CN106967606B

CN106967606B - 一种双价酵母菌细胞的破壁方法

Info

Publication number: CN106967606B
Application number: CN201710192244.8A
Authority: CN
Inventors: 罗研华
Original assignee: Hainan Zhengqiang Chaoyue Biochemical Technology Development Co ltd
Current assignee: Hainan Zhengqiang Chaoyue Biochemical Technology Development Co ltd
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: CN106967606A

Abstract

本发明公开了一种双价酵母菌细胞的破壁方法，包括如下步骤：S1、菌种选育；S2、培养；S3、酶解；S4、钝化与干燥；S5、机械温和破碎。首先选育、培养生长快且生物量和代谢物量高的酵母菌种，这种酵母的细胞壁薄厚适中。利用这种菌种，依据发酵工艺原理确定高生物量和胞内活性代谢物的工艺；根据酵母细胞壁的特殊结构，选择合适的酶，通过酶蚀将酵母细胞壁打上孔或蚀痕，以便在较低离心力撞击下，使细胞沿孔或痕破裂；破裂的细胞未受到高温、高热的影响，活性物质未损失，再采用低温闪蒸式干燥，获得成品。

Description

一种双价酵母菌细胞的破壁方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种双价酵母菌细胞的破壁方法。

背景技术

抗生素等药物作为饲料添加剂曾一度开创了饲料工业的革命，为畜牧业的发展作出了不可磨灭的贡献。但是，随着科学研究的不断深入，人们发现抗生素长期大量使用会导致细菌产生耐药性、造成动物机体免疫力下降、引发畜禽内源性感染和二重感染，并在畜禽产品和环境中造成残留等。因而，寻求和开发无污染、无残留、安全可靠的绿色饲料添加剂替代抗生素已成为国内外学者当前研究的热点。酵母源(生物饲料)作为一类天然的绿色生物饲料添加剂，在改善动物消化道健康、强化动物免疫水平、减少动物应激、稳定饲料质量、提高畜禽产品的质量等诸多方面有着良好的应用前景。但是，以前畜牧行业所应用的都是一些诸如酵母单细胞蛋白或一些酒糟类酵母加工的初级产品或工业副产品，虽然其效果已经得到认可，但这些产品作为饲料添加剂，种类过于单一且在质量上又缺少规范性，因此远未发挥出酵母生物饲料的应有价值，更无法真正替代抗生素类饲料添加剂，市场前景和实际应用价值有限，致使畜禽产品的产量和质量无法得到真正的改善，严重制约了我国畜禽肉类产品的出口。

以往的酵母生物饲料其在应用上总是侧重单方面的营养功能或是其活性物质生理功能。并未全面发挥出酵母细胞本身所具有的高营养和高活性物质生理功能的优势，从而使在实际的畜禽养殖中需要添加多种添加剂以满足动物营养和其它生理调节的双向需要，这无疑增加了饲养成本且多种类的饲料添加剂给畜禽养殖户带来不便。而双价酵母技术正是基于对酵母的营养功能和活性物质生理功能的最大化发挥而提出的。顾名思义：“双价”酵母其“一价”即为胞内活性物质，“另一价”为营养物质，是通过新型的酵母细胞破壁技术而得到的高活性、全营养的酵母源物质。其在发酵工艺和下游提取技术上的改进和创新，使酵母细胞在保留营养成分的基础上最大限度的降低了胞内活性物质的损失，使酵母细胞在水产、畜禽饲养中发挥双价功能。从而降低了饲养成本，提高畜禽肉类的品质并使真正替代抗生素类药物成为可能，达到绿色无公害化养殖之目的。

