CN107001346A - 1‑氧代‑1,2‑二氢异喹啉‑7‑基‑(5‑取代的噻吩‑2‑基)磺酰胺化合物、含有那些化合物的制剂以及它们作为aicarft抑制剂在治疗癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

1‑氧代‑1,2‑二氢异喹啉‑7‑基‑(5‑取代的噻吩‑2‑基)‑磺酰胺化合物、含有那些化合物的制剂和它们作为AICARFT抑制剂的用途。

Description

1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基-(5-取代的噻吩-2-基)磺酰胺 化合物、含有那些化合物的制剂以及它们作为AICARFT抑制剂 在治疗癌症中的用途
哺乳动物的叶酸代谢循环对于一个碳单位生物分子的转移是复杂但重要的过程。叶酸不能合成，但可通过食物获得。食物中的叶酸是循环的基本分子四氢叶酸(四氢叶酸盐，THFA)的起始原料。叶酸代谢的一个功能是通过形成核酸结构单元来支持DNA合成和修复。这种代谢过程包括：通过胸苷酸合酶加入甲基，由脱氧尿苷一磷酸(dUMP)从头合成脱氧胸苷一磷酸(dTMP)，随后磷酸化为三磷酸脱氧核苷酸。嘌呤核苷酸的从头生物合成从糖5-磷酸核糖基-1-焦磷酸(PRPP)开始。通过一系列反应，还包括四氢叶酸，这种途径得到肌苷5'-单磷酸(IMP)。随后，IMP可以转变为腺苷一磷酸(AMP)或鸟苷一磷酸(GMP)。
在IMP嘌呤的从头合成途径中，一个步骤是通过酶5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸转甲酰酶(AICARFT)来催化。通过N10-甲酰基-四氢叶酸(10-甲酰四氢叶酸；10-CHO-THFA)，AICARFT催化5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖基-5'-单磷酸(ZMP)成为5-甲酰氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(FAICAR)。嘌呤核苷酸的功能包括增殖和自我更新。由于嘌呤核苷酸在RNA和DNA的合成以及后续的正常和恶性细胞的细胞分裂和增殖中的重要性，所以，嘌呤生物合成路径长期以来被认为是抗癌药物研发的具有吸引力的靶标。
与正常分裂的细胞相比，干扰叶酸代谢对于快速分裂的细胞具有更大的毒性作用。由于细胞复制和存活需要叶酸代谢，所以，代谢抑制剂化合物已被用作抗肿瘤治疗，尽管它们具有毒性，应用也受到限制。氨蝶呤、氨甲蝶呤、雷替曲塞(ralitrexed)(在美国无法获得)、普拉曲沙(pralatrexate)和培美曲唑(Pemetrexed)是叶酸类似物(抗叶酸物)的实例。化学治疗剂5-氟尿嘧啶，虽然不认为它是叶酸类似物，但也是作为叶酸代谢抑制剂的抗肿瘤治疗剂。
虽然不考虑它们的原始作用机理，但据报道，氨甲蝶呤和培美曲唑(Pemetrexed)都显示出AICARFT抑制活性。进一步的，据报道，WO 2000/13688提供了用作AICARFT抑制剂的化合物。然而，迄今为止，还没有出现商品化的AICARFT抑制剂化学治疗剂。
还需要发现在叶酸代谢途径中相对于其它酶主要具有AICARFT抑制活性的化合物。进一步需要发现通常可以有助于IMP途径信号抑制活性的化合物，尤其有助于AICARFT抑制活性。
本发明的一个方面是式I的AICARFT抑制剂化合物∶
其中∶
R1选自∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；或X1和X2中的一个选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2或吗啉-4-基，另一个是氢；
其中，每个n独立地选自0、1或2；
Y1、Y2和Y3独立地选自氢、-OH、氟、-NH2或-CF3；条件是，它们不全都是氢；和
条件是，所有的n不能同时是0；进一步的条件是，只有一个n可以是2；且当一个n是2时，Y1、Y2和Y3中的每一个独立地选自氟、-OH或-CF3；
其中，Q1和Q2独立地选自氢、-CH3或-CH2CH3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；
R2是氢或氟；
或其可药用盐。
本发明的进一步的方面提供了式I的化合物，其中∶
R1选自∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；或X1和X2中的一个选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2或吗啉-4-基，另一个是氢；
其中，每个n独立地选自0、1或2；
Y1、Y2和Y3独立地选自氢、-OH、氟、-NH2或-CF3；条件是，它们不全都是氢；
条件是，所有的n不能同时是0；进一步的条件是，只有一个n可以是2；当一个n是2时，Y1、Y2和Y3中的每一个独立地选自氟、-OH或-CF3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；或
R2是氢或氟；
或其可药用盐。
本发明的另一个方面提供了式I的化合物，其中∶
R1选自∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；或
R2是氟；
或其可药用盐。
本发明的另一个方面是下列化合物∶
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3S)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-[(3S,4R)-3-氟-4-羟基-吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-(3,3-二氟-(4R)-4-羟基-吡咯烷-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4-二氢哒嗪-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；或
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(1R,3R)-3-羟基环戊基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐。
本发明的另一个方面是下列化合物∶
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐。
本发明的进一步方面是含有式I的化合物或其可药用盐以及可药用载体的药物组合物。
本发明的另一个方面提供了治疗患者癌症的方法，其中，癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病(CML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的式I的化合物，或其可药用盐。
本发明的另一个方面提供了治疗患者癌症的方法，其中，癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、慢性粒细胞性白血病(CML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的式I的化合物，或其可药用盐。
本发明的更进一步的方面提供了用于治疗的式I的化合物或其可药用盐。
本发明的另一个方面提供了用于治疗癌症的式I的化合物，或其可药用盐，其中，癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)。
本发明的另一个方面提供了用于治疗癌症的式I的化合物，或其可药用盐，其中，癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、慢性粒细胞性白血病(CML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)。
本发明的进一步的方面提供了用于制备治疗癌症的药物的式I化合物，或其可药用盐，其中，癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)。
本发明的进一步的方面提供了式I化合物或其可药用盐用于制备治疗癌症的药物的用途，其中，所述癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、慢性粒细胞性白血病(CML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)。
术语“患者”是指哺乳动物，“哺乳动物”包括但不局限于：人和陪伴动物，包括家猫(Felis catus)、家犬(Canis lupus familiaris)和驯养的马(Equus ferus caballus)。
“治疗有效量”是指抑制癌症患者的AICARFT以及破坏靶向癌细胞或减缓或抑制患者癌症发展所必需的式I化合物或其可药用盐的剂量，或含有式I化合物或其可药用盐的药物组合物的剂量。式I的化合物或其可药用盐的预测剂量在100至800 mg/患者/天的范围内。预测的优选剂量在150至600 mg/患者/天的范围内。预测的最优选剂量在225至500 mg/患者/天的范围内。考虑到疾病的阶段和严重程度以及个体患者的具体需要和响应，治疗患者所要求的确切剂量以及治疗时间的长度由医生确定。虽然基于每天来表示剂量，但为了给患者提供更优化的治疗益处并且控制或改善患者的任何不良反应，可以调节剂量方案。
术语“治疗”意指包括癌症的全部干预系列，通过治疗，例如，给予患者活性化合物，从而减轻、减缓或逆转一或多种症状，并且延迟癌症的发展，尽管不会实际上根除癌症。所治疗的患者是哺乳动物，尤其是人。
优选，使用可药用载体，将式I的化合物或其可药用盐配制为药物组合物，并且通过各种途径给药。优选，口服给予这样的组合物。这样的药物组合物和制备它们的方法在本领域为大家所熟知。参见，例如，REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(A.Gennaro等人，eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995)。在一个具体实施方案中，所述药物组合物包含N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺或其可药用盐，和可药用载体，以及任选的其它治疗组分，尤其通常地用于治疗癌症或具体癌症类型的治疗组分。
本发明的化合物，例如，实施例1，名称为∶N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺(IUPAC)；也可以称为∶2-噻吩磺酰胺，N-(6-氟-1,2-二氢-1-氧代-7-异喹啉基)-5-[(3R)-3-羟基-1-吡咯烷基]-(CAS)；和其它名称可以用于清楚地确定本发明的化合物。
本领域普通技术人员可以理解，式I的化合物，尤其是R1基团和R1基团上的取代基在吡咯烷-1-基的3位和可能的4位、可能在哌啶-1-基的3、4和5位、在环戊基的3和可能的4位、在6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基的可能的5位、在环戊-1-烯-1-基的4位和在环己-1-烯-1-基的4位是手性中心，或可以产生手性中心，得到两个或更多个立体异构体的外消旋混合物。本文使用的实体键合线，不同于与取代基键合的楔形或阴影线，除非进一步的具体到已知的程度，否则，其包括未确定构型的单一立体异构体和外消旋混合物，包括命名的化合物。具体立体异构体可以使用对映体纯的或富集的起始原料，通过立体有择合成来制备。任何起始原料、中间体或最终产物的具体立体异构体，可以利用本领域众所周知的技术来拆分，例如，下列文献所描述的技术：Stereochemistry of Organic Compounds, E. I.Eliel和S. H. Wilen(Wiley 1994)和Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J.,Jacques, A. Collet, 和S. H. Wilen(Wiley 1991)，包括手性固定相层析、酶拆分或分级结晶，或为此目的所形成的非对映异构体(例如，非对映体的盐)的层析。如果将手性化合物分离或拆分为它的异构体，但没有确定绝对构型或旋光度，则对应于手性色谱的每个洗脱物的顺序，将所述异构体任意指定为异构体1和异构体2，如果在合成的初期进行手性色谱，则相同名称用于随后的中间体和实施例。
本领域普通技术人员能够认识到，式I的化合物可以处于互变平衡之中。为了说明性的目的，所述平衡如下所示∶
为方便起见，式I描述了4-氧代形式，并且在该说明书中，使用对应名称。然而，这种描述包括对应的互变异构的羟基形式。
在本发明化合物的合成过程中，作为最初的起始原料所使用的化合物为大家所熟知，在购买不到的情况下，使用所提供的具体参考文献、通过本领域普通技术人员通常使用的标准方法，或通过在一般参考文献中得到的方法容易地合成。
已知的过程和方法的实例包括一般参考文献所描述的那些过程和方法，例如，Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendiumof Organic Synthetic Methods, 1-10卷（Volumes 1-10）, 1974-2002, WileyInterscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, andStructure, 第5版（5th Edition）, Michael B. Smith and Jerry March, WileyInterscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 第4版（4th Edition）, Part B,Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, KluwerAcademic/Plenum Publishers, 2000，等等，以及其中引用的参考文献。
另外，下面反应路线所描述的某些中间体可以包含一个或多个保护基。可变的保护基在每次出现时可以相同或不同，这取决于具体反应条件和所进行的具体转化。技术人员熟知保护和脱保护条件，并且在文献中进行了描述(参见，例如，“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and TheodoraW. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。
式I的化合物或其可药用盐，可以用本领域已知的各种方法制备，在下面的制备例和实施例中，举例说明了其中一些方法。所描述的每个途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或与不同方法的步骤结合，制备式I的化合物或其盐。可以使用本领域众所周知的常规方法，回收每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨和结晶。另外，除非另作说明，否则，所有的取代基如以前所定义。
本文使用的“ACN”是指乙腈；“AICAr”是指5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃核糖基；“ATIC”是指5-氨基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷酸转甲酰酶/次黄嘌呤核苷5'-单磷酸环化脱水酶(cyclohydralase)；“BSA”是指牛血清白蛋白；“Bu”是指丁基；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指二异丙基乙胺；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“DMEM”是指Dulbecco's改进的Eagle's培养基；“DMF-DMA”是指1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“DTT”是指二硫苏糖醇；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ee”是指对映体过量；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Ex”是指实施例；“F12”是指Ham's F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“HEPES”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“HOAc”是指乙酸；“HPBCD”是指羟丙基β-环糊精；“IC50”是指试剂可能产生的最大抑制响应的50%响应时的浓度； “IMP”是指次黄嘌呤核苷5'-单磷酸；“IPA”是指异丙醇；“min”是指分钟；“IPTG”是指异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“MeOH”是指甲醇；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“Ni-NTA”是指镍-氮川三乙酸；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“Prep”是指制备；“psi”是指磅/平方英寸；“QD”是指一天一次剂量；“RPMI”是指RoswellPark Memorial Institute；“Rt”是指保留时间；“SCX”是指强阳离子交换层析；“SFC”是指超临界流体色谱；“SEM”是指平均值的标准误差；“TFA”是指三氟乙酸；“THF”是指四氢呋喃。
下列制备例和实施例进一步说明本发明。
R2如上面式I所述。如反应路线1所说明，异喹啉-1-酮的合成从苯乙胺或3-氟苯乙胺的Friedal-Crafts环化开始，使用三光气，并在搅拌下逐滴加入有机碱，例如，三乙胺，而后加入路易斯酸，例如，三氯化铝，得到步骤1的产物。在步骤2中，在本领域众所周知的条件下，使用无机酸，例如，硫酸，并分批加入硝酸钾，在7位进行硝化。步骤3包括：在二氯乙烷中，加热至大约120℃，使用大量过剩的二氧化锰(大约18当量)进行氧化，得到6-取代的或未取代的-7-硝基-1,2-二氢异喹啉-1-酮。随后在本领域技术人员已知的多种条件下，可以进行硝基的还原。例如，在极性非质子溶剂中，例如，MeOH，在大约50 psi压力和大约60℃下，进行钯介导的氢化，得到6-取代的或未取代的-7-氨基-1,2-二氢异喹啉-1-酮(步骤3)。
在另一个制备中(反应路线1，步骤4)，在极性非质子溶剂中，例如，丙酮，并且加热至大约90-100℃，使DMF-DMA与2-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯反应，得到步骤4的产物2-[2-二甲基氨基)乙烯基]-5-硝基-苯甲酸甲酯。在步骤5中，在非极性溶剂中，例如，甲苯，使用2,4-二甲氧基苄胺，同时加热至大约90-100℃，将该中间体环化，得到7-氨基-(6-取代的或未取代的-2-(2,4-二甲氧基苄基)异喹啉-1(2H)-酮。可以按照上面步骤3描述的方法，使硝基还原，或者，在大约1:1的MeOH和水的溶液(含有氯化铵)中，加入锌粉，并加热至大约40-80℃，提供7-氨基-2-(2,4-二甲氧基苄基)-(6-氟或未取代的)-异喹啉-1-酮。如步骤6所示，或在合成的随后的步骤中，使用本领域众所周知的条件，例如，使用TFA或HBr/水，同时加热至大约80-95℃，可以除去2,4-二甲氧基苄基保护基。
反应路线2说明了5-取代的噻吩-2-磺酰氯的制备以及与保护或未保护的异喹啉-1(2H)-酮的偶合方法，当R1如式I所定义时，得到式I的磺酰胺化合物。根据产生必要的中间体磺酰氯的需要，可以在极性非质子溶剂中，例如THF，在-78℃，用丁基锂处理2-取代的5-溴噻吩，而后用二氧化硫和磺酰氯处理(步骤1)。在溶剂(例如，DCM)和有机碱(例如，吡啶)中，可以将该中间体加入到7-氨基-2H-异喹啉-1-酮中，由步骤2得到式I的化合物。如果使用保护的异喹啉-1(2H)-酮，则可以用酸(例如，TFA)除去保护基。其它备选方案包括：由2-取代的噻吩与氯磺酸或氯磺酸和五氯化磷制备步骤1的产物(步骤4)，以及由保护的5-硫基-2-取代的噻吩与1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲制备(步骤3)。
在另一个制备中，如反应路线3所示，5-卤素-取代的噻吩-2-磺酰氯与保护或未保护的异喹啉-1(2H)-酮偶合，提供有用的磺酰胺中间体。这是在有机碱(例如，吡啶)的存在下，在有或者没有溶剂(例如，DCM)的条件下，在0℃至室温下，通过胺与5-卤代-噻吩-2-磺酰氯的反应来进行，得到步骤1的磺酰胺中间产物。步骤1的中间产物还表示为除去任选的保护基，例如，用TFA除去。在Suzuki-Miyaura交叉偶合条件下，使用合适的硼酸，可以将步骤1的中间产物进一步烷基化。技术人员能够了解，有可用于促进这种交叉偶合反应的种种条件。相应地，合适的钯试剂包括：双(三苯基膦)氯化钯(II)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)与三环己基膦、(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)、四三苯基膦钯或醋酸钯(II)。合适的碱包括碳酸铯、碳酸钠、碳酸钾或磷酸三钾一水合物。可以在非极性溶剂中，例如，二噁烷，将该反应加热到大约100-150℃的温度下。
或者，可以在极性非质子溶剂中，例如，DMSO，使用溴化亚铜(I)、有机碱、羟脯氨酸、合适的胺和无机碱(例如，碳酸铯或碳酸钾)，并加热至大约100℃，完成铜介导的步骤1的5-溴-噻吩产物的胺化，在步骤2中得到式I的化合物。使用有机碱(例如，吡啶和/或DIPEA)、合适的胺，并且加热至大约100℃，通过在步骤1的中间体上进行SnAr反应，可以完成进一步的偶合实例，其中，Hal是氟，得到式I的化合物。在两种情况下，当W是PG时，用酸(例如，TFA)除去保护基。
