CN106994125A - mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,所述的mTOR抑制剂为PP242,分子式为C16H16N6O,其结构式如式(1)所示。本发明发现,PP242制备的药物能显著抑制脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤的生长,通过抑制mTOR,使肿瘤细胞重新恢复原纤毛结构,从而能够使得细胞可以感知细胞外界状态,达到抑制肿瘤生长的效果。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备领域,尤其涉及一种mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用。
背景技术
葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)是成人发生率最高的眼内恶性肿瘤,起源于葡萄膜层,恶性程度高,极易发生早期转移,预后差,死亡率高,严重威胁患者视力与生命。因此,研究眼部黑色素瘤发生机制,对探寻眼部黑色素瘤早期诊断和治疗新靶点,提高治疗有效性,降低眼球摘除率以及转移率,提高患者视觉预后以及生存寿命,具有十分重要的临床指导和科学意义。
因此,一种治疗眼部黑色素瘤的药物是十分具有实用价值的。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明提供了一种mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,其为临床治疗提供新的靶点和治疗药物,提高治疗有效性,降低眼球摘除率,提高患者视觉预后。
本发明提供的mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,所述的mTOR抑制剂为PP242,,分子式为C16H16N6O,其结构式如式(1)所示。
较佳地,药物中的所述的mTOR抑制剂通过诱导出肿瘤细胞原纤毛从而有效调整肿瘤细胞增殖及迁移起效。
较佳地,所述的mTOR抑制剂的终浓度为1μmol/L。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明发现,PP242能显著抑制脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤的生长,通过抑制mTOR,使肿瘤细胞重新恢复原纤毛结构,从而能够使得细胞可以感知细胞外界状态,达到抑制肿瘤生长的效果。
附图说明:
图1A为本发明实施例一中的ARL13B免疫荧光实验的显微放大图。
图1B为本发明实施例一中的ARL13B组织免疫荧光的显微放大图。
图1C为本发明实施例一针对图1A中的纤毛比例统计图。
图1D为本发明实施例一针对图1B中的纤毛比例统计图。
图2为本发明实施例二中的免疫荧光实验的显微放大图以及定量统计图。
图3A为本发明实施例三中的CCK8实验细胞的细胞生存曲线图。
图3B为本发明实施例三中的平板克隆增殖实验结果图。
图4为本发明实施例四中的Transwell细胞迁移实验结果图。
图5A为本发明实施例五中的westernblot蛋白定量实验结果图。
图5B为本发明实施例五中的LC3免疫荧光实验的显微放大图。
图5C为本发明实施例五中的针对图5B的定量统计图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明,以更好地理解本发明。
实施例一:
实验名称:免疫荧光实验
实验材料:脉络膜黑色素瘤组织芯片(Me1004a),购自西安艾丽生物科技有限公司;ARL13B、r-tublin抗体及第二抗体,购自Abcam(艾博抗(上海)贸易有限公司)。
实验步骤:将组织芯片置于湿盒内,铺加PBS于组织芯片上。稀释ARL13B、r-tublin抗体于4℃,13500g离心2min。在组织芯片的一端吸去玻片上的PBS缓冲液,并从另一端加上抗体,盖上加湿盒,室温温育1h。以PBS冼玻片3次(5min/次),从切片一端加入新的PBS缓冲液,由另一端吸去旧的缓冲液。稀释的第二抗体于4℃,13500g离心2min。将第二抗体加于组织芯片上,置加湿盒中室温温育1h,以PBS洗玻片3次(5min/次)。盖盖玻片,结果如图1所示:图1A显示出正常细胞ARPE19中纤毛结构广泛存在,而肿瘤细胞株OCM1、OCM1a、OM431中缺失原纤毛结构,图1B显示出组织芯片显示,肿瘤组织纤毛比例明显降低,且随肿瘤组织转移而减少,图1C显示出正常细胞的纤毛比肿瘤细胞更加丰富,图1D显示出肿瘤组织中纤毛比例随着迁移而逐渐降低。
