CN107001315A - 可用作蛋白质异戊二烯化的抑制剂的新型氨基吡啶化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物，其可选择地选自式(I)和(II)，其中R1为2‑吡啶基、3‑吡啶基或4‑吡啶基；R2表示式(III)、(IV)和(V)；和其中R5和R6表示氢原子或(C1‑4)烷基；和R7表示芳基羰基、杂芳基羰基、杂芳基乙酰基、(C1‑C4)烷氧基‑羰基甲基、式(VI)基团。还公开了式(I)和(II)的新型化合物。

Description

可用作蛋白质异戊二烯化的抑制剂的新型氨基吡啶化合物
技术领域
本发明涉及预防或治疗涉及蛋白质异戊二烯化异常的疾病或紊乱的领域，其包括预防或治疗早老症。
背景技术
异戊二烯化由将类异戊二烯基团添加至位于蛋白质羧基末端附近的半胱氨酸残基组成。这种酶翻译后修饰对于蛋白质的成熟和加工是重要的。除了调节蛋白质的定位和功能之外，这两个过程都需要介导蛋白质-蛋白质和膜-蛋白质的关联。缺乏涉及异戊二烯化和成熟的酶的动物的严重表型突出了这些过程的意义。此外，已经发现编码异戊二烯化的蛋白质或涉及异戊二烯化和成熟过程的酶的基因的改变是严重的人类疾病如癌症、神经变性紊乱、色素性视网膜炎和早老综合征的基础。最近对病理病症下异戊二烯化和后异戊二烯化过程的研究已经揭示了这些修饰和它们在不同细胞途径中的作用的令人惊讶的方面。这些酶作为治疗靶标的鉴定已经使研究人员验证它们在体外和体内作为抗肿瘤剂或抗衰老剂的作用。
Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)是一种超罕见的节段性过早衰老疾病，导致心脏病发作或中风的早期死亡。没有经批准的治疗，但是从2007年开始，几项近来的单臂临床试验已经施周蛋白质法尼基化抑制剂，目标在于降低产生疾病的早老蛋白的毒性。没有研究评估治疗是否影响患者的存活。
导致受Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)(OMIM#176670)影响的儿童过早衰老的分子机制的鉴定已经允许临床医生能够检测靶向重新使用的药物。然而，到目前为止，缺乏适当的体外细胞模型已经排除了使用高通量筛选(HTS)的化学实体的更广泛试验。
由于LMNA基因的外显子11中的单碱基取代(De Sandre-Giovannoli等人，2003，Science，第300卷：2055；ErikSSon等人，2003，Nature，第423卷：293-298)(c.1824C＞T，NCBI参考序列：NM_170707.3)，因而HGPS是非常罕见的遗传病(Merideth等人，2008，N EnglJ Med，第358卷：592-604)。这导致隐蔽剪接供体位点的活化，导致在前层蛋白A中缺失50个氨基酸，并产生称为早老蛋白的有毒形式的前层蛋白A蛋白质(Navarro等人，2004，Hum MolGenet，第13卷：2493-2503)。
因为缺失的序列要求其翻译后成熟，所以这个突变蛋白质在核膜上积聚，这是导致患者节段性过早和加速衰老的主要机制。虽然在HGPS细胞中容易观察到核形状的破坏，但是与一组充分表征的细胞功能障碍相关，包括过早衰老以及DNA修复、细胞增殖和分化中的缺陷。
自从发现导致HGPS的分子机制以来，已经将三种不同的药物重新使用用于它们靶向异戊二烯化过程的能力，即与氨基二膦酸盐唑来膦酸盐相关的HMG-CoA还原酶(HMGCR)抑制剂普伐他汀和法尼基转移酶抑制剂(FTI)替吡法尼(Varela等人，2008，Nat Med，第14卷：767-772；Yang等人，2005，Proc Natl Acad Sci USA，第102卷：10291-10296；Yang等人，2010，Journal of lipid research，第51卷：400-405)。在过去10年中，几项实验研究确实证实了这些药理学方法的相关性，表明对前层蛋白A异戊二烯化过程的抑制和与HGPS相关的核形状和其他细胞缺陷的改善相关。这些研究总共已经引发了三项临床试验的精心设计(Capell等人，2005，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.102：12879-12884；Capell等人，2008，Proe Natl Acad Sci USA，Vol.105：15902-15907；Glynn和Glover，2005，Human MolGenet，Vol.14：2959-2969；Varela等人，2008，Nat Med，Vol.14：767-772；Young等人，2013，Sci Transl Med Vol.5：171ps173)，其揭示了患者临床表型的一些部分改善，使得发现新的潜在分子成为必要(Gordon等人，2012，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.109：16666-16671)。
由于它们的多能性和自我更新性质，胚胎干细胞和(ES)诱导的多能性干细胞(iPS)提供了一种在HTS设置中产生用于体外测试化合物的无限制和均匀的生物资源的独特途径(Desbordes和Studer，2013，Nat Protoc，Vol.8：111-130；Lee等人，2012，NatBiotechnol，Vol.30：1244-1248)。自2011年以来，几个组已经证明iPS细胞系在分化成血管平滑肌细胞(VSMC)和间充质干细胞(MSC)后概括HGPS的某些方面的能力(Liu等人，2011，Nature，Vol.472：221-225；Nissan等人，2012，Cell Rep，Vol.2：1-2；Zhang等人，2011，CellStem Cell，Vol.8：31-45)。最近已经表明，这些细胞可以用于体外评价目前在HGPS患者中使用的药物对典型细胞和分子缺陷的功能效应，如核形状结构、早老蛋白表达及它们沿成骨细胞系的过早分化(Blondel等人，2014，Stem cells Transl Med，Vol.3：510-519)。
现有技术需要可获得可用于预防或治疗其中需要抑制蛋白异戊二烯化的疾病或紊乱的其它化合物。
发明简述
现在已经发现，属于一类如以下定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的氨基吡啶化合物的新型化合物能够抑制蛋白质异戊二烯化，更确切是蛋白质法尼基化，同时没有毒性。
因此，本发明涉及如下定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物，其用于其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的治疗和/或预防。
此外，本发明涉及用作药物的如下定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物。
同样地，本发明进一步涉及如下定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物。
本发明还提供包含至少一种所述新型化合物和至少一种药学可接受的赋形剂的药物组合物。
附图说明
图1：21608种小分子的前层蛋白A成熟的高通量筛选
5种已鉴定的前层蛋白A调节剂(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的剂量-反应实验。各图表表示细胞活性(上面的曲线)和前层蛋白A阳性核的百分比(下面的曲线)。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
图2：所述5种前层蛋白A调节剂的HGPS缺陷的药理学评价
(2A)在用5种前层蛋白A调节剂(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种处理48小时后，测量HGPSMSC中的核形态异常(核纤层蛋白A/C免疫染色)。各图表表示8次独立实验的平均值±SD。
(2B)在5种前层蛋白A调节剂(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种存在下分化7天后，测量HGPS MSC中的成骨分化(碱性磷酸酶活性)。各图表表示8次独立实验的平均值+/-SD。对关于细胞数的数据进行归一化。
(2C)在用5种前层蛋白A调节剂(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种处理48小时后，测量HGPS MSC中的细胞增殖(Ki-67免疫染色)。各图表表示8次独立实验的平均值+/-SD。
图3：Mono-AP的结构-活性的关系
(A)在用10μM的47种含有Mono-AP结构域的化合物处理48小时后，HGPS MSC中的前层蛋白A染色的核的自动定量分析。将数据与FTI 1μM(红色)进行比较。各值表示4次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(B)HGPS MSC中的前层蛋白A成熟过程鉴定为阳性的9种目标物(hits)(Mono-AP21、Mono-AP28、Mono-AP26、Mono-AP9、Mono-AP30、Mono-AP25、Mono-AP27、Mono-AP16、Mono-AP24)的剂量反应分析。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(C)用鉴定为阳性的9种目标物(Mono-AP21、Mono-AP28、Mono-AP26、Mono-AP9、Mono-AP30、Mono-AP25、Mono-AP27、Mono-AP16、Mono-AP24)处理后的HGPS MSC的细胞活性。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
图4：Mono-AP在HMG-CoA还原酶(HMGCR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和法尼基转移酶(FT)上的分子对接
(4A)25μM的Mono-AP1、50μM的Monop-AP2和50μM的Mono-AP3存在下FT活性的测量。1μM的替吡法尼(FTI)用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(4B)25μM的Mono-AP1、50μM的Monop-AP2和50μM的Mono-AP3存在下FPPS活性的测量。1μM的唑来膦酸用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(4C)25μM的Mono-AP1、50μM的Monop-AP2和50μM的Mono-AP3存在下HMGCR活性的测量。1μM的普伐他汀用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
图5：5种经验证的化合物对前层蛋白A成熟过程的影响
(5A)在用5种经验证的化合物(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种处理48小时后，HGPS MSC中的核纤层蛋白A/C之比的基因表达分析。数据在0.1％的DMSO处理的HGPS MSC上进行归一化。各图表表示3次独立实验的平均值+/-SD。
(5B)在用5种经验证的化合物(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种处理48小时后，HGPS MSC中的早老蛋白表达的基因表达分析。数据在0.1％的DMSO处理的HGPS MSC上进行归一化。各图表表示3次独立实验的平均值+/-SD。
图6：目标物(hits)对HDJ2和hRAS法尼基化的影响的分析
在用5种前层蛋白A调节剂(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)的每一种处理48小时后，显示GFP的胞质(未法尼基化的)定位的HGPS MSC的百分比的定量分析。各图表表示3次独立实验的平均值+/-SD。
图7：Mono-AP的结构活性关系研究
(7A)25μM的Moho-AP1、25μM的Monop-AP21和25μM的Mono-AP28存在下FT活性的测量。1μM的替吡法尼(FTI)用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(7B)25μM的Mono-AP1、25μM的Monop-AP21和25μM的Mono-AP28存在下FPPS活性的测量。1μM的唑来膦酸用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
(7C)25μM的Mono-AP1、25μM的Monop-AP21和25μM的Mono-AP28存在下HMGCR活性的测量。1μM的普伐他汀用作阳性对照。结果以对照的百分比表示。各点表示8次重复实验的百分比的平均值+/-SD。
发明详述
本发明提供抑制蛋白质异戊二烯化的新型化合物，其因此可用于预防或治疗需要抑制蛋白质异戊二烯化的任何疾病或紊乱。
更确切地，根据本发明已经发现，一类氨基嘧啶化合物是蛋白质异戊二烯化的抑制剂，所述化合物在本说明书中所详细说明。