在任选的步骤中，在合适的溶剂中，在标准条件下，式I的化合物与合适的可药用碱反应，可以形成式I化合物的可药用盐。这种盐的形成在本领域为大家所熟知和了解。参见，例如，P. Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTIONAND USE,(VCHA/Wiley-VCH, 2002); Gould, P.L., “Salt selection for basicdrugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217(1986); Bastin,R.J.,等人， “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical NewChemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435(2000); 以及Berge, S.M.,等人， “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19,(1977)。本领域普通技术人员可以理解，式I的化合物容易转变为和可被分离为可药用盐，例如，钠、钾、钙或镁盐。
制备例和实施例
下列制备例和实施例进一步说明本发明。
制备例1
2-[(E)-2-(二甲基氨基)乙烯基]-5-硝基-苯甲酸甲酯
将2-甲基-5-硝基-苯甲酸甲酯(1.79 kg，9.17 mol)加入到丙酮(16升)中。加入DMF-DMA(1.83 kg，15.4 mol)。将得到的混合物在95-100℃下搅拌16小时。冷却到20-25℃，并在搅拌下，将该混合物倾倒入水(48升)中，形成浆液。滤出固体，并用水洗涤滤饼。用水(2×16升)使该固体匀浆，并滤出固体。将固体在空气中干燥两天，得到粗品标题化合物的红色固体(2.42 kg，105%)。1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 8.72(1H, d, J=2.4 Hz), 8.06(1H, dd,J=9.2, 2.8 Hz), 7.46(1H, d, J=8.8 Hz), 7.21(1H, d, J=13.6 Hz), 6.42(1H, d, J=13.2 Hz), 3.92(3H, s), 3.02(6H, s)。
制备例2
2-(2,4-二甲氧基苄基)-7-硝基异喹啉-1(2H)-酮
加入2-[(E)-2-(二甲基氨基)乙烯基]-5-硝基-苯甲酸甲酯(2.4 kg粗品，9.65 mol)、2,4-二甲氧基苄胺(2.14 kg，12.8 mol)和甲苯(30升)。将该混合物加热到95-100℃，并在此温度下搅拌16小时。冷却到20-25℃，并过滤收集沉淀的固体。将黄色固体在空气中干燥两天，得到粗品(2.17 kg，66%)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/z): 341.1(M+H)。
制备例3
7-氨基-2-(2,4-二甲氧基苄基)异喹啉-1(2H)-酮
加入MeOH(10升)、水(10升)和氯化铵(1.56 kg，29.2 mol)。加入2-(2,4-二甲氧基苄基)-7-硝基异喹啉-1(2H)-酮(2 kg，5.84 mol)。将得到的混合物加热到40℃。然后，在40℃，向该混合物中加入锌粉(1.53 kg，23.37 mol)。取消加热。使内部温度慢慢地升到70℃。将该反应加热到80℃，并在此温度下搅拌16小时。将该反应混合物冷却到15-20℃。将该混合物过滤，并用EtOAc(1升×2)洗涤滤饼。向滤液中加入水(15升)，并用EtOAc(5升×3)提取。用Na2SO4干燥合并的有机提取物，过滤，并浓缩至干。用MTBE/MeOH处理所得到的残余物，得到标题化合物(942 g，53%)。ES/MS(m/z): 311.1(M+H)。
制备例4
7-氨基异喹啉-1(2H)-酮
一起加入7-氨基-2-(2,4-二甲氧基苄基)异喹啉-1(2H)-酮(849 g，2.74 mol)和TFA(5升)，形成褐色混合物。将该混合物加热到80-85℃，并在此温度下搅拌2小时。固体逐渐地溶解，并且该混合物变成暗紫色。将该反应混合物冷却至20-25℃。减压除去大部分TFA。加入MeOH(5升)，并在40-50℃下搅拌30分钟。过滤该混合物，并将滤液浓缩至干。将残余物溶解在EtOAc(5升)和水(5升)中。用EtOAc(5升)提取水相。将水相加热至55-60℃，并加入活性炭(90 g)。将该混合物在此温度下搅拌1小时。通过硅藻土过滤该混合物，并用水冲洗。将滤液自然地冷却至35℃，并在35-40℃，用固体Na2CO3(153 g)中和至pH=7-8。将该混合物冷却到5-10℃，并搅拌16小时。过滤收集沉淀的固体，用冷水和MTBE洗涤，露天干燥，得到标题化合物(260 g，59%)。ES/MS(m/z): 161.1(M+H)。
另一个制备例4
将7-氨基-2-(2,4-二甲氧基苄基)异喹啉-1(2H)-酮(2.1 kg，3.72 mol)加入到HBr溶液(21升，40%，在水中)中。将得到的混合物加热到95℃，并在此温度下搅拌18小时。将该反应冷却到20-25℃。过滤反应物，除去不溶性物质。用CHCl3/IPA(10/1，2×11升)提取滤液。分离有机相。将固体沉淀的水悬浮液过滤。将滤饼加入到CHCl3/IPA(10/1，11升)和HBr溶液(1升，40%，在水中)中。在80℃下搅拌该混合物2小时。过滤该混合物，得到粗品固体。将粗品固体加入到水(1升)中，并用10M NaOH溶液将pH值调节到7-8。滤出固体，并在烘箱中、在40℃下干燥24小时，得到标题化合物的褐色固体(475 g，44%)。ES/MS(m/z): 161.1(M+H)。
制备例5
6-氟-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮
在冰浴中，将2-(3-氟苯基)乙胺(1 kg，7.18 mol)的DCM(2升)溶液加入到三光气(852.4 g，2.87 mol)的DCM(5升)溶液中。然后，逐滴加入三乙胺(2升，14.36 mol)。将得到的溶液搅拌2小时，通过硅藻土过滤，并用DCM洗涤。在0℃，将滤液加入到AlCl3(3.82 kg，28.72 mol)的DCM(6升)悬浮液中。将得到的溶液升温至室温，并搅拌18小时。加入水，而后加入10% HCl，淬灭该反应。通过相分离来收集有机层，并用DCM提取水层。用饱和碳酸氢钠溶液和盐水溶液洗涤合并的DCM层，用Na2SO4干燥，真空浓缩，在硅胶上纯化，用石油醚/EtOAc=2:1洗脱，得到标题化合物(474.73 g，40 %)。1H NMR(400 MHz CDCl3)δ 8.05-8.09(m, 1 H), 7.02-7.04(m, 1), 6.90-6.92(m, 1 H), 6.77(br,s, 1 H), 3.55-3.59(m, 2H), 2.97-3.00(t, 2 H)。
制备例6
6-氟-7-硝基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮
将6-氟-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(1 kg，6.06 mol)的H2SO4(10升)溶液冷却到0℃，并分为几份加入KNO3(643 g，6.36 mol)。将得到的混合物在冰浴中搅拌2小时。将该混合物倾倒在冰-水中，并滤出固体。用水洗涤固体，在50℃下真空干燥过夜，得到标题化合物(1.18 kg，93%)。1H NMR(400 MHz DMSO)δ 8.43-8.45(d, 1 H), 8.26(br, s, 1 H),7.59-7.62(d, 1 H), 3.39-3.43(m, 2 H), 3.01-3.04(m, 2 H)。
制备例7
6-氟-7-硝基异喹啉-1(2H)-酮
将MnO2(4.136 kg，47.60 mol)加入到6-氟-7-硝基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(1 kg，4.76 mol)的二氯乙烷(10升)溶液中，并将该混合物加热到120℃，保持5小时。加入MnO2(2.068 kg，23.8 mol)，并搅拌该混合物过夜。进一步加入MnO2(1.241 kg，14.28 mol)，并搅拌该反应过夜。将该混合物冷却到大约80℃，用硅藻土过滤，并用DMSO(5×)冲洗。浓缩滤液，除去二氯乙烷，并将DMSO溶液倾倒入水中。滤出沉淀的黄色固体，用水洗涤，干燥，获得标题化合物(446 g，45%)。1H NMR(400 MHz MeOD)δ 8.98-9.00(d, 1 H), 7.62-7.65(d, 1H), 7.38-7.40(d, 1 H), 6.68-6.70(d, 1 H)。
制备例8
7-氨基-6-氟异喹啉-1(2H)-酮
向容器中加入小心湿润的10%钯/碳(20 g，0.18 mol)/MeOH(1.5升)和6-氟-7-硝基异喹啉-1(2H)-酮(100 g，0.48 mol)的混合物。将容器密封，并用H2吹扫三次。将得到的混合物在50 psi的H2中、在60℃下搅拌2.5小时。过滤该混合物，用MeOH反复冲洗，并浓缩至干。将残余物悬浮在MTBE中，过滤，用MTBE冲洗，并干燥，得到标题化合物(81.2 g，95%)的褐色固体。1H NMR(400 MHz, DMSO): δ 10.88(br, s, 1 H), 7.49-7.51(d, 1 H), 7.25-7.29(d, 1 H), 6.85-6.88(m, 1 H), 6.32-6.34(d, 1 H), 5.52(br, s, 2 H)。
制备例9
5-溴-N-[2-(2,4-二甲氧基苄基)-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基]噻吩-2-磺酰胺
在0℃，将吡啶(78.2 mL，966 mmol)和5-溴噻吩-2-磺酰氯(69.53 g，266 mmol)加入到7-氨基-2-(2,4-二甲氧基苄基)异喹啉-1(2H)-酮(75 g，241.6 mmol)的DCM(750 mL)溶液中。将得到的溶液在室温下搅拌2小时。加入水(500 mL)以沉淀出黑色固体。过滤该混合物，用水(3×300 mL)和MTBE洗涤固体，真空干燥，得到标题化合物(91 g，70%)。ES/MS(m/z)( 79Br/81Br)535/537[M+H]+。
制备例10
5-溴-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将5-溴-N-[2-(2,4-二甲氧基苄基)-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基]噻吩-2-磺酰胺(50 g，93.38 mmol)的TFA(100 mL)溶液加热到80℃，保持3小时。使其温热至室温。将残余物溶解在THF(60 mL)中，并小心地加入氨(60 mL)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。滤出悬浮液中的固体，用EtOAc洗涤，干燥，收集。用饱和NaHCO3水溶液洗涤滤液，并分离两个相。用CHCl3/IPA的9:1混合物(4×250 mL)提取水相，合并有机提取物，干燥，并蒸干。在9:1的MTBE/IPA混合物中研磨残余物，直到出现浅棕色固体沉淀为止。滤出固体，用MTBE洗涤，干燥，收集固体。浓缩滤液，并用硅胶柱(1:1的ACN/CH2Cl2)纯化，获得额外的产物。将三批固体在1:1的ACN/CH2Cl2的混合物中研磨。滤出合并的固体，用IPA洗涤，干燥，收集固体，得到标题化合物(24.5 g，68%)。ES/MS(m/z)( 79Br/81Br)385/387[M+H]+。
另一个制备例10
将7-氨基异喹啉-1(2H)-酮(15.1 g，94.27 mmol)、5-溴噻吩-2-磺酰氯(26.2 g，97.10mmol)和吡啶(45.7 mL，565.63 mmol)加入到DCM(500 mL)中。在氮气氛围中，将得到的混合物在室温下搅拌30分钟。用水稀释该混合物，并用5N HCl酸化至pH大约为4。搅拌10分钟。滤出所得到的沉淀，用水、乙醚冲洗，并将固体干燥。将沉淀悬浮在MeOH中，并加入NH3/EtOH，使它溶解。将该溶液与活性炭一起搅拌，用硅藻土过滤，并蒸发滤液。将获得的固体悬浮在丙酮中，过滤，干燥固体，得到标题化合物(24 g，66%)的浅黄色固体。ES/MS(m/z)( 79Br/81Br)385/387[M+H]+。
制备例11
5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将5-溴噻吩磺酰氯(54.48 g，202.06 mmol)分为几部分加入到7-氨基-6-氟异喹啉-1(2H)-酮(30 g，168 mmol)的吡啶(210 mL)溶液中。在氮气氛围中，将得到的混合物在室温下搅拌2小时。用DCM(120 mL)和水(210 mL)稀释该混合物。用浓HCl酸化该混合物，直到pH大约为6为止。滤出沉淀的固体，用水(2×)、1N HCl、水(3×)和MTBE洗涤，干燥，收集固体，得到标题化合物(53.6 g，79%)。ES/MS(m/z)( 79Br/81Br)403/405[M+H]+。
基本上利用制备例11的方法，使用合适的磺酰氯，将反应冷却至0℃，用NaOH(1N)洗涤来进行后处理，用EtOAc提取，而后酸化，并按照制备例11进行后处理，制备下列化合物。
表1
制备例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
12 5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 343
制备例13
5-乙酰基-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基]噻吩-2-磺酰胺
将5-溴-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.5 g，1.3 mmol)在THF(20 mL)中溶解，并将得到的混合物在氮气氛围中，在干冰/丙酮浴中冷却。慢慢地加入丁基锂(1.6M，在己烷中，2.9 mL，4.64 mmol)，并在冷却下搅拌大约40分钟，由此形成悬浮液。然后，加入N-甲氧基-N-甲基-乙酰胺(0.17 g，1.64 mmol)/THF(2 mL，24.6 mmol)，并将该混合物升温至0℃。用冰/水淬灭该反应混合物，将pH值调节至大约5，并用EtOAc提取该混合物。将有机提取物合并，并减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0-10%MeOH-NH3/DCM洗脱，得到纯度50%的标题化合物(0.52 g，115%)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/z): 347(M-H)。
制备例14
外消旋的反式-3-羟基-4-甲氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯
将外消旋的反式-4-甲氧基吡咯烷-3-醇盐酸盐(1.02 g，6.64 mmol)与碳酸钠(1.5 g，14.15 mmol)和THF(20 mL，245.8 mmol)与水(20 mL，1.11 mmol)的混合物合并，并将该混合物在冰浴中冷却。加入氯甲酸苄基酯(1.3 mL，8.81 mmol)，并将该混合物在氮气氛围中搅拌，同时升温至室温。完成后，用水稀释该反应，并用EtOAc提取该含水混合物。将合并的提取物用Na2SO4干燥，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0-5%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(1.68 g，100%)的粘油。ES/MS(m/z): 252(M+H)。
制备例15
外消旋的顺式-3-羟基-4-甲氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯
将外消旋的顺式-3-甲氧基-4-(4-硝基苯甲酰基)氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯(1.80g，4.5 mmol)溶解在MeOH(10 mL，245.8 mmol)中，加入氨/MeOH(2M，50 mL，100 mmol)，并将该混合物在室温下搅拌6小时。减压浓缩该混合物，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0-10%的THF/DCM洗脱，得到标题化合物(0.945 g，84%)的粘油。ES/MS(m/z): 252(M+H)。
制备例16
顺式-4-甲氧基吡咯烷-3-醇
将外消旋的顺式-3-羟基-4-甲氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯(0.93 g，3.7 mmol)与钯黑(0.023 g，0.22 mmol)和5%钯/碳(0.105 g，0.099 mmol)的混合物在THF(20 mL)和MeOH(20mL)中合并，并在氢气(345 kPa)中、在室温下搅拌4小时。通过硅藻土过滤该反应混合物，并用乙醇洗涤。减压浓缩滤液，得到标题化合物(0.493 g，113%)的粘油。ES/MS(m/z): 118(M+H)。
制备例17
顺式[4-[(1-叔丁氧羰基-4-氟-吡咯烷-3-基]氧羰基苯基]氮酸酯（azinate， 氮酸酯）
将偶氮二甲酸二异丙基酯(9.66ml，48.7mmol)加入到冰浴(0℃)冷却的(3R,4R)-3-氟-4-羟基-吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(5.0 g，24.4 mmol)、4-硝基苯甲酸(8.14 g，48.7 mmol)和三苯基膦(12.8 g，48.7 mmol)的THF(100 mL)溶液中，并搅拌2小时。将该反应升温至室温，并搅拌18小时。加入饱和碳酸氢钠溶液，淬灭该反应，用EtOAc提取，并用硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，得到油。通过正相硅胶色谱纯化该油，用25%的EtOAc-己烷洗脱，得到含有杂质夹带物的白色固体(10.7克，124%)。LC/MS m/e 299[M+1]+-叔丁基。虽然以手性反应物开始，但通过这个过程或随后使用制备例17的化合物的制备例或实施例没有保持手性纯度。
基本上利用制备例17的方法，使用外消旋的反式-3-羟基-4-甲氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯，制备下列化合物。
表2
制备例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
18 外消旋的顺式-3-甲氧基-4-(4-硝基苯甲酰基)氧基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯 401
制备例19
顺式3-氟-4-羟基-吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
将氢氧化钠(2N，6 0ml)加入到冰浴(0℃)冷却的[4-[(3S,4R)-1-叔丁氧羰基-4-氟-吡咯烷-3-基]氧基羰基苯基]氮酸酯(10.7克，30.2 mmol)的THF(50 mL)溶液中。在0℃搅拌2小时。减压浓缩，得到油。通过正相硅胶色谱纯化该油，用50%的MTBE-己烷洗脱(检测2，214nm)，得到澄清的油(2.72 g，43.9%)。1H NMR(399.81 MHz, d6-DMSO)δ 5.37(d, J=6.1Hz, 1H), 4.95-4.81(m, 1H), 4.20-4.18(m, 1H), 3.48-3.41(m, 3H), 2.99-2.91(m,1H), 1.35(d, J=1.2 Hz, 9H)。虽然以手性反应物开始，但通过这个过程或随后使用制备例19的化合物的制备例或实施例没有保持手性纯度。
制备例20
顺式内消旋的3,4-二羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
将N-甲基吗啉-N-氧化物(1.98克，14.2 mmol)加入到2,5-二氢吡咯-1-甲酸叔丁基酯(2.0克，11.8 mmol)、四氧化锇(0.04M，5.93 mL，0.47 mmol)的丙酮(50 mL)和水(10 mL)溶液中。在室温下搅拌18小时。减压浓缩该反应，并用EtOAc提取水相。减压浓缩有机提取物。通过正相色谱纯化该油，用己烷至80%(5% MeOH-THF)-20%己烷洗脱，得到标题化合物(0.51克，21.2%)。LC/MS m/e 202[M-H]-。
制备例21
3-(5-溴-2-噻吩基)环戊酮
将2.5M丁基锂(12.2 mL，17.7 mmol)加入到冷却(-78℃)的2,5-二溴噻吩(2 mL，97.3mmol)的THF溶液中，并在-70℃下保持该温度。将该反应升温至-60℃，而后冷却回到-78℃。加入固体溴化锌(4.98 g，22.12 mmol)。将该反应升温至-10℃，而后冷却到-78℃。逐滴加入2-环戊烯-1-酮(1.85 mL，22.12 mmol)，并在-78℃下搅拌5分钟；然后逐滴加入三甲基氯硅烷(2.93 mL，23.0 mmol)。将该反应升温至室温，并搅拌18小时。加入1N HCl(100 mL)，淬灭该反应，用EtOAc提取，并用硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，得到红色油。通过正相色谱纯化该油，用30%的THF-己烷洗脱，得到澄清的油(2.90克，11.82 mmol，66.8%)。1H NMR(399.81MHz, d6-DMSO)δ 7.04(d, J=3.7 Hz, 1H), 6.78(dd, J=1.0, 3.7 Hz, 1H), 3.62-3.59(m, 1H), 2.60-2.55(m, 1H), 2.35-2.32(m, 4H), 1.93-1.85(m, 1H)。
基本上利用制备例21的方法，使用(2-氧代环戊-3-烯-1-基)醋酸酯代替2-环戊烯-1-酮(制备例25)，制备下列化合物。
制备例编号 化学名称 结构 GC ES/MS(m/z)(M+1)
22 (2-氧代环戊-3-烯-1-基)醋酸酯 (79Br/81Br)302/304
制备例23
3-(5-溴-2-噻吩基)环戊醇
将硼氢化钠(0.254 g，6.73 mmol)加入到3-(5-溴-2-噻吩基)环戊酮(0.55 g，2.24mmol)的二噁烷(20 mL)悬浮液中。逐滴加入MeOH(2 mL)，并搅拌1小时。逐滴加入MeOH(大约20 mL)，淬灭反应。减压浓缩反应。通过正相硅胶色谱纯化，用35%的THF-己烷洗脱，得到澄清的油(0.325克，58.6%)。1H NMR(399.81 MHz, d6-DMSO)δ 6.98-6.96(m, 1H), 6.68(td,J=3.6, 0.8 Hz, 1H), 4.62(d, J=4.1 Hz, 0.7H), 4.55-4.54(m, 0.3H), 4.23-4.19(m,0.3H), 4.17-4.10(m, 0.7H), 3.47-3.43(m, 0.3H), 3.21-3.13(m, 0.7H), 2.32-2.27(m, 0.7H), 2.15-2.12(m, 0.3H), 1.99-1.93(m, 1.3H), 1.75-1.69(m, 3.9H)。
