CN106980175A - 基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置，在一个大数值孔径物镜和一个管镜构成的无限远校正光学系统中，利用离轴光束进行非荧光样品明视场显微成像；环形分布光源的M个子光源发出的光束以大倾角离轴照明样品；点亮所有子光源同时照明样品，将在管镜像方焦面形成由M个子光源单独照明的叠加图像，相机拍摄获得样品内一个层面的光切片图像；样品台在平移器的控制下，使得样品内不同的层面和物镜物方焦面重合，获得样品内多个层面的光切片图像。本发明利用焦面共轭成像，相对焦点共轭成像的点扫描共焦显微术，成像速度更快，适合于动态样品成像，并且装置简单，利用非荧光成像可避免荧光成像的生物毒性和光毒性。

Description

基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，具体涉及一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法和装置，特别涉及环形偏离物镜光轴照明样品的离轴光束焦面共轭光学切片显微术。

背景技术

广泛应用于生物医学、材料学等领域的传统宽场显微镜，由于具有较大的景深，较难获取样品内部三维结构的显微图像。光切片显微术，是一种获取样品内部三维结构图像的显微术，进一步扩展了显微镜的应用范围。光切片技术可分为荧光成像技术和非荧光成像技术，目前使用最多的是借助于荧光成像的光切片技术，例如扫描共焦荧光显微术、结构光照明荧光显微术、选择平面照明荧光显微术。但是，对于非荧光样品，只可利用样品对照明光的散射光进行成像，由于信噪比相对较弱，比荧光成像的光切片技术更难实现。利用扫描共焦显微术也可对非荧光样品进行光切片成像。扫描共焦显微术利用照明针孔和探测针孔的共轭物象关系，进行共焦的点照明和点探测成像，也就是使得来自照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所散射的光成像在探测针孔上，该点以外的任何散射光均被探测针孔阻挡，通过逐点扫描焦面处的样品层，从而获得比传统显微术更高的轴向分辨率，实现光切片成像。显然，逐点扫描的成像方式耗时，对动态物体成像非常不利，因此，对生物活体的光切片成像有局限性。结构光照明显微术也可以对非荧光样品进行光切片成像，但由于是采用结构光照明，照明装置相对复杂。另外，利用荧光成像，需对样品进行荧光标记，而荧光标记可能存在生物毒性，从而对样品产生影响；激发荧光的激发光，波长较短，对样品也可能存在光毒性。

发明内容

本发明的第一个目的是为了解决现有技术中的上述缺陷，提供一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，可有效避免扫描共焦显微术的逐点成像方式，提高光切片成像速度，以及避免荧光成像方法可能对样品产生的生物毒性和光毒性。

本发明的另一个目的是为了解决现有技术中的上述缺陷，提供一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置。

本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，所述方法包括下列步骤：

一个大数值孔径的物镜和一个管镜构成一个无限远校正光学系统，物镜的物方焦面与管镜的像方焦面形成一对物象共轭面，非荧光样品内的一个层面和物镜的物方焦面重合，一环形分布光源发出的光束偏离物镜光轴照明样品，在管镜的像方焦面处形成明视场图像，通过一台数码相机拍摄管镜像方焦面处的图像；

环形分布光源由M个子光源组成，每个子光源发出的光束均以倾角θ偏离物镜光轴照明样品；

每个子光源照明样品在管镜的像方焦面形成一幅图像，点亮所有子光源同时照明样品，将在管镜的像方焦面形成由M个子光源单独照明样品的叠加图像I(x,y)：I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_M(x,y)，相机拍摄该图像，获得样品内一个层面的光切片图像；

样品台在平移器的控制下，带动样品在物镜的光轴方向移动，使得样品内不同的层面和物镜物方焦面重合，获得样品内多个层面的光切片图像；

其中，M为整数，M≥4；倾角θ为照射样品的光束与物镜光轴之间的夹角，范围为：30°≤θ＜90°；I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_M(x,y)分别为每个子光源单独照明样品时在管镜像方焦面上形成的图像，(x,y)为相机光敏面的像素点坐标。

