CN106957819A - 一种提高t细胞活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高T细胞活性的方法，为提高T细胞质膜胆固醇水平从而提高T细胞活性。本发明公开了提高T细胞质膜胆固醇水平可提高T细胞活性，尤其是可提高CD8 T细胞的效应功能，增强CD8 T细胞对肿瘤的杀伤活性。本发明提供了一种全新的提高T细胞活性尤其是CD8 T细胞活性的方法，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。

Description

一种提高T细胞活性的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种提高T细胞活性的方法。
背景技术
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。根据是否表达CD4或CD8分子,T细胞可分为CD4T细胞和CD8T细胞。
T细胞活化是属于细胞免疫，细胞免疫T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞(效应T细胞)对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。T细胞是细胞免疫的主要细胞。
免疫治疗一直以来是肿瘤治疗的研究热点。CD8T细胞是肿瘤免疫治疗的核心，是肿瘤的特异性杀伤细胞，其杀伤能力强弱以及在肿瘤组织中的浸润情况直接与肿瘤的预后直接相关，而且直接关系肿瘤免疫治疗的成败。由于肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境，CD8T细胞的功能受到肿瘤微环境的抑制，目前免疫检测点阻断抗体抗PD-1，抗PD-L1和抗CTLA-4抗体在治疗黑色素瘤的临床试验中虽然整体效果不错，但单独使用时各自的客观反应率(Objective Response Rate)以及抗PD-1和抗CTLA-4抗体联合治疗客观反应率还是不尽如人意。这意味着急需新的手段来提高T细胞尤其是CD8T细胞的活性。
细胞内胆固醇代谢通路包括胆固醇合成、转运以及储存等途径，其中胆固醇合成通路主要由SCAP/SREBP复合物以及其下游胆固醇合成限速酶HMGCR调控；胆固醇的转运途径的调控主要受低密度脂蛋白受体(LDL receptor)、内体(endosome)和溶酶体(lysosome)中NPC1/2等蛋白及复合物的调控；而胆固醇存储则受胆固醇的酯化修饰以及去酯化修饰的调控，关键调控蛋白包括酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1/2和胆固醇酯水解酶(CEH)。现有技术并没有披露细胞质膜胆固醇水平与肿瘤的免疫治疗相关T细胞活化之间的关联。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明一方面提供了一种提高T细胞活性的方法，为提高T细胞质膜胆固醇水平从而提高T细胞活性。
提高T细胞活性包括但不限于：提高T细胞的效应功能。进一步的，所述提高T细胞活性包括提高CD8T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
在一个优选的实施例中，所述T细胞为CD8T细胞，通过上调CD8T细胞质膜胆固醇水平，提高了CD8T细胞的效应功能，进而提高了CD8T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。该方法亦可被认为是一种提高CD8T细胞的效应功能的方法或者提高CD8T细胞的肿瘤细胞杀伤能力的方法。
具体的，所述提高T细胞质膜胆固醇水平可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：
1)调节胆固醇代谢通路以提高T细胞质膜胆固醇水平
2)于T细胞上直接增加质膜上胆固醇的量。
可将胆固醇结合或依附于T细胞表面以于T细胞上直接增加质膜上胆固醇的量。
调节胆固醇代谢通路可以是：促进胆固醇的合成、促进胆固醇转运、抑制胆固醇的储存、抑制胆固醇的外排等。根据现有理论可知，促进胆固醇的合成、促进胆固醇转运、抑制胆固醇的储存及抑制胆固醇的外排都将会上调胆固醇水平。
具体的，可以在胆固醇合成促进剂、胆固醇转运促进剂、胆固醇储存促进剂、胆固醇降解抑制剂、胆固醇转化抑制剂或胆固醇外排抑制剂中的一种或多种存在下培养T细胞，以分别促进胆固醇的合成、促进胆固醇转运、促进胆固醇的储存、抑制胆固醇的降解、抑制胆固醇的转化、抑制胆固醇的外排，从而上调T细胞质膜胆固醇水平。
可以利用对胆固醇代谢相关基因或其表达多肽、蛋白或酶的激活或抑制来调节胆固醇代谢通路。一般情况下，对于上调胆固醇的合成和胆固醇转运基因采用激活的方式，而对于上调胆固醇的储存和外排的基因则采用抑制的方法。激活方法可以是上调相关基因的表达量，例如构建过表达载体并作用于T细胞,或者是通过小分子化合物上调相关基因的转录和/或抑制相关蛋白的降解。抑制的方法可采用基因敲除，基因敲低使相关基因失活或活性降低；或者也可利用抗体、蛋白、小分子等与基因的表达产物结合使相关基因表达产生的多肽、蛋白或酶失活或活性降低。
作为典型的代表，例如可以通过抑制胆固醇酯化来抑制胆固醇的储存，通过抑制胆固醇酯化相关的酶如酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1或敲除酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因可明显促进CD8T细胞的效应功能，增强其肿瘤细胞杀伤。