制备例24
2-(3-苄氧基环戊基)-5-溴-噻吩
将苄基溴(1.22 mL，10.2 mmol)和碘化钠(0.25 g，1.70 mmol)加入到3-(5-溴-2-噻吩基)环戊醇(2.1 g，8.5 mmol)的THF(100 mL)溶液中。将该反应冷却至0℃。5分钟之后，将氢化钠(60%，0.41克，10.2 mmol)加入到该反应中，并升温至室温。加入DMF，帮助溶解。加热到50℃，保持1小时，加入饱和氯化铵，淬灭反应，并用EtOAc提取，用硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，得到油。通过正相硅胶色谱纯化该油，用25%的THF-己烷洗脱，得到澄清的黄色油(1.3g，45.4%)。1H NMR(399.81 MHz, d6-DMSO)δ 7.33-7.28(m, 5H), 6.99-6.97(m, 1H),6.72-6.69(m, 1H), 4.41(d, J=2.6 Hz, 2H), 4.09-4.05(m, 1H), 3.45-3.37(m,0.3H), 3.25-3.18(m, 0.7H), 2.42-2.37(m, 0.7H), 2.20-1.78(m, 5.3H)。
制备例25
(2-氧代环戊-3-烯-1-基)醋酸酯
在密封容器中，将四乙酸铅(11.7 g，26.4 mmol)加入到2-环戊烯-1-酮(2 mL，23.9mmol)的苯(100 mL)溶液中。加热到80℃，保持72小时。冷却到室温，用硅胶垫过滤，并用DCM洗涤。减压浓缩，得到棕色油。通过硅胶色谱纯化该油，用己烷至25%的THF-己烷洗脱，得到澄清的油(1.42 g，42.3%)。1H NMR(399.80 MHz, CDCl3)δ 7.65(ddd, J=6.1, 3.0, 2.5Hz, 1H), 6.25(dt, J=6.1, 2.1 Hz, 1H), 5.11(dd, J=3.1, 6.9 Hz, 1H), 3.19-3.16(m, 1H), 2.63-2.57(m, 1H), 2.13(d, J=0.5 Hz, 3H)。
制备例26
[4-(5-溴-2-噻吩基)-2,2-二氟-环戊基]醋酸酯
将双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(2.6 mL，11.7 mmol)加入到[4-(5-溴-2-噻吩基)-2-氧代-环戊基]醋酸酯(1.18 g，3.89 mmol)的DCM(50 mL)溶液中。在室温下搅拌18小时。加入饱和碳酸氢钠溶液，淬灭该反应，搅拌15分钟，同时，反应放出气体，然后用DCM提取，并用硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，得到棕色油。通过硅胶色谱纯化该油，用20%的THF-己烷洗脱，得到澄清的油(0.77 g，60.8%)。GC/MS m/e( 79Br/81Br)324/326[M+H]+。
制备例27
2-(4-苄氧基-3,3-二氟-环戊基)-5-溴-噻吩
将碳酸钾(0.85 g，6.15 mmol)加入到[4-(5-溴-2-噻吩基)-2-氧代-环己基]醋酸酯(1.0 g，3.06 mmol)的MeOH(100 mL)溶液中，并在室温下搅拌大约12小时。除去溶剂，并将残余物真空干燥。将苄基溴(0.4 mL，3.4 mmol)加入到残余物的THF(100 mL)溶液中，并在室温下搅拌该反应18小时。用EtOAc稀释反应，加入饱和氯化铵溶液，淬灭该反应，用DCM反萃取水相，并将合并的有机提取物用硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，得到棕色油。通过硅胶色谱纯化该油，用20%的THF-己烷洗脱，得到澄清的油(1.0 g，87.1%)。GC/MS m/e( 79Br/81Br)372/374[M+H]+。
制备例28
5-(4-苄氧基-3,3-二氟-环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将2.5M丁基锂(2.5 mL，6.2 mmol)通过注射泵加入到冷却(-78℃)的2-(4-苄氧基-3,3-二氟-环戊基)5-溴噻吩(2.1 g，5.63 mmol)的THF(75 mL)溶液中，并保持至少-70℃的温度。在-78℃下搅拌1小时，并在-78℃下，通过小管加入新制备的饱和的二氧化硫的THF(50mL)溶液(在-78℃，通过吹扫管鼓入气体来制备)，并保持至少-70℃的温度。将该反应在-78℃下搅拌1小时，然后逐滴加入磺酰氯(1.4 mL，16.9 mmol)。将该反应升温至室温，并搅拌18小时。用2N HCl(100 mL)淬灭该反应，加入固体氯化钠以使溶液饱和，并用MTBE提取。用硫酸镁干燥有机提取物。过滤，减压浓缩，得到粘性棕色油，将其溶于DCM(50mL)中。通过滴液漏斗，将褐色溶液加入到0℃的7-氨基-6-氟异喹啉-1-(2H)-酮(1.0 g，5.63 mmol)的DCM(20 mL)和吡啶(50 mL)冷却溶液中。在室温下，搅拌该反应36小时。减压浓缩，得到油。通过硅胶色谱纯化该油，用90%(10%的MeOH-EtOAc)-10%己烷洗脱，得到橙色固体(1.49 g，49.5%)。MS(m/z): 535(M+H)。
制备例29
外消旋的-4,4-二氟哌啶-3-醇
对于外消旋的-4,4-二氟哌啶-3-醇的制备，参见Synlett 2009，No. 12，1933-1936，以及其中的参考文献。
制备例30
外消旋的反式-4-氟哌啶-3-醇盐酸盐
将HCl(57.0 mL，228 mmol；4M，在二噁烷中)加入到外消旋的反式-4-氟-3-羟基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯(5 g，22.8 mmol)的MeOH(50 mL)溶液中。在环境温度下搅拌16小时，并减压浓缩，得到标题化合物(3.7 g，100%)。1H NMR(400 MHz, d6-DMSO)δ 9.54-9.52(m, 2H),6.15-6.14(m, 1H), 4.66-4.52(m, 1H), 3.92-3.86(m, 1H), 3.15(d, J=12.0 Hz, 2H),2.97-2.82(m, 2H), 2.22-2.15(m, 1H), 1.94-1.85(m, 1H)。
制备例31
外消旋的顺式-4-氟-3-(4-硝基苯甲酰基)氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯
在0℃，将偶氮二甲酸二异丙基酯(8.66 mL，42.8 mmol)逐滴加入到外消旋的反式-4-氟-3-羟基-哌啶-1-甲酸酯(4.84 g，21.4 mmol)、4-硝基苯甲酸(7.3 g，42.8 mmol)和三苯基膦(11.3 g，42.8 mmol)的THF(150 mL)混合物中。搅拌该混合物，同时，逐渐地升温至环境温度，保持16小时。用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，并用EtOAc提取。合并有机提取物，用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用15-25%的丙酮/己烷洗脱，得到标题化合物(4.4 g，56%)。ES/MS(m/z): 391(M+23)。
制备例32
外消旋的顺式-4-氟-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯
将2N氢氧化锂水溶液(24 mL，48 mmol)加入到外消旋的顺式-4-氟-3-(4-硝基苯甲酰基)氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯(4.4 g，12 mmol)的THF(100 mL)溶液中。搅拌1小时，用水稀释，并用EtOAc提取。合并有机提取物，用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(2.78 g，100%)。ES/MS(m/z): 241(M+23)。
制备例33
外消旋的顺式-4-氟哌啶-3-醇盐酸盐
将HCl(31.7 mL，127 mmol；4N，在二噁烷中)加入到外消旋的顺式-4-氟-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯(2.78 g，12.7 mmol)的MeOH(100 mL)溶液中，并搅拌16小时。减压浓缩，得到残余物。用乙醚∶MeOH(10:1)研磨残余物，滤出沉淀，用乙醚冲洗，并干燥，得到标题化合物(1.6 g，81%)。1H NMR(400 MHz, d6-DMSO)δ 9.65-8.99(m, 2H), 6.17-6.15(m, 1H),4.88-4.74(m, 1H), 4.04-3.97(m, 1H), 3.08-2.96(m, 4H), 2.15-2.02(m, 2H)。
制备例34
3-羟基-4,4-二甲氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯
按照WO2009033581，制备3-羟基-4,4-二甲氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯。将氢氧化钾(7.040 g，125.47 mmol)溶解在MeOH(150 mL)中，并冷却到0℃。用N-叔丁氧羰基-4-哌啶酮(10 g，50.19 mmol)处理，并搅拌15分钟，而后逐滴加入碘(15.286 g，60.23 mmol)的MeOH(200 mL)溶液。在0℃下搅拌1小时，然后除去冷却浴，并搅拌1小时。真空浓缩。与甲苯混合，并过滤。浓缩至干，得到标题化合物(13.1 g(99%)的油，其不用进一步纯化，直接使用。
制备例35
3-苄氧基-4,4-二甲氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯
将氢化钠(612.222 mg，15.31 mmol)与THF(25 mL)混合，并冷却至0℃。加入3-羟基-4,4-二甲氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯(2 g，7.65 mmol)的THF(10 mL)溶液。在0℃下搅拌10分钟，而后加入苄基溴(2.618 g，15.31 mmol)。在环境温度下搅拌2小时。加入苄基三甲基碘化铵(0.2 g，0.72 mmol)，并继续搅拌16小时。倒入EtOAc(200 mL)和盐水(100 mL)的混合物中。分离各层，用MgSO4干燥有机层，并浓缩，得到3.5 g油。用硅胶色谱层析，用己烷和EtOAc(70/30)洗脱，得到标题化合物的油(2.52 g，93%)。1H NMR(CDCl3)δ 1.43(s, 9H),1.67-1.79(m, 1H), 1.8-1.97(m, 1H), 2.71-2.89(m, 1H), 2.9-3.09(m, 1H), 3.3(s,3H), 3.13(s, 3H), 3.38-3.49(m, 1H), 4.01-4.3(m, 2H), 4.37-45(m 1H), 4.85-4.73(m, 1H), 7.2-7.4(m, 5H)。
制备例36
3-苄氧基-4-氧代-哌啶-1-甲酸苄基酯
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将3-苄氧基-4,4-二甲氧基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯(14.56 g，41.43 mmol)与TFA(25mL)和水(0.1 mL)混合。在环境温度下搅拌50小时。浓缩，得到油。与水(25 mL)混合，并在环境温度下搅拌1小时。在最低加热下，真空浓缩，得到粘性的琥珀色油。用DCM(150 mL)稀释，并冷却至0℃。加入氯甲酸苄基酯(10.601 g，62.14 mmol)，而后逐滴加入DIPEA(16.064 g，124.29 mmol)。搅拌16小时，用1N HCl(3 × 100 mL)洗涤，并用MgSO4干燥。浓缩至干，用硅胶快速色谱纯化，用己烷和乙酸乙酯(70/30)洗脱，得到标题化合物的油(13.86 g，98%)。ES/MS(m/z): 357(M+H)。
制备例37
外消旋的3-苄氧基-4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄基酯，非对映异构体1
制备例38
外消旋的3-苄氧基-4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄基酯，非对映异构体2
在氮气氛围中将3-苄氧基-4-氧代-哌啶-1-甲酸苄基酯(2.6 g，7.66 mmol)与THF(30mL)混合并冷却至10℃。加入(三氟甲基)三甲硅烷(1.634 g，11.49 mmol)，而后逐滴加入1M四丁基氟化铵(13.835 g，15.32 mmol)/THF。在10℃下搅拌30分钟，然后除去冷却浴，并在环境温度下搅拌。1小时之后，加入1M四丁基氟化铵(4 mL)/THF，并搅拌10分钟。用盐水(50mL)淬灭该反应，并分离各层。用EtOAc(50 mL)提取水溶液，并与初始的THF层合并。用MgSO4干燥，并浓缩至干。用硅胶快速色谱纯化残余物，用己烷/EtOAc(70/30)洗脱，获得标题化合物的油。非对映异构体1(1 g，31%)，ES/MS(m/z): 410(M+H)。非对映异构体2(1 g，31%)，ES/MS(m/z): 410(M+H)。
制备例39
外消旋的4-(三氟甲基)哌啶-3,4-二醇，非对映异构体1
将3-苄氧基-4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄基酯(非对映异构体1，1.5 g，3.66mmol)、钯/碳10%(1 g)、MeOH(25 mL)和乙酸(10 mL)混合。在环境温度下搅拌，同时，将H2鼓入该混合物中16小时。过滤，并真空浓缩。与甲苯混合，再浓缩，得到油，回收0.85 g油膜。溶于MeOH中，洗脱到10 g SCX柱上，并用1个柱体积的MeOH洗涤。用2M NH3/MeOH洗脱产物。浓缩，得到标题化合物的固体(0.6 g，88%)。1H NMR(d6-DMSO)δ 1.36-1.48(m, 1H), 1.57-1.65(m, 1H), 1.8-1.97(m, 1H), 2.2(bs, 1H), 2.4-2.5(m, 1H), 2.52-2.7(m, 2H),3.5-3.6(m, 1H), 4.8(bs, 1H), 5.3(bs, 1H)。
基本上利用制备例39的方法，制备下列化合物。
表3
制备例编号 化学名称 结构 NMR
40 外消旋的4-(三氟甲基)哌啶-3,4-二醇，非对映异构体2 (d6-DMSO)δ 1.3-139(m, 1H), 1.75-1.89(m, 1H), 2.53-2.71(m, 3H), 2.85-2.93(m, 1H), 3.37(s, 1H), 3.15(s, 1H),4.8(bs, 1H), 5.8(bs, 1H)
制备例41
顺式内消旋的4,4-二氟-3,5-二羟基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯，异构体1
制备例42
外消旋的反式-4,4-二氟-3,5-二羟基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯，异构体2
在0℃，将碳酸铯(3.13 g，9.61 mmol)加入到冰冷却的环己烷-1,3-二酮(1.00 g，4.69mmol)的ACN(30 mL)溶液中，并搅拌。15分钟之后，加入1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮阳离子(diazonia，二氮阳离子)双环[2.2.2]辛烷双(四氟硼酸盐)(SelectfluorTM，3.99 g，11.26mmol)。30分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。2小时之后，过滤，并减压浓缩。将残余物溶解在EtOAc中，用1N盐酸水溶液提取，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物溶解在THF(50 mL)和乙醇(25 mL)的混合物中。在冰浴中冷却到0℃。加入硼氢化钠(887 mg，23.5 mmol)。30分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。1.5小时之后，用饱和氯化铵水溶液淬灭该反应。减压除去大部分溶剂。用EtOAc溶解残余物，用水和盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0-100%的EtOAc/己烷洗脱，得到异构体1和异构体2的3:1的混合物(0.43 g，36%)(异构体1的产率是27%，异构体2的产率是9%)。19F NMR(376 MHz, d4-CD3OD)δ-121.8(d,1F, J=240 Hz, 异构体1),-126.5(dd, 2F, J=570, 240 Hz, 异构体2),-142.0(d, 1F, J=240 Hz, 异构体1)。不用进一步纯化，直接使用。
制备例43
外消旋的反式3-氟-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯
制备例44
外消旋的顺式-3-氟-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯
在0℃，将硼氢化钠(1.20 g，31.7 mmol)加入到冰冷却的3-氟-4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁基酯(4.5 g，19.68 mmol)的MeOH(50 mL)溶液中。15分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。45分钟之后，用饱和氯化铵水溶液淬灭该反应。减压除去大部分溶剂。用EtOAc溶解残余物，用盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化残余物，用20-100% EtOAc/己烷洗脱，得到外消旋的反式-3-氟-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯(0.75 g，17%)：1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 4.34(ddd, 0.5H), 4.20(ddd, 0.5H), 4.06(br s, 1H), 3.86-3.76(m, 2H), 3.12(br s, 1H), 3.06(br s, 1H), 2.98(ddd, 1H),2.00-1.92(m, 1H), 1.56-1.46(m, 1H), 1.44(s, 9H)；和外消旋的顺式-3-氟-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯(2.55 g，59%)∶ 1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 4.66-4.57(m, 0.5H),4.55-4.45(m, 0.5H), 4.00-3.78(m, 2H), 3.70(br s, 1H), 3.32(br s, 1H), 3.10(brs, 1H), 2.85(s, 1H), 1.84-1.74(m, 1H), 1.71(br s, 1H), 1.44(s, 9H)。
制备例45
4-((叔丁氧羰基)氨基)-2,2-二氟-3-羟基丁酸乙酯
将铟(8.66 g，75.4 mmol)加入到2-溴-2,2-二氟醋酸乙酯(9.67 mL，75.4 mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁基酯(10.0 g，62.8 mmol)的THF(300 mL)溶液中。将该混合物在55℃下加热16小时，并冷却到环境温度。用饱和氯化铵水溶液淬灭该反应。减压除去大部分溶剂。将残余物溶解在EtOAc中，用1N HCl水溶液、水和盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。粗品(17.8 g，62.8 mmol)不用进一步纯化，直接使用∶1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ5.05(br s, 1H), 4.37(q, 2H), 4.25-4.08(m, 2H), 3.60-3.50(m, 1H), 3.48-3.33(m,1H), 1.46(s, 9H), 1.37(t, 3H)。
制备例46
4-((叔丁氧羰基)氧基)-3,3-二氟-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯
将4.0M HCl的二噁烷(100 mL)溶液加入到粗品4-((叔丁氧羰基)氨基)-2,2-二氟-3-羟基丁酸乙酯(17.8 g，62.8 mmol)中。2小时之后，减压除去所有溶剂。将残余物溶解在ACN(75 mL)中。加入三乙胺(75 mL)。17小时之后，加入DMAP(0.65 g，5.3 mmol)和二碳酸二叔丁基酯(30.2 mL，138 mmol)。2小时之后，减压除去溶剂。将水和盐水加入到残余物中。用1:1的己烷/EtOAc提取。合并有机提取物，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(6.50 g，31%)。1HNMR(400 MHz, CDCl3)δ 5.28-5.21(m, 1H), 4.05(dd, 1H), 3.88-3.80(m, 1H), 1.57(s, 9H), 1.53(s, 9H)。
制备例47
4,4-二氟吡咯烷-3-醇
将4.0M HCl的二噁烷(200 mL)溶液加入到4-((叔丁氧羰基)氧基)-3,3-二氟-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(6.00 g，17.8 mmol)中。8小时之后，减压除去溶剂。将残余物溶解在THF(150 mL)中，并将该反应混合物在冰浴中冷却到0℃。加入60 wt.%双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝的甲苯溶液(Red-AlTM，17.4 mL，88.9 mmol)。30分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。3小时之后，将该反应混合物在冰浴中冷却到0℃。用十水硫酸钠淬灭该反应。除去冷却浴，并在强烈搅拌下，将该反应混合物升温至环境温度。30分钟之后，滤出固体，用THF洗涤，并减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至10%的7M氨的MeOH/DCM溶液洗脱，得到标题化合物(1.80 g，82%)。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ 4.12-3.98(m,1H), 3.36-3.23(m, 1H), 3.22-3.02(m, 2H), 2.90-2.75(m, 1H)。
