；

12)5％脱脂奶粉室温封闭1小时，然后在TBST中5分钟/次，洗涤三次；

13)使用TBST按1:1000比例稀释一抗，室温孵育1小时，然后在TBST中5分钟/次，洗涤三次；

14)依据一抗来源选择二抗，TBST按1:2000稀释，室温孵育1小时，然后在TBST中5分钟/次，洗涤三次；

15)配制ECL发光液，将洗涤后的NC膜用干净的镊子夹出置保鲜膜，滴加ECL发光液，1分钟后沥干发光液，盖上保鲜膜；

16)暗室内按照2秒,10秒,2分钟,10分钟,30分钟的曝光时间顺序曝光，也可选择多张胶片压片，并适当延长曝光时间；

17)将曝光后的胶片置于Kodak机器内自动显影定影，直至烘干出片。

9.RT-PCR

荧光实时定量PCR实验材料和仪器

用Trizol法从细胞中提取RNA，Trizol购自Thermo Fisher公司(Cat No：15596026)，cDNA合成试剂盒来自Takara公司primerscript 1st strand cDNAsynthesis kit(Cat No：D6110)，荧光实时定量PCR试剂盒为Takara公司的SYBRpremix ex taq(Cat No：DRR041s)。荧光实时定量PCR仪为ABI公司7500Fast实时荧光定量PCR仪。引物为常规方法设计并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

10.Trizol法RNA提取

1)3.5cm培养皿的细胞用1mL Trizol试剂进行裂解；

2)将上述裂解液转入EP管中，在室温15-30℃下放置5分钟；

3)在上述EP管中，按每1mL Trizol加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下放置2-3分钟；

4)12000g(2-8℃)离心15分钟；

5)取上层水相置于新EP管中，按照每1mL Trizol加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在室温下放置10分钟；

6)12000g(2-8℃)离心10分钟；

7)弃上清，用吸水纸吸干废液，按照每1mL Trizol加1mL 75％乙醇进行洗涤，漩涡混合，7500g(2-8℃)离心5分钟，弃上清；

8)吸水纸吸干废液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

9)用50μl RNase-free water溶解RNA沉淀；

10)用DNase I处理得到的RNA，37℃水浴30分钟。

11)加入1μl stop solution(50mM EDTA)，65℃水浴10分钟，拿出后立刻插冰上，即得到纯化的总RNA；

12)按Takara公司的primerscript 1st strand cDNA synthesis kit中所提供的说明书，选择Oligo primers进行反转录，得到cDNA。

NE受体的PCR程序为：94℃2min(94℃30s，60℃30s，72℃20s，30cycle)，72℃10min。

P2受体的RT-PCR程序为：94℃10min(95℃25s，60℃30s，72℃30s，40cycle)。

实施例1ATP对NE诱导的褐色脂肪细胞产热的增强作用

ATP要想发挥作用，必然是通过褐色脂肪细胞膜上的受体，发明人检测了ATP的受体(P2receptor)在褐色脂肪细胞中的表达丰度，发现ATP受体在褐色脂肪存在着多亚型的表达，在P2X受体亚型中，P2X1与P2X4表达占主导，在P2Y受体亚型中，P2Y13与P2Y14表达占主导，其他亚型丰度较低，但依然可能发挥着重要的作用。

发明人选用10μM的ATP与之前的0.1μM NE共同作用细胞。

结果如图10A－10E所示。ATP与NE共同作用于褐色脂肪细胞，结果发现，ATP和ATP-γS都能显著增强NE诱导的褐色脂肪细胞产热。ATP对NE的增强作用体现在两个方面：一，反应的细胞数，在5次实验的158个细胞中，有95％的细胞是产热(图10A)，比起NE(去甲肾上腺素)单独作用有显著提升，而ATP单独作用则不会引发明显的褐色脂肪细胞的产热反应(图10B)；二，单个细胞的产热量有明显增加，增加了90％。比较了产热的细胞中产热量的变化(图10C)，NE+ATP显著提高了单个细胞的产热幅度(P＜0.01)。