如本文中的实施例所示，这些氨基嘧啶化合物有效地抑制蛋白质异戊二烯化，更确切是蛋白质法尼基化，同时它们没有毒性。
本文还表明，通过异戊二烯化酶的特异性靶向发挥这些氨基吡啶化合物对蛋白质异戊二烯化的抑制，所述异戊二烯化酶包括法尼基化酶如法尼基焦磷酸合酶(FPPS)。
使用通过重编程来源于患有早老症的个体的成纤维细胞得到的中胚层干细胞的细胞模型，本文已经表明，这些氨基嘧啶化合物能够修复正常表型，特别是通过抑制前层蛋白A的法尼基化。
本文表明，这些新型氨基嘧啶化合物能够挽救在早老症中遇到的核形状异常。
此外，本文表明，这些新型氨基嘧啶化合物挽救来源于患有早老症的个体的中胚层干细胞的过早分化的疾病相关表型。
此外，本文表明这些氨基嘧啶化合物没有毒性，包括没有细胞毒性。值得注意的是，这些氨基嘧啶化合物对细胞增殖具有降低的影响或没有影响，也对细胞能量代谢没有影响。
本发明描述了一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环。
根据第一方面，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团、Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
条件是
当R1为2-吡啶基时，R2不是4-甲基苯甲基，
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
条件是
当R5和R6均是甲基时，R7不是吲哚-3-基乙酰基。
根据优选的实施方式，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团、Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子或(C1-C4)烷基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
条件是
当R1为2-吡啶基时，R2不是4-甲基苯甲基，
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，和
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
条件是
当R5和R6均是甲基时，R7不是吲哚-3-基乙酰基。
根据另一个方面，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
条件是
当R1为2-吡啶基时，R2不是4-甲基苯甲基，
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
条件是
当R5和R6均是甲基时，R7不是吲哚-3-基乙酰基，
当R5和R6均是甲基时，R7不是基团。
根据另一个优选的实施方式，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子或(C1-C4)烷基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
条件是
当R1为2-吡啶基时，R2不是4-甲基苯甲基，
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，和
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
条件是
当R5和R6均是甲基时，R7不是吲哚-3-基乙酰基，
当R5和R6均是甲基时，R7不是基团。
在另一个优选的实施方式中，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，和Rc为氢原子、卤素原子或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团、Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环。
在一个特别的实施方式中，本发明的主题涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基，和Rc为氢原子或卤素原子，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，和
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基。
本发明的化合物可以游离碱的形式或与药学上可接受的酸的加成盐的形式存在。
化合物的″药学上可接受的盐″表示药学上可接受的且具有母体化合物期望的药理学活性的盐。
根据本发明的化合物的适合的药学上可接受的酸加成盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、三氟醋酸盐、抗坏血酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、醋酸盐和苹果酸盐。
本发明的化合物及其盐可形成溶剂化物(例如水合物)，和本发明包括所有此类溶剂化物。
在本发明的范围内，术语：
-″卤素″理解为表示氯、氟、溴、或碘，特别是表示氯、氟或溴，更优选氟，
-本文中使用的″(C1-C4)烷基″分别是指C1-C4正、仲或叔饱和烃。实例为，但不限于，甲基、乙基、1-丙基、2-丙基，
-本文中使用的″(C1-C4)烷氧基″分别是指O-(C1-C4)烷基部分，其中烷基如上所定义。实例为，但不限于，甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基，
-表述″芳基羰基″中的″芳基″理解为表示6至10个环原子的一价单环或双环的芳族烃基。实例为，但不限于，苯基、萘基。更优选″芳基″为苯基，
-本文中使用的表述″杂芳基羰基″和″杂芳基乙酰基″中的″杂芳基″是指5至10个环原子的一价单环或双环的芳族基，其中一个或多个，优选一个、两个或三个环原子为选自N、O或S的杂原子，剩余的环原子为碳。代表性的实例包括，但不限于，吡咯基、噻吩基、噻唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基、恶唑基、异恶唑基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、喹啉基、异喹啉基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基等。优选所述杂芳基为噻吩基、呋喃基，更优选为噻吩基，和
-″患者″可以延伸到人或哺乳动物，例如猫或狗。
在特别的方面中，以下基团
表示选自以下基团的基团：
和更优选选自以下基团的基团：
在一个特别的变型中，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、 和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基。
本发明进一步涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如下所定义的式(Ia)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、 和R4为被卤素原子取代的苯基。
本发明进一步涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如下所定义的式(Ib)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中R3表示选自由以下组成的组的基团：
-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
本发明进一步涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如下所定义的式(Ic)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基。
本发明进一步涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的式(I′a)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
根据优选的实施方式，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(I′a)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其中R3表示选自由以下组成的组的基团：
根据更优选的实施方式，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(I′a)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其中R3表示选自由以下组成的组的基团：
在另一个特别的变型中，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rc和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，Rb和Rd独立地为氢原子或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环。
在另一个特别的变型中，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
根据优选的实施方式，本发明涉及一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的如上所定义的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，
其中
R5表示(C1-4)烷基，和优选甲基；
R6表示(C1-4)烷基，和优选甲基；和
R7表示以下基团：
根据本发明的优选的实施方式，所述用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物选自：
(1){2-[4-(2-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP1
(2){2-[4-(4-氟-苯基)4-羟基-哌啶-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP9
(3)[2-(4-苯甲酰基-哌啶-1-基]-嘧啶-4-基]-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP16
(4){2-[4-(3-甲基-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP21
(5){2-[4-(4-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP24
(6){4-[4-(氰基-吡啶-2-基-甲基)-嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯，即Mono-AP25
(7){2-[4-(2，4-二氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP26
(8){2-[4-(6-氟-4H-苯并[1，3]二恶英-8-基甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP27
(9){2-[4-(3-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP28
(10){2-[4-(3，4-二氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP30
(11)吡啶-4-基-{6-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-乙腈，即Mono-AP2
(12)[2-(4-苯甲基-4-羟基-哌啶-1-基)-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈，即Mono-AP3
(13){4-[6-(甲基-间-甲苯基-氨基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-基}-(1-苯基-5-丙基-1H-吡唑-4-基)-甲酮，即Di-AP2，和
(14)1-{4-[6-(甲基-间-甲苯基-氨基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-基}-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)-乙酮，即Di-AP1，
和它们的药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体和它们的混合物形式，包括外消旋混合物。
同样地，本发明还涉及如上所定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物。