制备例48
2,2-二甲基-4-氧代-4-(2-噻吩基)丁酸
在0℃，将三氯化铝(3.12 g，23.4 mmol)加入到冰冷却的噻吩(7.77 mL，97.56 mmol)和3,3-二甲基四氢呋喃-2,5-二酮(2.50 g，19.5 mmol)的DCM(60 mL)溶液中。将该反应混合物慢慢地升温至环境温度。16小时之后，将该反应混合物在冰浴中冷却到0℃。用2N HCl水溶液淬灭。用DCM提取。合并所有的有机层，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到标题化合物(4.15 g，19.5 mmol)，其不用进一步纯化，直接使用。ES/MS(m/z):214(M+H)。
制备例49
5,5-二甲基-3-(2-噻吩基)-1,4-二氢哒嗪-6-酮
将肼(15 mL，468 mmol)加入到粗品2,2-二甲基-4-氧代-4-(2-噻吩基)丁酸(4.15 g，19.5 mmol)的IPA(60 mL)溶液中。将该混合物在110℃下加热17小时，并冷却到环境温度。减压除去溶剂，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至100%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(0.65 g，16%)。1H NMR(400 MHz, d6-DMSO)δ 10.8(s, 1H), 7.61(dd, 1H),7.46(dd, 1H), 7.11(dd, 1H), 2.86(s, 2H), 1.09(s, 6H)。
制备例49a
2-苄基硫基-5-溴-噻吩
在0℃，将N-溴代琥珀酰亚胺(232.6 g，1.30 mol)一次性加入到2-苄基硫基噻吩(321g，1.48 mol)的DCM(1.9升)溶液中。除去冷却浴，并在室温下搅拌30分钟。过滤该混合物，并用MTBE(2×50 mL)冲洗固体。真空浓缩滤液。使残余物在MTBE(1升)中成浆30分钟。滤出固体，并用MTBE(2×100 mL)冲洗。用冰/水(200 mL)和盐水(200 mL)洗涤滤液。干燥有机相(MgSO4)，过滤，并真空浓缩，得到标题化合物(390 g，99%)。1H-NMR(CDCl3)δ 7.3-7-2(3H,m), 7.2-7.1(2H, m), 6.86(1H, d, J=3.9 Hz), 6.67(1H, d, J=3.9 Hz), 3.92(2H,s)。
制备例49b
6-[5-(苄基硫基)噻吩-2-基]-4,4-二甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮
在室温下，将异丙基氯化镁(44 mL，88.3 mmol，2.0M，在THF中)逐滴加入到2-苄基硫基-5-溴-噻吩(22.9 g，80.3 mmol)的THF(230 mL)溶液中，并搅拌30分钟。在-78℃，将该溶液通过小管加入到2,2-二甲基琥珀酸酐(11.5 g，88.3 mmol)的THF(115 mL)溶液中。在-78℃下搅拌15分钟，并将该混合物逐渐地升温至室温。除去冷却浴，并在室温下搅拌30分钟。加入MTBE(200 mL)，并用1N HCl(100 mL)洗涤。将两个相分离，并用MTBE(2×50 mL)提取水溶液。干燥合并的有机提取物(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到褐色固体。将固体悬浮在4:1的己烷/MTBE混合物中，研磨，并滤出固体。用己烷洗涤灰色固体，干燥并收集得到中间体4-(5-苄基硫基-2-噻吩基)-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸(18.7 g，70%)。ES/MS(m/z): 335(M+H)。
将4-(5-苄基硫基-2-噻吩基)-2,2-二甲基-4-氧代-丁酸(18.7 g，55.9 mmol)溶解在2-丙醇(187 mL)中，并加入肼一水合物(4.15 mL，83.9 mmol)。在80℃下搅拌该混合物过夜。将该混合物升温至室温，并蒸发溶剂至干。将黄色残余物悬浮在MTBE中。滤出亮黄色固体，用MTBE洗涤，干燥，得到标题化合物(16 g，87%)。ES/MS(m/z): 331(M+H)。
制备例50
N-烯丙基-2,2-二甲基-戊-4-烯酰胺
将DIPEA(4.08 mL，23.4 mmol)加入到2,2-二甲基戊-4-烯酸(2.00 g，15.6 mmol)、丙-2-烯-1-胺(1.76 mL，23.4 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(4.49g，23.4 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(12%水，3.16 g，23.4 mmol)的DCM(150 mL)溶液中。5小时之后，加入EtOAc。用1N HCl水溶液和盐水提取。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(2.20g，90%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 5.90-5.67(m, 3H), 5.20-5.01(m, 4H), 3.88(t,2H), 2.29(d, 2H), 1.19(s, 6H)。
制备例51
3,3-二甲基-1,4-二氢吡啶-2-酮
将(1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(Grubbs催化剂，第二代，0.51 g，0.60 mmol)加入到N-烯丙基-2,2-二甲基-戊-4-烯酰胺(2.00 g，12.0 mmol)的甲苯(50 mL)溶液中。用氮气吹扫10分钟，使该反应混合物脱气。将该混合物在105℃下加热5小时，并冷却到环境温度。减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(1.05 g，70%)。ES/MS(m/z):126(M+H)。
制备例52
3,3-二甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯
将DMAP(0.10 g，0.84 mmol)和二碳酸二叔丁基酯(3.85 mL，16.8 mmol)加入到3,3-二甲基-1,4-二氢吡啶-2-酮(1.05 g，8.39 mmol)的ACN(40 mL)溶液中。1小时之后，减压除去溶剂，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至25%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(1.80 g，95%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 6.78-6.70(m, 1H), 5.18-5.09(m, 1H),2.20-2.15(m, 2H), 1.53(s, 9H), 1.22(s, 6H)。
制备例53
5-碘代-3,3-二甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯
将N-碘代琥珀酰亚胺(1.45 g，6.46 mmol)加入到3,3-二甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯(0.97 g，4.31 mmol)的二甲基甲酰胺(21.5 mL)溶液中。17小时之后，用饱和硫代硫酸钠水溶液和水淬灭该反应。用乙醚提取。将有机提取物合并，并用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(0.95 g，63%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 7.20-7.17(m, 1H), 2.61(d, 2H), 1.55(s, 9H), 1.27(s, 6H)。
制备例54
3,3-二甲基-5-(噻吩-2-基)-3,4-二氢吡啶-2(1H)-酮
将0.5M 2-噻吩基溴化锌的THF溶液(10.8 mL，5.4 mmol)加入到5-碘代-3,3-二甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯(950 mg，2.71 mmol)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)与DCM的复合物(221 mg，0.27 mmol)的THF(20 mL)溶液中。用氮气吹扫10分钟，使该反应混合物脱气。将该混合物在60℃下加热17小时，并冷却到环境温度。用2N HCl水溶液淬灭，并剧烈搅拌。用EtOAc稀释。分离有机层，用1N HCl水溶液、水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(450 mg，80%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 8.41(br s,1H), 7.12(dd, 1H), 6.99(dd, 1H), 6.91(dd, 1H), 6.59(d, 1H), 2.60(d, 2H), 1.28(s, 6H)。
制备例55
外消旋的2-乙基-2-甲基戊-4-烯酸
在-78℃，将2.5M的正丁基锂的己烷溶液(28.8 mL，72.0 mmol)加入到干冰/丙酮冷却的二异丙胺(10.56 mL，75 mmol)的THF(100 mL)溶液中。15分钟之后，将该反应混合物在冰浴中温热到0℃。30分钟之后，加入2-甲基丁酸(3.28 mL，30 mmol)。15分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。1小时之后，将该反应混合物在冰浴中冷却到0℃。加入烯丙基碘(3.01 mL，33 mmol)和六甲基磷酰胺(3.00 mL，17.2 mmol)。将该反应混合物慢慢地升温至环境温度过夜。16小时之后，用饱和氯化铵水溶液淬灭该反应。减压除去大部分溶剂。将残余物溶解在EtOAc中，用1N HCl水溶液、水和盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到标题产物(6.09 g，30 mmol)，其不用进一步纯化，直接使用。1H NMR(400MHz, d6-DMSO)δ 12.10(br s, 1H), 5.78-5.64(m, 1H), 5.10-5.00(m, 2H), 2.33-2.08(m, 2H), 1.60-1.33(m, 2H), 1.01(s, 3H), 0.80(t, 3H)。
制备例56
外消旋的N-烯丙基-2-乙基-2-甲基-戊-4-烯酰胺
将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(8.63 g，45.0 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(12%水，6.08 g，45.0 mmol)加入到粗品外消旋的2-乙基-2-甲基戊-4-烯酸(6.09 g，30 mmol)的DCM(200 mL)溶液中。加入丙-2-烯-1-胺(3.38 mL，45.0 mmol)和DIPEA(7.85 mL，45.0 mmol)。4小时之后，加入更多的DCM。用1N HCl水溶液和盐水提取。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(2.20 g，40%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 5.93(br s, 1H),5.85-5.59(m, 2H), 5.17-4.94(m, 4H), 3.86-3.80(m, 2H), 2.37(dd, 1H), 2.09(dd,1H), 1.73-1.59(m, 1H), 1.45-1.34(m, 1H), 1.08(s, 3H), 0.80(t, 3H)。
制备例57
外消旋的3-乙基-3-甲基-1,4-二氢吡啶-2-酮
将(1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌(Grubbs催化剂，第二代，0.47 g，0.55 mmol)加入到N,4-二烯丙基四氢吡喃-4-甲酰胺(2.00 g，11.0 mmol)的甲苯(60 mL)溶液中。用氮气吹扫5分钟，使该反应混合物脱气。将该混合物在100℃下加热5小时，并冷却到环境温度。减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(1.10 g，72%)。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ 7.71(br s, 1H), 6.10-5.98(m, 1H), 5.07-5.00(m, 1H), 2.31-2.20(m,1H), 2.16-2.07(m, 1H), 1.70-1.52(m, 2H), 1.14(s, 3H), 0.90(t, 3H)。
制备例58
外消旋的3-乙基-3-甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯
将DMAP(100 mg，0.79 mmol)和二碳酸二叔丁基酯(3.63 mL，15.8 mmol)加入到3-乙基-3-甲基-1,4-二氢吡啶-2-酮(1.10 g，7.90 mmol)的ACN(40 mL)溶液中。2小时之后，减压除去溶剂，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(2.00 g，95%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 6.76-6.69(m, 1H), 5.14-5.06(m,1H), 2.24-2.18(m, 2H), 1.82-1.68(m, 2H), 1.54(s, 9H), 1.18(s, 3H), 0.89(t,3H)。
制备例59
外消旋的3-乙基-5-碘代-3-甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯
将N-碘代琥珀酰亚胺(1.52 g，6.77 mmol)加入到3-乙基-3-甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯(1.20 g，4.51 mmol)的二甲基甲酰胺(23 mL)溶液中。17小时之后，用饱和硫代硫酸钠水溶液和水淬灭该反应。用乙醚提取四次。将所有的有机提取物合并，并用水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至20%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(1.15 g，70%)。ES/MS(m/z): 366(M+H)。
制备例60
外消旋的3-乙基-3-甲基-5-(2-噻吩基)-1,4-二氢吡啶-2-酮
将0.5M的2-噻吩基溴化锌的THF溶液(4.38 mL，2.19 mmol)加入到3-乙基-5-碘代-3-甲基-2-氧代-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯(400 mg，1.10 mmol)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)与DCM的复合物(89 mg，0.11 mmol)的THF(11 mL)溶液中。用氮气吹扫10分钟，使该反应混合物脱气。将该混合物在60℃下加热18小时，并冷却到环境温度。用2N HCl水溶液淬灭，并剧烈搅拌。用EtOAc稀释。分离有机层，用1N HCl水溶液、水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(180 mg，74%)。ES/MS(m/z): 222(M+H)。
制备例61
叔丁基-环戊-3-烯-1-基氧基-二苯基-硅烷
在-20℃，将叔丁基氯代二苯基硅烷(36.66 g，133.38 mmol)逐滴加入到3-环戊烯-1-醇(10.2 g，121.26 mmol)和1H-咪唑(18.16 g，266.77 mmol)/无水DMF(100 mL)中。加入完成之后，使反应温度逐渐地升温到环境温度，并在氮气氛围中搅拌过夜。将水、氯化铵和EtOAc加入到该反应混合物中，并搅拌该混合物1小时。分离有机层，用氯化铵(5×)洗涤，直到pH值是酸性为止，用水(2×)和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(40.22 g，93%)。ES/MS(m/z): 405.2(M+2 MeCN+H)。
制备例62
外消旋的反式叔丁基-(3,4-二溴环戊氧基)-二苯基-硅烷
在-20℃，将溴(22.23 g，7.15 mL，139.10 mmol)的四氯化碳(10 mL)溶液用20分钟逐滴加入到叔丁基-环戊-3-烯-1-基氧基-二苯基-硅烷(40.2 g，115.92 mmol)的四氯化碳(200 mL)和乙醇(0.1 mL)的搅拌溶液中。在冷却浴中继续搅拌一个小时。将该反应混合物倾倒入饱和碳酸氢钠中。分离有机层。用盐水洗涤有机提取物，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(55.19 g，106.41 mmol，93%)。GCMS 425(M-56)。
制备例63
外消旋的(3-溴环戊-3-烯-1-基)氧基-叔丁基-二苯基-硅烷
在无水THF(500 mL)中，制备反式外消旋的叔丁基-(3,4-二溴环戊氧基)-二苯基-硅烷(50.44 g，104.58 mmol)的储备溶液，并分成两份。加入固体氨基钠(5.2 g，130.5 mmol)和固体叔丁醇钠(18 g，188 mmol)。将每个容器所得到的米色混合物在室温下搅拌29小时。在烧瓶一中，GCMS显示85:15的产物/起始原料，在烧瓶二中，显示反应完成。将额外的0.5当量的氨基钠加入到烧瓶一中，并再搅拌24小时。用饱和氯化铵淬灭烧瓶二，并用乙醚(3×)提取。合并有机提取物，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到棕色油。对于每个反应，完成相同的后处理过程。将两个部分合并，用硅胶快速色谱纯化残余物，用己烷: 5%DCM/己烷洗脱，梯度为20-50%，得到标题化合物(18.45 g，43.95%)。GCMS(M-56)345.1。
制备例64
外消旋的5-[4-[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基环戊烯-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将外消旋的(3-溴环戊-3-烯-1-基)氧基-叔丁基-二苯基-硅烷(2.71 g，6.75 mmol)、双(频哪醇合)二硼(5.14 g，20.25 mmol)、(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)(330.79 mg，0.405 mmol)、乙酸钾(4.64 g，47.26 mmol)加入到1,4-二噁烷(60 mL)中。将该反应混合物在100℃下加热2小时。将该反应混合物冷却至室温。加入水，并用EtOAc提取。用硫酸钠干燥有机层，过滤，并减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化粗品，用DCM:MeOH(90:10)洗脱，得到中间体硼酸酯。在微波管瓶中，将5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(2.1 g，5.21 mmol)、叔丁基-二苯基-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环戊-3-烯-1-基]氧基-硅烷(3.50 g，7.81 mmol)、四(三苯基膦)钯(481.43 mg，0.416 mmol)和磷酸三钾N-水合物(3.57 g，16.82 mmol)与1,4-二噁烷(10mL)和水(5 mL)合并。将管瓶放在Biotage initiator中，并加热到140℃，保持20分钟。加入水，而后加入1N HCl，使溶液呈酸性。将该混合物用EtOAc(3×)提取。合并有机提取物，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化粗品，用DCM:MeOH(90:10)洗脱，得到标题化合物(210 mg，7%)。ES/MS(m/z): 643.0(M-H)。
制备例65
外消旋的5-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环己-1-烯-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
在微波管瓶中，将5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.6g，1.49 mmol)、叔丁基-二甲基-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-基]氧基-硅烷(1.01 g，2.98 mmol)、四(三苯基膦)钯(0.138 g，0.119 mmol)和磷酸三钾N-水合物(1.02 g，4.81 mmol)与1,4-二噁烷(8 mL)和水(4 mL)合并。将管瓶放在Biotage initiator中，并加热到140℃，保持20分钟。加入水，而后加入1N盐酸，使溶液呈酸性。将该混合物用EtOAc(3×)提取。合并有机提取物，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到暗褐色油脂。将DCM加入到该油脂中。几分钟之后，从溶液中沉淀出固体。滤出固体，得到标题化合物(0.513 g，64.5%)。ES/MS(m/z): 535.2(M+H)。