结果表明，ATP对NE诱导的褐色脂肪细胞的产热有显著增强作用，可见在体内，当NE与ATP共同释放时，褐色脂肪细胞的产热效率非常高。

实施例2ATP合成酶抑制剂对NE诱导的褐色脂肪细胞产热的增强作用以及膜电压的影响

鱼藤酮(rotenone)是一种电子传递链复合物Ⅰ的抑制剂，它阻断电子由NADH向CoQ的传递。实验时，提前加入5μM鱼藤酮30分钟，然后加入0.1μM NE，结果如图18A－18C所示。结果显示，所有细胞产热都被激活，但是不能持续。表明NADH并不是激活产热所必需的，但是细胞持续产热所需的，它提供的质子梯度才是褐色脂肪细胞能够源源不断的进行产热的能量来源。

寡霉素(oligomycin)是氧化磷酸化的抑制剂之一，与ATP合成酶的Fo部分(膜内质子透过的部分)结合，可特异地抑制质子的运输，所以也抑制ATP的合成和分解。

实验时，同时加入10μg/mL寡霉素和0.1μM NE，结果如图19A－19C所示。结果显示，每个细胞都有较强的产热，并且细胞的膜电压持续的下降。为收集尽量多的细胞信息，以时间成像的视野为中心，在NE前与加NE后，分别拍3x3的9个视野，通过前后成像的对比，得到细胞的膜电压变化及产热的结果。在此次实验的9个视野共有172个细胞，每个细胞都有产热反应，并且膜电压下降，可见ATP合成酶在线粒体膜电压的维持上确实起到了很大的作用。

实施例3NE诱导时细胞的膜电压变化

温度敏感染料的测温方法(方法参见中国专利申请号201410850735.3)中提到，罗丹明800作为一个参比染料可以反映膜电压的变化，也就是温度敏感染料的测温方法除了检测温度的变化，还可以同时监测线粒体膜电压的变化。

结果如图17A，17B所示。结果表明，线粒体膜电压在NE处理时有不同的变化，五次实验的150个细胞中，55.6％的细胞是膜电压下降的，并且膜电压的下降伴随着的细胞的温度增加。在这些细胞当中，有76％的细胞是产热的，也就是有近20％的细胞膜电压增加并且产热。

结果显示，线粒体膜电压都有轻微的上升，然后再下降或者继续上升。此段轻微的上升与细胞还原型辅酶的增加是一致的(图14F)，是细胞代谢增强的结果。

正常情况下，质子梯度的来源是电子传递链中的复合物中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，而当细胞处于缺氧或者膜电压下降时，会使用于合成ATP的ATP合成酶的功能反转，水解ATP泵质子，以维持细胞的正常的膜电压。

此外，当添加了ATP合成酶抑制剂(如寡霉素)时，观察到几乎所有细胞的线粒体膜电压均去极化。

实施例4NE诱导时细胞的pH值变化

NE诱导褐脂细胞产热同时，观察到胞内pH值变化与膜电压去极化程度具有正相关性(图17C空心点)，即去极化的细胞pH值会增加，超极化的细胞，pH会降低。

实施例3中提到膜电压去极化的细胞多为产热细胞，因此胞内pH值增加的细胞多为产热的细胞。这与UCP1激活时将线粒体外的质子漏向线粒体内的结论是相吻合的(胞浆的质子浓度降低导致pH值升高)。同时，还观察到用10μg/mL寡霉素将ATP合成酶抑制情况下(图17C实心点)，细胞全部去极化，并且胞内pH值多为增加。该结果表明，胞内pH值变化可以作为褐脂细胞产热程度的一个度量指标。

实施例5NE诱导时细胞内ATP的变化

AT1.03是通过细菌FoF1-ATP合成酶的ε亚基(约14kDa)特异性的和ATP结合但并不水解ATP，FoF1-ATP合成酶ε亚基和ATP结合时引起巨大的构象变化，从而使结合在ε亚基两端的CFP和mVenus发生荧光共振能量转移(Sze et al.)，激光共聚焦显微镜拍照时，以458nm的激光激发CFP，分别收取eCFP和mVenus的发射光，通过计算mVenus发射光(535nm-565nm)强度和eCFP发射光(480nm-495nm)强度的比值，从而指示细胞中ATP的水平。加上线粒体的定位信号克隆成新的质粒mito-AT1.03可以测量线粒体基质内的ATP浓度。