因此，所述化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)和(14)以及它们的药学上可接受的盐如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、三氟醋酸盐、抗坏血酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、醋酸盐和苹果酸盐的任一种是新的，且形成本发明的一部分。
因此，同样地，本发明提供化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)和(14)以及它们的药学上可接受的盐。
式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物可包含一个或多个不对称碳原子。因此，如上所述，它们可以对映异构体或非对映异构体的形式存在。这些对映异构体、非对映异构体和它们的混合物，包括外消旋混合物，包括在本发明的范围内。
根据另一个方面，本发明涉及用作药物的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的化合物和具体化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)和(14)以及它们的药学上可接受的盐。
因此，本发明的新型化合物，即式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)以及如上所列举的具体化合物可用作药物，更特别是可用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱。所述疾病或紊乱可包括Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)、早老症、神经变性疾病、帕金森氏症、弥漫性路易体病、多系统萎缩症、香-德综合征、纹状体黑质变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、泛酸激酶相关神经变性、认知障碍、痴呆、溶酶体贮积症、II型糖原贮积病、黏多醣贮积症、粘脂贮积病II、粘脂质贮积病III、粘硫脂病、GM2活化蛋白缺乏变体AB、Danon病、萨拉病、戴萨克斯症、山霍夫氏病、辛德勒疾病、神崎病、α-甘露糖苷过多症、β-甘露糖苷过多症、岩藻苷病、唾液腺病、天冬氨酰葡糖胺尿症、碳水化合物缺乏糖蛋白综合征、Wolman病、Farber病、尼曼匹克病型A、B和C、戈谢病、克拉伯病、法布瑞氏症、多发性硫酸脂酶缺乏症、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷脂沉积症、GM3神经节苷脂沉积症、半乳糖唾液酸贮积症、胱氨酸过多症、唾液酸贮积病、固缩骨发育障碍、异染性脑白质营养不良、半乳糖唾液酸贮积症、神经元蜡样脂褐质沉积症、乳糖酰基鞘氨醇中毒症、Pompe病、钴胺素缺乏型F、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病；线粒体病、眼病、炎性疾病、心血管病、增生性疾病、抑郁症、焦虑症、免疫性疾病、肿瘤病、肿瘤、癌症、转移瘤、白血病、恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、腺瘤、肿瘤形成、成神经细胞瘤、腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性单核细胞性白血病、血管生成髓样化生、间皮瘤、神经胶质瘤、动脉粥样硬化、胆石、胆结石、脂肪肉芽肿(lipocalcinogranulomatosis)、高胆固醇血症、高脂蛋白血症、胆固醇结晶栓塞、心肌梗死、脑梗死、心绞痛、骨质疏松症、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、佩吉特病、神经纤维瘤型1、豹皮综合征、努南综合征、Legius综合征、先天性水痘症候群、遗传性牙龈纤维瘤型1、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、毛细管畸形-动静脉畸形、皮肤老化、激素老化、光诱导皮肤过早衰老、肌肉-脂肪-皮肤老化、限制性皮肤病、头发改变或脱落、脱发病、丁型肝炎病毒感染和病毒感染。
更特别地，所述肿瘤和癌症选自骨、脑、肾、肝、肾上腺、结肠直肠、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、胰腺、肺、非小细胞肺、小细胞肺、阴道、甲状腺、颈部和头部癌症和肿瘤。
本发明的化合物可通过本领域技术人员实践的有机合成常规方法制备。以下概述的一般反应顺序表示用于制备本发明化合物的一般方法，并不意味着限制范围或通用性。
如以下在方案1、2和3中所说明和图示的，三条路线，分别为路线A、路线B和路线C，可用于回收根据本发明的化合物。
方案1：路线A
将1当量的0.1M的2-吡啶基乙腈、3-吡啶基乙腈或4-吡啶基乙腈和优选2-吡啶基乙腈的THF溶液滴加至1.1当量的0.1M的氢化钠在四氢呋喃(THF)中的悬浮液。搅拌所述混合物30分钟，然后通过冰浴冷却至0℃。滴加1当量的1M的二氯嘧啶如2，4-二氯嘧啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并在室温下搅拌所述反应混合物过夜。部分蒸发所述反应混合物，用水稀释，并使用浓缩的HCl回到pH7。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的橙色固体(卤化中间体)。
在1当量的适当的仲胺R2H和1当量的二异丙基乙胺(DIEA)存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。
所述路线A特别适合于式(I)的化合物，其中R1、R2和R4如以上式(I)所定义的，R3表示(C1-C4)烷氧基-羰基甲基或基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re如以上式(I)所定义。
更特别地，如以下在实验部分更详细示出的，化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)和(12)可通过路线A制备。
方案2：路线B
将1当量的0.1M的2-吡啶基乙腈、3-吡啶基乙腈或4-吡啶基乙腈和优选4-吡啶基乙腈的THF溶液滴加至1.1当量的0.1M的氢化钠在THF中的悬浮液。搅拌所述混合物30分钟，然后通过冰浴冷却至0℃。滴加1当量的1M的4，6-二氯嘧啶的DMF溶液，并在室温下搅拌所述反应混合物过夜。部分蒸发所述反应混合物，用水稀释，并使用浓缩的HCl回到pH7。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的橙色固体。
在5当量的哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。
在2当量的DIEA存在下，将0.2M的酸溶解在DMF中。添加1当量的0.2M的O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)的溶液，并搅拌反应混合物5分钟。添加DMF中的0.2M胺当量，并搅拌反应介质1小时，然后蒸发。将残留物再溶解在乙酸乙酯中，并用1M Na2CO3洗涤，然后用水洗涤。蒸发有机相，并在C18上在水/甲醇梯度中纯化所述产物。
路线B特别适合于式(I)的化合物，其中R1如以上式(I)所定义，R2为R3表示芳基羰基如苯甲酰基或杂芳基羰基如噻吩基羰基。
更特别地，如以下在实验部分更详细示出的，化合物(11)可通过路线B制备。
方案3：路线C
将1当量的0.1M的R5-苯基-N-R6如N-甲基-间甲苯胺的乙醇溶液添加至1当量的0.1M的二氯嘧啶如4，6-二氯嘧啶的乙醇溶液。使所述介质回流4小时，然后部分蒸发，并用水稀释。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的固体。
在5当量的哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。
在2当量的DIEA存在下，将0.2M的酸溶解在DMF中。添加1当量的0.2M的TBTU溶液，并搅拌所述反应混合物5分钟。添加DMF中的0.2M胺当量，并搅拌反应介质1小时，然后蒸发。将残留物再溶解在乙酸乙酯中，并用1M Na2CO3洗涤，然后用水洗涤。蒸发有机相，并在C18上在水/甲醇梯度中纯化所述产物。
路线C特别适合于式(II)的化合物，其中R5和R6如以上式(II)所定义，R7为芳基羰基、任选被选自(C1-C4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基、和任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基。
更特别地，如以下在实验部分更详细示出的，化合物(13)和(14)可通过路线C制备。
根据本发明的一些化合物的化学结构和数据分别示出在下表I和表II中。
已经通过液相色谱-质谱法(LC/MS)进行根据本发明的各化合物(1)至(14)的表征。
分析条件如下：
装置：偶联至质谱仪Micromass/Waters Platform LC的Waters 2795HPLC
柱：Varian Pursuit C18(2.0×20.0mm，5微米)
流速：0.8mL/min
分析时间：5min
检测：Waters 996Diode Array(180-500nm)
流动相：pH 8的10mM在水/甲醇(9/1以体积计)中的甲酸铵(A)和10mM在甲醇中的甲酸铵(B)。
洗脱：
时间(min) A(％，v/v) B(％，v/v)
0 100 0
0.2 100 0
2.7 0 100
4.4 0 100
5 100 0
使用电喷射电离源(ES＜+＞)得到质谱。
此外，表II包括根据本发明的各化合物(1)至(14)的纯度、分子量和保留时间。
表I
表II
在此说明的氨基吡啶化合物以及含有其的药物组合物的施用方法描述在本说明书的其它地方。
以下实施例详细地示出根据本发明的化合物(1)至(14)的制备。所得到的产物的结构已经至少通过LC-MS确认。
具体实施方式
实施例I：根据本发明的化合物的制备
如上所述：
-根据本发明的化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)和(12)可通过路线A制备；
-根据本发明的化合物(11)可通过路线B制备；和
-根据本发明的化合物(13)和(14)可通过路线C制备。
实施例I-1：Mono-AP1，表I的化合物(1)
步骤1
将1当量的0.1M的2-吡啶基乙腈的THF溶液滴加至1.1当量的0.1M的氢化钠在四氢呋喃(THF)中的悬浮液。搅拌所述混合物30分钟，然后通过冰浴冷却至0℃。滴加1当量的1M的2，4-二氯嘧啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并在室温下搅拌所述反应混合物过夜。部分蒸发所述反应混合物，用水稀释，并使用浓缩的HCl回到pH7。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的橙色固体(卤化中间体)。得到所述卤化中间体，产率为55％。
步骤2
在1当量的1-(2-氟苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(1)，产率为82％。
实施例I-2：Mono-AP9，表I的化合物(2)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的4-(4-氯苯基)哌啶-4-醇和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热所述反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(2)，产率为80％。
实施例I-3：Mono-AP16，表I的化合物(3)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的苯基-哌啶-4-基-甲酮盐酸盐和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热所述反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(3)，产率为75％。
实施例I-4：Mono-AP21，表I的化合物(4)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(3-甲基苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(4)，产率为84％。
实施例I-5：Mono-AP24，表I的化合物(5)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(4-氟苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(5)，产率为76％。
