CN106959240B - 一种反复膨胀过程实现大块组织体的膨胀透明方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对大块组织体多次进行低温浸泡、聚合以及膨胀的反复膨胀透明化方法,低温浸泡用于实现聚合单体和交联剂在组织体内的有效渗透;聚合用于形成可支撑组织体的交联网络;膨胀过程用于实现组织体的胀大;通过依次进行浸泡、聚合以及膨胀实现组织体的一次膨胀,然后重复这个过程实现二次、三次…,直至第n次膨胀后实现大块组织体的膨胀透明。采用本发明的反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法可以实现大块组织体的膨胀透明化,且组织碎裂程度小,这项技术有助于将膨胀显微镜方法用于大块组织体的神经网络结构的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医学光学成像技术领域,具体设计为一种将鼠脑组织反复进行低温浸泡、聚合以及膨胀的过程实现小鼠全脑组织体的膨胀透明方法。
背景技术
脑神经元结构的变化或缺失与多种多样的神经系统疾病有着直接的关系,故而脑组织的形态学分析对于遗传学,病理学以及基础医学等领域均具有十分重要的意义。近些年来,普通光学显微镜技术用于鼠脑神经元的成像已经非常成熟,但受到光学衍射极限的影响,成像精度再提升的空间已经非常小。人们一直致力于寻找一种新的途径来增大成像的分辨率,膨胀显微镜也就是在这种背景下应运而生。膨胀显微镜包括在生物样品内合成一种可溶胀的聚合网络,通过物理膨胀使得生物样品达到放大效果,然后用传统的显微镜进行观察。对比于传统的超分辨成像,膨胀显微镜有以下几个优点:①膨胀显微镜可以进行大范围的三维样品成像,而传统方法常常要求样品必须是小范围的,且样品不能过厚。②膨胀显微镜不需要特定的探针,而点定位超分辨成像是需要的,从而也可以实现多色成像。③膨胀过程中样品因为大量吸水会变得透明,这种透明的样品可以加速超分辨成像的速度。
因为大块组织体很难实现膨胀,所以以往所报道的用于膨胀显微镜的样品一般为细胞或者200μm厚度以下的组织切片,现有技术缺乏大组织体的膨胀透明技术。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种反复膨胀过程实现大块组织体的膨胀透明方法,其目的在于通过将大块组织反复进行低温浸泡渗透、聚合以及膨胀,实现大块组织体的膨胀透明,由此解决现有技术用于膨胀显微镜的样品一般为细胞或者200μm厚度以下的组织切片,缺乏实现大块组织体的膨胀透明技术的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法,包括如下步骤:
(1)对组织体依次实施渗透、聚合以及膨胀,实现所述组织体的一次膨胀透明化;所述渗透过程通过在含有包埋单体和交联剂的浸泡母液中浸泡完成;
(2)重复步骤(1),并调整包埋单体的浓度,增大交联剂的浓度,直至所述组织体实现膨胀透明化。
优选地,所述渗透过程具体包括如下步骤:将所述组织体置于含有包埋单体和交联剂的浸泡母液中静置过夜;然后向所述浸泡母液中加入引发剂、抑制剂和加速剂,并在在-10~4℃,优选-5~0℃静置1~2天,实现组织体的低温浸泡渗透过程,得到渗透后的组织体。
优选地,所述包埋单体为丙烯酸钠和丙烯酰胺;所述交联剂为N,N’-甲叉双丙烯酰胺;所述引发剂为过硫酸铵,所述抑制剂为2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物;所述加速剂为四甲基乙二胺。
优选地,所述聚合过程包括如下步骤:将渗透后的组织体置于室温使其凝胶化,得到聚合后的组织体。
优选地,所述膨胀过程具体为:将聚合后的组织体置于蒸馏水中透析溶胀5~10小时,每1小时更换一次蒸馏水,得到膨胀后的组织体。
优选地,步骤(2)所述调整渗透时包埋单体的浓度的具体方法为:控制所述包埋单体的总浓度不变,调整包埋单体的浓度比例,使得包埋单体丙烯酸钠/丙烯酰胺的浓度比随着膨胀次数的增加而逐渐减小。