结果如图15A-15C和16A-16C所示。结果显示，胞浆内的ATP在NE处理时迅速下降，线粒体内的ATP含量也有不同程度的下降。在分离出来的褐色脂肪线粒体上的实验表明，线粒体处于解偶联状态时，只有少量的ATP的产生(不足原先的20％)。由于细胞的各项生命活动仍在继续，ATP的消耗仍在继续，所以细胞内ATP的降低是一个复杂的过程。但胞内ATP的下降会激活糖酵解过程的限制酶磷酸果糖激酶，使糖酵解增强，增加ATP的供应。但是之后细胞的ATP水平一直处于较低的水平，并没有恢复的迹象，表明细胞内有受NE激活的机制可以持续消耗细胞内的ATP。

实施例6NE诱导时细胞内的钙反应

钙离子作为细胞内第二信使，对细胞内的代谢起着重要的作用。ATP与NE都可以引发胞浆钙的增加。

发明人用染料fura2-AM测量胞浆内钙离子浓度的变化(图11A-11G)。结果显示，褐色脂肪细胞内的钙离子水平不均一(图11A、11F)，在0.1μM NE处理时，所有细胞胞浆内的钙都有明显增加(n＝54，三次实验)(图11A、11B)。这持续增加的钙，可以调节细胞内多种的代谢活动。

在线粒体中钙离子的增加可以使呼吸作用增强，从而产生更多的ATP或者热量。而线粒体中CoQ的还原状态可以影响到长链脂肪酸对UCP1的激活。原代褐色脂肪细胞不易转染，因此将每次实验的细胞无差别成像，可以提供有力的证据。结果显示，线粒体内的钙都有明显的增加(图12A-12C)，可见细胞的代谢增强。α1受体的激活可以引起细胞内质网钙的释放，实验结果显示，细胞内质网的钙释放具有很大的波动性(图13A-13C)，这可能是引起胞浆钙增加波动的原因之一。

虽然转染的实验因为细胞数量的限制以及细胞的不确定性无法判断是否包含了产热与不产热的两种的细胞，但从整体的反应依然可以看出，NE处理时，线粒体的钙是增加的，而内质网的钙是释放的。并且注意到一点，不论是线粒体还是内质网内的钙在变化后都没有回到最初的状态。

实施例7NE诱导时细胞内氧化还原态的改变

当NE处理时，无论是胞浆中的钙离子还是线粒体内的钙离子浓度都有很大的增加，钙离子对细胞内的代谢有至关重要的影响。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(Waller et al.)两个辅酶参与细胞内重要的代谢过程：糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化，与ATP的产生有直接的关系。细胞内存在它们的氧化状态(NAD+/FAD)和还原状态(NADH/FADH2)，但是只有FAD和NADH是有明显的荧光的。实验利用FAD与FAD+NADH的荧光比值来表示细胞的代谢状态。

结果如图14A-14G所示。结果显示，褐色脂肪细胞内FAD和NADH有较强的荧光(图14A、14B)，并且在NE刺激时，细胞内的氧化还原状态有较大的变化(图14D)：FAD的荧光值只有轻微的上升，而NADH的荧光值下降比较剧烈，表示在NE刺激时细胞内的还原型辅酶(NADH)有较强的消耗。此外，所有细胞在加入NE之后先是有一段还原型辅酶的略微增加，然后才是还原势能的大量消耗。

结果表明，NE加入后，细胞内的代谢是增强的，产生了更多的还原型辅酶。并且从图14C和14E可以看出每个细胞起始的氧化还原状态不尽相同，对NE刺激的反应有强有弱(图14E、14F)。

实施例8NE诱导的褐色脂肪细胞的产热

8.1线粒体温度测量法在原代褐色脂肪细胞中的应用

利用线粒体温度测量方法进行褐色脂肪细胞产热的研究，可以在单细胞水平上得到大量的线粒体产热的数据，从而对研究褐色脂肪细胞的产热研究提供了很好的工具。

电镜数据显示，褐色脂肪细胞内有大量的线粒体，因此可以在机体需要时进行高效的产热。光敏染料罗丹明B甲酯可以定位于褐色脂肪细胞的线粒体(图2A-2E)，而褐色脂肪内主要是由线粒体在产热，在此可以用光敏染料罗丹明800与罗丹明B甲酯的荧光强度的比值来表示细胞温度的变化。而由于线粒体产生的热量要经过热量的传递才能到达整个细胞，因此在快速变化的温度测量中，线粒体的温度变化只能反应细胞温度变化的趋势，如果用线粒体的温度变化作为细胞的温度变化，无疑会高估细胞整体的温度变化。因此，在测定褐色细胞的产热时，只做定性和半定量的分析，也就是褐色细胞的产热及相对的产热量，而不去量化产热引起的温度变化。