实施例I-6：Mono-AP25，表I的化合物(6)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(3-甲基苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(6)，产率为84％。
实施例I-7：Mono-AP26，表I的化合物(7)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(2，4-二氟苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(7)，产率为89％。
实施例I-8：Mono-AP27，表I的化合物(8)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(6-氟-4H-苯并[1，3]二恶英-8-基甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热所述反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(8)，产率为74％。
实施例I-9：Mono-AP28，表I的化合物(9)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(3-氟苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(9)，产率为83％。
实施例I-10：Mono-AP30，表I的化合物(10)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的1-(3，4-二氟苯甲基)哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(10)，产率为87％。
实施例I-11：Mono-AP3，表I的化合物(12)
首先，进行如以上实施例I-1中所述的步骤1。
步骤2
在1当量的4-苯甲基-哌啶-4-醇和1当量的二异丙基乙胺(DIEA)存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并将所述反应混合物加热至130℃持续1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到化合物(12)，产率为71％。
实施例I-12：Mono-AP2，表I的化合物(11)
步骤1、2和3
将1当量的0.1M的4-吡啶基乙腈的THF溶液滴加至1.1当量的0.1M的氢化钠在THF中的悬浮液。搅拌所述混合物30分钟，然后通过冰浴冷却至0℃。滴加1当量的1M的4，6-二氯嘧啶的DMF溶液，并在室温下搅拌所述反应混合物过夜。部分蒸发所述反应混合物，用水稀释，并使用浓缩的HCl回到pH7。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的橙色固体。
在5当量的哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到所述中间产物，产率为50％。
在2当量的DIEA存在下，将0.2M的2-噻吩羧酸溶解在DMF中。添加1当量的0.2M的O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)的溶液，并搅拌反应混合物5分钟。添加1当量的在DMF中的0.2M胺中间体，并搅拌反应介质1小时，然后蒸发。将残留物再溶解在乙酸乙酯中，并用1M Na2CO3洗涤，然后用水洗涤。蒸发有机相，并在C18上在水/甲醇梯度中纯化所述产物。得到化合物(11)，产率为70％。
实施例I-13：Di-AP2，表I的化合物(13)
步骤1和步骤2：
将1当量的0.1M的N-甲基-间甲苯胺的乙醇溶液添加至1当量的0.1M的4，6-二氯嘧啶的乙醇溶液。使所述介质回流4小时，然后部分蒸发，并用水稀释。用乙酸乙酯萃取所述溶液，干燥有机相，并蒸发，得到不进一步纯化即使用的固体。
在5当量的哌嗪和1当量的DIEA存在下，将0.1M所述卤化中间体溶于DMF中，并在130℃下加热反应混合物1小时。蒸发反应介质，并通过在C18半自动装置上在水/甲醇梯度中的色谱法纯化所述产物。得到所述中间产物，产率为50％。
步骤3：
在2当量的DIEA存在下，将0.2M的1-苯基-5-丙基-1H-吡唑-4-羧酸溶解在DMF中。添加1当量的0.2M的TBTU溶液，并搅拌所述反应混合物5分钟。添加1当量的在DMF中的0.2M胺中间体，并搅拌反应介质1小时，然后蒸发。将残留物再溶解在乙酸乙酯中，并用1M Na2CO3洗涤，然后用水洗涤。蒸发有机相，并在C18上在水/甲醇梯度中纯化所述产物。得到化合物(13)，产率为70％。
实施例I-14：Di-AP1，表I的化合物(14)
进行如以上实施例I-13中所定义的步骤1和步骤2。
步骤3：
在2当量的DIEA存在下，将0.2M的(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸溶解在DMF中。添加1当量的0.2M的TBTU溶液，并搅拌所述反应混合物5分钟。添加1当量的在DMF中的0.2M胺中间体，并搅拌反应介质1小时，然后蒸发。将残留物再溶解在乙酸乙酯中，并用1M Na2CO3洗涤，然后用水洗涤。蒸发有机相，并在C18上在水/甲醇梯度中纯化所述产物。得到化合物(14)，产率为74％。
实施例II：药理学数据
A.材料和方法
成纤维细胞重编程
从在Assistance Publiquede Marseille进行的患者13-8243的患者活组织检查分离用于本研究的成纤维细胞，并由Coriell Cell Repository(Camden，USA)提供对照DM4603。使用利用OCT4、KLF4、SOX2、c-Myc的Yamanaka的初始方法将成纤维细胞重编程为iPS细胞，使用逆转录病毒载体转录(Takahashi等人，2007，Cell 131，861-872)。
多能性干细胞培养和分化
使WT和HGPS iPS细胞在STO小鼠成纤维细胞上生长，用10mg/ml的以30000/cm2接种的丝裂霉素C灭活，并如前所述生长(Nissan等人，2012，Cell report 2：1-9)。
对于分化，使用我们组先前发表的用于分化的定向方案(Nissan等人，2012，Cellreport 2：1-9)，将iPSC分化为间充质干细胞MSC。
基于前层蛋白A定位细胞的试验
将2000个HGPS MSC铺板在黑色384孔透明底板(Corning)中。在药物处理48h后，将细胞固定在4％多聚甲醛中(15分钟，室温)。在补充有0.1％triton X-100和1％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)和兔抗前层蛋白A(ANTOO45，Diatheva)的PBS溶液中，在4℃下同时进行透化、封闭和初级杂交步骤过夜。用结合有物种特异性荧光团的第二抗兔抗体(Invitrogen)染色细胞(1小时，室温)，并用Hoechst 33342使核显形。使用洗涤/染色站(ELx405Biotek，RapidStak Thermo，Multidrop Labsystems)自动进行这些步骤。使用ArrayScan VTI HCS Reader(Cellomics)分析前层蛋白A定位。第一通道用于核鉴定(Hoechst 33342染色)，第二个鉴定前层蛋白A染色。使用5x物镜以高分辨率相机模式获取图像，并使用Spot Detector生物应用分析。使用以Z′＝1-[3(SDP+SDN)/(MP-MN)]计算的Z′因子评估所述试验的鲁棒性，其中MP和MN分别对应于阳性对照(1μM替吡法尼)和阴性对照(0.1％的DMSO)的平均值，SDP和SDN对应于它们的标准偏差。
初级筛选处理
在Biocell 1800(Agilent)上进行初级筛选。对此，将2000个HGPSMSC接种到38μL的20％FBS培养基中，并将涂布有0.1％的明胶的黑色384孔透明底板加入每个孔中。在接种五小时后，将2μL的来自化合物库的20X化合物单次转移到细胞试验板中。在各板中，将阴性对照(0.1％的DMSO)和阳性对照(1μM的替吡法尼)分别添加第1列和第2列中。然后将培养板孵育48小时，然后处理用于前层蛋白A检测试验。在48小时期间处理72个板中的每一个，固定并使用先前描述的优化方案用特异性抗前层蛋白A抗体染色。为了防止发现有毒分子，平行监测每个区域的细胞数，并且在它们的验证和评估其表型二次表型之前排除显示高于30％的死亡率的候选者。
化合物库
化合物库包括21，608种化合物，属于以384孔板形式分布的4种不同的库，可从Prestwick Chemical(Illkirch，法国)、LOPAC(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)、CHEM-X-INFINITY(Romainville，法国)和Curie Institute(Orsay，法国)得到。所述Prestwick化合物库含有1120种FDA批准的药物。以两个浓度下试验该库：0.2μM和5μM。所述LOPAC库(Sigma-aldrich)含有一批1280种药学活性化合物。以两个浓度下试验该库：0.2μM和10μM。所述Chem-X-Infinity库由属于约30个不同化合物族的10568种小有机分子组成。以5μM的浓度下试验该库。Curie Institute库含有8，640种小分子，这些小分支是在针对不同治疗靶点(包括抗HIV、抗激酶、蛋白质-蛋白质相互作用、磷酸酶抑制剂)的优化程序中获得的。以相当于包含在2至15μM的浓度的2，5μg/mL下试验该库。
数据分析
使用连接到Spotfire软件(Tibco Co)的定制的Hiscreen应用(Discngine，巴黎，法国)进行所述筛选的数据分析。通过对每个板计算前层蛋白A核参数的百分比的Z′因子来评价筛选的鲁棒性。将与具有前层蛋白A核的细胞的百分比和每个区域的细胞数有关的原始数据归一化为DMSO对照的平均值。在这些归一化数据上平行使用Z记分板和Z分数运算法进行目标物选择。仅选择Z记分板和/或Z分数运算之3且与DMSO条件相比未减少30％以上的细胞数的目标物用于随后的验证步骤。这些后者以与用于初级筛选相同的浓度再试验，一式四份。然后，以渐进浓度测试已验证的目标物，以平行检测其功效、潜力和毒性。
成骨分化
在MSC培养基中在384孔板中以每孔600个细胞接种MSC，并如前所述进行处理。72小时后，在不存在或不存在不同药物的情况下，用STEMPRO成骨诱导培养基(Invitrogen)替代MSC培养基。在处理7天后，用95％乙醇固定细胞，通过添加碱性磷酸酶的比色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑(NBT)(Sigma-Aldrich)或该酶的显色底物(在405nm处吸光)对硝基苯基磷酸酯(pNPP)(Pierce Biotechnology)染色。
免疫细胞化学
在4步方案中，在透化和在补充有0.1％triton X-100和1％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)的PBS中封闭之前，在4％多聚甲醛中固定细胞(15分钟，室温)。将初级抗体在室温下在封闭液孵育1小时。抗体包括小鼠抗-核纤层蛋白A/C(克隆JOL2，Millipore，Billerica，USA)、兔抗前层蛋白A(ANTOO45，Diatheva)和抗Ki67(克隆Ki-S5，MAB4190，Millipore，Billerica，USA)。用结合有物种特异性荧光团的第二抗体(Invitrogen)染色细胞(1小时，室温)，并用Hoechst 33342使核显形。
ATP测量
在96个孔板(3917，Corning)中接种HGPS和对照MSC(5000个细胞/孔)，并用不同的药物处理。在独特剂量处理48小时后，根据制造商的建议，使用CellTiter(Promega)测量ATP含量。使用Analyst GT多模式板读数器(Molecular Devices)测量发光。同时，借助于自动显微镜计数各孔中的Hoechst 33342染色的核。以ATP测量与计数的细胞核数之间的比例给出所得到的结果。
蛋白质印迹法
收集MSC的全细胞溶解产物，通过SDS-PAGE分离，并通过液体转移法转移到PVDF膜上。在10％脱脂奶(Bio-Rad)中，在0.1％tris缓冲盐水(TTBS)1X中，在室温下封闭印迹1小时。使用的初级抗体为小鼠抗核纤层蛋白A/C 1∶200(Millipore，JOL2)、兔抗前层蛋白A 1/100(ANTOO45，Diatheva)和β-肌动蛋白1/200000(Sigma)。在4℃下在夜间孵育薄膜。使用结合辣根过氧化物酶的物种特异性二级抗体(GE-Healthcare，Little Chalfont，UK)，随后通过增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂(Perkin-Elmer，Waltham，USA)检测抗原-抗体结合。
定量PCR