进一步地，将环形分布光源的M个子光源分成N组，每次点亮其中一组光源照明样品，相机依次拍摄每次照明样品时所形成的图像，将获得的N幅图像：I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_N(x,y)，利用这N幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片图像I(x,y)，消除离焦像处理的算法，可优选：N幅图像线性叠加算法I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_N(x,y)，或提取N幅图像相同坐标像素点最大值算法I(x,y)＝max[I₁(x,y),I₂(x,y),…,I_N(x,y)]；其中N为范围：2≤N≤M的整数，max[]为取最大值运算符。

进一步地，所述环形分布光源，由一个或几个光源在一旋转机构的控制下，绕物镜4光轴旋转形成，光源每旋转一个方位角Δφ，相机同步拍摄一幅图像，将旋转一周拍摄到的图像进行线性叠加，获得样品内一个层面的光切片图像；方位角Δφ范围：0＜Δφ≤90°。

本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，所述装置依次由环形分布光源、物镜、管镜和相机构成一无限远校正光路，样品置于样品台上，样品台在平移器的控制下可沿物镜光轴平移；物镜和管镜的光轴相同，且通过环形分布光源的圆环中心；环形分布光源发出光束偏离物镜光轴以倾角θ照射样品，相机的光敏面和管镜的像方焦面重合；计算机控制平移器的移动和相机的图像拍摄。

进一步地，所述环形分布光源由M个子光源组成，且均匀分布形成一圆环形，每个子光源发出的光束均以倾角θ偏离物镜光轴照明样品。

进一步地，所述物镜的数值孔径NA要足够大，使得光源偏离物镜光轴照明样品时，在管镜像方焦面处形成明视场图像，范围：0.75≤NA＜2.0。

进一步地，所述环形分布光源与所述样品之间设置有折射率匹配镜，所述折射率匹配镜为半球面平凸透镜或圆锥透镜，透镜的底面和封装有样品的载玻片粘合在一起。

进一步地，所述环形分布光源由两个设置在一个半圆环上的子光源组成，半圆环设置在一旋转平台上，旋转平台的转轴和物镜光轴重合，两子光源对称分布在所述物镜的光轴两侧，在旋转平台的控制下，绕所述物镜的光轴旋转，形成环形偏离物镜光轴照明样品；

一台计算机同时控制所述平移器的移动、所述旋转平台的转动和所述相机的同步拍摄。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)扫描共焦显微术是点对点的共焦成像，而本发明是面对面的共焦成像，成像速度更快，方便用于动态样品成像。

(2)避免荧光成像可能对样品产生的生物毒性和光毒性。

(3)相对结构光照明显微术，本发明照明装置简单。

(4)操作简单、方便实用。

附图说明

图1是实施例二中公开的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置的结构示意图；

图2是焦面处样品层在下侧离轴光束照明下的成像示意图；

图3是焦面处样品层在上侧离轴光束照明下的成像示意图；

图4是焦面内离焦样品层在下侧离轴光束照明下，管镜像方焦面成像示意图；

图5是焦面内离焦样品层在上侧离轴光束照明下，管镜像方焦面成像示意图；

图6是焦面外离焦样品层在下侧离轴光束照明下，管镜像方焦面成像示意图；

图7是焦面外离焦样品层在上侧离轴光束照明下，管镜像方焦面成像示意图；

图8是实施例三中公开的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置的结构示意图；

图9是实施例三中获得的骨骼肌样品的一个光切片图像；

图10是普通宽场显微获得的骨骼肌样品的显微图像；

图11是实施例四中公开的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置的结构示意图；

图12是实施例四中获得的肺支气管样品的一个光切片图像；

图13是普通宽场显微获得的肺支气管样品的显微图像；

图中：1-环形分布光源，2-折射率匹配镜，3-样品台，4-物镜，6-管镜，7-相机，8-平移器，9-计算机，10-旋转平台。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