制备例66
5-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环己-1-烯-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
制备例67
5-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环己-1-烯-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
从外消旋的5-(4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环己-1-烯-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.575 g，1.08 mmol)开始，用手性色谱分离对映异构体，使用Chiralpak AD-H 21x250 mm柱，用30% IPA:70% CO2洗脱，流速70 g/min，得到制备例66，异构体1(0.222 g，38%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 535.0(M+H)，以及制备例67，异构体2(0.216 g，38%，99% ee)， ES/MS(m/z): 535.0(M+H)。
实施例1
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺
在密封管瓶中，将5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.59g，1.47 mmol)、(R)-3-吡咯烷醇(0.265 g，3.04 mmol)、溴化亚铜(I)(0.052 g，0.36mmol)、羟脯氨酸(0.10 g，0.8 mmol)和碳酸铯(1.03 g，3.16 mmol)与DMSO(8 mL)合并，并将得到的混合物在100℃下加热过夜。用水稀释该反应混合物，并将pH值调节至大约5。用EtOAc提取该含水混合物，而后用含有少量的MeOH的DCM提取。从含有任何产物的固体中倾析出水，并将固体吸收在50/50的DCM/MeOH中。合并，减压浓缩所有的有机物，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化所得到的残余物，用0-10%的MeOH/DCM洗脱。从EtOAc/己烷中浓缩出合适的物质，干燥，得到标题化合物(0.16 g，27%)的褐色固体。ES/MS(m/z): 410(M+H)。
基本上利用实施例1所描述的方法，制备下列化合物。
表4
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
2 外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基哌啶-1-基]噻吩-2-磺酰胺 424
3 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3S)-3-羟基哌啶-1-基]噻吩-2-磺酰胺 424
4 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基哌啶-1-基]噻吩-2-磺酰胺 424
5 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基哌啶-1-基)噻吩-2-磺酰胺 424
6 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[4-羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]噻吩-2-磺酰胺 492
7 外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 410
8 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3S)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 410
9 顺式内消旋-5-(3,5-二羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 440.0
10 外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[4-羟基-3,3-二甲基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 438.2
11 外消旋的反式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 440.0
12 反式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，异构体1 440.1
13 反式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，异构体2 440.1
14 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(4S)-4-羟基-3,3-二甲基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 438.1
15 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(4R)-4-羟基-3,3-二甲基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 438.2
16 外消旋的反式5-[3,4-二羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 425.9
17 5-[(3S,4S)-3,4-二羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 426.0
18 5-[(3S,4S)-3-(二甲基氨基)-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 453.0
19 5-[(3R,4R)-3,4-二羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 426.0
20 外消旋的反式5-[3,4-二羟基哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 440
21 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3S,4S)-3-羟基-4-(吗啉-4-基)吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺 495
另一个制备例，实施例1
将(R)-3-吡咯烷醇(23.5 g，269.9 mmol)和DIPEA(126 mL；719.8 mmol)加入到5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(70 g，180 mmol，88%纯度)的吡啶(430 mL)溶液中，并将得到的混合物在105℃(内部温度)下加热5小时。在40℃，高真空浓缩该混合物。通过硅胶垫纯化残余物，用1:1的丙酮/己烷至100%的丙酮洗脱。使所获得的物质在CH2Cl2(200 mL)中成浆30分钟。滤出沉淀的固体，用CH2Cl2(2 × 100 mL)洗涤，干燥，收集，得到标题化合物(32 g，43%)的米黄色固体。ES/MS(m/z): 410(M+H)。
实施例22
5-[(1E)-N-羟基乙亚胺酰基]-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将5-乙酰基-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.5 g，1.4mmol)与盐酸羟胺(0.21 g，3.0 mmol)/乙醇(20 mL，343.5 mmol)合并，并将该混合物在氮气氛围中、在80℃下加热过夜。减压浓缩该反应混合物，得到残余物。用水稀释残余物，将pH值调节至大约5，并用EtOAc提取该混合物。将合并的提取物用Na2SO4干燥，减压浓缩该溶液，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0-10%的MeOH/DCM洗脱。将洗脱的级分浓缩，其主要富集在肟异构体(E异构体)中。在乙醚中研磨该物质，收集沉淀，干燥，得到标题化合物(0.127 g，24%，9:1的E/Z混合物)。LC/MS(m/z): 364(M+H)。
基本上利用实施例22的方法，使用合适的酮，制备下列化合物。
表5
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
23 5-[(1E)-N-羟基-2-甲氧基乙亚胺酰基]-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 394
24 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(1E)-N-羟基-2-甲氧基乙亚胺酰基]噻吩-2-磺酰胺 410(M-H)
实施例25
顺式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例26
顺式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[3-羟基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，异构体2
基本上如实施例1所述，制备实施例25和26，只不过使用碳酸钾代替碳酸铯，并将pH值调节至4来代替pH5。将粗品纯化，而后利用反相快速色谱将残余物再纯化(含有10% TFA的水∶含有10% TFA的ACN)，梯度∶15% ACN，含有10% TFA，等度，3分钟，15-30%：5分钟，得到顺式异构体的混合物(66 mg，0.15 mmol)。如实施例33和34所描述，利用手性色谱分离对映异构体，使用下列不同的参数∶Chiralpak IA，21 x 250 mm；BPR设定点∶103 kPa。获得第一个洗脱峰，为实施例25，异构体1(0.027 g，4%，Rt=3.18分钟；>99% ee)，MS(m/z): 440(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例26，异构体2(0.023 g，3%，Rt=3.83分钟；97.5% ee)，MS(m/z):440(M+H)。
实施例27
外消旋的顺式5-[3,4-二羟基哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
在密封管瓶中，将5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(100mg，0.29 mmol)、顺式-哌啶-3,4-二醇盐酸盐(对映异构体的混合物，53.9 mg，0.35 mmol)、二甲基甲酰胺(0.3M，1 mL)和二异丙胺(200 µl)合并，并在100℃下加热18小时。冷却至环境温度，并蒸发。利用硅胶色谱纯化，使用1-10%的MeOH/DCM梯度，得到标题化合物的顺式对映异构体的混合物(83.5 mg，65%)。ES/MS(m/z): 440(M+1)。
实施例28
(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基){[5-(4-羟基哌啶-1-基)噻吩-2-基]磺酰基}氮阴离子(azanide，氮阴离子)钠
将N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基哌啶-1-基)噻吩-2-磺酰胺(实施例5)(1 g，2.4 mmol)、2-丙醇(10 mL，131 mmol)和1N氢氧化钠水溶液(2.4 mL，2.4mmol)合并。加热该混合物，使所有的固体溶解，通过0.45µM针筒式滤器温热过滤。加热，使任何得到的沉淀溶解，而后在室温下搅拌该混合物，使其结晶。滤出固体，用2-丙醇洗涤，在50℃下真空干燥，得到标题化合物(920 mg，2.1 mmol)。ES/MS(m/z): 424(M+H，游离酸)。
基本上利用实施例28所描述的方法，制备下列化合物。
表6
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)
29 (6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)({5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-基}磺酰基)氮阴离子钠 410
实施例30
外消旋的顺式5-(3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将TFA(6 mL，79 mmol)加入到(3R,4S)-3-氟-4-羟基-吡咯烷-1-甲酸叔丁基酯(1.0 g，4.87 mmol)的DCM(12 mL)溶液中。搅拌1小时。减压浓缩，并在高真空下干燥过夜。与5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(1.0 g，2.48 mmol)、溴化铜(0.11g，0.74 mmol)、羟脯氨酸(0.2 g，1.5 mmol)和碳酸钾(1.37 g，9.92 mmol)在DMSO(12 mL)中合并。在110℃下微波2小时。通过反相色谱纯化该油。使用含有0.1%甲酸的水，5%等度，5分钟，然后使用含有0.1%甲酸的5-50%的ACN。减压浓缩至油状，得到标题化合物(244 mg，23.0%)。LC/MS m/e 428[M+H]+。
基本上利用实施例30的方法，制备下列化合物。
表7
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
31 外消旋的反式5-(3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 428
32 顺式内消旋5-[(3R,4S)-3,4-二羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 426
实施例33
5-[(3S,4R)-3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
实施例34
5-[(3R,4S)-3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将外消旋的顺式5-(3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(244 mg，0.57 mmol)溶解在2.5 mL的MeOH和0.5 mL的DCM和几滴异丙胺中，利用手性色谱纯化，使用下列参数∶柱∶Chiralpak AD-H，150 x 21.2 mm；流速∶70 mL/min；检测∶320 nm；流动相∶40% MeOH/60% CO2；柱温∶35℃；BPR设定点∶100 bar；BPR温度∶40℃。收集第一个洗脱峰，为实施例33的标题化合物(75 mg，30.8%，Rt=2.20分钟；96.8%ee)，ES/MS(m/z): 428(M+H)。收集第二个洗脱峰，为实施例34的标题化合物(71 mg，29.2%，Rt=3.31分钟，99% ee)，ES/MS(m/z): 428(M+H)。
实施例35
5-[(3S,4S)-3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
实施例36
5-[(3R,4R)-3-氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物拆分对映异构体∶柱∶ChiralpakAD-H，21.2 x 250 mm；检测∶225 nm；获得第一个洗脱峰，为实施例35的标题化合物(46 mg；Rt=1.58分钟；99% ee)，ES/MS(m/z): 428(M+H)。重复手性纯化(293 mg，0.69 mmol)，获得第二个洗脱峰，为实施例36(129 mg，Rt=2.9分钟；96.8% ee)，ES/MS(m/z): 428(M+H)。
实施例37
外消旋的5-(3,3-二氟-4-羟基吡咯烷-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(2.50 g，7.30 mmol)和4,4-二氟吡咯烷-3-醇(1.90 g，15.4 mmol)的吡啶(50 mL)溶液在110℃下加热40小时，并冷却至环境温度。减压除去溶剂。利用反相色谱纯化残余物，流动相A∶0.1% TFA/水；流动相B∶0.1% TFA/ACN。用10至45%的B/A洗脱。利用硅胶快速色谱进一步纯化残余物，用2.5至7.5%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(1.70 g，52%)。ES/MS m(m/z): 446(M+H)。
实施例38
5-[(4S)-3,3-二氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺；丙-2-胺
实施例39
5-[(4R)-3,3-二氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺-丙-2-胺
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物(实施例37)拆分对映异构体∶柱∶Lux Amylose-2，21.2 x 250 mm；检测∶225 nm；流动相∶30% MeOH(0.2% IPA)/70% CO2。获得第一个洗脱峰，为实施例38的标题化合物(54 mg，Rt=3.22分钟；99% ee)，ES/MS(m/z):446(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例39的标题化合物(48 mg，Rt=4.43分钟；99% ee)，ES/MS(m/z): 446(M+H)。
基本上如实施例38和39所描述，制备下列化合物。
表8
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
40* 5-[(4S)-3,3-二氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 446
41* 5-[(4R)-3,3-二氟-4-羟基吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 446
*将光学纯的化合物溶解在4:1的DCM/IPA中，用0.1N HCl水溶液和盐水提取，用硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩，得到上面的实施例。
实施例42
外消旋的反式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(3-羟基环戊基)噻吩-2-磺酰胺
实施例43
外消旋的顺式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(3-羟基环戊基)噻吩-2-磺酰胺
将氢氧化钯(20%，在碳上，0.83 g)加入到反应器中，并用氮气吹扫容器。用乙醇(25mL)湿润催化剂，然后将5-(3-苄氧基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.644 g，1.29 mmol)的乙醇(25 mL)溶液加入到催化剂中。在Parr振荡器中，在室温下，在氢气氛围中(30 psig)，将该反应摇动18小时。加入更多的催化剂(0.844 g)，并将该反应在氢气氛围中(30 psig)摇动24小时。进一步加入催化剂(1.23 g)，并将该反应在氢气氛围中(30 psig)摇动24小时。过滤该悬浮液，并减压浓缩，得到澄清的油。通过反相纯化方法纯化该油，用LC柱洗脱∶Waters Xbridge C18 30 x 75 mm 5µm；A=10 mM NH4HCO3-5% MeOH/水，B=ACN，化合物梯度∶6% B，等度，4分钟，6-13.4% B，3分钟，13.4-30% B，1分钟；柱温∶环境温度；流速∶85 mL/min。分离第一个洗脱峰，为实施例42(40 mg，7.6%，Rt=6.63分钟)LC/MS(m/z): 409(M+H)。分离第二个洗脱峰，为实施例43(120 mg，22.9%，Rt=7.30分钟)。LC/MS(m/z): 409(M+H)。
另一个制备例，实施例42
另一个制备例，实施例43
将三溴化硼(1M，在庚烷中，40 mL)逐滴加入到0℃的5-(3-苄氧基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(20 g，40.1 mmol)的DCM(600 mL)溶液中。在室温下搅拌该反应，直到LC/MS(样品，在MeOH中)显示起始原料耗尽(～3小时)为止。将该反应冷却到0℃，并逐滴用MeOH(200 mL)淬灭该反应。减压浓缩该反应，得到粘性红色油。通过反相纯化方法纯化该油，用4%(0.1%甲酸，在ACN中)/96%(0.1%甲酸，在水中)洗脱5分钟，然后在30分钟期间内将ACN数量从4%提高至55%；得到第一个洗脱峰，为外消旋的反式异构体(1.85 g，11.3%)LC/MS(m/z): 409(M+H)，以及第二个洗脱峰，为外消旋的顺式异构体(2.39g，14.6%)。LC/MS(m/z): 409(M+H))。
基本上利用另一个制备实施例42和43的方法，制备下列化合物。
表9
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
44* 外消旋的反式5(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 445
45* 外消旋的顺式5(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 445
*通过反相色谱纯化该油，用10 mM碳酸氢铵溶液(5%等度)洗脱10分钟，然后用5-30%的ACN洗脱28分钟，30%的ACN洗脱13分钟，得到第一个洗脱峰，为实施例44，以及第二个洗脱峰，为实施例45。
实施例46
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(1R,3R)-3-羟基环戊基]噻吩-2-磺酰胺