根据制造商的方案，使用RNeasy Mini提取试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf，法国)分离全部RNA。进行柱上DNase I消化以避免基因组DNA扩增。使用Nanodrop技术检查RNA水平和质量。使用Superscript III反转录试剂盒(Invitrogen)，将总计500ng的RNA用于反转录。按照制造商的说明书，使用ABI 7900系统(Applied biosystem)和TaqMan基因表达Master Mix(Roche)进行Q-PCR分析。基因表达的定量分析基于DeltaCt方法，并对18S表达进行归一化(Assay HS_99999901_S1)。PCR引物先前已由S.Rodriguez及其同事(RodriguezS等人，2009，Eur J Hum Genet，VOL 17(7)：928-37)描述。引物序列为核纤层蛋白A(外显子11/12)，5′-TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG-3′(SEQ ID N°1)和5′-AGTTCTGGGGGCTCTGGGT-3′(SEQID N°2)；核纤层蛋白C(外显子9/10)，5′-CAACTCCACTGGGGAAGAAGTG-3′(SEQ ID N°3)和5′-CGGCGGCTACCACTCAC-3′(SEQ ID N°4)以及早老蛋白(外显子11/12)，5′-ACTGCAGCAGCTCGGGG-3′(SEQ ID N°5)和5′-TCTGGGGGCTCTGGGC-3′(SEQ ID N°6)。TaqmanMGB探针序列为核纤层蛋白A(外显子11)，5′-ACTCGCAGCTACCG-3′(SEQ ID N°7)；核纤层蛋白C(外显子10)，5′-ATGCGCAAGCTGGTG-3′(SEQ ID N°8)和早老蛋白(外显子11)，5′-CGCTGAGTACAACCT-3′(SEQ ID N°9)。用于LMNA位点试验的报告和猝灭剂染料是5′6FAM和3′-非荧光猝灭剂染料(NFQ；Applied Biosystems)。
分子对接
结构分析和对接研究基于可从蛋白质数据库获得的晶体结构。从具有吡咯基抑制剂(PDB id：2Q1L，分辨率)的配合物提取HMGCR的链C和D的结构。使用晶体结构(PDBid：1YV5，分辨率)，包括其三个镁原子但不包括其共结晶配体，建模hFPPS。使用法尼基转移酶晶体结构(PDB id：3E37，分辨率)，保持其锌阳离子，但除去其抑制剂。对于这两个结构，添加氢原子，并将实验的共结晶配体的质量中心用于限定结合位点的中心，其中进行构象搜索。AutoDock 4.2.1用于所有对接计算，使用对接参数的默认值，除了遗传算法(GA)运行的数量从10增加到200以增加构象搜索。然后使用截止值的聚类分析处理所得到的独立GA运行。
HMGCR比色活性试验
根据制造商的方案，使用HMGCoA还原酶试验试剂盒(Sigma-Aldrich)测量HMGCR活性。所述试验基于分光光度测量在340nm处吸光率的降低，其表示在底物HMG CoA存在下HMGCR的催化亚单位对NADPH的氧化。
用于FPPS和FT活性试验的细胞溶解产物的制备
将HGPS MSC的细胞团块重悬于25mM Tris-HCl pH 7.4、1mM DTT、1mM MgCl2、1mMEDTA、1mM PMSF中，并在4℃下以10,000xg离心10分钟。使用Lowry方法测定蛋白质含量。在37℃下，将含有100μg总蛋白质的细胞溶解产物的等分试样与测试物质一起孵育30min。
FPPS活性试验
使用具有一些改变的Krisans等人的方法(Krisans等人，1994，The Journal ofbiological chemistry VOL.269：14165-14169)进行FPPS试验，并由Gupta等人(Gupta等人，1999，Eur J Med Chem，VOL.43：2751-2767)描述。简言之，在150μL含有25mmol/L的Hepes，pH＝7、2mmol/L的MgCl2、1mmol/L的二硫苏糖醇、5mmol/L的KF、1％正辛基-β-吡喃葡萄糖苷、3.3μmol/L的[4-14C]IPP(18Ci/mmol)、3μmol/L的未标记的IPP和20μmol/L的香叶基二磷酸酯中测定FPPS。通过添加40μL的处理或未处理的细胞溶解产物开始反应，并在37℃下孵育45min。通过在含有100μg/mL法尼醇作为载体的80％乙醇中添加150μL的2.5mol/LHCl终止反应。样品在37℃下水解30min，以将FPP转化为法尼醇，并通过添加150μL的10％NaOH中和。将反应产物(法尼醇)萃取到1mL正己烷中，并将有机相的等分试样(200μL)用于放射性计数。测定平行样品以评价总体和非特异性放射性。在所有实验中，进行酶测定，一式三份。
FT活性试验
通过法尼基转移酶[3H]SPA酶测定(Amersham Life Science，Buckinghamshire，英国)测定FT活性。简言之，在含有50mmol/L的Hepes、30mmol/L的MgCl2、20mmol/L的KCl和5mmol/L的二硫苏糖醇的20μl的测定缓冲液、20μl的[3H]-FPP(12pmol)和20μl的生物素核纤层蛋白B中测定FT活性。通过添加40μL的处理或未处理的细胞溶解产物开始反应，并在37℃下孵育1小时。通过添加150μL的含有SPA珠的停止试剂停止反应，并在闪烁计数器中计数。FT活性以每毫升总蛋白质每分钟加入到生物素核纤层蛋白-B缩氨酸中的[3H]-FPP的pmol(pmol/min/mg prot)表示。测定平行样品以评价总体和非特异性放射性。在所有实验中，进行酶测定，一式三份。
在所述化合物存在下，使用Click-IT法尼醇(Life technologies)处理法尼基化蛋白质HGPS MSCs的测量48h。根据制造商的方案，使用Alexa555叠氮化物(Lifetechnologies)第二次显示出法尼基化蛋白质。
表面等离子体共振
使用BIAcore 3000仪器在25℃下测量表面等离子体共振(SPR)。将FPPS(2800RU)固定在CM5芯片的流通池上。运行缓冲液为HBSEP pH 7.4(20mM的Hepes，150mM的NaCl和0.005％的P20)。使用10mM甘氨酸，pH 3.0，进行再生。使用在1.95nM至5μM的浓度范围注射的化合物进行用于FPPS粘合剂的亲合性测定的测量。使用Scrubber2(Biologic软件)和BIAeval软件(BIAcore)评价数据。
Ras法尼基化的测量
通过分析过量表达编码在C末端融合至GFP的哺乳动物hRas的CaaX盒的质粒的HGPS MSC中的GFP定位来测量Ras法尼基化。
活细胞成像
在96孔板中以每孔2500个细胞接种HGPS MSC，并在所述药物存在下在7天内培养。使用IncuCyte可变焦距显微镜(Essen Bioscience)监控细胞密度。各值对应于在三个独立的孔中拍摄的四个照片的平均细胞密度。
统计分析
使用Dunnet比较试验，通过单向方差分析(ANOVA)进行统计分析。p＜0.05的值认为是显著的(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
B结果
B.1.通过高通量筛选鉴定前层蛋白A法尼基化的抑制剂
本研究在衍生自HGPS iPS细胞的MSC上进行，所述MSC如前所述(Blondel等人，2014，Stem Cells Transl Med，VOL.3：510-519)分化，并在扩增十代后使用。药物筛选策略基于前层蛋白A的亚细胞定位的检测，假定其核定位与其法尼基化的抑制直接相关。开发了高通量免疫染色测定法，以稳定地定量384孔板中的前层蛋白A表达和定位。0.1％的DMSO和FTI(1μM的替吡法尼)分别用作阴性对照和阳性对照。为了在384孔板中用FTI处理的HGPSMSC中获得均匀且可重复的前层蛋白A染色，优化药物筛选试验。通过计算阴性和阳性对照之间超过0.8的Z′因子来评估试验的质量控制。然后，按照筛选程序的不同步骤，测试来自4种不同化合物库的21，608个小分子。使用自动成像平台进行前层蛋白A定位的定量分析，在药物治疗48小时后，测量在核基质隔室中呈现前层蛋白A染色的HGPS MSC的比例。
当它们的效果优于所有测试化合物的平均值的3个标准偏差而不影响细胞活力超过30％时，化合物被认为是潜在的候选者。这产生59个目标物的第一列表。再测试实验排除那些候选者的43种，因为它们或者有毒，或者认为是假阳性。
对16种经验证的化合物，通过以逐渐增大的剂量评估其功效和毒性，显示出优于50％的功效而无细胞毒性的5种(图1)，完成药物筛选过程。EC50为1μM至34μM，超过80％的核前层蛋白A定位在最高的无毒剂量处具有平稳阶段(图1)。对于各化合物，将前层蛋白A核定位而无毒性的最高有效浓度确定为最佳浓度，随后用于二次和功能试验。蛋白质印迹分析证实，在用5种化合物(Mono-AP1、Mono-AP2、Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2)中的每种化合物处理的细胞中，增加前层蛋白A，而定量PCR显示出所述药物的翻译后效应，除了一种(Di-AP1)以外，在不同的处理之后，所述药物均显示出不增加核纤层蛋白A和早老蛋白mRNA表达(图5A和5B)。免疫染色证实，在任何这些药物存在下，在蛋白质水平上对早老蛋白表达没有影响。
5种目标物的化学结构分析显示，它们的5种含有具有一个、两个或四个氮原子结合的氨基嘧啶基(AP)，分别称为Mono-AP和Di-AP。细胞毒性测量显示这些化合物中没有一种在治疗剂量下是有毒的。最后，通过观察在两种其它异戊烯基化蛋白质HDJ2和hRas上的相似作用，证明了对前层蛋白A的法尼基化缺乏选择性。HDJ2蛋白质印迹分析显示，在Mono-AP1、Mono-AP2，Mono-AP3、Di-AP1和Di-AP2处理后，所述蛋白质的未法尼基化的形式增加。通过其在过量表达编码在C末端与GFP融合的哺乳动物hRa的CaaX盒的质粒的HGPS MSC中的定位测量的hRAS法尼基化，显示出在所有化合物存在下未法尼基化的CAAX盒显著增加。在单氨基嘧啶处理后，在HGPS MSC中法尼基化蛋白质水平的总体降低证实了这些结果。
5种目标物对HGPS相关缺陷的功能效应
对所述5种目标物的挽救核形态异常的能力进行评价。在不同的化合物存在下，处理HGPS MSC 48小时，并染色核纤层蛋白A/C。Mono-AP1、Mono-AP2和Mono-AP3是三种最有效的化合物，在不显著不同于用作阳性对照的FTI替吡法尼的水平下修复HGPS MSC的核形态缺陷。Di-AP2还显著修复该病理性结构缺陷，而Di-AP1无效(图2A)。HGPS MSC显示出成熟分化为成骨细胞谱系(Blondel等人，2014，Stem Cells Transl Med VOL.3：510-519；Scaffidi和Misteli，2008，Nat Cell Biol VOL.10，452-459)。因此，通过在成骨分化7天后测量碱性磷酸酶活性，监测所述5种目标物的每一种对该功能损伤的效果。在不显著不同于FTI处理后观察到的那些的Mono-AP1和Di-AP1的水平下，所有化合物均能够强有力挽救该表型(图2B)。
通过测量细胞增殖和能量代谢，评估所述5种化合物的潜在副作用。Ki-67阳性增殖细胞的定量未显示用所述化合物处理的MSC的增殖减少(图2C)。有趣的是，Di-AP1能够将Ki-67阳性细胞的数量增加到65％。在长期的活体成像培养中证实了，显示Mono-AP1、Mono-AP2和Mono-AP3比FTI替吡法尼具有更少的细胞生长抑制的结果。测量HGPS MSC的ATP含量，显示任何这些分子对能量代谢没有副作用。相反地，Di-AP1增加ATP含量。
单氨基嘧啶的作用方式
由于Mono-AP是挽救两种测试的功能缺陷而不引起不良反应的最有效化合物，因而涉及所述药物作用方式的本研究的最后一部分聚焦在它们上。
为此目的，47种化合物类似物的库来源于Mono-AP1({2-[4-(2-氟苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-4-基-乙腈)，并且关于前层蛋白A的法尼基化，以10μM浓度进行评价。这组实验显示，9种化合物对前层蛋白A定位显示出超过20％的效果(图3A)。这9种第二代Mono-AP的剂量反应实验表明，它们中只有两种(Mono-AP21和Mono-AP28)比Mono-AP1更有效，分别具有1.5μM和2μM的EC50(图3B和3C)。在用Mono-AP21和Mono-AP28处理后，在挽救HGPS MSC中核形状缺陷和过早成骨中观察到类似的能力。
如Mono-AP25中用官能化链如-CH2CO2Et替换连接在哌嗪核上的苯甲基导致功效降低(图3B)。