酵母细胞的细胞壁主要成分为多糖(85％～90％)和蛋白质(10％～15％),其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的几丁质等组成。处于细胞壁内层的β-葡聚糖与几丁质共价相连起到细胞骨架的作用；而外层的甘露聚糖与中层蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸以O-糖苷键相连接，形成的甘露糖蛋白覆盖于细胞表面，给予酵母细胞一定的韧性。酵母细胞壁独特的结构致使其破壁不易，给酵母活性物质的分离提取带来不少的困难。以往的破壁方法如研磨法、冻融法、酸碱法、高压均质法等，研磨法料液损失比较严重，且由于机械产热，即使附有冷却设备，胞内活性成分仍会有较大损失；冻融法该方法对细胞损害较为严重，且操作复杂费时；酸碱法有一定的污染和不利于下游分离等缺点；高压匀质法易将细胞撞击，导致底物流失。每种破碎方法都有一定的局限性，具体选择什么样的破壁方法要根据具体情况而定。且对酵母细胞的破壁效果不理想，并且有些方法还会破坏胞内生物大分子物质的活性。为了加速酵母细胞壁的破裂，增加目的产物提取率及保证胞内生理物质的活性，将上述方法结合使用是现在普遍进行探索采用的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种双价酵母菌细胞的破壁方法，实现了加速酵母细胞壁的破裂、增加目的产物提取率及保证细胞内生理物质的活性作用。

双价酵母活性成分的应用：(1)作为蛋白来源，为动物提供营养；(2)改善动物消化道健康，提高动物生产性能；(3)改善动物的免疫机能，提高动物的抗应激能力；(4)稳定饲料质量，提高养殖效果。

本发明采用的技术手段如下：一种双价酵母菌细胞的破壁方法，包括如下步骤：

S1、菌种选育：选取活化斜面上的原始酵母菌株，接种入YEPD固体培养基中培养扩增，将扩增后的酵母菌株转接至淀粉培养基中，筛选优势酵母菌株；

S2、培养：首先将S1得到的酵母菌株接种至种子培养基中，旋转式振动培养，其次再接种至摇瓶培养基中，旋转式振动培养，最后在置有固体发酵培养基的培养池中进行发酵；

S3、酶解：采用复合酶对S2中的酵母菌株细胞壁进行酶解，所述复合酶为甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶；

S4、钝化与干燥：S3中经过酶解打孔后的酵母菌株采用闪蒸法进行低温干燥；

S5、机械温和破碎：将干燥钝化后的酵母菌株装入离心式粉碎机，进行细胞破碎。

优选地，所述步骤S1中，原始酵母菌株为产朊假丝酵母、酿酒酵母、白地霉、热带假丝酵母和酿酒酵母。

优选地，所述步骤S1中，所述YEPD固体培养基：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.0～3.0％，葡萄糖1.0～3.0％，琼脂1.5～2.0％；所述淀粉培养基：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.0～3.0％，淀粉1.0～2.0％，琼脂1.5～2.0％。

优选地，所述步骤S2中，所述种子培养基：淀粉1.0～3.0％，蛋白胨0.1～1.0％，麦芽汁0.1～0.5％，酵母膏0.1～0.5％；

所述摇瓶培养基：淀粉5.0～10.0％，酵母膏0.5～1.5％，尿素0.1～1.0％，硫酸镁0.01～0.10％，氯化钠0.005～0.015％，氯化钙0.005～0.015％，磷酸二氢钾0.005～0.015％；

所述固体发酵培养基：麸皮50～80％，玉米粉10～15％，豆粕粉25～30％，碳酸钙1～6％，硫酸铵0.1～1.0％，硫酸镁0.01～0.10％，硫酸锰0.001～0.01％。

优选地，发酵pH值为4.0～6.0，发酵时间为35～40h，发酵温度为25～35℃。

优选地，培养池的通气量为30～90m³/min。

优选地，所述步骤S2中固体发酵培养基中，还包括磷酸氢二钾0.05～0.15％，磷酸二氢钾0.5～1.5％，硫酸铵0.1～1.0％，钙锰锌镁盐0.1～0.5％。

优选地，所述步骤S3中，所述复合酶为甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的质量比为1～3:1：2～4。