实施例47
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(1S,3S)-3-羟基环戊基]噻吩-2-磺酰胺
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶柱∶Chiralpak AD-H，21 x 250 mm；检测∶225 nm；流动相∶35% MeOH/65% CO2；柱BPR设定点∶103kPa；获得第一个洗脱峰，为实施例46的标题化合物(14 mg，35%，Rt=2.45分钟；99% ee)，ES/MS(m/z): 409(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例47的标题化合物(14 mg，35%，Rt=2.81分钟；95.9% ee)，ES/MS(m/z): 409(M+H)。
实施例48
顺式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(3-羟基环戊基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例49
顺式N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(3-羟基环戊基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，如实施例32和33所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶溶解过程中不使用异丙胺，柱∶Chiralpak AD-H，21 x 250 mm；检测∶225 nm；流动相∶35% MeOH/65%CO2；BPR设定点∶103 kPa；BPR。获得第一个洗脱峰，为实施例48，异构体1(45 mg，38%，Rt=2.22分钟；99.2% ee)，ES/MS(m/z): 409(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例49，异构体2(40 mg，33%，Rt=2.61分钟；97.6% ee)，ES/MS(m/z): 409(M+H)。
实施例50
反式5-(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例51
反式5-(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶溶解过程中不使用异丙胺，柱∶Chiralpak AD-H，20 x 150 mm；检测∶225 nm；流动相∶35% IPA/65%CO2；BPR设定点∶103 kPa；获得第一个洗脱峰，为实施例50，异构体1(32 mg，30%，Rt=2.06分钟；99% ee)， ES/MS(m/z): 445(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例51，异构体2(44 mg，41%，Rt=2.42分钟；98.7% ee)，ES/MS(m/z): 445(M+H)。
实施例52
顺式，5-(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例53
顺式，5-(3,3-二氟-4-羟基环戊基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶柱∶Chiralpak AD-H，21 x 250 mm；检测∶225 nm；流动相∶35% IPA/65% CO2。获得第一个洗脱峰，为实施例52，异构体1(119 mg，40%，Rt=2.23分钟；99% ee)，ES/MS(m/z): 445(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例53，异构体2(119 mg，40%，Rt=2.80分钟；97.6% ee)，ES/MS(m/z): 445(M+H)。
实施例54
外消旋的5-(4,4-二氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将外消旋的4,4-二氟哌啶-3-醇(1.0 g，7.4 mmol)加入到5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(1.4 g，4.1 mmol)的吡啶(10 mL)溶液中。加热到100℃，保持20小时，并冷却到环境温度。用水稀释该混合物，并用浓HCl水溶液酸化。用EtOAc提取。合并有机提取物，用水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。利用硅胶快速色谱纯化残余物，用10-45%的ACN(含有0.1% TFA):H2O(含有0.1% TFA)的梯度洗脱20分钟，然后在45%下保持10分钟。随后，利用硅胶快速色谱纯化，用MeOH∶DCM(4:6)洗脱，得到标题化合物(0.75 g，40%)。ES/MS(m/z): 460(M+H)。
基本上利用实施例54的方法，制备下列化合物。
表10
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
55 外消旋的，反式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 442
56 外消旋的5-(3,3-二氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 460
实施例57
外消旋的，顺式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将外消旋的顺式-4-氟哌啶-3-醇盐酸盐(1.6 g，10 mmol)溶解在MeOH中，装载到SCX柱上，并用7N的NH3/MeOH洗脱，浓缩，得到外消旋的顺式-4-氟哌啶-3-醇(1.2 g，10 mmol)。将外消旋的顺式-4-氟哌啶-3-醇(0.84 g，7.0 mmol)加入到5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(1.2 g，3.5 mmol)的吡啶(10 mL)溶液中。将该混合物在100℃下加热16小时，并减压浓缩。将残余物溶解在EtOAc中，用浓HCl水溶液酸化，并用EtOAc提取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到残余物。利用硅胶快速色谱纯化残余物，用10%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(1.0 g，65%)。ES/MS(m/z):442(M+H)。
实施例58
5-[(3S)-(4,4-二氟-3-羟基哌啶-1-基)]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
实施例59
5-[(3R)-(4,4-二氟-3-羟基哌啶-1-基)]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
使用下列参数，如实施例32和33所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶溶解过程中不使用异丙胺，柱∶Chiralpak AD-H，150 x 20 mm；检测∶225 nm；流动相∶40% IPA/CO2；柱温∶40℃；BPR设定点∶103 kPa；BPR温度∶35℃。获得第一个洗脱峰，为实施例58(0.35 g，42%，Rt=2.39分钟，98% ee)，ES/MS(m/z): 460(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例59(0.34 g，38%，Rt=2.92分钟，98.8% ee)，ES/MS(m/z): 460(M+H)。
实施例60
反式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例61
反式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，如实施例32和33所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶柱∶Chiralpak AD-H，21 x 250 mm；检测∶225 nm；流动相∶40% IPA/CO2；BPR设定点∶103 kPa。获得第一个洗脱峰，为实施例60，异构体1(0.26 g，32%，Rt=2.57分钟，99% ee)，ES/MS(m/z):442(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例61，异构体2(0.31 g，39%，Rt=3.17分钟，97% ee)，ES/MS(m/z): 442(M+H)。
实施例62
顺式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例63
顺式-5-(4-氟-3-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，如实施例33和34所述，由外消旋混合物来拆分对映异构体∶溶于MeOH中，柱∶Chiralpak AD-H，5 x 150 mm；检测∶300 nm；流动相∶35% EtOH/CO2；柱温∶40℃；BPR设定点∶103 kPa。获得第一个洗脱峰，为实施例62，异构体1(0.44 g，45%，Rt=4.52分钟，>98%ee)，ES/MS(m/z): 442(M+H)。获得第二个洗脱峰，为实施例63，异构体2(0.44 g，46%，Rt=5.29分钟，>94% ee)，ES/MS(m/z): 442。
实施例64
外消旋的5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，非对映异构体1
将碳酸钾(298.6 mg，2.16 mmol)与4-(三氟甲基)哌啶-3,4-二醇的非对映异构体1(0.2 g，1.08 mmol)和DMSO(12 mL)合并。加入溴化亚铜(I)(61.98 mg,0.43 mmol)、羟脯氨酸(120.4 mg，0.43 mmol)和5-溴-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(435 mg，1.08 mmol)。用氮气替代空气，并在100℃下加热16小时。通过高真空蒸馏，除去大部分DMSO。加入饱和NH4Cl水溶液(0.25 mL)，并用MeOH(20 mL)稀释。过滤，浓缩，得到油。通过低pH值反相HPLC纯化残余物，使用C18 AXIA填充的30x75 mm柱，流动相A∶0.10% TFA/水，流动相B∶0.10% TFA/ACN。用5%至42% B/A洗脱，得到标题化合物(187 mg，34%)。ES/MS(m/z): 508(M+H)。
基本上利用实施例64的方法，制备下列化合物。
表11
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
65* 外消旋的5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，非对映异构体2 508
*用硅胶色谱进一步纯化物质，用90/10的CHCl3/MeOH洗脱。
实施例66
5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例67
5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
使用下列参数，使用实施例33和34所述的色谱手性方法，由外消旋的5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺非对映异构体1，分离两个对映异构体∶Chiralpak AD-H，20x150 mm柱。收集第一个洗脱峰，得到实施例66，异构体1(47 mg，26%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 508(M+H)，以及实施例67，异构体2(49 mg，27%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 508(M+H)。
实施例68
5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例69
5-[3,4-二羟基-4-(三氟甲基)哌啶-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
通过手性色谱，使用Chiralpak AD-H，20x150 mm柱，用40% MeOH/CO2洗脱，流速：70mL/min，由外消旋的5-[-3,4-二羟基-4-(三氟甲基)-1-哌啶基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺非对映异构体2(23 mg)分离两个对映异构体，得到实施例68，异构体1(8.8 mg，38%， >99% ee)，ES/MS(m/z): 508(M+H)，以及实施例69，异构体2(9.3mg，40%，>99% ee)， ES/MS(m/z): 508(M+H)。
实施例70
顺式，内消旋的5-(4,4-二氟-3,5-二羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，非对映异构体1
实施例71
外消旋的反式5-(4,4-二氟-3,5-二羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，非对映异构体2
将DCM(3 mL)和TFA(3 mL)加入到顺式内消旋的4,4-二氟-3,5-二羟基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯和外消旋的反式-4,4-二氟-3,5-二羟基-哌啶-1-甲酸叔丁基酯(0.42 g，1.66mmol)的3:1混合物中。2小时之后，减压除去溶剂。加入5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.15 g，0.44 mmol)、DIPEA(3 mL)和吡啶(6 mL)。将该混合物在100℃下加热24小时，并冷却到环境温度。减压除去溶剂。装载到SCX柱上。用MeOH洗脱，并浓缩滤液。通过高pH值反相HPLC分离两个非对映异构体，使用C18 OBD 30x75 mm柱，流动相A∶含有5% MeOH的10 mM碳酸氢铵水溶液，流动相B∶ACN。用2%至12%的B/A洗脱，流速：85 mL/分钟，得到实施例70，非对映异构体1(40 mg，19%)，ES/MS(m/z): 476(M+H)；，以及实施例71，非对映异构体2(20 mg，10%)， ES/MS(m/z): 476(M+H)。
实施例72
5-(3,3-二氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例73
5-(3,3-二氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
如实施例66和67所述，由外消旋混合物，拆分对映异构体，得到实施例72，异构体1(40mg，27%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 460(M+H)；以及实施例73，异构体2(40 mg，27%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 460(M+H)。
实施例74
外消旋的反式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
将TFA(3 mL)加入到外消旋的反式-3-氟-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁基酯(288 mg，1.31mmol)的DCM(3 mL)溶液中。2小时之后，减压除去溶剂。加入5-氟-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(180 mg，0.53 mmol)和吡啶(5 mL)。加入DIPEA(0.50 mL，2.87 mmol)。将该混合物在100℃下加热18小时，并冷却到环境温度。减压除去溶剂。将残余物溶解在4:1的DCM/IPA中，用1N HCl水溶液和盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至10%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(145 mg，62%)。ES/MS(m/z): 442(M+H)。
基本上利用实施例74的方法，制备下列化合物。
表12
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
75 外消旋的顺式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 442
实施例76
反式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例77
反式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
如实施例66和67所述，由外消旋的反式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺分离两个对映异构体，得到实施例76，异构体1(50mg，22%，99.4% ee)，ES/MA(m/z): 442(M+H)；以及实施例77，异构体2(50 mg，22%，98.9%ee)， ES/MS(m/z): 442(M+H)。
实施例78
顺式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例79
顺式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
通过手性色谱，使用Chiralpak OJ-H，21x250 mm柱，用25% MeOH/CO2洗脱，流速70 g/min，由外消旋的顺式5-(3-氟-4-羟基哌啶-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(175 mg，0.40 mmol)分离两个对映异构体，得到实施例78，异构体1(30mg，17%，97.5% ee)，ES/MS(m/z): 442(M+H)；以及实施例79，异构体2(50 mg，29%，99.3%ee)， ES/MS(m/z): 442(M+H)。
实施例80
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基)噻吩-2-磺酰胺
将5-溴-N-(1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(1.00 g，2.48 mmol)、2-氧代-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,4-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁基酯(1.12 g，3.47 mmol)、四(三苯膦)钯(0)(148 mg，0.124 mmol)在二噁烷(40 mL)和水(10 mL)中的混合物加热至100℃。24小时之后，将该反应混合物冷却至环境温度。减压除去溶剂。将残余物溶解在4:1的DCM/IPA中，用1N HCl水溶液和盐水提取，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到残余物。利用反相色谱纯化，流动相A∶0.1% TFA/水；流动相B∶0.1% TFA/ACN。用10至50%的B/A洗脱。用硅胶快速色谱进一步纯化，用0至10%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(180 mg，17%)。ES/MS(m/z): 420(M+H)。
实施例81
5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
在0℃，将氯磺酸(0.430 mL，6.51 mmol)加入到冰冷却的3,3-二甲基-5-(噻吩-2-基)-3,4-二氢吡啶-2(1H)-酮(450 mg，2.17 mmol)的DCM(60 mL)溶液中。15分钟之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。1.5小时之后，将该反应混合物倾倒入冰冷却的盐水中。用DCM(4×)提取。合并有机提取物，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。在冰浴中、在0℃冷却残余物。加入7-氨基-6-氟-1,2-二氢异喹啉-1-酮(194 mg，1.09 mmol)和吡啶(5 mL)。加入之后，除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。16小时之后，加入5N HCl水溶液，使pH=1。用EtOAc提取。将有机提取物合并，并用1N HCl水溶液和盐水洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至10%的MeOH/DCM洗脱，得到标题化合物(280 mg，57%)。ES/MS(m/z): 448(M+H)。
实施例82
5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺
在0℃，将五氯化磷(200 mg，0.96 mmol)加入到冰冷却的氯磺酸(0.16 mL，2.4 mmol)中。15分钟之后，加入5,5-二甲基-3-(2-噻吩基)-1,4-二氢哒嗪-6-酮(200 mg，0.96mmol)。除去冷却浴，并将该反应混合物升温至环境温度。4小时之后，将该反应混合物倾倒入冰冷却的盐水中。用EtOAc提取。合并有机层，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。将7-氨基-6-氟-1,2-二氢异喹啉-1-酮(137 mg，0.77 mmol)和吡啶(5 mL)加入到残余物中。17小时之后，减压除去溶剂。装载到SCX柱上。用MeOH洗脱，并浓缩滤液。用硅胶快速色谱纯化残余物，用0至10%的MeOH/DCM洗脱。减压浓缩含有产物的级分。利用反相色谱进一步纯化，流动相A∶0.1% TFA/水；流动相B∶0.1% TFA/ACN。用10至45%的B/A洗脱，得到标题化合物(20 mg，6%)。ES/MS(m/z): 449(M+H)。
