CN107028872A - 一种复合水凝胶、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水凝胶领域，公开了一种复合水凝胶、其制备方法及应用。本发明的复合水凝胶由多糖和纳米粒子在水性介质中交联而成，所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。所述复合水凝胶以纳米粒子作为物理交联点，与多糖链段产生非共价键作用，实现了对多糖链段的交联。实验结果表明，由于纳米粒子的掺入，复合水凝胶具有了较好的促进细胞增殖和加快伤口愈合的作用。而且，本发明的复合水凝胶可在温和条件下发生，制备方法简单。

Description

一种复合水凝胶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及水凝胶领域，特别涉及一种复合水凝胶、其制备方法及应用。

背景技术

水凝胶是一种具有三维网状结构的新型高分子材料，其以水性介质为分散介质。

水凝胶对低分子物质具有较好的透过性，含水量高，溶胀快，有良好的生物相容性，具有药物缓释性能。因此水凝胶不仅可开发用做传感器、人造肌肉、细胞固定和记忆材料，还可以将其用于药物载体和组织工程基质材料。

水凝胶是由水溶性或亲水性的高分子通过一定的化学交联或物理交联得到的。这些高分子按照其来源可分为天然和合成两大类，天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸，壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸等)。合成的亲水高分子包括聚乙烯、醇、丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚N-聚代丙烯酰胺等)。天然高分子由于具有更好的生物相容性、对环境的敏感性以及丰富的来源、低廉的价格，因而正在引起越来越多学者的重视。但是天然高分子材料稳定性较差，易降解。

研究表明，在天然高分子材料交联得到的水凝胶中引入二氧化硅等无机纳米粒子可以赋予高分子水凝胶特定功能性，提高其力学性能，或改变其理化性质，从而进一步拓展水凝胶的应用领域。例如，公开号为CN 101658485中国专利公开了一种纳米杂化水凝胶，其具备很好的持久广谱抗菌性能；公开号CN 101647756A的中国专利公开了一种可以用于牙根管填充材料的纳米杂化水凝胶，同样具有很好的抗菌性能。

但是，目前还没有成熟的具备促进细胞增殖作用的水凝胶。本发明希望通过在天然高分子材料中引入其他粒子，制备一种稳定的、具有促进细胞增殖，加快伤口愈合作用的水凝胶。

发明内容

本发明提供了一种复合水凝胶、其制备方法及其应用，所述复合水凝胶可以促进细胞增殖，加快伤口愈合。

本发明公开了一种复合水凝胶，由多糖和纳米粒子在水性介质中交联而成，所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

优选的，所述多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、葡聚糖和透明质酸中的一种或多种。

优选的，所述纳米粒子的质量浓度为2～40wt％。

优选的，所述纳米粒子表面带有修饰基团，所述修饰基团为羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基、阳离子或阳离子基团。

优选的，所述纳米粒子的直径为5～500纳米。

优选的，所述多糖的分子量为5～5000kDa。

优选的，所述多糖的浓度为5～200mg/mL。

本发明还公开了一种复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将纳米粒子和多糖在水性介质中混合搅拌，得到复合水凝胶；

所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

优选的，在所述混合搅拌前，还包括：将纳米粒子进行表面修饰。

本发明还公开了上述技术方案所述的复合水凝胶以及上述技术方案的所述制备方法制备的复合物水凝胶在外用制剂材料或化妆材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的复合水凝胶，由多糖和纳米粒子在水性介质中交联而成，所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。所述复合水凝胶以纳米粒子作为物理交联点，与多糖链段产生非共价键作用，实现了对多糖链段的交联。实验结果表明，由于纳米粒子的掺入，复合水凝胶具有了较好的促进细胞增殖和加快伤口愈合的作用。而且，本发明的复合水凝胶可在温和条件下发生，制备方法简单。

附图说明

图1表示实施例2制备的复合水凝胶的扫描电镜图；

图2表示实施例13制备的复合水凝胶处理受伤小鼠后的组织切片图；

图3表示实施例15制备的复合水凝胶处理受伤小鼠后的组织切片图；

图4表示比较例1的羟乙基壳聚糖溶液处理受伤小鼠后的组织切片图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明的实施例公开了一种复合水凝胶，由多糖和纳米粒子在水性介质中交联而成，所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