优选地，所述步骤S4中，干燥温度为50～65℃。

优选地，所述离心式粉碎机的外围筛网目数为60～100。

采用本发明所提供的一种双价酵母菌细胞的破壁方法，具有以下有益效果：在培养的过程中，通过简单易得的培养基选育了细胞壁厚度适中、大小均一、敏感易被相应的酶穿孔的筛选菌株，为下一工序提供了良好的优势菌种；通过发酵过程是细胞内活性物质开始大量富集，实现二次快速生长繁殖；将酵母细胞壁进行酶解打孔，然后通过离心式粉碎机的剪切、离心撞击，轻易地使酵母破壁，是破壁与粉碎一步法完成，通过低温干燥减少破壁成本与活性物质的高热等情况下损失。通过酶解及机械法相结合的形式，加速了酵母细胞壁破裂，使得酵母细胞内的生理活性物质也能顺利地、高保留地溶出细胞内，不仅增加产物提取率及保证细胞内生理物质的活性，其中生理物质的活性含量大于90％，能够在水产、畜禽饲养中发挥“双价”功能。

附图说明

图1为本发明发酵过程中pH值的控制示意图；

图2为本发明发酵过程中通气量对酵母活性物质含量的影响示意图；

图3为本发明复合酶配比对酵母菌细胞破壁率示意图；

图4为本发明酶解pH值对酵母菌细胞破壁率示意图；

图5为本发明酶解温度对酵母菌细胞破壁率示意图；

图6为本发明粉碎机外围筛网目数对酵母菌细胞破壁率示意图；

图7为本发明粉碎机转速对酵母菌细胞破壁率示意图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：

一种双价酵母菌细胞的破壁方法，包括如下步骤：

S1、菌种选育：选取活化斜面上的原始酵母菌株，接种入YEPD固体培养基中培养扩增，将扩增后的酵母菌株转接至淀粉培养基中，进行筛选优势酵母菌株。

其中，所述原始酵母菌株为产朊假丝酵母、酿酒酵母、白地霉、热带假丝酵母和酿酒酵母。

所述活化斜面培养基：淀粉2.0g，蛋白胨0.5g，麦芽汁0.3g，酵母膏0.3g，琼脂2.0g，水100mL。pH值为5.0。

所述YEPD固体培养基：酵母膏0.5～1.5g，蛋白胨1.0～3.0g，葡萄糖1.0～3.0g，琼脂1.5～2.0g，水100mL，优选为：酵母膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，琼脂1.8g，水100mL。

所述淀粉培养基：酵母膏1g，蛋白胨2g，淀粉1.5g，琼脂1.8g，水100mL。pH值为5.0。

S2、培养：首先将S1得到的优势酵母菌株接种至装有上液量为25mL的种子培养基，并将种子培养基置于250mL的三角瓶中培养，培养温度为28℃、200rpm下进行旋转式振动培养16h。其次再按10％的接种量接种至装有上液量为50mL摇瓶培养基的500mL三角瓶中，在28℃、200rmp下旋转式振动培养16h。最后按10％的接种量接种至固体发酵培养基进行发酵35～40h后可出池，发酵培养池内保持一定湿度，温度控制在25～35℃，中间不断通气以降温、补氧，通气量为30～90m³/min；

见图1：在不控制pH的自然发酵过程中，溶液中pH呈现先降低后增大的趋势，趋势为4.0～6.0，使得菌株生长良好。且由下表可知最优pH值为5.0：

在温度对发酵过程的影响中，前期培养：入发酵池6h左右酵母生长不明显，发酵培养池温度在30℃左右，池内相对湿度85％以上。中期培养：培养6～8h以后，酵母进入对数生长期，该期是酵母细胞的积累期。后期培养：培养24h左右后，当细胞出芽率下降至10％左右时，开始进入后期培养。通过后期培养使细胞进一步成熟，同时降低物料水分。