传统明视场光学显微镜，由于受到衍射的限制，轴向可分辨距离一般大于600纳米，其参与成像的光束主要以物镜光轴附近的近轴光束为主。为了提高显微成像轴向分辨率，获取超薄光切片，本发明提出采用大数值孔径物镜，利用大倾角偏离物镜光轴的光束进行成像。在各种传统显微成像系统中，参与成像的光束都以近轴光束为主，这是本发明与传统显微成像技术的最大区别。尽管暗场显微镜采用离轴照明方式，其目的是使得照明光束的直射光不能进入物镜成像，保证背景是一个暗场来突显微弱散射光所成的图像，但这些用于成像的散射光仍然是以近轴光束为主。

本实施例公开了一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，所述方法包括下列步骤：

一个大数值孔径的物镜4和一个管镜6构成一个无限远校正光学系统，物镜4的物方焦面与管镜6的像方焦面形成一对物象共轭面，非荧光样品内的一个层面和物镜4的物方焦面重合，一环形分布光源1发出的光束偏离物镜4光轴照明样品，通过一台数码相机7拍摄管镜6的像方焦面处的图像；

其中，环形分布光源1由M个子光源组成，且均匀分布形成一圆环形，每个子光源发出的光束均以倾角θ离轴照明样品；子光源为LED光源或激光光源，但不限于这两种光源，子光源发出的光束可以直接照射样品，也可先通过光纤传输再照射样品。

每个子光源照明样品在管镜6的像方焦面形成一幅图像，点亮所有子光源同时照明样品，将在管镜6的像方焦面形成由M个子光源单独照明的叠加图像I(x,y)：I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_M(x,y)，相机拍摄图像，获得样品内一个层面的光切片图像；

样品台3在平移器8的控制下，带动样品在物镜4的光轴方向移动，使得样品内不同的层面和物镜物方焦面重合，获得样品内多个层面的光切片图像；

其中，M为整数，M≥4；倾角θ为照射样品的光束与物镜光轴之间的夹角，范围为：30°≤θ＜90°；I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_M(x,y)分别为每个光源单独照明样品时在管镜像方焦面上形成的图像，(x,y)为相机光敏面的像素点坐标。

物镜4采用大数值孔径的物镜，物镜4的数值孔径NA的范围在0.75≤NA＜2.0。

将环形分布光源的M个子光源分成N组，每次点亮其中一组光源照明样品，相机依次拍摄每次照明样品时所形成的图像，将获得的N幅图像：I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_N(x,y)，利用这N幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片图像I(x,y)，消除离焦像处理的算法，可优选：N幅图像线性叠加算法I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_N(x,y)，或提取N幅图像相同坐标像素点最大值算法I(x,y)＝max[I₁(x,y),I₂(x,y),…,I_N(x,y)]；其中N为范围：2≤N≤M的整数，max[]为取最大值运算符。

将一个或几个光源在一旋转机构的控制下，绕物镜4光轴旋转，形成环形离轴照明，光源每旋转一个方位角Δφ，相机同步拍摄一幅图像，将旋转一周拍摄到的图像进行线性叠加，获得样品内一个层面的光切片图像；方位角Δφ范围：0＜Δφ≤90°。

用载玻片封装的样品，环形分布光源1发出的离轴光束先透过一个折射率匹配镜2再照射样品。

对于一个无限远校正光路系统，物镜4的物方焦面与管镜6的像方焦面具有物象共轭关系，相机7置于管镜6的像方焦面，在环形大倾角的离轴光束照明样品下，获取物镜4的物方焦面处样品层的图像，图1为本发明的装置示意图。