按照本发明，所述复合水凝胶多糖、纳米粒子和水性介质。所述多糖和纳米粒子在水性介质中交联得到复合水凝胶。本发明对于水性介质没有特殊限制，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、乙酸溶液、组织培养液或体液。

所述多糖优选为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、葡聚糖和透明质酸中的一种或多种。所述多糖的分子量优选为5～5000kDa，更优选为100～1000kDa。在形成的水凝胶中，所述多糖的浓度优选为5～200mg/mL，更优选为60～120mg/mL，最优选为80～100mg/mL。所述多糖的浓度决定了交联后复合水凝胶的孔径，所述多糖的浓度越大，复合水凝胶的孔径越小。

所述纳米粒子做为物理交联点，可以与多糖链段产生非共价键作用从而实现对多糖链的交联。所述纳米粒子是凝胶化的关键，尤其是纳米粒子的粒径及表面性质决定了交联的程度及交联后的性能。所纳米粒子的直径优选为5～500纳米，更优选为40～300纳米。所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。其中纳米二氧化硅为带有羟基的二氧化硅。所述纳米二氧化硅可以为市售产品，或者参照文献(W.；Fink,A.；Bohn,E.Controlled Growth of Monodisperse SilicaSpheres in the Micron Size Range.J.Colloid Interface Sci.1968,26,62-69)制备得到。所述羟基磷灰石即碱式磷酸钙，所述羟基磷灰石的按照参考文献(Kuriakose T A,Kalkura N,Palanichamy M,et al.Synthesis of stoichiometricnano crystalline hydroxyapatite by ethanol-based sol-gel technique at lowtemperature[J].J Cryst Growth,2004,263:517-523)制备得到。

优选的，所述纳米粒子表面还可以通过化学或物理改性从而带有修饰基团，所述修饰基团优选为羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基、阳离子或阳离子基团。所述修饰基团中的羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基可以与多糖发生非共价键链接，促进交联得到复合水凝胶，所述阳离子或阳离子基团可以负载生物活性分子，从而使复合水凝胶负载生物活性物质，具备生物活性。所述阳离子优选为钙离子，即用钙离子对纳米粒子进行改性。所述钙离子可以来源于氢氧化钙。在形成的水凝胶中，所述纳米粒子的质量浓度优选为2～40wt％，更优选为5～20wt％，最优选为7.5～10wt％。

本发明对于所述纳米粒子的形状没有特殊限制，可以为球形或无规则形。

本发明还公开了一种复合水凝胶的制备方法，将纳米粒子和多糖在水性介质中混合搅拌，得到复合水凝胶；

所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

在本发明的制备方法中，以纳米粒子，多糖和水性介质为原料。对于所述纳米粒子、多糖和水性介质的叙述与上述技术方案相同，在此不再赘述。

按照本发明，将纳米粒子和多糖在水性介质中混合搅拌，得到复合水凝胶。本发明对于混合搅拌的温度没有特殊限制，室温即可，便于原位包封如蛋白、多肽、药物或细胞等生物活性物质。所述混合搅拌的时间优选为5～30分钟。

优选的，将纳米粒子修饰后，再与多糖在水性介质中混合。所述修饰基团优选为羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基、阳离子或阳离子基团。所述修饰基团中的羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基可以与多糖发生非共价键链接，促进交联得到复合水凝胶，所述阳离子或阳离子基团可以负载生物活性分子，从而使复合水凝胶负载生物活性物质，具备生物活性。所述阳离子优选为钙离子，即用钙离子对纳米粒子进行改性。所述钙离子可以来源于氢氧化钙。本发明对于纳米粒子的修饰方法没有特殊限制，按照本领域技术人员熟知的方法即可。如纳米二氧化硅表面进行羧基修饰可参照文献：孙丽卫，羧基化二氧化硅纳米粒子的制备及其对酶及辅酶固定化的研究.北京化工大学[D].2012。