8.2 0.1μM NE引发的褐色脂肪产热反应

用0.1μM的NE处理原代的褐色脂肪细胞，加药处理后药物会一直留在观察液中。为降低激光共聚焦成像时的光毒性和获得尽量多的细胞信息，在不影响实验结果后续处理的前提下，发明人降低了成像的分辨率，因此，无法获得清晰的线粒体成像，但是荧光强度的变化依然可以检测，也可以从整体上反应细胞线粒体温度的变化(图3F)。NE，以及β3受体特异激动剂CL316243或β受体广谱激动剂异丙肾上腺素(Isoprenaline)都仅能引起部分原代褐色脂肪细胞的产热反应(图3A－3H)。原代褐色脂肪细胞的产热响应并不一致，在5次NE刺激的实验中150个细胞只有76％的细胞是产热的(图3A)，并且每次实验由于成像视野选取的问题，此数值会略有差别。因此在涉及后续统计产热细胞数量的实验时，都进行多次的重复平行实验。

为了便于数据的统一，细胞的成像温度为33℃，值得一提的是，最初实验将成像温度设为37℃时，很多细胞产热后死亡，提示细胞对温度耐受有一定范围。此外，由于两个染料的动态变化速度不可能完全一致，因此，在NE加入后的那个微小的降温可能是一个假象，也可能反映了一个真实的刺激反应，因为同样的现象用荧光蛋白测温方法也明显可见。然而，这些不影响最终稳定时细胞的最终的温度变化。

8.3NE受体及抑制剂的作用

收集原代褐色脂肪细胞的mRNA，进行PCR扩增，发现9种不同NE受体的亚型表达不一，其中α1B与α2受体只有痕量的表达，其他几种受体表达量相当高(图4)。

SR 59230A在高浓度时为广谱的NE受体的抑制剂(Leblais et al.,2004)，在1μM SR 59230A存在的情况下，0.1μM NE引发的褐色脂肪细胞产热反应可以被完全抑制(图5A和5B)，可见产热的细胞确实是由NE受体介导的，并不是由于NE药物的存在使两种染料重新分布产生的假象。SR 59230A虽然抑制了细胞的产热反应，但是P-HSL(Ser563)的磷酸化并没有完全的抑制(图7A和7B)，可见只有少量P-HSL(Ser563)的磷酸化并不能激发褐色脂肪细胞的产热反应。

为了进一步验证受体的作用，选取了已知的特异性较高的受体的抑制剂：CGP-20712(β1受体抑制剂)。将抑制剂提前作用于细胞，再加0.1μM NE刺激，观察细胞的产热反应。发现产热的细胞明显减少(42％，n＝180个细胞，5次实验)，并且30分钟之后有些细胞温度开始降低，使整体细胞的产热反应曲线呈现“钟形”(图6A-6E)，表明在成熟的褐色脂肪细胞中，β1受体参与持续的细胞产热反应。进一步的免疫印迹实验也可以看出抑制β1受体可以减少P-HSL(Ser563)的磷酸化(图7A和7B)，从而证明β1受体确实参与了NE诱导的细胞产热。

8.4 10μM NE引发的褐色脂肪细胞产热反应

既然0.1μM NE不能引起全部细胞的产热反应，是否是由于细胞NE的不同亲和力受体表达的差异性导致没有达到最大的激活浓度呢？实验结果如图8A-8D所示。结果表明，加大NE的浓度，确实可以增加细胞内P-HSL(Ser563)的磷酸化程度(图8A、8B)。10μM NE可以略微增加细胞的产热幅度(图8D)。但是，在3次实验的110个细胞中，有81％的细胞是产热，与0.1μM NE的76％没有明显的差异(P＝0.26)。NE浓度增加100倍，依然不能使所有的细胞都有产热反应。