根据阿贝相干成像理论，在相干照明模式下，照明光束照明到样品后发生衍射，直透光方向为零级衍射光束方向(或零级角谱光束方向)。在物镜光轴方向的照明光束其零级衍射光束仍然在光轴方向；在离轴光束照明下，其零级衍射光束也偏离光轴方向。零级衍射光束确定了成像系统对样品在管镜像方焦面所成像的位置。图2、图3、图4、图5、图6和图7分别给出了样品层处于物镜焦面和离焦面时，在管镜像方焦面所成像的情况。图2和图3分别表示焦面处的样品层在两束对称的离轴光束照明下，管镜像方焦面所成像情况；图4和图5分别表示焦面内的离焦样品层在两束对称的离轴光束照明下，管镜像方焦面所成像情况；图6和图7分别表示焦面外的离焦样品层在两束对称的离轴光束照明下，管镜像方焦面所成像情况。从图2和图3可看出，对焦面处的样品层，由于物镜物方焦面与管镜像方焦面的物象共轭关系，不同倾角的离轴光束照明所成像的位置是相同的，也就是，像是重叠的；从图4和图5、图6和图7可看出，对离焦样品层，不论在焦面内还是在焦面外，其像面不在管镜像方焦面，相机在管镜的像方焦面拍摄到的像是模糊的，并且不同倾角的离轴光束照明所成像在管镜像方焦面的位置是不相同的，也就是像是错开的。离焦图像的错开方向和照明光束的方向有关；图像错开量与离轴光束的倾角有关，也和离焦距离有关，还和显微放大倍数(或管镜和物镜的焦距比)有关：倾角越大，错开量越大；离焦距离越大，错开量越大；放大倍数越大，错开量也越大。本发明根据这一成像特性，采用环形不同方向、大倾角的离轴光束照明样品，对每个离轴光束所形成的图像进行消除离焦像处理。例如，共有M个子光源构成的360度环形分布光源，每个子光源单独照明所形成的图像分别为：I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_M(x,y)，将这些图像进行线性叠加，得到图像I(x,y)：I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_M(x,y)，那么叠加后的结果是，焦面处样品层的图像得到增强(因为不同方向照明的图像位置相同)，而离焦处样品层的图像将会变得更加模糊甚至消失(因为不同方向照明的图像位置错开的)，这样就可获得一个更加清晰的焦面处样品层图像，轴向分辨率得到提高，即I(x,y)为一个样品层的光切片图像；也可以提取这些图像相同坐标像素点最大值I(x,y)＝max[I₁(x,y),I₂(x,y),…,I_M(x,y)]，重建一幅消除了离焦像的图像I(x,y)，也即获得了一个样品层的光切片图像。由于本发明采用的是焦面共轭成像，不像扫描共焦显微术的焦点共轭成像，无需逐点扫描成像，相对于扫描共焦显微术，本发明将大大提高成像速度。

需要说明的是，尽管是离轴照明，但仍然是明视场成像，故物镜4的数值孔径要足够大，要保证照明光束的直射光能进入物镜4参与成像。大数值孔径物镜4，可允许的离轴照明光束倾角θ越大，光切片效果就会越好。

使用折射率匹配镜2的原因是，如果样品封装在载玻片和盖玻片之间，光源发出的光束由空气经载玻片再照明样品，由于空气和载玻片的折射率不匹配，尽管光束入射到载玻片的入射角很大，但光束进入载玻片后发生折射，使得离轴照明样品光束的离轴倾角将大幅降低，不利于提高轴向分辨率。通过使用折射率匹配镜2，可以确保最终照明光束以一个较大的离轴倾角照射样品。

实施例二

如附图1所示，本实施例公开了一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，依次由环形分布光源1、物镜4、管镜6和相机7构成一无限远校正光路，环形分布光源1发出的离轴光束以倾角θ照射样品，样品置于样品台3上，样品台3位于环形光源1和物镜4之间，样品台3在平移器8的控制下可沿物镜4的z方向光轴平移；物镜4和管镜6的光轴相同，且通过环形分布光源1的圆环中心；相机7的光敏面和管镜6的像方焦面重合；计算机9控制平移器8的移动和相机7的图像拍摄。