基本上利用实施例82的方法，制备下列化合物。
表13
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
83 外消旋的5-(5-乙基-5-甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺 462
另一个制备实施例82
在0℃，将1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲(17 g，86 mmol)分为几份加入到6-[5-(苄基硫基)噻吩-2-基]-4,4-二甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2H)-酮(19 g，57 mmol)的ACN(290 mL)、乙酸(9.5 mL)和水(19 mL)的悬浮液中，在加入期间，保持内部温度<25℃。将MTBE(200 mL)加入到该反应混合物中，滤出白色固体，用MTBE洗涤，干燥，收集，得到中间体化合物5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4-二氢哒嗪-3-基)噻吩-2-磺酰氯。将滤液浓缩至干，溶于DCM中，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，直到水相的最终pH值>5为止。干燥有机相(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到黄色固体。将两个固体悬浮在MTBE中，并研磨。滤出白色固体，用MTBE洗涤，干燥，收集，得到5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4-二氢哒嗪-3-基)噻吩-2-磺酰氯化合物，纯度86%(13.1 g，64%)。ES/MS(m/z): 305(M-H)。
在0℃，将5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4-二氢哒嗪-3-基)噻吩-2-磺酰氯(13.1 g，36.7 mmol)分为几部分加入到7-氨基-6-氟-1,2-二氢异喹啉-1-酮(5.89 g，33 mmol)的吡啶(79 mL)溶液中。在室温下搅拌2.5小时。浓缩至干。用DCM(100 mL)超声处理残余物，直到形成橙色悬浮液为止。滤出固体，用DCM和MTBE洗涤，干燥，得到标题化合物(14 g，80%)。ES/MS(m/z): 449(M+H)。
实施例84
5-(5-乙基-5-甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例85
5-(5-乙基-5-甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢吡啶-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
通过手性色谱，使用Chiralpak AD-H，21.2x150 mm柱，用40% MeOH/CO2洗脱，流速70g/min，由外消旋的5-(5-乙基-5-甲基-6-氧代-1,4-二氢吡啶-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(190 mg，0.412 mmol)分离两个对映异构体，得到实施例82，异构体1(85 mg，45%，>99% ee)，ES/MS(m/z): 462(M+H)；以及实施例83，异构体2(85mg，45%，>99% ee)， ES/MS(m/z): 462(M+H)。
实施例86
外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环戊-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺
将四正丁基氟化铵(1M，在THF中，8 mL)加入到5-[4-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基环己烯-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺(0.135 g，0.252mmol)中。在室温下搅拌1.5小时。加入饱和氯化铵，然后用EtOAc提取，用硫酸钠干燥，并减压浓缩。用硅胶色谱纯化粗品，用DCM:MeOH(95:5)洗脱，得到无色油脂。将DCM加入到该油中，滤出所得到的固体，得到标题外消旋化合物(110 mg，81%)。ES/MS(m/z): 407.1(M+H)。
实施例87
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环戊-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1
实施例88
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环戊-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2
利用手性色谱，使用Lux 5u Cellulose-2，21x250 mm柱，用40%乙醇∶60% CO2洗脱，流速70 g/min，在225 nm下检测，分离外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环戊-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺，得到实施例87，异构体1(22 mg，16.6%，>99%ee)，ES/MS(m/z):407.1(M+H)以及实施例88，异构体2(25 mg，19%，>99% ee)， ES/MS(m/z):407.1(M+H)。
基本上利用实施例87和88的方法，制备下列化合物。
表14
实施例编号 化学名称 结构 ES/MS(m/z)(M+1)
89 外消旋的N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环己-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺 421.0
90 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环己-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体2 421.0
91 N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-(4-羟基环己-1-烯-1-基)噻吩-2-磺酰胺，异构体1 421.0
癌症越来越被认为是疾病的非均匀积累，它的起始和发展由细胞和组织微环境中调节DNA修复、基因稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移病变的一或多种基因的异常功能所诱导。“癌症”基因的变体或异常功能可以源于天然存在的DNA多态性、基因组复制数的变化(通过扩增、缺失、染色体丧失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、反转或导致基因表达解除管制的其它重排)以及基因点突变。癌性瘤可以由一种异常基因功能诱导，并且由相同的异常基因功能来保持，或通过其它异常基因功能来加剧保持和发展。
除上述遗传染色体畸变以外，每种癌症还可以包括基因组的后天修饰，包括DNA甲基化、基因组印记和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。后天修饰可以在恶性肿瘤的诱导和/或保持中起作用。
已经编著了人类癌症的细胞遗传畸变的大量目录，并且在线保持和定期校正(参见The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the USNational Cancer Institute(NCI)Cancer Genome Anatomy Project(CGAP)网址∶http://cgap.nci.nih.gov)。数据库包括至少一些本发明的恶性肿瘤的染色体畸变。Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project详细地在线保持了与肿瘤生成有关系的所有人类基因的“癌症基因统计”("Cancer Gene Census") (参见， http:// www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census)，以及人类癌症的体细胞突变的COSMIC(癌症的体细胞突变的目录)数据库(参见， http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic)。包含与各种癌症有关系的细胞遗传变化的大量信息的其它渠道，是Atlas of Genetics andCytogenetics in Oncology and Haematology(http://atlasgeneticsoncology.org// Anomalies/Anomliste.html#MDS)。这些数据库还包括至少一些本发明的恶性肿瘤的染色体畸变。
通过活检、免疫(球蛋白)分型及其它检验法来诊断癌性恶性肿瘤是已知和常规使用的方法。除了高分辨染色体显带和先进的染色体成像技术之外，还可以通过细胞遗传分析来测定癌症的疑似病例中的染色体畸变，例如，原位杂交荧光(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、复合FISH(M-FISH)、对比基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNPChips)及本领域技术人员已知和使用的其它诊断和分析检验。
抗叶酸物通过抑制叶酸代谢循环中的一或多种目标酶来妨碍叶酸的作用，并且使增殖所需要的DNA前体物的细胞丧失。癌细胞生长迅速，并由此高度需要DNA前体物，使得它们尤其容易受到抗叶酸物的影响。虽然通过在叶酸代谢循环中选择性抑制AICARFT来起作用，但是，预计式I的化合物针对与已知的抗叶酸物(包括氨甲喋呤、雷替曲塞(ralitrexed)、普拉曲沙(pralatrexate)、培美曲唑(Pemetrexed)和5-氟尿嘧啶)所针对的相同和类似的癌症具有活性。预计式I的化合物具有活性的癌症包括∶恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌(包括间皮瘤)、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤)、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL；包括T-ALL、淋巴母细胞和单核细胞性白血病)。
下列体外和体内研究证明了所列举的式I化合物或其可药用盐在抑制AICARFT、选择性抑制AICARFT方面的效果以及体内抗肿瘤活性。作为人类临床化学治疗活性的特征，本领域技术人员通常了解这些检验。 证明AICARFT抑制活性和效果的试验可以基本上如下进行，或通过得到类似数据的类似试验来进行。
试验
体外抗增殖试验
克隆&酶纯化
人类AICARFT(NCBI登录号∶NM_004044.6)cDNA购买于Openbiosystem Co.(Cat#MHS1011-62310，克隆体ID∶4300570，登记∶BC008879)。使用N端HIS标记，将编码全长人类AICARFT的核苷酸序列插入pET21d(Novagen)载体中。细菌BL21(DE3)(Novagen)用作表达主体，并在18℃下，在2xTY培养基中，用1 mM IPTG诱导蛋白表达，过夜。将细胞颗粒在-80℃下保存，用于随后的蛋白纯化。在4℃下进行蛋白纯化。在搅拌下，将每升细胞颗粒在50 mL冷的溶解缓冲液(50 mM Tris-HCl，pH7.5，300 mM NaCl，10%甘油，0.1% Triton X-100，0.5mg/mL溶菌酶，5U/mL benzonase，1 mM DTT，10 mM咪唑，以及Roche不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂)中培养，由此使冷冻的细胞颗粒溶解，并超声处理。在16,500 rpm下，在BechmanJA-18旋转器中离心45分钟，使溶胞产物澄清。将上清液用Ni-NTA琼胶糖树脂(Qiagen)培养3小时，而后用10个树脂体积的含有0.1% Triton X-100的缓冲液A(50 mM Tris-HCl，pH7.5，300 mM NaCl，10%甘油，1 mM DTT，10 mM咪唑)洗涤初始的批料。然后，将树脂填充到柱上，并用缓冲液A洗涤。用10-500 mM咪唑(在缓冲液A中)的梯度洗脱HIS标记的AICARFT蛋白。将收集的含有HIS-AICARFT的级分浓缩，装载到HiLoad 26/600 Superdex 200柱(GEHealthcare Biosciences)上，并用储存缓冲液(50 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl，1mM DTT，10%甘油)洗脱。收集含有HIS-AICARFT的级分，并利用Bradford检验方法，使用BSA作为标准，测定蛋白浓度。将蛋白等分，并在-80℃下保存。
四氢叶酸底物合成
酶反应的一种底物，10-甲酰四氢叶酸(10-F-THFA)，化学稳定性有限，并因此在ATIC酶活性测定的同一天进行合成。常规合成路线描述在下列文献中：P. Rowe, Methods Enzymol., 18, 733-735,(1971)和J. Rabinowitz, Methods Enzymol., 6, 814-815,(1963)。在这个合成中，第一步是亚叶酸(Sigma CAS 1492-18-8)转化为5,10-次甲基四氢叶酸(5,10-M-THFA)。这个转化通常在进行酶活性测定的前一天进行，但可以提前至多1周进行，并且在室温下保存。向亚叶酸(81.6 mg)中加入β-巯基乙醇(2 mL)，并加入37%的浓HCl(80µl)。将该反应在室温下最少培养3小时，偶尔进行搅拌。目测颜色由澄清变成黄色，并使用石英比色皿，通过光谱分析来监测亚叶酸完全转化为5,10-M-THFA。在该步骤期间，UV吸收从266 nm转变为356 nm。这形成了80 mM的5,10-M-THFA溶液。在试验的早上，将80mM的5,10-M-THFA在40μM碳酸氢铵(当天新制备的)中稀释至1.6 mM。将该反应在室温下培养3-5小时。目测颜色由黄色变成澄清，并使用石英比色皿，通过光谱分析来监测5,10-M-THFA转化为10-F-THFA。在该步骤期间，UV吸收从356 nm转变为258 nm。这形成了1.6 mM的10-F-THFA溶液。在DMSO中制备试验化合物，形成10 mM储备溶液。将该储备溶液在DMSO中连续稀释3倍，获得10点稀释曲线，化合物的最终浓度范围是100µM至5 nM。在该试验中，DMSO的最终浓度是5%。
酶测定方法
向384孔聚丙烯试验板(NUNC 264573)的每个孔中加入1μL DMSO(对照孔)或化合物(在DMSO中)和9μL的55.56μM ZMP(Sigma-Aldrich CAS 3031-94-5)(在水中)。然后，加入10μL200μM的10-F-THFA和 6nM ATIC酶(在 40μM碳酸氢铵中)。用于定义100%抑制的孔不含酶。最终试验条件是：25μM ZMP、100μM 10-F-THFA、 3nM ATIC酶和20μM碳酸氢铵。将该试验在室温下培养1小时，而后，加入40μL的ACN，使该反应终止。
利用监测IMP和ZMP信号的液相色谱-质谱(LC-MS)方法，测定AICARFT生物化学试验的抑制作用。该方法使用Agilent RapidFire 300色谱系统和AB Sciex 6500™三级四极质谱仪(带有Analyst® 2.1软件)。将生物化学样品装载到常规填充的聚合物弱阴离子交换保护柱上，取样时间0.6秒(大约30µL)，荷载缓冲液：1 mM乙酸铵/10% ACN，流速：1.25mL/分钟。将样品洗涤1秒钟，而后使用20 mM乙酸铵(pH10)和ACN的60:40的混合物洗脱2秒钟，总流速：1.25 mL/分钟。洗脱之后，将柱用荷载缓冲液再平衡3000 msec，而后开始下一次注射。这个系统的总循环时间为大约9秒钟/样品。
质谱仪在负离子TurboIonSpray®多反应监控方式下运行，源温：750℃。每个分析物的前体和碎片离子是∶IMP(347→79)和ZMP(337→79)。使用AB Sciex MultiQuant™version 2.1，测定IMP和ZMP的峰面积。IMP峰面积除以IMP和ZMP峰面积的总和，用于评估反应的转化率。使用ACTIVITYBASE 4.0，将转化率与四参数逻辑斯谛方程拟合，测定IC50值。代表该试验中测试的示例化合物的活性的具体值提供于表15中。
表15：酶测定
实施例# IC50(nM)
1 15.0(+ 10.9, n=9)
8 13.8(+ 7.0, n=4)
33 7.75(+ 1.15, n=3)
41 10.6(+3.1, n=4)
46 29.1(+ 28.8, n=6)
81 <5.08
84 <5.08
平均值+SEM；SEM=平均值的标准误差。
表15的数据表明，在该试验中，实施例1、8、33、41、46、81和84的化合物抑制AICARFT。
低水平叶酸培养基
用1M Hepes(5 mL)、100 mM丙酮酸钠(5 mL)和0.5 g/mL葡萄糖(2.5 mL)补充500 mLGibco不含叶酸的RPMI培养基(Gibco #27016-021)，与高水平叶酸ATCC RPMI培养基(ATCC#30-2001)匹配。为了制备完全培养基，将常规和不含叶酸的RPMI培养基补充以10% FBS。向不含叶酸的培养基中添加FBS加入了低水平的叶酸，现在认为是低水平的叶酸培养基。
在低水平叶酸培养基培养的NCI H460细胞中的ZMP的MS检测
使NCI-H460细胞在完全高水平叶酸RPMI培养基(ATCC #30-2001)中生长，直到细胞融合达到～80%。用PBS洗涤细胞，进行胰蛋白酶化，将细胞再悬浮在完全低水平叶酸RPMI培养基(Gibco #27016-021)中，并进行细胞计数。将1.25 x 106个细胞转移到含有完全低水平叶酸RPMI培养基(40 mL)的T225烧瓶中。培养七天。如果融合超过80%，则再次用完全低水平叶酸培养基分裂细胞。用PBS洗涤细胞，进行胰蛋白酶化，将细胞再悬浮在完全低水平叶酸RPMI培养基中，并进行细胞计数。将在完全低水平叶酸培养基(1 mL)+ 5% DMSO中的10×106个细胞等分在每个冷冻管中。使用细胞冷冻装置，在-80℃冰箱中，以缓慢和可控方式冷冻细胞。第二天，将细胞转移到液氮中，长期保存。在37℃水浴中，将冷冻管中的细胞解冻，用低水平叶酸试验培养基洗涤细胞一次：不含叶酸的RPMI 1640培养基(Gibco，#27016-021)、葡萄糖(Sigma，#G5767)、Hepes(Hyclone，#SH30237.01)、丙酮酸钠(Hyclone，#Sh30239.01)、10% FBS(Hyclone，#SH30070.03)。将细胞浓度用培养基调节到250,000个细胞/mL，将100µl/孔(25,000个细胞/孔)加入到Biocoat聚D-赖氨酸96孔板(BD，#35-4640)中，由此涂覆细胞，并在37℃下，用5% CO2培养过夜。用稀释在含有3% DMSO的培养基中的20µl/孔化合物处理细胞。在37℃下用5% CO2培养16小时，然后除去培养基，将1x SureFire溶解缓冲液(SureFire Lysis Buffer) (50µL)(PerkinElem，SureFire®试剂盒组分)加入到每个孔中，并在室温下培养10分钟，同时，轻微地摇动。
通过LC-MS测定AICARFT对于ZMP、2'-脱氧尿苷5'-单磷酸(dUMP)和N1-(β-D-呋喃核糖基)-5-氨基咪唑-4-甲酰胺(AICAr)的浓度的抑制的细胞效果。将生长在96孔板中的细胞的培养基除去，并且溶解在AlphaScreen® SureFire®溶解缓冲液中。制作标准曲线，其包括浓度为5-10,000 ng/mL的ZMP、dUMP和AICAr(在40 mM乙酸铵(pH4)中)。将每个标准物或样品的等分试样(40µL)在深的96孔板中与160µL内标溶液混合，所述内标溶液包含100ng/mL的13C5-ZMP(委托合成)和13C5-AICAr(委托合成)(在40 mM乙酸铵(pH4)中)。使用Beckman Biomek FX液体处理器，将400µL DCM加入到每个样品中。将样品密封，旋转5分钟，并被放在冰箱中至少30分钟。使用Eppendorf 5810R离心机，在4,000 rpm和4℃下，将样品离心10分钟，并使用Biomek液体处理器，将75µL水层转移到干净的96孔板中。将板密封，而后分析。
LC-MS方法使用Shimadzu Prominence 20A HPLC系统，与运行Analyst® 2.1软件的AB Sciex 5500™或AB Sciex 6500™三级四极质谱仪连接。使用Thermo Hypercarb™Javelin保护柱(2.1 x 20 mm，5µm)，将提取的样品分离，注射体积为15µL，流速为1 mL/分钟。流动相A是50 mM甲酸铵(pH4)和ACN的95:5的混合物。流动相B是ACN和MeOH(含有0.3%甲酸和2%浓氢氧化铵溶液(v/v))的70:30的混合物。梯度如下∶0分钟，0% B；0.25分钟，0% B；2.00分钟，30% B；2.01分钟，95% B；3.50分钟，95 % B，3.51分钟，0 % B，5.00分钟，停止。
质谱仪在阳离子TurboIonSpray®多反应监控方式下运行，源温：700℃。每个分析物的前体和碎片离子是∶ZMP(339→110)、13C5-ZMP(344→110)、dUMP(309→81)、AICAr(259→127)和13C5-AICAr(264→127)。绘制出分析物浓度相对于分析物/内标峰面积比的图，建立标准曲线，并利用AB Sciex MultiQuant™ 2.1软件，使用1/浓度加权，进行数据的线性拟合。使用ACTIVITYBASE 4.0，将反算的ZMP浓度与四参数逻辑斯谛方程拟合，测定IC50值。代表该试验中测试的示例化合物的活性的具体值提供于表16中。
表16：低水平叶酸培养基试验
实施例# IC50(nM)
1 22.0(+9.9, n=7)
8 25.0(+ 22.1, n=3)
33 7.93(+ 5.24, n=7)
41 42.2(+18.8, n=5)
46 39.6(+33.1, n=6)