见图2：在通气量对发酵过程的影响中，通过改变发酵池的通气量使酵母细胞生长繁殖速度减慢，并按一定时间间隔进行胞内维生素含量的检测。当通气量在45m³/min时，胞内维生素B6的含量较大，是由于酵母细胞的生长速度突然减慢，体内代谢开始转移的结果，而使维生素等生理活性物质开始积累。

所述种子培养基：淀粉1.0～3.0g，蛋白胨0.1～1.0g，麦芽汁0.1～0.5g，酵母膏0.1～0.5g，水100mL。优选为：淀粉2.0g，蛋白胨0.5g，麦芽汁0.3g，酵母膏0.3g，水100mL，且pH值为5.0。

所述摇瓶培养基：淀粉5.0～10.0g，酵母膏0.5～1.5g，尿素0.1～1.0g，硫酸镁0.01～0.10g，氯化钠0.005～0.015g，氯化钙0.005～0.015g，磷酸二氢钾0.005～0.015g，水100mL。优选为：淀粉8.0g，酵母膏1.0g，尿素0.5g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.01g，氯化钙0.01g，磷酸二氢钾0.01g，水100mL，且pH值为5.0。

所述固体发酵培养基：麸皮50～80g，玉米粉10～15g，豆粕粉25～30g，碳酸钙1～6g，硫酸铵0.1～1.0g，硫酸镁0.01～0.10g，硫酸锰0.001～0.01g，水100mL，优选为：麸皮60g，玉米粉13g，豆粕粉27g，碳酸钙4g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.05g，硫酸锰0.005g，水100mL。

当接种到发酵培养池后，前期0～16小时控制温度28～33℃，pH5.0～5.5，通气量60～120m³/min的条件下发酵16小时左右。当酵母细胞生物量达到一定水平后，降低温度到26～27℃，通气量45m³/min，pH维持在5.0，在促进胞内生理活性物质合成和积累的阶段，并加入适量的酵母营养素(磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.5％、钙锰锌镁盐0.3％)，从而防止酵母细胞的过度生长繁殖，使胞内生理活性物质开始积累。一般在发酵培养28小时左右，胞内活性物质的含量趋于稳定，此时将发酵温度和pH、通气量重新调节到酵母细胞最适的生长繁殖条件，使酵母细胞再次大量生长和繁殖，直至发酵结束。通过该工艺过程达到“双高”的目的。

S3、酶解：采用复合酶对S2中的酵母菌株细胞壁进行酶解。依据酵母细胞“三明治状”的特殊结构，通过逐步酶解法在酵母细胞壁上穿孔，但不使胞壁完全破碎，为下步进行“温和”机械破碎做好前提准备。所述复合酶为甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶。所述甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的配比为1～3:1:2～4。

见图3所示，所述甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的配比为优选为3:1:4；

见图4所示，在pH 5～6范围内，可溶性细胞破壁率较高。pH过高或过低酶迅速失活，破壁率降低，该pH值与酵母固体发酵培养所控制的pH 5.5～6较为一致，为直接喷洒复合酶剂进行胞壁破孔提供了必要的理论依据；

见图5所示：加酶后随着温度的升高酵母的破壁率获得了显著的提高，当温度达到38℃时，提取率达到最大值86.1％。超过38℃后，温度的升高反而使酵母的破壁率下降，这说明复合酶对酵母破壁的最适温度为38℃。由于该酶解过程目的是要在酵母细胞表面打孔，而非完全将酵母细胞破壁，因此为了达到最佳工艺目标，采用最优酶量和最佳作用温度进行酶解，以缩短酶解打孔的作用时间，从而大大缩短了整个工艺流程。经试验，在38℃，pH5.5～6，复合酶浓度150mg/kg的条件下，能达到较为理想的打孔效果。

S4、钝化与干燥：S3中经过酶解打孔后的固体鲜酵母菌株采用闪蒸法进行低温干燥，干燥温度为50～65℃。由于前一步骤中采用的组合酶为都是低温酶，因此在干燥初期温度达到60摄氏度左右即首先完成了对酶的钝化，在后续的干燥过程中除去水分以利于下一步的超微粉碎去壁。实现钝化与干燥在同一过程中完成。