环形分布光源1和样品之间设置有折射率匹配镜2，折射率匹配镜2采用折射率匹配液和承载样品的载玻片连接，环形分布光源1发出的离轴光束透过折射率匹配镜2以倾角θ照射样品。

折射率匹配镜2为一平凸球面透镜或圆锥透镜，但不限于这两种透镜，透镜的底平面与载玻片连接。

实施例三

如图8所示，本实施例公开了另一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，该装置采用一个60倍、数值孔径1.49的物镜4和一个焦距200mm的管镜6组成一个无限远校正光学系统。由80个白光LED光源均匀分布在一个直径132mm的环形铝合金内面组成一个环形分布光源1，每个LED功率相同为0.15瓦。电源控制器将80个光源同时点亮，每个LED光源发出的光束同时照明一个用作折射率匹配镜2的半球面平凸透镜，半球面平凸透镜为K9玻璃材料、球面半径为10mm。半球面平凸透镜的底面通过香柏油和封装有样品的载玻片粘合在一起，固定在一个样品台3上。一个三维(x,y,z方向)平移台和一个一维(z方向)纳米平移台构成平移器8，样品台3在平移器8的控制下，使得半球面平凸透镜的中心轴和物镜4光轴重合，并将样品置于物镜4的物方焦面处。调整环形分布光源1的位置，使得物镜光轴通过环形分布光源1的圆环中心。样品台3在平移器8的控制下，在光轴z方向以纳米级精度移动，使样品中不同层面和物镜物方焦面重合。一台计算机9控制平移器8的移动和相机7的同步拍摄。调整好装置后，点亮所有LED光源，将样品内的一个层面和物镜的焦面重合，相机拍摄所成的图像。图9为利用这个装置拍摄到的一个骨骼肌样品的光切片图像，作为对比，图10给出了普通尼康倒置宽场显微镜拍摄到的图像。比较图9和图10，可看出图10中的一些离焦像在图9中已消失，图9的轴向分辨率已大幅提高，获得了光切片效果。

实施例四

如图11所示，本实施例公开了另一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，该装置采用一个60倍、数值孔径1.49的物镜4和一个焦距200mm的管镜6组成一个无限远校正光学系统。

二个功率分别为0.13瓦、波长520nm的LED光源，设置在一个半圆环上，半圆环半径为78.05mm，并对称分布在物镜4的光轴两侧，每个LED光源发出的中心光线和物镜光轴的夹角为71.3度，相交于物镜4的光轴。半圆环设置在旋转平台10上，在旋转平台10的控制下，绕物镜光轴旋转，构成环形分布光源1，形成环形离轴照明。一个三维(x,y,z方向)平移台和一个一维(z方向)纳米平移台构成平移器8，样品台3在平移器8的控制下，将样品置于物镜4的物方焦点处，并且可以控制样品台3在z方向以纳米级精度移动，以拍摄样品中不同层面的光切片图像。一台计算机9控制平移器8的移动、旋转平台10的转动和相机7的同步拍摄。点亮的环形分布光源1在旋转平台10的带动下，每旋转一个方位角Δφ，相机7同步拍摄一幅图像，将旋转一周拍摄到的图像进行线性叠加，获得样品内一个层面的光切片图像。图12为利用这个装置拍摄到的一个肺支气管样品的光切片图像，作为对比，图13给出了普通尼康倒置宽场显微镜拍摄到的图像。对比图13，图12的切片效果明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

一个大数值孔径的物镜和一个管镜构成一个无限远校正光学系统，物镜的物方焦面与管镜的像方焦面形成一对物象共轭面，非荧光样品内的一个层面和物镜的物方焦面重合，一环形分布光源发出的光束偏离物镜光轴照明样品，在管镜的像方焦面处形成明视场图像，通过一台数码相机拍摄管镜像方焦面处的图像；