81 10.2(+ 8.6, n=4)
84 10.1(+7.3, n=5)
平均值+SEM；SEM=平均值的标准误差。
表16的数据表明，在该试验中，虽然将培养基中存在的低水平叶酸调节至某种程度，但实施例1、8、33、41、46、81和84的化合物还抑制AICARFT。
体外增殖试验
通过针对下列细胞系的实验对象组的细胞数统计试验，测定实施例1和41的体外抗增殖活性：从ATCC、CASTCC、CLS、DSMZ、ECACC、HSRRB、ICLC、JCRB、NCI、Riken和SNU细胞库获得的肾上腺、自主神经节、胆道、血液ALL、血液AML、血液CML、血液霍杰金氏淋巴瘤、血液淋巴瘤、血液多发性骨髓瘤、血液NHL、血液RAEB、骨、乳腺ER+、乳腺成纤维细胞、乳腺成纤维细胞混合物、乳腺HER2、正常乳腺、三阴性乳腺、宫颈、CNS、子宫内膜、眼睛、正常成纤维细胞、肾ns、肾脏、大肠、肝脏、正常肝脏、肺腺癌、肺ns、肺NSCLC、混合的肺NSCLC、肺SCLC、鳞状肺、黑素瘤、正常黑素瘤、食道腺癌、食道ns、鳞状食道、卵巢、胰腺腺癌、胰腺导管癌、胰腺ns、胸膜间皮瘤、前列腺腺癌、前列腺小细胞、唾液腺、小肠、软组织、胃、睾丸、甲状腺、鳞状甲状腺、正常脐静脉内皮细胞、鳞状上呼吸消化道、尿路ns、尿路转移细胞癌和鳞状外阴的细胞系。在获得样品的日期，使用细胞库推荐的培养条件，使细胞生长。制作完全培养基，加入合适的马血清(ex. Invitrogen，Cat. No. 16050130)或FBS(ex. Invitrogen，Cat. No.10099-141或Hyclone Cat. No. CH30160.03)和添加剂。
对于附着的细胞系，使用真空泵，除去并且清除培养基。用0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.038%(w/v)EDTA溶液简单地冲洗细胞层，除去包含胰蛋白酶抑制剂的所有痕量的血清。将3.0 mL胰蛋白酶-EDTA溶液加入到烧瓶中，在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞层分散为止。加入8.0 mL完全生长培养基，并通过缓慢移液吸出细胞。
对于悬浮细胞系，将细胞悬液转移到离心管中，并在800-1000 rpm下离心3-5分钟。使用真空泵，除去上清液。加入合适体积的完全培养基。通过轻轻地移液使细胞颗粒悬浮。统计细胞数量，并将细胞调节至合适的播种密度。按照设计的板布局，将100μl(对于48、96和120小时检验的细胞)或200μl(对于144小时检验的细胞)细胞悬液加入到96孔白色壁透明底的板中(ex. Corning， Cat. No. 3707或 3610)，并将板放在CO2培养箱中过夜。
制备化合物的2 mM DMSO储备溶液，在增殖试验中进行检验。测定所检验的浓度，并将化合物在低水平叶酸培养基中稀释至200×的最后浓度。DMSO是稀释剂。将化合物在稀释剂中进行连续的1:3稀释。将0.5或1µl/孔的稀释化合物加入到涂覆的细胞中。化合物的最后浓度是1×。当测定每个细胞系时，将板在37℃下培养大约2个倍增时间。在倒置显微镜下观察细胞形态。将板和它的内含物平衡到室温，保持大约30分钟。将100μl的CellTiter-Glo试剂(Promega，Cat. No. G7571)加入到试验板中。在定轨振荡器上，将内含物混合2分钟，引起细胞溶解。将板在室温下培养10分钟，使荧光信号稳定。用白色背封粘贴透明的底部，并用Flexstation3(Molecular Devices)记录荧光。设置应该是∶荧光，积分时间：500ms。测定每个样品的%抑制(参见表17)。
表17∶增殖试验
表17的数据表明，在该试验中检验的实施例1和41的化合物，在标准培养基条件下抑制癌细胞增殖。在标准培养基条件下，作为此试验的代表性数据，在评价的49个肺腺癌细胞系的一个细胞系中，对于大细胞肺癌NCI-H460，实施例1和实施例41分别显示了0.61µM和1.88µM的IC50值，在28个大肠细胞系的一个细胞系中，对于结肠癌HCT-116，分别显示了8.1µM和10.8µM的IC50值。
低水平叶酸体外增殖试验
通过针对下列46个癌细胞系的实验对象组的细胞数量统计试验，测定实施例1的体外抗增殖活性：从ATCC、DSMZ、JCRB和Riken细胞库获得的肺、结肠直肠、胃、胰腺、肝脏、乳腺、大脑、黑素瘤、胰腺、纤维肉瘤、肾脏、T细胞白血病、淋巴母细胞、单核白细胞& CML源癌细胞系。将生长在高水平叶酸RPMI培养基(ATCC #30-2001)+ 10% FBS(Hyclone #SH30070.03)中的细胞转移到低水平叶酸RPMI培养基中，并使叶酸缺乏7天。将生长在高水平叶酸培养基中的细胞用PBS洗涤，胰蛋白酶化，并再悬浮在低水平叶酸培养基中。使细胞在低水平叶酸培养基中生长7天，确保播种在组织培养烧瓶中时的密度在7天之后不会超过80%融合度。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶化，再悬浮在低水平叶酸培养基中，并统计细胞。播种在96孔聚D赖氨酸板(Corning #354640)的100µl低水平叶酸培养基中，3000个细胞/孔。使细胞附着过夜。制备要在增殖试验中进行检验的化合物的10 mM DMSO储备溶液。确定要检验的浓度，并将化合物在低水平叶酸培养基中稀释至2×的最后浓度。计算此溶液的% DMSO，并使用该数值用于稀释。将化合物在稀释剂中进行连续的1:2或1:3稀释。将100µl/孔的稀释化合物加入到涂覆的细胞中。化合物的最后浓度是1×。保证最终% DMSO不超过0.5%。对于柱#1(2µM星孢菌素)和柱#12(DMSO，½稀释浓度)，保留最大和最小信号参比对照。将感兴趣的化合物给予细胞7天。为了测定增殖结果，将1/10体积的阿尔玛蓝细胞活力试剂(Invitrogen DAL-1100)加入到每个孔中。重新将板放到组织培养箱中，并使反应进行大约1.5-4小时。在Envision板读数器(Perkin Elmer)或其它荧光板读数器上读板，激发：570 nm，发射：585nm。测定每个样品的%抑制(参见表18)。
表18∶实施例1的在低水平叶酸培养基中的体外抗癌活性
表18的数据表明，在该试验中检验的所例举的化合物，实施例1，在叶酸水平与人血浆相似的培养基条件下，抑制癌细胞扩散。作为此试验的代表性数据，在低水平叶酸培养基中，在21个肺细胞系中的一个细胞系中，对于大细胞肺癌NCI-H460，实施例1显示了20 nM的IC50值，而在6个胃肠细胞系的一个细胞系中，对于结肠直肠癌HCT-116，它显示了3 nM的IC50值。
在人类癌症小鼠异种移植模型中的抗肿瘤效果
基于上述体外增殖试验数据，利用预计敏感的人类结肠直肠腺癌细胞系HCT-116和人类肺癌NCI-H460小鼠异种移植肿瘤模型，研究实施例1的体内抗癌活性。使用开始测定时体重23-28 g的雌性无胸腺裸鼠(Harlan)，进行体内研究。接收后和在整个研究中，在适当大小的带有接触床(contact bedding)的实底笼中，每个笼中放置5个动物。使动物笼保持12小时照明/黑暗循环。使动物适应14天，而后植入NCI-H460或HCT-116细胞，不限量提供低水平叶酸饮食(Teklad 130451)和饮用水。从American Type Culture Collection(ATCC)获得HCT-116和NCI-H460细胞系，并且按照ATCC说明书进行培养。在对数期生长期间采集植入所使用的细胞，并悬浮在无血清培养基中。然后，将悬浮的细胞用BD Matrigel基质(ref354234)进行1:1稀释。在右肋部注射5.0E+06细胞(0.2 mL细胞/Matrigel悬浮液)。在植入后第8天，开始监测肿瘤。当平均肿瘤体积达到200 mm3时，使用专利的随机化软件，将动物重新分配到各组中，每个组5-6个动物。1-12组保持低水平叶酸饮食(Teklad 130451)，在开始给药之前28小时，以及每个剂量之前4小时，开始给予叶酸(Sigma F8798 Lot #SLBH0909V)，给予剂量列于表19中。每周将叶酸配制在PBS中，并通过口服填喂法给予0.2mL。使13-16组随机化处于标准食物(Teklad 2920X)条件下。每周将化合物配制在20%HPBCD/磷酸盐缓冲液(pH8)中，同时，加入一个摩尔当量的NaOH。通过口服填喂法给予配制的化合物(0.2 mL)，剂量和计划如表19所示。还QD给予赋形剂，作为该研究的对照臂。一周测定2×肿瘤体积和体重。利用卡钳测量法(mm)测定肿瘤体积，并且使用椭球的公式∶肿瘤体积(mm3)=长度×宽度2/2，其中，长度和宽度指的是每次测定收集的较大和较小的垂线尺寸。在给药期间，每天监测动物行为和动物健康情况。给予表19所示的最后剂量之后，停止该研究。
将数据转换为对数标度，使时间和治疗组之间的方差平均化，开始肿瘤体积数据的统计分析。使用SAS软件(Version 9.3)中的MIXED方法，利用随时间和治疗的双向重复测定方差分析，分析对数体积数据。重复测定的相关模型是Spatial Power。在每个时点，将治疗组与对照组进行比较。在每个时点，为了计算校正平均数和标准误差，对于每个治疗组，还分别使用MIXED方法。两个分析说明每个动物和从研究初期排除大肿瘤动物时出现的数据缺失之间的自相关。绘制每个治疗组相对于时间的校正平均数和标准误差。在每个时点对比治疗组与对照组的分析，使用log10肿瘤体积，并且得到p值。对于显示的p值的统计显著性，“*”=P<0.05。
使用Delta T/C %计算。方程式∶T=治疗组的最终肿瘤体积；T0=治疗组的基线肿瘤体积(假定与C0相同)；C=对照组的最终肿瘤体积；C0=对照组的基线肿瘤体积(假定与T0相同)；Delta T/C，%=100 *(T-T0)/(C-C0)
AICARFT体内靶向抑制(IVTI)试验
通过肿瘤异种移植的液相色谱-质谱(LC-MS)分析，测定AICARFT抑制对于途径相关的分析物浓度的体内效果。将干冰上肿瘤异种移植物在分析天平上称重，转入2 mLEppendorf Safe-Lock Tube Lock TubeTM中，并放在干冰上。制备含有13C5-ZMP(1000 ng/mL)、13C5-AICAr(500 ng/mL)、抗坏血酸(0.1%)和甲酸(0.1%)(在MeOH/DCM(80:20)中)的内标溶液，并在20℃下保存。对于样品管中的每mg组织，加入10µL内标溶液。分别制备包括7.6-50,000 ng/mL浓度的ZMP、dUMP、AICAr的标准曲线(在内标溶液中)。
将一个5 mm钢珠(Qiagen)加入到每个试样管中，并将该管放在湿润的冰上15分钟。在15 Hz下，将样品在Qiagen TissueLyser II上均化5分钟，而后在13,000 rpm和4℃下，在Eppendorf 5430R微量离心机上离心10分钟。取出每个上清液的等分试样(200µL)，并放入深的96孔板中。此外，将每个标准曲线溶液的等分试样(200µL)放入深的96孔板中。利用Beckman Biomek FX液体处理器，将DCM(600µL)和0.1%抗坏血酸溶液(200µL)加入到每个孔中。将板密封，旋转5分钟，并在4,000 rpm和4℃下，在Eppendorf 5810R离心机上离心5分钟。将上层的等分试样(75µL)转入干净的96孔板中，并将额外的75µL 40 mM的乙酸铵(pH4)加入到每个孔中。将板密封，而后分析。LC-MS方法使用Shimadzu Prominence 20A HPLC系统，与运行Analyst® 2.1软件的AB Sciex 5500TM或AB Sciex 6500TM三级四极质谱仪连接。使用两个串联的Thermo HypercarbTM Javelin保护柱(2.1 x 20 mm，5µm)，将提取的样品分离，注射体积为15µL，流速为0.75 mL/分钟。流动相A是50 mM甲酸铵(pH4)和ACN的95:5的混合物。流动相B是ACN和MeOH(含有0.3%甲酸和2%浓氢氧化铵溶液(v/v))的70:30的混合物。梯度如下∶0分钟，0% B；0.25分钟，0% B；4.00分钟，30% B；4.01分钟，95% B；5.50分钟，95% B，3.51分钟，0% B，7.50分钟，停止。质谱仪在阳离子TurboIonSpray®多反应监控方式下运行，源温：700℃。每个分析物的前体和碎片离子是∶ZMP(339→110)、13C5-ZMP(344→110)、dUMP(309→81)、AICAr(259→127)和13C5-AICAr(264→127)。绘制出分析物浓度相对于分析物/内标峰面积比的图，建立标准曲线，并利用AB Sciex MultiQuantTM 2.1软件，使用1/浓度加权，进行数据的线性拟合。13C5-ZMP用作ZMP和dUMP的内标。13C5-AICAr用作AICAr的内标。
利用小鼠和狗血浆进行的AICARFT体内靶向抑制(IVTI)试验
通过液相色谱-质谱(LC-MS)，测定AICARFT抑制对于AICAr的循环浓度的体内效果。制备包括1 ng/mL-2000 ng/mL浓度的AICAr的标准曲线(在40 mM乙酸铵中，pH4)。在ACN中，将血浆样品(75µL)或标准样品(75µL)与300µL内标溶液混合，所述内标溶液含有13C5-AICAr(20 ng/mL)和甲酸(1%)。将样品旋转混合5分钟，并使其通过Phenomenex Phree 96孔除去磷脂的SPE板。将洗脱液收集在96孔板中，并在50℃、在热的氮气氛围中干燥。将每个样品在50µL 40 mM乙酸铵(pH4)中重组。将板密封，并在分析之前旋转5分钟。LC-MS方法使用Shimadzu Prominence 20A HPLC系统，与运行Analyst® 2.1软件的AB Sciex 5500TM或ABSciex 6500TM三级四极质谱仪连接。使用两个串联的Thermo HypercarbTM Javelin保护柱(2.1 x 20 mm，5µm)，将提取的样品分离，注射体积为15µL，流速为1 mL/分钟。流动相A是50mM甲酸铵(pH4)和ACN的95:5的混合物。流动相B是ACN和MeOH(加入（spiked with）0.3%甲酸和2%浓氢氧化铵溶液(v/v))的70:30的混合物。对于小鼠血浆样品，使用下列梯度∶0分钟，0% B；0.25分钟，0% B；2.00分钟，25% B；2.01分钟，95% B；3.50分钟，95% B；3.51分钟，0%B；4.50分钟，停止。对于狗血浆样品，下列梯度用于排除内源性的干扰∶0分钟，0% B；0.25分钟，0% B；5.99分钟，20% B；6.00分钟，95% B；8.00分钟，95% B；8.01分钟，0% B；10.00分钟，停止。质谱仪在阳离子TurboIonSpray®多反应监控方式下运行，源温：700℃。每个分析物的前体和碎片离子是∶AICAr(259→127)和13C5-AICAr(264→127)。绘制出分析物浓度相对于分析物/内标峰面积比的图，建立标准曲线，并利用AB Sciex MultiQuantTM 2.1软件，使用1/浓度加权，进行数据的线性拟合。
表19∶在小鼠异种移植肿瘤模型和IVTI中的抗肿瘤活性
根据上面表19所提供的内容，在该试验中检验的所例举的实施例1的化合物，当连续QD给予2周时，显示了对于HCT-116 & NCI-H460异种移植肿瘤的体内抗癌活性。该活性与HCT-116 & NCI-H460癌细胞系中观察到的体外活性一致。小鼠的血清叶酸水平显著地高于人类的血清叶酸水平(CP Leamon等人，(2008)JPET 327:918-925)，并且基于抗增殖IC50值对于组织培养中的叶酸水平的依赖性，可能低估了在人类中所观察到的活性。观察到的肿瘤生长抑制活性与肿瘤ZMP和血浆AICAr提高有关。表19中的数据还支持血浆AICAr作为AICARFT抑制的生物标志物的用途。
在小猎犬中的药效响应
在小猎犬中进行的单一上升剂量研究中，在最相关的非临床物种中评价对于实施例1、实施例33和实施例41的药效(PD)响应。小猎犬、非人灵长类和人是低水平血清叶酸物种，而啮齿类是高水平血清叶酸物种(CP Leamon等人，(2008)JPET 327:918-925)。在AICARFT抑制剂治疗的狗中的药效响应，更加代表了在AICARFT抑制剂治疗的患者中的预计药效响应。
为了说明“正常”靶向接合，即，未携带肿瘤，通过口服填喂法给药，用AICARFT抑制剂治疗一对非首次用于实验的小猎犬；每个实验包括两对狗，(每对有一只雄性狗,一只雌性狗)，对它们在不同的场合进行治疗，使每对狗得到两次治疗，每次治疗间隔至少七天。
治疗之后，以一定的时间间隔获取血浆样品，用于测定通过提高的血浆AICAr浓度所显示的药效响应。实验完毕后，为了再次使用，将动物放回到群体中。
表20：小猎犬的血浆AICAr升高
实施例# 剂量 给药后的采集时间 平均血浆AICAr，nM
1 10 mg/kg QD，口服 8 138
1 30 mg/kg QD，口服 8 254
1 100 mg/kg QD，口服 8 652
1 300 mg/kg QD，口服 8 931
赋形剂，口服 0 18
33 10 mg/kg QD，口服 8 98
33 30 mg/kg QD，口服 8 213
33 100 mg/kg QD，口服 8 726
33 300 mg/kg QD，口服 8 1150
赋形剂，口服 0 12
41 10 mg/kg QD，口服 8 158
41 30 mg/kg QD，口服 8 362
41 100 mg/kg QD，口服 8 1534
41 300 mg/kg QD，口服 8 1373
如表20所提供的内容，在该试验中检验的实施例1、实施例41和实施例33的化合物在狗中显示了AICARFT的体内抑制作用。在狗中的这种活性与上面HCT-116和NCI-H460小鼠异种移植评价中所观察到的这些化合物的体内活性一致。

Claims (13)

1.式I的化合物∶
其中∶
R1选自基团∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；或X1和X2中的一个选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2或吗啉-4-基，另一个是氢；
其中，每个n独立地选自0、1或2；
Y1、Y2和Y3独立地选自氢、-OH、氟、-NH2或-CF3；条件是，它们不全都是氢；且
条件是，所有的n不同时是0；进一步的条件是，只有一个n可以是2；和当一个n是2时，Y1、Y2和Y3中的每一个独立地选自氟、-OH或-CF3；
其中，Q1和Q2独立地选自氢、-CH3或-CH2CH3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；
R2是氢或氟；
或其可药用盐。
2.权利要求1所要求的化合物，其中∶
R1选自基团∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；或X1和X2中的一个选自-OH、-OCH3、-N(CH3)2或吗啉-4-基，且另一个是氢；
其中，每个n独立地选自0、1或2；
Y1、Y2和Y3独立地选自氢、-OH、氟、-NH2或-CF3；条件是，它们不全都是氢；且
条件是，所有的n不同时是0；和进一步的条件是，只有一个n可以是2；和当一个n是2时，Y1、Y2和Y3中的每一个独立地选自氟、-OH或-CF3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；
R2是氢或氟；
或其可药用盐。
3.权利要求1或2所要求的化合物，其中∶
R1选自基团∶
其中，X1和X2中的每一个独立地选自氢、氟或-CH3；
其中，Z1和Z2中的每一个独立地选自氢或氟；
R2是氟；
或其可药用盐。
4.权利要求1、2或3的任一项所要求的化合物，其中，所述化合物是∶
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3S)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-[(3S,4R)-3-氟-4-羟基-吡咯烷-1-基]-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-(3,3-二氟-(4R)-4-羟基-吡咯烷-1-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；
5-(5,5-二甲基-6-氧代-1,4-二氢哒嗪-3-基)-N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐；或
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(1R,3R)-3-羟基环戊基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐。
5.权利要求1、2、3或4的任一项所要求的化合物，其中，所述化合物是∶
N-(6-氟-1-氧代-1,2-二氢异喹啉-7-基)-5-[(3R)-3-羟基吡咯烷-1-基]噻吩-2-磺酰胺，或其可药用盐。
6.包含权利要求1的化合物或其可药用盐和可药用载体的药物组合物。
7.治疗患者癌症的方法，所述癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐。
8.治疗患者癌症的方法，所述癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐。
9.权利要求1的化合物或其可药用盐，用于治疗。
10.权利要求1的化合物或其可药用盐，用于治疗癌症，所述癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病。
11.权利要求1的化合物或其可药用盐，用于治疗癌症，所述癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病。
12.式I的化合物或其可药用盐，用于制备治疗癌症的药物，所述癌症是恶性胶质瘤、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、头和颈癌、肾癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、胃癌、骨肉瘤、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、成纤维细胞肉瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病。
13.式I的化合物或其可药用盐，用于制备治疗癌症的药物，所述癌症是三阴性乳腺癌、膀胱癌、肺癌、间皮瘤、结肠直肠癌、非霍杰金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、T-ALL、淋巴母细胞或单核细胞性白血病。
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