S5、机械温和破碎：将钝化干燥的酵母菌株装入离心式粉碎机，见图4和图5所示，进行细胞破碎。所述离心式粉碎机的外围筛网目数为60～100，当外围网格为100目时，破壁效果最好，其破壁率达到81％，且符合低目数破壁的预期目标。使大部分(70±2％)的酵母细胞的细胞壁得以破碎，而余下(30±2％)的酵母细胞仍以活性酵母的形式存在，仍然具有活力，达到“温和”破碎的目的；

见图6所示：高速旋转的物料颗粒与外圈筛网碰撞后将被粉碎，未通过网孔的物料将咋在腔体内被反复粉碎，直至粒径小于网孔孔径。因此，筛网网孔的大小不仅决定物料的通过程度，而且还控制着粉碎腔内物料的粉碎次数，显然，颗粒在腔内停留时间越长，被粉碎的次数就越多，粉碎的效果也更好。为了保证有一定比例的酵母细胞经粉碎后仍具有胞壁完整性和生理活性，就必须选择适宜的筛网孔径，防止过度破碎。当外围网格为100目时，破壁效果最好，其破壁率达到81％，且符合低目数破壁的预期目标；

见图7所示：由于离心式粉碎机的作用原理是物料在转子的带动下做高速旋转运动，产生的离心力使颗粒不断加速旋转，并与粉碎腔发生碰撞而被细化。因此转子的旋转速率对粉碎效果有很大影响，一般旋转半径为120mm时，转子边缘线速度可达100m/s。为了达到双价酵母70％左右的破碎率，在筛网目数为100的情况下尽量选择较小的旋转半径，防止过度破碎而影响双价酵母的应用价值。在转子半径为70mm时的破碎效果较为适宜，酵母细胞整体破碎率在69％，且未破碎的酵母细胞的胞壁完整性也较好，仍具有生理活性的活酵母占28.5％。

其中，步骤S1筛选优势酵母菌株：通过镜检法和酶解法对扩增后的酵母菌株进行逐个检测，选取其中易酶解(用酶量较少，酶解时间短)，酵母细胞大且均一，细胞壁适中(过薄会降低细胞壁多糖的产量，过厚则对酶解破孔不利)，而光滑的菌落。将筛选到的易酶解、能利用淀粉为碳源的酵母菌落转接到以淀粉为碳源的酵母完全培养基中进行进一步的扩增培养，并通过细胞计数仪、生物量测定和蛋白质测定法，筛选出具有高生物量(生长繁殖旺盛)和胞内生理活性物质高表达的菌落。对这些菌落进行反复的纯化和筛选直至得到具有合适生物量和胞内蛋白表达量的优势酵母菌株，选取最优势酵母菌株进行下一个工序。

酵母细胞壁厚度测定：将样品制成分散的酵母细胞均匀悬液，在显微镜下直接观察，以胞壁适中而光滑，细胞大小均一为准进行筛选。

酵母细胞壁敏感性测定：将样品制成分散的酵母细胞菌悬液，分别用梯度浓度的酶液进行酶解，以用酶浓度低，酶解时间短的酵母细胞为准进行筛选。

酵母生物量的测定：将培养液离心(3000rpm)、洗涤三次后，再离心，60℃干燥后粉碎，得淡黄色的酵母粉，称重，根据离心的培养液体积计算出酵母的产量。

酵母细胞内生理活性蛋白的测定：

a、精确称取1g鲜酵母(称准至0.0002g)于消化管中，加入消化粉2.5g，沿壁缓缓加入10mL硫酸，然后置消化装置上，打开水源及电源，消化约3h至无烟，溶液变清，呈淡黄色后，继续加热10min。

b、取出消化管，稍冷，冷却，用30ml蒸馏水冲洗瓶颈，放冷，然后移入100ml容量瓶中，用少量蒸馏水冲洗消化管3次，洗液并入容量瓶中，最后加蒸馏水至刻度摇匀，即得消化液。