实施例二:
实验名称:免疫荧光实验
实验材料:ARL13B、r-tublin抗体及第二抗体,购自Abcam(艾博抗(上海)贸易有限公司)。
实验步骤:铺好细胞爬片的24孔板细胞待长至80%后弃去培养液,铺加PBS于细胞爬片上,4%PFA固定5min。稀释的ARL13B、r-tublin抗体于4℃,13500g离心2min。在组织芯片的一端吸去玻片上的PBS缓冲液,并从另一端加上抗体,盖上加湿盒,室温温育1h。以PBS冼玻片3次(5min/次),从切片一端加入新的PBS缓冲液,由另一端吸去旧的缓冲液。稀释的第二抗体于4℃,13500g离心2min。将第二抗体加于细胞爬片上,置加湿盒中室温温育1h,以PBS洗玻片3次(5min/次)。盖盖玻片,显微镜下观察结果,图2显示出,用1uMTO抑制剂处理后,肿瘤细胞纤毛比例出现显著提高。
实施例三
实验名称:细胞增殖实验
实验材料:人脉络膜黑色素瘤OCM1、OCM1a、OM431细胞,37℃,5%CO2常规培养,培养基为10%胎牛血清(FBS)的DMEM(Gibco);PP242购自MedChemExpress(MCE中国);CCK8购自日本同仁化学;六孔板购自Thermo Fisher(美国赛默飞);结晶紫购自生工公司(生工中国);
实验步骤:OCM1、OM431、OCM1a培养至密度为70%-80%,生长状态良好,折光率高时消化离心,用10%FBS DMEM重悬。OCM1、OCM1a细胞接种于96孔板,每孔2000个细胞,100ul培液,分别于0h,24h,48h,72h加入10ul CCK8,继续37℃孵育4h,上机OD450nm测吸光度值。细胞计数取1000细胞/孔铺于六孔板上,六孔板每孔含2毫升10%DMEM培液。待2周后用结晶紫染色,PBS清洗2遍,拍照计算细胞克隆团数。图3A为CCK8实验显示,用1uM PP242处理后肿瘤细胞株增殖能力下降;图3B为平板克隆实验显示,1uM PP242能抑制肿瘤细胞分裂增殖。
实施例四:
实验名称:Transwell细胞迁移实验
实验材料:37℃,5%CO2常规培养,培养基为10%胎牛血清(FBS)的DMEM(Gibco);PP242购自MedChemExpress(MCE中国);六孔板购自Thermo Fisher(美国赛默飞);结晶紫购自生工公司(生工中国);Transwell小皿购于millipore(美国密理博)。
实验步骤:使用8μm的24孔板Transwell小室。24孔板每孔内加入10%FBS的DMEM培养液900μl,将小室悬挂于24孔内,每个小室内接种10000个细胞于200μl的2%FBS的DMEM培养液中。培养2~3天后,吸去孔内和小室内培养液,PBS小心洗一次。加入结晶紫染色30min,PBS小心洗一次。将小室内测的细胞全部擦拭干净。将小室的外侧细胞拍照观察。用33%的乙酸溶液将结晶紫完全溶解,酶标仪630nm吸光值测定OD值,进行统计分析,图4为transwell实验显示出1uM PP242处理肿瘤细胞株后,肿瘤细胞迁移能力明显下降。
实施例五:
实验名称:western blot以及细胞免疫荧光
材料准备:核蛋白提取试剂盒购自Thermo Fisher(美国赛默飞),蛋白loading以及ladder购自碧云天生物公司,LC3B、P62、beta-actin、兔二抗抗体购自美国abcam公司,Western转膜、电泳试剂均购自美国Bio-rad公司。
实验步骤:弃原培养液,使用冷的PBS将洗去脱落的细胞碎片,吸净PBS后,加入适量的含PMSF蛋白裂解液RIPA,充分覆盖细胞表面,置于冰上裂解30min。使用细胞刮将细胞碎片刮下,将全部液体转移至干净的EP管内,12000rpm,4℃离心30min后,将上清液体转移至另一个干净的EP管内。BSA方法检测蛋白浓度。根据蛋白体积加入4×SDS蛋白loading,沸水内10min蛋白变性。-80℃保存待用。利用Thermo Fisher BioReagents细胞质、细胞核蛋白提取试剂盒,将细胞核蛋白单独提取。使用10%的SDS-聚丙烯酰胺胶行蛋白电泳。孔道内加入4μl蛋白Marker,等质量的变性后蛋白。