CN106983865B - Brd4抑制剂jq1在角膜瘢痕抑制中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种BRD4抑制剂JQ1在角膜瘢痕抑制中的应用，包括将角膜基质细胞与一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物进行接触，或给予受试者一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物；本发明发现通过所述方法可以使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。本发明以BRD4为靶点，提供一种预防或治疗角膜瘢痕的药物小分子化合物JQ1，可用于该病的早期干预治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种BRD4抑制剂JQ1在角膜瘢痕抑制中的应用。
背景技术
角膜瘢痕是继发于多种角膜疾病的病理性改变，是许多角膜疾病造成视力不同程度损害甚至丧失的直接原因。角膜组织中含有角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，角膜的上皮细胞层受损后可迅速再生，而基质层和内皮细胞层在损伤后不可再生，角膜在外伤、炎症瘢痕愈合后引起角膜混浊、屈光力改变等。角膜损伤后，角膜基质细胞会死亡或者转变为修复表型，而修复表型可以使角膜基质细胞再生或导致纤维化瘢痕形成。在创伤修复过程中，受伤部位周围的角膜基质细胞分化为肌成纤维细胞，它们介导了细胞迁移、伤口收缩以及ECM重塑堆积，这些都严重影响了角膜的透明性及屈光性。
角膜瘢痕是个较难治愈的顽症，目前针对角膜瘢痕尚无有效治疗方法，临床上尝试过多种治疗方法，如雷帕霉素、氟米龙眼液治疗，或手术治疗，如采用激光、冷冻、手术切除(植皮)、放疗或用激素局部封闭等方法，但疗效预后均不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种BRD4抑制剂JQ1在角膜瘢痕抑制中的应用，该用途是基于发明人的下列发现而完成的：
当角膜损伤时，TGFβ被激活，促使角膜基质细胞转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，并同时增强炎症反应，刺激胶原蛋白大量增多，引起ECM堆积，最终角膜瘢痕形成，平滑肌肌动蛋白α-SMA是肌成纤维细胞合成的标志，其水平的高低代表成纤维细胞活化的程度。发明人发现，在人角膜基质细胞HCF的分离培养过程中，于培养基中加入一定剂量的TGFβ能诱导HCF向肌成纤维细胞转化，在诱导的过程中加入不同浓度的JQ1(50-500nM)，JQ1呈浓度梯度抑制HCF向肌成纤维细胞分化，另外与对照相比，TGFβ能提高BRD4表达，而JQ1呈梯度依赖作用抑制BRD4的表达，表明表观调控蛋白BRD4与成纤维细胞分化密切相关。以正常C57小鼠建立角膜瘢痕模型，采用3mm环钻作痕，上皮刮刀刮除角膜上皮后，用刮胡刀片刮除浅基质层建立角膜瘢痕模型，成模后结膜下注射7μl JQ1(浓度为500nM，小鼠体重为25g/只)作为治疗组(PBS为对照组)，治疗后1,3,5天照相观察瘢痕治疗情况，结果表明建模后7天小鼠角膜出现显著瘢痕，JQ1结膜下注射后5天治疗组与对照组相比瘢痕显著改善，免疫荧光、western blot结果都显示治疗后α-SMA表达量降低，表明JQ1能部分反转、治疗角膜瘢痕。以上发现促成了本发明。
其中，本发明术语为以下含义：
TGF-β转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)；
BRD4，BET家族的一个成员，能够特异性识别并结合染色质组蛋白H3/H4乙酰化赖氨酸残基，调节基因转录，是细胞生长所必需，与细胞周期调控、DNA复制及基因重排等密切相关，并在肿瘤发生发展过程中起重要作用。
JQ1作为一种小分子化合物，是BET蛋白家族的抑制剂，作用于BRD4。ECM，细胞外基质；HCF，人角膜基质细胞；α-SMA，α平滑肌肌动蛋白。
即本发明的第一目的在于提供一种制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用，包括将角膜基质细胞与一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物进行接触。
优选地，在本发明所述的制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用中，所述应用为使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
更优选地，在本发明所述的制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用中，所述角膜基质细胞为人角膜基质细胞。
优选地，在本发明所述的制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用中，所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1或其衍生物。
优选地，在本发明所述的制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用中，所述JQ1的浓度为50-500nM。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用，所述应用包括给予受试者一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物。