c、用25ml移液管准确吸取消化液25ml至凯式定氮仪蒸馏管中，连接好定氮仪装置，打开冷却水。在三角瓶加入25ml3％硼酸，加入4～5滴混合指示剂，作为接收液，将接收氨液的导管伸入液面一下。向凯式定氮仪蒸馏管中加入25ml30％NaOH溶液，加热蒸馏，直到三角瓶中收集液达到150～200ml时，停止加热，用蒸馏水吹洗冷凝管，同时将洗涤液收集在接收液中。

d、按以上法方做空白样。

e、计算

试样中蛋白质含量按瞎试计算：X＝[C×(V1-V2)×0.01401×6.25]/[W×Ds×25/100]

X-试样中蛋白质百分含量，％。

C-硫酸标准溶液的浓度，mol/L。

V1-试样消耗硫酸标准溶液的体积，ml。

V2-空白试验消耗硫酸标准溶液的体积，ml。

0.01401-与1.00ml硫酸标准溶液[C(1/2H2SO4)＝0.1mol/L]相当的以克表示的氮的质量，g。

W-试样的质量，g。

Ds-试样干物质百分含量，％。

6.25-氮与粗蛋白质换算系数。

在检测过程中注意，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的0.5％。

步骤S2选用的菌株是由S1筛选而得进行培养发酵通过发酵工艺优化，改进发酵培养基组成和比例，改进发酵条件，创造适合菌体生长和生物合成的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，达到显著提高发酵产量的目的。

综上所述，采用本发明所提供的一种双价酵母菌细胞的破壁方法，在培养的过程中，通过简单易得的培养基使得代谢产物和活菌量得率双高；将酵母细胞壁进行酶解打孔，然后通过离心式粉碎机的剪切、离心撞击，轻易地使酵母破壁，是破壁与粉碎一步法完成，通过低温干燥减少破壁成本与活性物质的高热等情况下损失。通过酶解及机械法相结合的形式，加速了酵母细胞壁破裂，使得酵母细胞内的生理活性物质也能顺利地、高保留地溶出细胞内，不仅增加产物提取率及保证细胞内生理物质的活性，其中生理物质的活性含量大于90％，能够在水产、畜禽饲养中发挥“双价”功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种双价酵母菌细胞的破壁方法，其特征在于，包括如下步骤：

S5、机械温和破碎：将干燥钝化后的酵母菌株装入离心式粉碎机，进行细胞破碎；

所述步骤S1中，原始酵母菌株为产朊假丝酵母、白地霉、热带假丝酵母和酿酒酵母；

所述步骤S1中，所述YEPD固体培养基：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.0～3.0％，葡萄糖1.0～3.0％，琼脂1.5～2.0％；所述淀粉培养基：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.0～3.0％，淀粉1.0～2.0％，琼脂1.5～2.0％；

所述步骤S2中，所述种子培养基：淀粉1.0～3.0％，蛋白胨0.1～1.0％，麦芽汁0.1～0.5％，酵母膏0.1～0.5％；

所述固体发酵培养基：麸皮50～80％，玉米粉10～15％，豆粕粉25～30％，碳酸钙1～6％，硫酸铵0.1～1.0％，硫酸镁0.01～0.10％，硫酸锰0.001～0.01％；

所述步骤S2中，发酵pH值为4.0～6.0，发酵时间为35～40h，发酵温度为25～35℃；

所述步骤S2中，培养池的通气量为30～90m³/min；

所述步骤S2中，固体发酵培养基中还包括磷酸氢二钾0.05～0.15％，磷酸二氢钾0.5～1.5％，硫酸铵0.1～1.0％，钙锰锌镁盐0.1～0.5％；

所述步骤S3中，所述复合酶为甘露聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的质量比为1～3:1:2～4；

所述步骤S4中，干燥温度为50～65℃；

所述步骤S5中，所述离心式粉碎机的外围筛网目数为60～100。