在形成的水凝胶中，所述纳米粒子的质量浓度优选为2～40wt％，更优选为5～20wt％，最优选为7.5～10wt％。在形成的水凝胶中，所述纳米粒子的质量浓度优选为2～40wt％，更优选为5～20wt％，最优选为7.5～10wt％。

本发明还公开了上述技术方案所述复合水凝胶及上述技术方案所述方法制备的复合水凝胶在外用制剂材料或化妆材料中的应用。

经过小鼠背部皮肤缺损模型的实验，结果表明，本发明制备的复合水凝胶具有促进细胞增殖和加快伤口愈合的作用。而且所述复合水凝胶为多孔结构，可以担载小分子物质，而且进一步的，如果其带有活性基团，还可以负载生物活性分子，有利于物质的传递和运输。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的复合物水凝胶及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

以下实施例涉及的胶原为solarbio公司产品。RPMI 1640培养基为Gibco公司生产的市售产品。

实施例1

根据文献(W.；Fink,A.；Bohn,E.Controlled Growth of MonodisperseSilica Spheres in the Micron Size Range.J.Colloid Interface Sci.1968,26,62-69)制备得到40纳米的胶体二氧化硅纳米粒子。

将胶体二氧化硅纳米粒子在水中搅拌分散，形成均匀的分散体系。用水配置分子量为200kDa的羧甲基壳聚糖的水溶液，与40纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，5分钟形成复合水凝胶。羧甲基壳聚糖的最终浓度为80mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为10wt％。

动物实验：取成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的上述制备的水凝胶，每2天涂抹一次，每次0.2mL。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察。

治疗2周后，实验组小鼠伤口完全复原。上述实验说明本发明制备的水凝胶能够促进细胞增殖，加速伤口愈合。

实施例2

40纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中以采用溶胶-凝胶法制备的粒径为40纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中搅拌分散，形成均匀的分散体系。然后，将氢氧化钙的饱和水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，其中二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为50:1，体系中的水与二氧化硅的质量比为50:1。将该体系于25℃下磁力搅拌8小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为40纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：用水配置分子量为50kDa的羧甲基壳聚糖溶液，与40纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，5分钟形成凝胶。羧甲基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为10wt％。

使用SEM观察所形成凝胶的形貌，如图1。从图1中可以看出，所制备的凝胶具备大量的孔结构，有利于物质的传递和运输。

实施例3

50纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用商品化的粒径为50纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料。由于本实施例中胶体二氧化硅纳米粒子以在水中的均匀分散体系存在，所以使用时直接将氢氧化钙的饱和水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为75:1，体系中水与二氧化硅的质量比为40:1。将该体系于20℃下磁力搅拌10小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为50纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为35kDa的壳聚糖乙酸溶液，使该壳聚糖在0.1％乙酸溶液中充分溶解后，与50纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，10分钟形成凝胶。壳聚糖的最终浓度为80mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为7.5％。

实施例4

50纳米羟基磷灰石纳米粒子的合成：本实施例中采用的羟基磷灰石按照参考文献(Kuriakose T A,Kalkura N,Palanichamy M,et al.Synthesis ofstoichiometric nano crystalline hydroxyapatite by ethanol-based sol-gel techniqueat low temperature[J].J Cryst Growth,2004,263:517-523)制备得到粒径约为50纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为5kDa的葡聚糖的水溶液，与50纳米的羟基磷灰石纳米粒子混合，充分搅拌，15分钟形成凝胶。葡聚糖的最终浓度为200mg/mL，羟基磷灰石纳米粒子的最终浓度为40wt％。

实施例5

100纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用溶胶-凝胶法制备的粒径为100纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中分散，形成均匀的分散体系。然后，将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为75:1，体系中水与二氧化硅的质量比为20:1。将该体系于18℃下磁力搅拌12小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为100纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为10kDa的透明质酸的水溶液，与100纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，12分钟形成凝胶。透明质酸的最终浓度为150mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为20wt％。