所述环形分布光源由M个子光源组成，每个子光源发出的光束均以倾角θ偏离物镜光轴照明样品；

每个子光源照明样品在管镜的像方焦面形成一幅图像，点亮所有子光源同时照明样品，将在管镜的像方焦面形成由M个子光源单独照明样品的叠加图像I(x,y)：I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_M(x,y)，相机拍摄该图像，获得样品内一个层面的光切片图像；

样品台在平移器的控制下，带动样品在物镜的光轴方向移动，使得样品内不同的层面和物镜物方焦面重合，获得样品内多个层面的光切片图像；

其中，M为整数，M≥4；倾角θ为照射样品的光束与物镜光轴之间的夹角，范围为：30°≤θ＜90°；I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_M(x,y)分别为每个子光源单独照明样品时在管镜像方焦面上形成的图像，(x,y)为相机光敏面的像素点坐标。

2.根据权利要求1所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，其特征在于，

将环形分布光源的M个子光源分成N组，每次点亮其中一组光源照明样品，相机依次拍摄每次照明样品时所形成的图像，将获得的N幅图像：I₁(x,y)、I₂(x,y)、…、I_N(x,y)，利用这N幅图像进行消除离焦像处理，获得样品内一个层面的光切片图像I(x,y)，消除离焦像处理的算法采用：N幅图像线性叠加算法I(x,y)＝I₁(x,y)+I₂(x,y)+…+I_N(x,y)，或提取N幅图像相同坐标像素点最大值算法I(x,y)＝max[I₁(x,y),I₂(x,y),…,I_N(x,y)]；其中N为范围：2≤N≤M的整数，max[]为取最大值运算符。

3.根据权利要求1或2所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片方法，其特征在于，

所述环形分布光源，由一个或几个光源通过在一旋转机构的控制下，绕物镜光轴旋转形成，光源每旋转一个方位角Δφ，相机同步拍摄一幅图像，将旋转一周拍摄到的图像进行线性叠加或取最大值，获得样品内一个层面的光切片图像；方位角Δφ范围：0＜Δφ≤90°。

4.一种基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，其特征在于，所述装置依次由环形分布光源、物镜、管镜和相机构成一无限远校正光路，样品置于样品台上，样品台在平移器的控制下可沿物镜光轴平移；物镜和管镜的光轴相同，且通过环形分布光源的圆环中心；环形分布光源发出光束偏离物镜光轴以倾角θ照射样品，相机的光敏面和管镜的像方焦面重合；计算机控制平移器的移动和相机的图像拍摄。

5.根据权利要求4所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，其特征在于，

所述环形分布光源由M个子光源组成，且均匀分布形成一圆环形，每个子光源发出的光束均以倾角θ偏离物镜光轴照明样品。

6.根据权利要求4所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，其特征在于，

所述物镜的数值孔径NA要足够大，使得光源偏离物镜光轴照明样品时，在管镜像方焦面处形成明视场图像，范围：0.75≤NA＜2.0。

7.根据权利要求4所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，其特征在于，

所述环形分布光源与所述样品之间设置有折射率匹配镜，所述折射率匹配镜为半球面平凸透镜或圆锥透镜，透镜的底面和封装有样品的载玻片粘合在一起。

8.根据权利要求4所述的基于环形离轴照明焦面共轭的非荧光成像光切片装置，其特征在于，

所述环形分布光源由两个设置在一个半圆环上的子光源组成，半圆环设置在一旋转平台上，旋转平台的转轴和物镜光轴重合，两子光源对称分布在所述物镜的光轴两侧，在旋转平台的控制下，绕所述物镜的光轴旋转，形成环形偏离物镜光轴照明样品；

一台计算机同时控制所述平移器的移动、所述旋转平台的转动和所述相机的同步拍摄。