优选地,所述调整包埋单体的浓度的具体方法为:控制所述包埋单体的总浓度为0.115g/ml,随着膨胀次数的增加,调整丙烯酸钠单体的浓度在0.095~0.060g/ml中逐渐减少,同时逐渐增大丙烯酰胺的浓度,调整范围为0.020~0.055g/ml。
优选地,步骤(2)所述增大交联剂的浓度,具体方法为:随着膨胀次数的增加,所述交联剂的浓度在0.75mg/ml~3mg/ml范围内逐渐增大。
优选地,所述组织体的初始厚度最大可达到0.5cm。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果。
本专利发明了一种通过反复进行低温浸泡渗透、聚合以及膨胀的过程实现小鼠全脑组织体的膨胀透明技术。采用本发明的反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法可以实现大块组织体的膨胀透明化,且组织碎裂程度小。这项技术有助于将膨胀显微镜方法用于大块组织体的神经网络结构的研究,解决由于组织体的直观体积上的变化导致的成像的量以及相应的信息量的急剧增加要求脑成像的速度必须在鼠脑的基础上得到提升的问题。
附图说明
图1是实施例1对鼠脑组织进行反复膨胀透明化流程图;
图2a图为固定后的新鲜鼠脑;b图为经过反复三次膨胀后的鼠脑;黑色方格边长为0.5cm。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的一种反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法,适用于厚度范围为1~5毫米的组织体的膨胀透明化,包括如下步骤:
(1)对大块组织体依次实施渗透、聚合以及膨胀,实现所述组织体的一次膨胀透明化;所述渗透过程通过在含有包埋单体和交联剂的浸泡母液中浸泡完成;
(2)重复步骤(1),并调整所述渗透时包埋单体的浓度,增大渗透时交联剂的浓度,直至所述大块组织体实现膨胀透明化。
其中,所述渗透过程具体包括如下步骤:将所述组织体置于含有包埋单体和交联剂的浸泡母液中静置过夜,所述浸泡母液中还含有氯化钠溶液;然后向所述浸泡母液中加入引发剂、抑制剂和加速剂,并在在-10℃静置1~2天,实现组织体的低温浸泡渗透过程,得到渗透后的组织体。其中渗透过程除了可以在-10℃进行以外,也可以根据需要在-10~4℃,优选-5~0℃中在一定时间内实现良好渗透。
其中包埋单体总浓度为0.1~0.15g/ml,包埋单体包括丙烯酸钠和丙烯酰胺,其中丙烯酸钠的浓度范围为0.06~0.095g/ml,丙烯酰胺的浓度范围为0.02~0.055g/ml;交联剂为N,N’-甲叉双丙烯酰胺,其浓度范围为0.75~3mg/ml,其中浸泡母液氯化钠浓度约为0.117g/ml;引发剂可以为过硫酸铵,其质量分数为0.2%,抑制剂可以为2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物,其质量分数为0.01%~0.02%;加速剂为四甲基乙二胺,其质量分数为0.2%。
氯化钠的加入一方面是源于研究对象是鼠脑组织体,维持它的渗透作用,另一方面是维持母液中的离子浓度,防止丙烯酸钠在未固定在鼠脑组织体前就膨胀处组织体外。
聚合过程包括如下步骤:将渗透后的组织体置于室温使其凝胶化,得到聚合后的组织体。
低温渗透过程聚合反应很慢,所以聚合主要发生在室温下凝胶化过程,大约需要1~3小时。
所述膨胀过程具体为:将聚合后的组织体外层水凝胶除去,然后将组织体置于蒸馏水中透析溶胀5~10小时,每1小时更换一次蒸馏水,得到膨胀后的组织体。
步骤(2)所述调整所述渗透时包埋单体的浓度的具体方法为:控制所述包埋单体的总浓度不变,调整包埋单体的浓度比例,使得包埋单体丙烯酸钠/丙烯酰胺的浓度比随着膨胀次数的增加,逐渐减小。比如,控制所述包埋单体的总浓度不变为0.115g/ml,随着膨胀次数的增加,调整丙烯酸钠单体的浓度在0.095~0.060g/ml中逐渐减少,同时逐渐增大丙烯酰胺的浓度,调整范围为0.020~0.055g/ml。
步骤(2)所述增大交联剂的浓度,具体方法为:随着膨胀次数的增加,所述交联剂的浓度在0.75mg/ml~3mg/ml范围内逐渐增大。