最后，使用控制蛋白质异戊二烯化的三种关键酶(HMG-CoA还原酶(HMGCR)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)和法尼基转移酶(FT))实际评估Mono-AP1、Mono-AP2和Mono-AP3的直接相互作用，以突出优化所述化合物的潜在途径。Mono-AP与所述三种酶的结合能量的计算表示与FPPS和FT而不是HMGCR的活性位点的潜在相互作用(图5B)。Moho-AP1和Mono-AP3对接在FPPS上揭示了这些化合物的苯基结构域在与FPPS的Mg2+阳离子的阳离子-pi相互作用中的主要作用。适当的替换如给电子基团(Me、OMe或NH2)可增强Mono-AP3的苯基结构域与Mg2+阳离子的结合。Mono-AP1显示出比Mono-AP2和Mono-AP3对FT更高的亲合性，因为存在与氨基酸Y861B和S599B的氢键。最后，生物化学实验证实了Mono-AP对FPPS和FT两者而不是HMGCR的直接抑制，FT活性降低了20％，FPPS降低了40％(图4A、4B和4C，图7A、7B和7C)。
通过表面等离子体共振(SPR)实验证实了Mono-AP(Mono-AP1和Mono-AP2)与FPPS的相互作用。因此，将FPPS固定在CM5芯片上，并使用Biacore平台测量其与Mono-AP的相互作用。这些实验的结果证实了Mono-AP1和Mono-AP2与FPPS的直接相互作用，并且对于这两种相互作用，可计算平衡解离(Kd)和缔合(Ka)常数(参见下表A)。
表A
Mono-AP1 Mono-AP2
FPPS Kd(M) 2.4*10-5 2*10-4
Ka(1/M) 9.5/103 5.04*103
通过测量三种酶FT、FPPS和HMGCR在Mono-AP存在下的生化活性，进行分子对接和SPR结果的验证。生物化学试验的结果证实Mono-AP对FPPS和FT两者而不是HMGCR的直接抑制，FT活性降低20％至30％，FPPS活性降低40％至50％。
最后，剂量-反应实验允许测定在0，35至9，32μM范围内的Mono-AP1、2和3对FT和FPPS酶活性的IC50值(参见下表B)。
IC50值对应于导致氨基吡啶化合物测量的最大抑制作用的50％的测试的所述氨基吡啶化合物的浓度。
表B
IC50(μM) Mono-AP1 Mono-AP2 Mono-AP3
FPPS 1.55 1.82 5.54
FT 3.46 9.32 0.35
HMGCR 没有抑制 没有抑制 没有抑制
本文实施例的主要结果是发现能够挽救与HGPS相关的病理表型的新型法尼基化抑制剂家族(图6)。除了用于治疗HGPS的潜在用途之外，该结果强调了用于已经用法尼基化抑制剂治疗的疾病的新型分子。其还强调了iPS细胞衍生物用于药物发现的独特潜力。
在错误处理(misprocessed)的前层蛋白A的C末端的异常法尼基化基序的持续性是导致HGPS中早老蛋白毒性的主要分子机制(Cau等人，2014，Semin Cell Dev Biol.)。在该发现之后，通过使用FTI以及双膦酸酯和他汀类药物的组合设计独立的临床前和临床研究，几个团队已经表明几种已知的异戊二烯化抑制剂的兴趣(Gordon等人，2012，Proc NatlAcad Sci USA VOL.109：16666-16671；Varela等人，2008，Nat Med Vol.14：767-772)。基于FTI的临床试验的结果揭示了患者的一些有限的改进，然而，强调了需要更有效且毒性更低的新分子(Gordon等人，2012，Proc Natl Acad Sci USA VOL.109：16666-16671)。本研究基于以下假设：可以鉴定此类化合物不靶向一种特定酶，而是前层蛋白A异戊二烯化的整个过程。
有趣的是，在从21608个小分子筛选出来的全体目标物中，作为一种内部对照，三种(一种他汀类和两种喹啉)已经在其他研究中被鉴定为前层蛋白A法尼基化调节剂(Varela等人，2008，Nat Med Vol.14：767-772；Yang等人，2005，Proc Natl Acad Sci USAVOL.102：10291-10296.)。事实上，QCs最初被描述为RAS法尼基化的抑制剂，因此建议它们的治疗用途是用作癌症中的抗增殖剂(Jasinski等人，2008，Invest New Drugs VOL.26：223-232.)。在疟疾患者中，也已经对QCs在恶性疟原虫中抑制法尼基转移酶的能力进行了评价(Eastman等人，2006，Journal of lipid research VOL.47：233-240；Gupta和Prabhakar，2008，Eur J Med Chem VOL 43：2751-2767；Nallan等人，2005，J Med ChemVOL.48，3704-3713；Van Voorhis等人，2007，Antimicrobial agents and chemotherapy51，3659-3671)以及随后，保持它们干涉法尼基化的能力，评价以改进HGPS患者成纤维细胞中的核形态异常(Capell等人，2005，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.102，12879-12884)。此外，已经在人类中被广泛用于HMGCR抑制剂以降低胆固醇水平和预防心血管疾病的他汀类(Goldstein和Brown，1990，Nature VOL.343：425-430)也被描述为潜在的HGPS治疗(Varela等人，2008，Nat Med Vol.14，767-772)。
我们高通量药物筛选的最显著的结果是，所鉴定的5种化合物共有共同的化学结构氨基嘧啶基团。一组47种有关化合物的随后分析通过将9种其它化合物添加至初始列表增强了该结果。即使文献中描述的氨基嘧啶可能有不同的靶点和作用方式，有趣的是，其他最近研究已经强调了该家族化合物的治疗潜力。在过去10年中，氨基嘧啶已被描述为B-Raf的高效抑制剂(Mathieu等人，2012，J Med Chem VOL.55：2869-2881)、JAK(Tyner等人，2010，Blood VOL.115，5232-5240)、CDK1/2抑制剂(Ryu等人，2011，Bioorg Med Chem LettVOL.21：7185-7188)或EGFR和ErbB-2(Xu等人，2008，Bioorg Med Chem Lett VOL 18：4615-4619.)。还描述了氨基嘧啶(尼罗替尼)抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其是大多数慢性粒细胞性白血病患者的一线治疗靶点(Verstovsek等人，2005，Cancer VOL.104：1230-1236)。
对接研究建议，嘧啶类似物可以结合香叶基转移酶，这表明在蛋白质异戊二烯化的调控中的意义(Ethiraj等人，2013，Chem Biol Drug Des VOL.82：732-742)。将嘧啶基添加至二膦酸盐(噻吩并嘧啶)也表明，增加它们与法尼基焦磷酸合酶的烯丙基亚基的结合(Leung等人，2013，J Med Chem VOL.56：7939-7950)。本结果描述了氨基嘧啶作为蛋白质异戊二烯化的抑制剂，揭示了它们在不存在二膦酸盐的情况下调节该过程的能力。由于他们表明Mono-AP显示出对FPPS和FT活性位点的强亲合性，这导致在生物化学实验中FT和FPPS活性分别降低20％和40％，因而对接结果保持不变。
自1978年发现真菌中的蛋白质异戊二烯化机制(Kamiya等人，1978，BiochemBiophys Res Commun VOL.83：1077-1083)，已经实验证实超过100种蛋白质进行异戊二烯化，其中特别是小GTPAses Rho、Ras、Rac和Cdc24(Lane和Beese，2006，Journal of lipidresearch VOL.47：681-699)。因为这些小GTPases在许多细胞事件例如，细胞内信号转导、增殖、炎症和运动中是必需的，已经做出了大量的努力来鉴定具有治疗前景的抑制异戊二烯化的化合物。1982年，首次提出法尼基化抑制剂的治疗用途的建议是作为抗癌药物，鉴定RAS多基因家族作为人类致癌基因，随后证明它们需要法尼基化来表达它们的恶性转化活性(Bos，1989，Proc Natl Acad Sci USA VOL.102：12879-12884.)。实验研究似乎舒缓法尼基转移酶抑制剂的治疗潜力，因为取决于上下文，它们诱导细胞凋亡、细胞周期停滞或抑制细胞增殖、细胞迁移和血管生成(Berndt等人，2011，Nat Rev Cancer Vol.11：775-791)。因此，自2000年以来，使用四种不同的FTI，即替伐尼、替尼他尼、BMS-214662和L-778123，在各种癌症适应症中进行了至少75项临床试验(William等人，2012，Journal of medicinalchemistry 55，169-196)。然而，大部分这些临床试验没有成功。例如，在晚期实体癌(VanCutsem等人，2004，journal of the American Society of Clinical Oncology 22，1430-1438)或急性骨髓性白血病(，Chevallier等人，2009，Leuk Res VOL.33：1124-1126.)患者中没有观察到寿命显著增加。由于大多数药物呈现非常狭窄的治疗窗口，在接近患者使用的剂量的剂量时毒性出现，该失败的一个解释可能是患者的非最佳剂量。为了达到最佳效益/风险比的目标，事实上，Mono-AP在法尼基化中与替吡法尼一样有效，而不诱导细胞毒性，这是令人鼓舞的。失败的另一个原因可能是对法尼基转移酶的活性的限制，因为在FTI存在下可能存在N-Ras和K-Ras(即香叶酰香叶酰化)的替代异戊二烯化。这导致了被描述为靶向FPPS或HMGCR的整体异戊二烯基化抑制剂的开发。迄今为止，临床上最常用的FPPS抑制剂是无机焦磷酸盐的化学稳定类似物，二膦酸盐类的所有成员(Burr和Russell，2011，BoneVOL.49：1)。这些化合物主要用作用于骨质疏松症的治疗，因为它们抑制骨吸收。存在两大类具有不同分子机制的化合物。第一类包括非氮二膦酸盐，例如氯膦酸盐和依替膦酸盐，其模拟焦磷酸盐并抑制破骨细胞，最终导致其死亡，可能通过干扰线粒体ATP转位酶(Lehenkari等人，2002，Mol Pharmacol VOL.61：1255-1262.)。第二类，含氮化合物(N-BP)如唑来膦酸盐，通过抑制FPPS干扰特异性代谢反应。因此，它们调节由这些靶点控制的各种细胞过程，并且对于破骨细胞功能是重要的，包括细胞形态、细胞骨架排列、膜起皱、囊泡的运输和细胞凋亡(Ridley等人，1992，Cell VOL.70：389-399)(Ridley等人，1992，CellVOL.70：401-410)。最近，描述了一种新型FPPS抑制剂，即N6-异戊烯基腺苷，显示对早衰成纤维细胞中核形态异常的改进(Bifulco等人，2013，The FEBS journal VOL.280：6223-6232)。在本研究中，我们证明Mono-AP结合FPPS和FT，通过在多个位点靶向蛋白质异戊二烯化来增加另一种作用方式。因此，对于现有的异戊二烯化抑制剂，将需要监测Mono-AP在治疗前景中的使用潜力，以避免由于对前层蛋白A缺乏特异性而引起的不期望的副作用。
自发现人类多能性干细胞以来，疾病特异性细胞已变成药物验证和发现的主要工具。与其他细胞模型相比，那些细胞的公认优点是它们的人类起源、它们的生理或病理性非转化状态、它们在无限自我更新中的能力以及从理论上衍生出生物体的任何细胞表型的可能性。关于通过HTS的药物发现，代替或者除特定的生物化学靶点之外，多能性干细胞衍生物还提供了分析表型性状的可能性。在过去的10年，已经使用该能力进行了几个研究。对多能性干细胞的第一次药物筛选集中在能调节干细胞维持(Andrews等人，2010，Nat RevCancer Vol.11：775-791；Desbordes等人，2008，Cell Stem Cell VOL 2：602-612)或细胞分化(Zhu等人，2009，Cell Stem Cell VOL.4：416-426)(Shan等人，2013，Nat Chem BiolVOL.9：514-520)的化合物的鉴定上。最近，出现了不同的表型药物筛选，本研究为此增加了一个更成功的实例，旨在发现用于特定疾病如心脏肥大的潜在治疗途径(Carlson等，2013，J Biomol Screen VOL.18：1203-121)和家族性自主神经异常，其中KF-86466被鉴定为潜在的治疗(Lee等人，2012，Nat Biotechnol VOL.30：1244-1248.)。除了已经使它们独特的所有这些优点之外，有趣的是强调这些细胞可以进行功能测试的事实。正如本文中的情况一样，因此二次试验可以是补充的，并提供另外更多的还原性初级药物筛选试验的生理验证。在这里，这使我们能够基于与HGPS相关的表型性状立即反向筛选所有候选目标化合物。在此基础上，可以以成本和时间有效的方式优先考虑化合物并选择最有希望的化合物进行结构活性关系研究。