实施例6

300纳米改性羟基磷灰石纳米粒子的合成：本实施例中以粒径为300的纳米羟基磷灰石粒子为原料，制备方法参考实施例4所述文献。首先，将羟基磷灰石纳米粒子在水中搅拌分散，形成均匀的分散体系。然后，将氢氧化钙的饱和水溶液加入到上述羟基磷灰石纳米粒子的水分散体系中，其中羟基磷灰石和氢氧化钙的质量比为6:1。将该体系于20℃下磁力搅拌9小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为300纳米的改性羟基磷灰石纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为200kDa的羟乙基壳聚糖的水溶液，与300纳米的改性羟基磷灰石纳米粒子混合，充分搅拌，30分钟形成凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为5mg/mL，羟基磷灰石纳米粒子的最终浓度为30wt％。

实施例7

5纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用商品化的粒径为5纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料。由于本实施例中胶体二氧化硅纳米粒子以在水中的均匀分散体系存在，所以使用时直接将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为100:1，体系中水与二氧化硅的质量比为30:1。将该体系于20℃下磁力搅拌18小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为5纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为25kDa的羟乙基壳聚糖的水溶液，与5纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，30分钟形成凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为25wt％。

实施例8

25纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用商品化的粒径为25纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料。由于本实施例中胶体二氧化硅纳米粒子以在水中的均匀分散体系存在，所以使用时直接将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为75:1，体系中水与二氧化硅的质量比为40:1。将该体系于18℃下磁力搅拌20小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为25纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为150kDa的羟乙基壳聚糖的水溶液，与25纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，20分钟形成凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为2wt％。

实施例9

500纳米羟基磷灰石纳米粒子的合成：本实施例中按照参考文献(Kuriakose T A,Kalkura N,Palanichamy M,et al.Synthesis of stoichiometricnano crystalline hydroxyapatite by ethanol-based sol-gel technique at lowtemperature[J].J Cryst Growth,2004,263:517-523)制备得到为500纳米羟基磷灰石粒子。

凝胶的形成：配置分子量为8kDa的羟乙基壳聚糖和分子量为12kDa的羧甲基壳聚糖的混合溶液，与500纳米羟基磷灰石粒子混合，充分搅拌，3分钟形成凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，羧甲基壳聚糖的最终浓度也为100mg/mL，羟基磷灰石粒子的最终浓度为20wt％。

实施例10

100纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用溶胶-凝胶法制备的粒径为100纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中分散，形成均匀的分散体系。然后，将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为100:1，体系中水与二氧化硅的质量比为25:1。将该体系于15℃下磁力搅拌10小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为100纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：配置分子量为10kDa的葡聚糖和分子量为10kDa的透明质酸的混合溶液，与100纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，7分钟形成凝胶。葡聚糖的最终浓度为80mg/mL，透明质酸的最终浓度也为100mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为15wt％。

实施例11

80纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用溶胶-凝胶法制备的粒径为80纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中分散，形成均匀的分散体系。然后，将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为60:1，体系中水与二氧化硅的质量比为30:1。将该体系于15℃下磁力搅拌10小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为80纳米的生物活性纳米粒子。

凝胶的形成：使用RPMI 1640培养基配置分子量为50kDa的葡聚糖的溶液，与80纳米的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，8分钟形成凝胶。葡聚糖的最终浓度为200mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为20wt％。

实施例12

将成纤维细胞L929分散于葡聚糖RPM1640溶液，与实施例11制备的80南无的生物活性纳米粒子混合，充分搅拌，形成凝胶。将凝胶置于RPMI 1640培养基中进行培养，培养基中另外加入10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和1％链霉素。CCK-8试剂盒测定L929细胞在凝胶中的增殖情况为：细胞在3天内增殖初始细胞量的285％，第7天增殖405％，由此可以看出，所制备的凝胶具有很好的生物相容性，并能促进L929细胞的增殖。

实施例13

12纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用商品化的粒径为12纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料。由于本实施例中胶体二氧化硅纳米粒子以在水中的均匀分散体系存在，所以使用时直接将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为80:1，体系中水与二氧化硅的质量比为20:1。将该体系于20℃下磁力搅拌12小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为12纳米的生物活性纳米粒子。

12纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的后处理：所得到的生物活性二氧化硅纳米粒子用磷酸盐缓冲液(PBS)透析(pH为7.4)24小时，每4小时更换一次PBS。

凝胶的制备：用0.2M磷酸缓冲液配制分子量为150kDa的羟乙基壳聚糖溶液，与已透析的二氧化硅纳米粒子混合搅拌5分钟，即得到水凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为7.5wt％。

实施例14

动物实验：在成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)随机分为2组(实验组、对照组，每组6只)，在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹实施例13制备的水凝胶，每2天涂抹一次，每次0.2mL，对照组不做处理。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察(图2)。图2中，(a)为对照组处理后的组织切片图；(b)为水凝胶处理后组织切片图。

从图2中可以看出，治疗2周后，实验组小鼠伤口完全复原，而对照组伤口虽然愈合，但新生成皮肤的毛囊、血管等功能组织尚未形成。上述实验说明所制备的羟乙基壳聚糖与二氧化硅纳米粒子水凝胶能够促进皮肤伤口的愈合质量。

实施例15

100纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用溶胶-凝胶法制备的粒径为100纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中分散，形成均匀的分散体系。然后，将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为80:1，体系中水与二氧化硅的质量比为30:1。将该体系于15℃下磁力搅拌8小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为100纳米的生物活性纳米粒子。

100纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的后处理：所得到的生物活性二氧化硅纳米粒子用0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)透析(pH为7.4)24小时，每4小时更换一次PBS。

凝胶的制备：用RPMI 1640溶液配制分子量500kDa的透明质酸溶液，并混入一定量的胶原蛋白，将成纤维细胞L929分散于RPMI 1640溶液，与已透析的二氧化硅纳米粒子混合搅拌10分钟，即得到含有L929细胞的水凝胶。透明质酸的最终浓度为200mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为15wt％，成纤维细胞L929的浓度是10⁶个/mL，胶原的最终浓度是10mg/mL。

实施例16

动物实验：在成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)随机分为2组(实验组、对照组，每组6只)，在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹实施例15制备的水凝胶，每2天涂抹一次，每次0.2mL，对照组不做处理。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察(图3)。从图3中可以看出，治疗2周后，实验组小鼠伤口完全复原。上述实验说明所制备的含有L929细胞的葡聚糖与二氧化硅纳米粒子水凝胶能够促进皮肤伤口的愈合质量。

实施例17

40纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中以采用溶胶-凝胶法制备的粒径为40纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料，制备方法参考实施例1所述文献。首先，将胶体二氧化硅纳米粒子在水中搅拌分散，形成均匀的分散体系。然后，将氢氧化钙的饱和水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，其中二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为60:1，体系中的水与二氧化硅的质量比为60:1。将该体系于20℃下磁力搅拌12小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为40纳米的生物活性纳米粒子。

氨基修饰二氧化硅纳米粒子的合成：将上述干燥得到的40纳米的生物活性纳米粒子100mg溶于100mL的乙醇溶液中，加入100uL的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，60℃，磁力搅拌800rpm，反应24h，离心，并用水洗涤三次即得到氨基修饰二氧化硅纳米粒子。

凝胶的形成：用水配置分子量为75kDa的羧甲基壳聚糖溶液，与40纳米的氨基修饰二氧化硅纳米粒子，充分搅拌，7分钟形成凝胶。羧甲基壳聚糖的最终浓度为80mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为7.5wt％。

动物实验：在成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)随机分为2组(实验组、对照组，每组6只)，在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹本实施例制备的水凝胶，每2天涂抹一次，每次0.2mL，对照组不做处理。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察。治疗2周后，实验组小鼠伤口完全复原。

实施例18

12纳米生物活性二氧化硅纳米粒子的合成：本实施例中采用商品化的粒径为12纳米的胶体二氧化硅纳米粒子为原料。由于本实施例中胶体二氧化硅纳米粒子以在水中的均匀分散体系存在，所以使用时直接将1mmol/L的氢氧化钙水溶液加入到上述胶体二氧化硅纳米粒子的水分散体系中，保持二氧化硅和氢氧化钙的摩尔比为100:1，体系中水与二氧化硅的质量比为25:1。将该体系于20℃下磁力搅拌10小时后，离心，并用水洗涤以除去未反应的氢氧化钙，干燥后即可得到粒径约为12纳米的生物活性纳米粒子。