本发明提供了一种对大块组织体多次进行低温浸泡、聚合以及膨胀的反复膨胀方法,低温浸泡用于实现聚合单体和交联剂在组织体内的有效渗透;聚合用于形成可支撑组织体的交联网络,先在低温条件下聚合,其后转移至室温环境中静置若干小时确保聚合完全;膨胀过程用于实现组织体的胀大,该过程要确保缓慢。通过依次进行浸泡、聚合以及膨胀实现组织体的一次膨胀,然后多次进行这个过程实现二次、三次。。。,直至第n次膨胀后组织体径向长度膨胀至原样品两倍左右,反复膨胀。
本发明的反复膨胀透明化组织体的方法适用于厚度最大可达到0.5cm的大块组织体。本发明的主要创新点在于,对于大块组织体的膨胀透明化方法,并非简单地重复现有技术小样本(细胞或者200μm厚度以下的组织切片)的包埋、聚合和膨胀过程,而是通过大量的实验探索以及创造性劳动,摸索出了一套反复包埋、聚合和膨胀过程,反复实验探索表明对于反复膨胀组织体,组织体越大,达到预期膨胀度的膨胀次数越多,膨胀过程越难控制。
组织体越大,实现组织体径向膨胀两倍难度急剧上升,膨胀过程组织体破碎的可能性也逐渐增大。故而在有效地时间内实现单体以及交联剂的有效渗透和透析膨胀过程中膨胀速度的快慢尤为重要。探索中发现反复包埋过程中的单体丙烯酸钠含量越高,膨胀速度越快,但包埋后的组织体偏软,容易变形甚至破碎。研究中发现随着组织体膨胀次数的增加,单体质量浓度,丙烯酰胺/丙烯酸钠的比值逐渐增大有利于组织体实现有效的膨胀的同时减小膨胀破碎的风险。通过大量实验探索(100次以上),本发明提供了一种大块组织体的膨胀透明化方法,获得了对于不同质量的组织体,其获得良好膨胀效果时对应的反复膨胀次数以及具体操作时每次膨胀包埋单体和交联剂浓度、用量调整策略。
本发明具体实施方式所用组织体来源于鼠脑,形状并不规则,所述厚度为对应组织体最厚的区域。
以下为实施例:
实施例1
一种反复膨胀过程实现大块组织体的膨胀透明方法,如图1所示,包括如下步骤:
(1)第一次膨胀:将鼠脑组织(210mg,如附图2a,厚度为5毫米)置于含丙烯酸钠(0.095g/ml),丙烯酰胺(0.02g/ml),氯化钠(0.117g/ml)以及交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(1.0mg/ml)的30ml水溶液中低温静置过夜,第二天加入引发剂过硫酸铵(相比于溶液质量为0.2%),以及加速剂四甲基乙二胺(相比于溶液质量为0.2%)。转移到冰箱冷冻层(-10℃)放置1.5天。取出置于室温条件使其完全凝胶化,除去大部分外层水凝胶,置于蒸馏水中透析溶胀8h,每小时更换一次蒸馏水,得到初次溶胀后的鼠脑组织。
(2)第二次膨胀:将初次溶胀后的鼠脑组织再次置于含丙烯酸钠(0.089g/ml),丙烯酰胺(0.026g/ml),氯化钠(0.117g/ml)以及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(1.5mg/ml)的50ml水溶液中低温静置过夜。同样,第二天加入引发剂过硫酸铵(相比于溶液质量为0.2%),抑制剂2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(相比于溶液质量为0.01%),以及加速剂四甲基乙二胺(相比于溶液质量为0.2%)。转移到冰箱冷冻层(-10℃)放置1.5天,取出置于室温条件使其完全凝胶化,除去大部分外层水凝胶,置于蒸馏水中透析溶胀8h,每小时更换一次蒸馏水,得到再次溶胀后的鼠脑组织。
(3)第三次膨胀:将再次溶胀后的鼠脑组织第三次置于含丙烯酸钠(0.085g/ml),丙烯酰胺(0.03g/ml),氯化钠(0.117g/ml)以及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(2mg/ml)的100ml水溶液中低温静置过夜。同样,第二天加入引发剂过硫酸铵(相比于溶液质量为0.2%),抑制剂2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(相比于溶液质量为0.01%),以及加速剂四甲基乙二胺(相比于溶液质量为0.2%)。转移到冰箱冷冻层(-10℃)放置1.5天.取出置于室温条件使其完全凝胶化,除去大部分外层水凝胶,置于蒸馏水中透析溶胀8h,每小时更换一次蒸馏水,得到如附图2b所示膨胀后的鼠脑。