因此，在本发明中公开的化合物上进行的测试的结果表明，所述化合物可用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱。在所有之中，所述疾病或紊乱可包括Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)、早老症、神经变性疾病、帕金森氏症、弥漫性路易体病、多系统萎缩症、香-德综合征、纹状体黑质变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、泛酸激酶相关神经变性、认知障碍、痴呆、溶酶体贮积症、II型糖原贮积病、黏多醣贮积症、粘脂贮积病II、粘脂质贮积病III、粘硫脂病、GM2活化蛋白缺乏变体AB、Danon病、萨拉病、戴萨克斯症、山霍夫氏病、辛德勒疾病、神崎病、α-甘露糖苷过多症、β-甘露糖苷过多症、岩藻苷病、唾液腺病、天冬氨酰葡糖胺尿症、碳水化合物缺乏糖蛋白综合征、Wolman病、Farber病、尼曼匹克病型A、B和C、戈谢病、克拉伯病、法布瑞氏症、多发性硫酸脂酶缺乏症、GM1神经节苷脂沉积症、GM2神经节苷脂沉积症、GM3神经节苷脂沉积症、半乳糖唾液酸贮积症、胱氨酸过多症、唾液酸贮积病、固缩骨发育障碍、异染性脑白质营养不良、半乳糖唾液酸贮积症、神经元蜡样脂褐质沉积症、乳糖酰基鞘氨醇中毒症、Pompe病、钴胺素缺乏型F、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病；线粒体病、眼病、炎性疾病、心血管病、增生性疾病、抑郁症、焦虑症、免疫性疾病、肿瘤病、肿瘤、癌症、转移瘤、白血病、恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、腺瘤、肿瘤形成、成神经细胞瘤、腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性单核细胞性白血病、血管生成髓样化生、间皮瘤、神经胶质瘤、动脉粥样硬化、胆石、胆结石、脂肪肉芽肿(lipocalcinogranulomatosis)、高胆固醇血症、高脂蛋白血症、胆固醇结晶栓塞、心肌梗死、脑梗死、心绞痛、骨质疏松症、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、佩吉特病、神经纤维瘤型1、豹皮综合征、努南综合征、Legius综合征、先天性水痘症候群、遗传性牙龈纤维瘤型1、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、毛细管畸形-动静脉畸形、皮肤老化、激素老化、光诱导皮肤过早老化、肌肉-脂肪-皮肤老化、限制性皮肤病、头发改变或脱落、脱发病、丁型肝炎病毒感染和病毒感染。
更特别地，所述肿瘤和癌症选自骨、脑、肾、肝、肾上腺、结肠直肠、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、胰腺、肺、非小细胞肺、小细胞肺、阴道、甲状腺、颈部和头部癌症和肿瘤。
因此，本发明要求保护的化合物可用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱，其可选自早老症疾病、神经变性疾病、代谢疾病、线粒体病、眼病、炎性疾病、心血管病、增生性疾病、免疫性疾病、脑梗死、皮肤老化、激素老化和病毒感染。
早老症疾病可选自Hutchinson-Gilford早老综合征、Mulvihill-Smith类早老综合征和Wiedemann Rautenstrauch新生儿早衰综合征。
例如，在神经退行性疾病中，可提及痴呆、运动神经元疾病、主要影响中枢神经系统的系统性萎缩、戴萨克斯症、传染性海绵状脑病、共济失调毛细血管扩张、常染色体显性小脑共济失调、Baggio-Yoshinari综合征、Batten病、皮质基底节变性、Creutzfeldt-Jakob病、致命的家族性失眠、额颞痴呆和与17号染色体相关的帕金森综合征、具有近端显性的遗传性运动和感觉神经病变、婴儿感染性疾病、运动性共济失调、莱姆共济失调、Macchado-Joseph病、具有脑桥和小脑发育不全的精神障碍和小头畸形、多系统萎缩症、神经棘红细胞增多症、尼曼匹克病、脑桥小脑发育不良、丙酮酸脱氢酶缺乏症、蛋白质聚集、雷夫叙姆病、山霍夫氏病、香-德综合征、脊髓小脑共济失调、脊髓亚急性联合变性、脊髓性肌萎缩、亚急性硬化性全脑炎、脊髓痨、中毒性脑病、中毒性脑白质病、摇头状刺猬综合征、脑炎、癫痫、遗传性脑病、脑和脑畸形、脑积水、帕金森氏症、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALG ou LouGehrig′s疾病)、亨廷顿氏病、朊病毒病和阿尔茨海默氏病。
例如，在代谢疾病中，可提及溶酶体贮积症、肥胖症、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、糖尿病、低脂血症、半乳糖血症、苯丙酮酸尿症和唾液酸贮积病。
在溶酶体贮积病中，可提及神经节甘脂、戈谢病、尼曼匹克病、法布里病、神经酰胺病(脂肪性肉芽肿，法伯病)、sulfatidoses(异染性脑白质营养不良)、粘硫脂病(多发性硫酸脂酶缺乏症，奥斯汀病)、球状体细胞、脑白质营养不良(克拉伯病)、Hurler(黏多醣贮积症(MPS)IH)、Scheie疾病(MPS IS或IV)、Hunter(MPS II)、Sanfilippo(MPS III)、Morquio(MPS IV)、Maroteaux-Lamy(MPS VI)、Sly(MPS VII)、糖原病II型或糖原贮积病II型(也称为庞佩氏病)。
唾液酸贮积病可选自婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、萨拉病和中等严重的萨拉病。
作为线粒体疾病，可提及阿尔卑斯病、巴特综合征、致命性小儿心肌病、β-氧化缺陷、肉碱-酰基肉碱缺乏症、肉碱缺乏症、辅酶Q10缺乏症、配合物I缺乏症、配合物II型缺乏症、配合物III型缺乏症、配合物IV缺乏症、配合物V缺乏症、CPEO、CPT I缺乏症、CPT II缺乏症、KSS、乳酸性酸中毒、LBSL-脑白质营养不良、LCAD、LCHAD、Leigh病、Luft病、MAD/戊二酸尿症II型、MCAD、MELAS、MIRAS、线粒体细胞病、线粒体DNA耗尽、线粒体脑病、线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD或DMDF)、皮尔森综合征、丙酮酸脱羧酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶缺乏症、POLG突变、呼吸链、Leber氏遗传性视神经病变、共济失调、色素性视网膜炎、下垂症、肌源性胃肠道脑病、带有破裂红色纤维的肌阵挛性癫痫(MERRF)、SCAD、SCHAD和VLCAD。
眼病可选自睑外翻、兔眼、眼睑松弛、下垂症、眼睑黄斑瘤、眼睑炎、利什曼病、罗阿丝虫病、盘尾丝虫病和虱病中的眼睑的寄生虫感染，疱疹病毒感染、麻风病、触染性软疣、雅司病、带状疱疹和肺结核中眼睑的牵连，脓疱病中眼睑的牵连、泪腺炎、泪溢、dysthyroidexophtalmos、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、角膜溃疡、角膜擦伤、雪盲、弧眼、Thygeson氏表面点状角膜病、角膜新血管形成、Fuch′s营养不良症、干性角膜结膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、白内障、脉络膜视网膜炎症、脉络膜视网膜瘢痕、脉络膜变性、遗传性脉络膜营养不良、脉络膜出血和破裂、脉络膜脱离、脉络膜视网膜炎、视网膜脱离、视网膜分裂、视网膜动脉闭塞、视网膜静脉阻塞、视网膜病、年龄相关的黄斑变性、外周视网膜变性、视网膜色素变性、视网膜出血、视网膜层分离、黄斑水肿、青光眼、浮游物、Leber氏遗传性视神经病变、视盘脉络膜疣、斜视、眼肌瘫痪、内斜视、外斜视、远视、近视、散光、屈光参差、老花眼、适应障碍、弱视、Leber先天性黑斑、暗点、色盲、夜盲症、失明、红眼和阿盖尔罗伯逊瞳孔。
例如，在炎症性疾病中，可提及阿尔茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、克罗恩氏病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维组织肌痛、肝炎、过敏性肠综合征(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森氏症、溃疡性结肠炎。
举例来说，在心血管病中，可提及冠状动脉疾病(CAD)如心绞痛和心肌梗死(俗称心脏病发作)、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心房颤动、先天性心脏病、心内膜炎、主动脉瘤、外周动脉疾病和静脉血栓形成。
增生性疾病可选自肿瘤性疾病、肿瘤、癌症、转移瘤。
更特别地，如以上所述，肿瘤和癌症可选自骨、脑、肾、肝、肾上腺、结肠直肠、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、胰腺、肺、非小细胞肺、小细胞肺、阴道、甲状腺、颈部和头部癌症和肿瘤。
举例来说，癌症可选自白血病、恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、腺瘤、肿瘤形成、成神经细胞瘤、腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性单核细胞性白血病、血管生成髓样化生、间皮瘤和胶质细胞瘤。
免疫性疾病可选自急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性家族性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自家免疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻疹、轴索&神经元神经病、巴罗病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯曼病、乳糜泻、恰加斯病、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜炎天疱疮、克罗恩氏病、耳蜗前庭综合征、冷凝集素病、先天性心脏阻塞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST疾病、基本混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病、皮炎疱疹、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler氏综合征、子宫内膜异位、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、埃文斯综合征、纤维组织肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球性肾炎、古德帕斯彻综合征、具有多血管炎的肉芽肿病(GPA)(以前称为韦格纳氏肉芽肿)、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、少年关节炎、少年糖尿病(1型糖尿病)、少年肌炎、川崎综合征、Lambert-Eaton综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、地衣硬化症、木样结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病、慢性美尼尔氏病、微观多血管炎、混合型结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡、穆-哈病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic′s)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神紊乱)、附肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、Pars平面炎(周围性葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征、多肌痛风湿病、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞发育不良、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥性综合征、精子与睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac′s综合征、交感性眼炎、Takayasu′s动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、Vesiculobullous皮肤病、白癜风和韦格纳氏肉芽肿(现称为具有多血管炎的肉芽肿病(GPA))。
皮肤老化可选自光诱导皮肤过早老化和肌肉脂肪皮肤老化。
例如，在病毒感染中，可提及水痘、流感(流行性感冒)、人类免疫缺陷性病毒(HIV/AIDS)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、麻疹和风疹、带状疱疹、病毒性胃肠炎(肠胃炎)、病毒性肝炎、病毒性脑膜炎、登革热、切昆贡亚热、病毒性肺炎、禽流感；普通感冒、巨细胞病毒(CMV)感染、埃博拉病毒感染、马尔堡病毒感染、汉他病毒感染、单纯疱疹病毒感染、传染性单核细胞增多症、拉沙发烧和南美出血热、中东呼吸综合征(MERS)、脊髓灰质炎、带状疱疹神经痛、严重急性呼吸综合征(SARS)、天花、H1N1猪流感和黄热病。