羧基修饰二氧化硅纳米粒子的合成：将上述干燥得到的12纳米的生物活性纳米粒子50mg溶于100mL的乙醇溶液中，加入100uL的三乙氧基硅丙基马来酸，78℃，磁力搅拌1000rpm，反应18h，离心，并用水洗涤三次即得到羧基修饰二氧化硅纳米粒子。

凝胶的制备：用水配制分子量为100kDa的羟乙基壳聚糖溶液，与上述12纳米羧基修饰二氧化硅纳米粒子混合搅拌10分钟，即得到水凝胶。羟乙基壳聚糖的最终浓度为150mg/mL，二氧化硅纳米粒子的最终浓度为25wt％。

动物实验：在成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)随机分为2组(实验组、对照组，每组6只)，在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹本实施例制备的水凝胶，每2天涂抹一次，每次0.2mL，对照组不做处理。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察。治疗2周后，实验组小鼠伤口完全复原。比较例1

用0.2M磷酸缓冲液配制分子量为20kDa的羟乙基壳聚糖溶液并混入一定量的胶原蛋白，得到混合液。羟乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL，胶原的最终浓度是10mg/mL。

动物实验：在成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)随机分为2组(实验组、对照组，每组6只)，在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹羟乙基壳聚糖溶液，每2天涂抹一次，每次0.2mL，对照组不做处理。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察。

治疗2周后，实验组小鼠伤口没有复原。上述实验说明不含有纳米粒子的羟乙基壳聚糖溶液促进细胞增殖效果不明显。

比较例2

用0.2M磷酸缓冲液配制分子量为20kDa的羟乙基壳聚糖溶液，乙基壳聚糖的最终浓度为100mg/mL。

动物实验：取成年的6周Balb/c雄性小鼠(平均重量20-25g)在背部中央切除1cm×1cm大小的皮肤组织，在实验组伤口上均匀的涂抹羟乙基壳聚糖溶液，每2天涂抹一次，每次0.2mL。2周后处死小鼠，取背部包含伤口区域的皮肤组织，福尔马林固定，包埋切片，HE染色观察(图4)。图4为比较例1的羟乙基壳聚糖溶液处理受伤小鼠后的组织切片图。

从图4可以看出，治疗2周后，实验组小鼠伤口没有复原。上述实验说明不含有纳米粒子的羟乙基壳聚糖溶液促进细胞增殖效果不明显。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种复合水凝胶，由多糖和纳米粒子在水性介质中交联而成，所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述多糖为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、葡聚糖和透明质酸中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的复合水凝胶，其特征在于，所述纳米粒子的质量浓度为2～40wt％。

4.根据权利要求3所述的复合水凝胶，其特征在于，所述纳米粒子表面带有修饰基团，所述修饰基团为羟基、羧基、醚基、酮基、氨基、酰胺基、吡啶基、吲哚基、阳离子或阳离子基团。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的复合水凝胶，其特征在于，所述纳米粒子的直径为5～500纳米。

6.根据权利要求1～4任意一项所述的复合水凝胶，其特征在于，所述多糖的分子量为5～5000kDa。

7.根据权利要求6所述的复合水凝胶，其特征在于，所述多糖的浓度为5～200mg/mL。

8.一种复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将纳米粒子和多糖在水性介质中混合搅拌，得到复合水凝胶；

所述纳米粒子为纳米二氧化硅、纳米羟基磷灰石、包含纳米二氧化硅的粒子或包含纳米羟基磷灰石的粒子。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述混合搅拌前，还包括：将纳米粒子进行表面修饰。

10.权利要求1～7任意一项所述的复合水凝胶以及权利要求8～9任意一项所述制备方法制备的复合物水凝胶在外用制剂材料或化妆材料中的应用。