从图2a可以看出,组织体膨胀前的尺寸为(长*宽*厚度=1.5cm*0.5cm*0.5cm),而膨胀后的尺寸为(长*宽*厚度=3cm*1.25cm*1cm)该鼠脑组织体的径向膨胀比为(2*2.25*2),如图2b所示,膨胀后的组织体经以上反复膨胀过程之后透明度增大,其中背景方格边长为0.5cm。
实施例2-8
对于不同质量的组织体,按照实施例1的反复膨胀透明化方法,摸索出对于不同质量组织体实现反复膨胀透明化的具体实验参数。实施例2-8膨胀次数、每次膨胀对应调整的单体浓度、浓度比以及交联剂浓度变化数据,列举在表1中。
表1实施例2-8不同质量组织体反复膨胀透明化具体操作条件
其中控制单体总浓度为0.115g/ml;丙烯酸钠/丙烯酰胺的比例如上表数据依次增大,交联剂随着膨胀次数的增加浓度逐渐增大,交联剂的浓度在0.75mg/ml~3mg/ml范围内逐渐增大。
采用本发明的反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法可以实现大块组织体的膨胀透明化,且组织碎裂程度小。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种反复膨胀实现大块组织体的膨胀透明化方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)对组织体依次实施渗透、聚合以及膨胀,实现所述组织体的一次膨胀透明化;所述渗透过程通过在含有包埋单体和交联剂的浸泡母液中浸泡完成;
(2)重复步骤(1),并调整所述包埋单体的浓度,增大所述交联剂的浓度,直至所述组织体实现膨胀透明化;
步骤(2)所述调整包埋单体的浓度的具体方法为:控制所述包埋单体的总浓度不变,调整包埋单体的浓度比例,使得包埋单体丙烯酸钠与丙烯酰胺的浓度比随着膨胀次数的增加而逐渐减小。
2.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述渗透过程具体包括如下步骤:将所述组织体置于含有所述包埋单体和所述交联剂的浸泡母液中静置过夜,然后向所述浸泡母液中加入引发剂、抑制剂和加速剂,并在-10~4℃,静置1~2天,实现组织体的低温浸泡渗透过程,得到渗透后的组织体。
3.如权利要求2所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述包埋单体为丙烯酸钠和丙烯酰胺;所述交联剂为N,N’-甲叉双丙烯酰胺;所述引发剂为过硫酸铵,所述抑制剂为2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物;所述加速剂为四甲基乙二胺。
4.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述聚合过程包括如下步骤:将渗透后的组织体置于室温使其凝胶化,得到聚合后的组织体。
5.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述膨胀过程具体为:将聚合后的组织体置于蒸馏水中透析溶胀5~10小时,每1小时更换一次蒸馏水,得到膨胀后的组织体。
6.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述调整包埋单体的浓度的具体方法为:控制所述包埋单体的总浓度为0.115g/ml,随着膨胀次数的增加,调整丙烯酸钠单体的浓度在0.095~0.060g/ml中逐渐减少,同时逐渐增大丙烯酰胺的浓度,调整范围为0.020~0.055g/ml。
7.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,步骤(2)所述增大交联剂的浓度,具体方法为:随着膨胀次数的增加,所述交联剂的浓度在0.75mg/ml~3mg/ml范围内逐渐增大。
8.如权利要求1所述的膨胀透明化方法,其特征在于,所述组织体的初始厚度最大为0.5cm。
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