实施例9脂肪细胞中UCP1表达

增加NE的浓度，依然没有将全部细胞进行激活产热。与之前对于褐色脂肪细胞产热的研究都的测耗氧量或者以cAMP的生成量来代替不同，此次观察到单个细胞的产热不均一，是否是由于分离的原代褐色脂肪细胞混有白色脂肪的缘故呢。褐色脂肪细胞区别于白色脂肪的重要分子就是线粒体的解偶联蛋白：UCP1。用UCP1的抗体进行细胞的染色，发现所有分离的脂肪细胞内都有UCP1的表达,细胞色素C为线粒体分子标记蛋白，表明UCP1抗体的线粒体特异性定位(图9A-9H)。

实施例10ATP对NE增强作用的作用机制

发明人检测了NE与ATP共同作用时，P-HSL(Ser563)的磷酸化情况，发现NE与ATP共同作用使P-HSL(Ser563)的磷酸化增加减少(图20A)，这与褐色脂肪细胞内高表达的P2Y13与P2Y14受体相吻合，因为这两个受体与Gi蛋白相偶联，可以抑制PKA的功能。说明ATP对NE的增强作用不是通过增加酯酰甘油的裂解来实现的。

氧化还原状态的改变显示细胞内代谢状态的变化，细胞内的氧化态表示FAD与NAD+的含量高，会诱导细胞产生过量的ROS，NE与ATP共同作用时，细胞内氧化态的改变比NE单独作用时要小(图20B)，表明细胞内ROS的产量减少，因ROS诱导的产热细胞也不会增加。

如图20C所示，虽然ATP对NE诱导的产热的细胞数目有明显的增加，但是仍有近20％细胞膜电压增加而细胞产热，如果是ATP合成酶在其中起到了重要的作用，那么胞外ATP的作用就是使ATP合成酶的功能反转作用受到了抑制，或者总的长链脂肪酸浓度增加，使UCP1的重新抑制变得困难，此时长链脂肪酸的增加只能是磷脂酶PLA2的作用，可以通过胞浆内pH及钙离子的改变去间接了解PLA2的活性状态。

参考文献

1.Leblais,V.,Pourageaud,F.,Ivorra,M.D.,Guibert,C.,Marthan,R.,and Muller,B.(2004).Role ofα-adrenergic receptors in the effectof theβ-adrenergic receptor ligands,CGP 12177,bupranolol,and SR 59230A,on the contraction of rat intrapulmonary artery.J Pharmacol Exp Ther 309,137-145.

2.Sze,L.,Fretz,C.,Hildebrandt,G.,Westphal,K.,and Brandle,M.(2008).A patient with a"good nose".Experimental and clinicalendocrinology&diabetes:official journal,German Society ofEndocrinology[and]German Diabetes Association 116,129-131.

3.Waller,R.F.,Reed,M.B.,Cowman,A.F.,and McFadden,G.I.(2000).Protein trafficking to the plastid of Plasmodium falciparum is via thesecretory pathway.The EMBO journal 19,1794-1802.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种产热增强化合物的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于增强NE类化合物诱导褐色脂肪细胞的产热效率，其中，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ATP类化合物选自下组：ATP、ATP-γS、BzATP、α,β-亚甲基腺苷三磷酸、2-甲硫腺苷三磷酸、ADP、UTP、UDP、MRS2690、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂选自下组：寡霉素、水蓼辣素、原钒酸盐、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂或组合物还包括NE类化合物。

5.一种体外非治疗性的增强哺乳动物产热的方法，其特征在于，包括步骤：

在NE类化合物和产热增强化合物存在下，培养褐色脂肪细胞，从而增强哺乳动物的产热，其中，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述NE类化合物与所述产热增强化合物的摩尔比为1-100：10-1000，较佳地，1-5：50-500，更佳地，1-2：100-200。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述产热增强化合物的作用浓度为0.1-100μg/mL，较佳地，1-50μg/mL，更佳地，5-20μg/mL。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：

(i)NE类化合物；

(i i)产热增强化合物，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合；和

(iii)药学上可接受的载体。

9.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：

(a)含有NE类化合物的第一制剂；

(b)含有产热增强化合物的第二制剂，所述产热增强化合物选自下组：ATP类化合物、线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂、或其组合；和

(c)说明书。

10.一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一线粒体复合物V/ATP合成酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在NE类化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。