为此目的，可以将有效量的所述化合物施用于患有其中需要抑制蛋白质异戊二烯化、更确切是抑制蛋白质法尼基化的疾病或紊乱的患者，特别是HGPS和早老症，以及来自以上提及的疾病。
本发明还涉及选自根据本发明的如上定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的任一个的化合物和如上定义的化合物(1)至(14)的至少一种化合物或其药学上可接受的盐之一在制备旨在用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化、更确切是抑制蛋白质法尼基化的疾病或紊乱，特别是HGPS和早老症以及所有以上列举的疾病的药物组合物中的用途。
本发明还包括药物组合物，其包含选自如上定义的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)的新化合物和如上定义的化合物(1)至(14)的至少一种化合物或其任何药学上可接受的盐。
因此，这些药物组合物含有有效量的所述化合物和一种或多种药物赋形剂。
根据剂型和期望的施用模式选择上述赋形剂。
在这方面，它们可以以适合于肠内或肠胃外施用的任何药物形式与适当的赋形剂一起存在，例如以平片或包衣片、硬明胶、软壳胶囊和其它胶囊、栓剂或可饮用的，如悬浮液、糖浆、或可注射的溶液或悬浮液的形式，其剂量能够每日施用0.1至1000mg活性物质。
本发明进一步涉及一种患有其中需要抑制蛋白质异戊二烯化、更确切是抑制蛋白质法尼基化的疾病或紊乱的患者的治疗方法，特别是HGPS、早老症或以上列举的疾病的任一种，其至少包括向患有它们的患者施用有效量的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(I′a)以及(1)至(14)任一个的化合物或其药学上可接受的盐之一的步骤。
序列表
<110> 国家医疗保健研究所(INSERM)
<120> 可用作蛋白质异戊二烯化的抑制剂的新型氨基吡啶化合物
<130> PR73628
<150> EP14306578.7
<151> 2014-10-08
<160> 9
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白A引物
<400> 1
tcttctgcct ccagtgtcac g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白A引物
<400> 2
agttctgggg gctctgggt 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白C引物
<400> 3
caactccact ggggaagaag tg 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白C引物
<400> 4
cggcggctac cactcac 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 早老蛋白引物
<400> 5
actgcagcag ctcgggg 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 早老蛋白引物
<400> 6
tctgggggct ctgggc 16
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白A探针
<400> 7
actcgcagct accg 14
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核纤层蛋白C探针
<400> 8
atgcgcaagc tggtg 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 早老蛋白探针
<400> 9
cgctgagtac aacct 15

Claims (16)

1.一种用于治疗和/或预防其中需要抑制蛋白质异戊二烯化的疾病或紊乱的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其可选地选自：
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
条件是
当R1为2-吡啶基时，R2不是4-甲基苯甲基，
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
条件是
当R5和R6均是甲基时，R7不是吲哚-3-基乙酰基。
2.用于根据权利要求1的用途的化合物，其可选择地选自
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-杂芳基羰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，和Rc为氢原子、卤素原子或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环，
和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
和
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基、或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环。
3.用于根据权利要求1或2的用途的化合物，其为式(II)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-芳基羰基，
-任选被选自(C1-4)烷基和苯基的一个或两个基团取代的杂芳基羰基，
-任选在杂芳基环上被苯基取代的杂芳基乙酰基，
-(C1-C4)烷氧基-羰基甲基，和
-基团，Ra、Rc和Re独立地为氢原子、卤素原子、(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，Rb和Rd独立地为氢原子或(C1-C4)烷氧基，Ra和Rb、或Rb和Rc、或Rc和Rd、或Rd和Re一起任选与它们连接的碳原子形成稠合至包含两个氧原子的苯基环的5或6元环。
4.用于根据权利要求1至3任一项的用途的化合物，其可选择地选自
(1)
其中
R1为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；
R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、 和R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基；
(2)
其中
R5表示氢原子或(C1-4)烷基；
R6表示氢原子或(C1-4)烷基；和
R7表示选自由以下组成的组的基团：
-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
5.用于根据权利要求1、2和4任一项的用途的化合物，其可选择地选自：
(1)
其中R2表示选自由以下组成的组的基团：
R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、 和R4为被卤素原子取代的苯基；
(2)
其中R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
(3)
其中R4为被卤素原子取代的苯基，或苯甲基。
6.用于根据权利要求1、2、4和5任一项的用途的化合物，其为式(I′a)：
其中R3表示选自由以下组成的组的基团：-CH2-C(＝O)O-(C1-4)烷基、
7.用于根据权利要求1、2、4、5和6任一项的用途的化合物，其为式(I′a)：
其中R3表示选自由以下组成的组的基团：
8.用于根据权利要求1至4任一项的用途的化合物，其为式(II)，其中
R5表示(C1-4)烷基，和优选甲基；
R6表示(C1-4)烷基，和优选甲基；和
R7表示以下基团：
9.用于根据权利要求1的用途的化合物，其选自：
(1){2-[4-(2-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(2){{2-[4-(4-氯-苯基)-4-羟基-哌啶-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(3)[2-(4-苯甲酰基-哌啶-1-基]-嘧啶-4-基]-吡啶-2-基-乙腈
(4){2-[4-(3-甲基-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(5){2-[4-(4-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(6){4-[4-(氰基-吡啶-2-基-甲基)-嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯
(7){2-[4-(2，4-二氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(8){2-[4-(6-氟-4H-苯并[1，3]二恶英-8-基甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(9){2-[4-(3-氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(10){2-[4-(3，4-二氟-苯甲基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(11)吡啶-4-基-{6-[4-(噻吩-2-羰基)-哌嗪-1-基]-嘧啶-4-基}-乙腈
(12)[2-(4-苯甲基-4-羟基-哌啶-1-基)-嘧啶-4-基}-吡啶-2-基-乙腈
(13){4-[6-(甲基-间-甲苯基-氨基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-基}-(1-苯基-5-丙基-1H-吡唑-4-基)-甲酮，和
(14)1-{4-[6-(甲基-间-甲苯基-氨基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-基}-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)-乙酮。
10.用于根据权利要求1至9任一项的用途的化合物，其中所述疾病或紊乱选自早老症疾病、神经变性疾病、代谢疾病；线粒体病、眼病、炎性疾病、心血管病、增生性疾病、免疫性疾病、脑梗死、皮肤老化、激素老化和病毒感染。
11.用于根据权利要求10的用途的化合物，其中所述增生性疾病为选自骨、脑、肾、肝、肾上腺、结肠直肠、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、胰腺、肺、非小细胞肺、小细胞肺、阴道、甲状腺、颈部和头部癌症和肿瘤的肿瘤和癌症。
12.选自根据权利要求1至8任一项所述的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(I′a)的化合物的化合物或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，其用作药物。
13.根据权利要求12的用作药物的化合物，其选自如权利要求9所限定的化合物(1)至(14)或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物。
14.选自如权利要求1至8任一项所限定的式(I)、(II)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(I′a)的化合物的化合物，或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，所述盐例如是盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、三氟醋酸盐、抗坏血酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、醋酸盐和苹果酸盐。
15.根据权利要求14的化合物，其选自如权利要求9所限定的化合物(1)至(14)，或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体及其混合物形式的任一种，包括外消旋混合物，所述盐例如是盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、三氟醋酸盐、抗坏血酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、醋酸盐和苹果酸盐。
16.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求14或15任一项所限定的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
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