优选地，在本发明用于制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用中，所述应用包括使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
更优选地，在本发明用于制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用中，所述受试者为哺乳动物；更优选地，所述受试者为小鼠；最优选地，所述受试者为人。
优选地，在本发明用于制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用中，所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1或其衍生物。
优选地，在本发明用于制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用中，所述JQ1的浓度为50nM～500nM。
由上可见，本发明至少有以下优点，即：
现有技术中JQ1是一种BET蛋白家族抑制剂，可抑制多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、中线癌等多种肿瘤的生长。
而本发明发现TGFβ由角膜上皮细胞释放，在正常角膜中处于静止状态，当角膜损伤时，TGFβ被激活，促使基质细胞转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，并同时增强炎症反应，刺激胶原蛋白大量增多，引起ECM堆积，最终角膜瘢痕形成。平滑肌肌动蛋白α-SMA是一种新陈代谢活跃和具有高度收缩性的细胞，是肌成纤维细胞合成的标志，其水平的高低代表成纤维细胞活化的程度。组蛋白乙酰化是表观遗传研究的重要组成部分，BRD4通过与乙酰化赖氨酸结合调节基因的转录表达，是慢性纤维化的驱动因子，而小分子化合物JQ1则是其抑制剂，本发明以BRD4为靶点，提供一种预防或治疗角膜瘢痕的药物小分子化合物JQ1，可用于该病的早期干预治疗。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中的α-SMA表达水平的免疫荧光检测图；
图2为本发明的一个实施例中的α-SMA表达水平的western blot检测图；
图3为本发明的一个实施例中的结膜注射JQ1治疗角膜瘢痕对照图；
图4为本发明的一个实施例中的JQ1对α-SMA表达水平的免疫荧光检测图；
图5为本发明的一个实施例中的JQ1对α-SMA表达水平的western blot检测图。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，给出了治疗或预防角膜瘢痕形成的方法，该方法包括将角膜基质细胞与一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物进行接触。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述方法为使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述角膜基质细胞为人角膜基质细胞。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1或其衍生物。
优选地，在本发明的另一个实施例中，所述JQ1的浓度为50nM～500nM。
优选地，在本发明的一个实施例中，还提供了一种预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的方法，所述方法包括给予受试者一种有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述方法包括使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂或其衍生物，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述受试者为哺乳动物；更优选地，所述受试者为小鼠；最优选地，所述受试者为人。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1或其衍生物。
更优选地，在本发明的另一个实施例中，所述JQ1的浓度为50nM～500nM。
在本发明的一个实施例中，在人角膜基质细胞HCF的分离培养过程中，于培养基D/F12中加入一定剂量的TGFβ能诱导HCF向肌成纤维细胞转化，在诱导的过程中加入不同浓度的JQ1(50-500nM)，JQ1呈浓度梯度抑制HCF向肌成纤维细胞分化，另外与对照相比，TGFβ能提高BRD4表达，而JQ1呈梯度依赖作用抑制BRD4的表达，表明表观调控蛋白BRD4与成纤维细胞分化密切相关。以正常C57小鼠建立角膜瘢痕模型，采用3mm环钻作痕，上皮刮刀刮除角膜上皮后，用刮胡刀片刮除浅基质层建立角膜瘢痕模型，成模后结膜下注射500nM的JQ1 7μl(小鼠体重为25g/只)作为治疗组(PBS为对照组)，治疗后1,3,5天照相观察瘢痕治疗情况，结果表明建模后7天小鼠角膜出现显著瘢痕，JQ1结膜下注射后5天治疗组与对照组相比瘢痕显著改善，免疫荧光、western blot结果都显示治疗后α-SMA表达量降低，表明JQ1能部分反转、治疗角膜瘢痕。