置于800ml电泳缓冲液内[0.1%SDS,250mM甘氨酸(PH8.3)25mM Tris碱],80V电压恒压电泳约30min,直至蛋白样品进入下层胶内,电压换为120V,继续电泳40min。将胶取下,切除多余部分,连同海绵和滤纸一起充分浸泡于预冷的转膜缓冲液中(39mM甘氨酸,10%甲醇,48mM Tris碱)。裁剪适当大小的PVDF膜,置于甲醇中激活。按照电源阳极、海绵、滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸、海绵和电泳阴极的顺序依次摆放,并夹紧成三明治结构。加入冰砖,置于1L转膜缓冲液中。使用200mA电流恒流转膜,转膜时间根据蛋白分子大小调整。将转膜成功的PVDF膜置于5%TBS配制的BSA中,室温封闭1h。加入适量使用5%TBS配制的一抗,封于杂交袋中,4℃孵育过夜。取出PVDF膜,使用5%TBST室温清洗3次,每次10min。加入适量的二抗,封于杂交袋中,室温避光孵育1h。取出PVDF膜,使用5%TBST室温避光清洗3次,每次10min。膜待扫描使用。将PVDF膜平铺于Odyssey激光成像系统进行扫描、分析。细胞免疫荧光如前述。
图5A为western blot实验显示出,LC3蛋白随着药物处理而增高,P62随着药物处理减少,说明该药可以有效促进自噬发生。图5B为免疫荧光显示,LC3斑块在PP242处理后显著数量增多。图5C为定量说明PP242的确使得LC3斑块增多,说明PP242促进肿瘤细胞发生自噬。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明发现,PP242能显著抑制脉络膜黑色素瘤以及结膜黑色素瘤的生长,通过抑制mTOR,使肿瘤细胞重新恢复原纤毛结构,从而能够使得细胞可以感知细胞外界状态,达到抑制肿瘤生长的效果。
纤毛是突出于细胞表面的细胞器。两个中心粒中的一个在细胞分裂间期可转变成基体,在附属纤维介导下开始组装纤毛。在纤毛组装过程中,各种蛋白和脂质发生定向转运。肿瘤发生发展的作用。由于原纤毛能够影响细胞周期和调控原纤毛相关的信号转导通路,故原纤毛损伤可能参与肿瘤的发生发展过程。在细胞间期,两个中心粒的其中一个可转换成基体,然后开始组装微管形成纤毛,可见原纤毛的形成与细胞分裂呈负相关]。原纤毛缺失时,肿瘤细胞不断进行有丝分裂,抑制了细胞的分化和凋亡。TOR(target ofrapamycin)是雷帕霉素的蛋白质靶标,在自噬过程中发挥主要的调节作用,本发明率先采用mTOR抑制剂pp242首次成功诱导出原纤毛,从而有效的调整肿瘤细胞增殖以及迁移。由于迄今为止,尚没有mTOR的抑制剂在脉络膜黑色素瘤中应用的报道,现有技术中对脉络膜黑色素瘤和结膜黑色素瘤的疗效和作用机制尚不清楚。所以本发明开拓了一个新的领域。旨在为眼部黑色素瘤的临床治疗提供新的靶点和治疗药物,提高治疗有效性,降低眼球摘除率,提高患者视觉预后。
实验证明,PP242终浓度达到1μM即可达到有效的治疗浓度,且药物作用效果随着浓度升高而增加,可显著抑制眼部黑色素瘤生长。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (3)
1.mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,其特征在于,所述的mTOR抑制剂为PP242,,分子式为C16H16N6O,其结构式如式(1)所示。
2.根据权利要求1所述mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,其特征在于,药物中的所述的mTOR抑制剂通过诱导出肿瘤细胞原纤毛从而有效调整肿瘤细胞增殖及迁移起效。
3.根据权利要求1所述mTOR抑制剂在制备治疗脉络黑色素瘤药物中的应用,其特征在于,所述的mTOR抑制剂的终浓度为至少1μmol/L。
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CN112368577A (zh) * | 2018-04-12 | 2021-02-12 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 用于抑制由微尘引起的视网膜细胞损伤的物质的筛选方法,以及用于抑制由微尘引起的视网膜细胞损伤的组合物 |
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