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1：研究添加JQ1(Abcam,美国)对TGFβ诱导的人角膜基质细胞HCF分化的影响。
采用2.4U/ml Dispase II(Roche,美国)4℃消化正常人角膜环(山东省眼科研究所眼库提供，人角膜片中央角膜应用于临床手术后剩余的角膜环应用于本研究)过夜，显微镜下撕去上皮层和内皮，去掉多余的巩膜组织，将角膜组织剪成6-8小块，于1.25mg/ml胶原酶中37℃消化1小时，收集消化后的组织块，用D/F12+10％FBS(Gibco,美国)培养液重悬离心，接种培养皿中，为人角膜基质细胞(HCF)P0代细胞，将P2-P4代HCF细胞2000个接种于96孔板中，选择其中1孔作为对照，其余5孔加入2ng/ml TGFβ，并在其中四孔TGFβ处理孔内同时加入50-500nM JQ1,然后于5％CO2和37摄氏度的条件下培养，3天后免疫荧光检测α-SMA表达水平结果见图1。
如图1所示，免疫荧光结果显示，在人角膜基质细胞HCF的分离培养过程中，2ng/mlTGFβ处理3天显著提高了HCFα-SMA表达水平，而JQ1呈梯度依赖作用抑制α-SMA的表达。即TGFβ处理3天显著提高了HCFα-SMA表达水平，而JQ1呈梯度依赖作用抑制α-SMA的表达。
接种于6孔板且分别加入JQ1(50nM-500nM)、2ng/ml TGFβ处理的一批细胞用western blot定量检测α-SMA、BRD4(GAPDH是通用内参，不是检测对象，只是参照物)；TGFβ提高α-SMA的同时也能提高BRD4表达，并且JQ1抑制α-SMA的作用与其抑制BRD4正相关，表明BRD4在成纤维细胞分化过程中起重要作用，选择JQ1治疗瘢痕其根源是以BRD4为治疗靶点。GAPDH广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参，即将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
得到同样的结果见图2，其中，-表示阴性对照未加入相应试剂；+表示加入2ng/mlTGFβ实验组。western blot结果表明，2ng/ml TGFβ处理3天显著提高了HCFα-SMA表达水平，而JQ1呈梯度依赖作用抑制α-SMA的表达，其中100nM JQ1抑制作用已足够显著，其抑制作用与BRD4表达正相关，证实了表观遗传调控蛋白BRD4在成纤维细胞分化过程中的作用。
实施例2：研究外源性添加JQ1对角膜瘢痕的影响。
1.小鼠角膜瘢痕模型的建立及JQ1对角膜瘢痕的影响。
将12只成年C57BL/6小鼠分别用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，并用刮胡刀片刮除浅基质层建立角膜瘢痕模型，7天后小鼠角膜出现显著瘢痕，将成模小鼠随机分为对照组和实验组，结膜下注射7μl JQ1(浓度500nM，小鼠体重为25g/只)作为治疗组(PBS为对照组)，治疗后照相观察瘢痕治疗情况结果见图3，如图3所示建模后7天小鼠角膜出现显著瘢痕(左上、右上图)，JQ1结膜下注射后5天治疗组(右下图)与对照组(左下图)相比瘢痕显著改善。
2.JQ1对小鼠角膜瘢痕模型α-SMA表达的影响
取治疗后的C57BL/6小鼠眼球，置于OCT冷冻包埋剂中制作冰冻样本。用冰冻切片机制作8μm厚度冰冻切片,通过免疫荧光方法检测JQ1对α-SMA的影响。如图4所示，JQ1治疗组能明显减少角膜基质细胞中α-SMA的表达(左图为治疗后对照组，即图3左下眼球组织，右图为治疗后JQ1处理组，即图3右下眼球组织)，结果显示治疗后α-SMA表达量降低。
另外收集上述处理的小鼠角膜用RIPA蛋白裂解液(碧云天，中国)提取蛋白，采用western blot方法定量分析α-SMA表达情况，结果如图5，JQ1治疗组能明显减少α-SMA蛋白的表达,表明JQ1能部分反转、治疗角膜瘢痕。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种抑制BRD4表达的试剂在制备治疗或预防角膜瘢痕形成的药物中的应用，所述应用包括将角膜基质细胞与一种有效量的抑制BRD4表达的试剂进行接触；
所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1；
所述JQ1的浓度为50nM～500nM。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述角膜基质细胞为人角膜基质细胞。
4.一种抑制BRD4表达的试剂在制备预防或治疗受试者中的角膜瘢痕的药物中的应用，所述应用包括给予受试者一种有效量的抑制BRD4表达的试剂；
所述抑制BRD4表达的试剂为JQ1；
所述JQ1的浓度为50nM～500nM。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为使角膜基质细胞，接触有效量的抑制BRD4表达的试剂，由此减少角膜瘢痕形成、或反转、改善或治疗角膜瘢痕。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述受试者为哺乳动物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述受试者为小鼠。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述受试者为人。
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