具体的，还可以在胆固醇存在下培养T细胞，从而使胆固醇结合或依附于T细胞表面以增加质膜上胆固醇的量。
本发明实施例已证实直接增加质膜胆固醇水平将提高CD8T细胞的效应功能。而基于现有技术可知，前述调节胆固醇代谢通路的方法均可上调胆固醇水平，由此可推知，前述调节胆固醇代谢通路的方法亦可获得提高CD8T细胞的效应功能的效果，进而认为这些方法亦可以提高T细胞活性。
将胆固醇结合或依附于T细胞表面以增加质膜上胆固醇的量可以是物理的或者是化学的方法。在一个优选的实施例中，将环糊精(MβCD)包被的胆固醇处理CD8T细胞从而直接上调质膜上胆固醇的量。
所述的提高T细胞活性的方法可以是体内的或体外的。
采用本发明的方法体外处理后活性提高的T细胞可被用于治疗的或非治疗的目的。
本发明第二方面还提供了质膜胆固醇水平促进剂在制备T细胞活性促进剂中的用途。
所述质膜胆固醇水平促进剂包括但不限于：胆固醇合成促进剂、胆固醇转运促进剂、胆固醇储存促进剂、胆固醇降解抑制剂、胆固醇转化抑制剂、胆固醇外排抑制剂。
所述的质膜胆固醇水平促进剂可为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
所述胆固醇合成促进剂可促进胆固醇的合成从而增加质膜胆固醇水平，可以是现有的可促进胆固醇合成的化合物。
所述胆固醇转运促进剂可促进胆固醇的转运从而增加质膜胆固醇水平，可以是现有的可促进胆固醇转运的化合物。
所述胆固醇降解抑制剂可抑制胆固醇的降解从而增加质膜胆固醇水平，可以是现有的可抑制胆固醇降解的化合物。
所述胆固醇转化抑制剂可抑制胆固醇的转化从而增加质膜胆固醇水平，可以是现有的可抑制胆固醇转化的化合物。如：酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂等。
所述酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂是指对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。
对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性，或者抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
胆固醇外排抑制剂可抑制胆固醇的外排从而增加质膜胆固醇水平，可以是现有的可抑制胆固醇外排的化合物。
作为实施例具体列举的，所述质膜胆固醇水平促进剂为酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶抑制剂，如Avasimibe、K604、CP113,818等。
所述T细胞活性促进剂能提高T细胞的效应功能和/或提高T细胞对靶细胞的杀伤能力。在优选的实施例中，所述T细胞活性促进剂能提高CD8T细胞的效应功能。
本发明的优点在于：提供了一种全新的提高T细胞尤其是CD8T细胞活性的方法，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。
附图说明
图1.CD8T细胞质膜胆固醇水平直接影响CD8T细胞的效应功能和CTL对靶细胞的杀伤能力。
a.MβCD处理(终浓度0.2–1mM,稀释于PBS中，37℃处理5分钟，PBS洗3次，最后换RPMI 1640完全培养基培养)降低Acat1CKO CD8T细胞质膜胆固醇水平，随后通过铺板抗体α-CD3(5μg/ml)+α-CD28(5μg/ml)刺激24小时，然后胞内染色和流式检测颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达；
b.MβCD处理(终浓度1mM,37℃处理5分钟，方法同a)降低Acat1CKO OT-I CTL细胞质膜胆固醇水平,通过检测LDH的释放分析OT-I CTL对靶细胞EL-4的杀伤效率；
c.MβCD包被的游离胆固醇处理(终浓度1-10μg/ml,稀释于RPMI 1640完全培养基中，37℃处理15分钟，PBS洗3次，最后换RPMI 1640完全培养基继续培养)上调野生型CD8T细胞质膜上胆固醇水平，随后通过铺板抗体α-CD3(5μg/ml)+α-CD28(5μg/ml)刺激24小时，然后胞内染色和流式检测颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达；
d.MβCD包被的游离胆固醇处理(终浓度1-10μg/ml,37℃处理15分钟，方法同c)升高野生型OT-I CTL细胞质膜上胆固醇水平,通过检测LDH的释放分析OT-I CTL对靶细胞EL-4的杀伤效率。
t-检验用于数据分析。
图2.抑制胆固醇代谢相关通路影响CD8T细胞的效应功能。
a-d.分别抑制胆固醇合成(Lovastatin：HMGCR抑制剂)、胆固醇运输(U18666A)和胆固醇酯酰化修饰(CP113，818和K604)后，通过胞内染色和流式细胞术检测CD8T细胞活化(α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(5μg/ml)铺板刺激)后颗粒酶B(GzmB)，细胞因子IFNγ和TNFα的表达。
图3.ACAT1基因敲除后，CD8T细胞胆固醇代谢途径重编程，细胞质膜胆固醇水平上调。
a-b.α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(5μg/ml)铺板刺激活化CD8T细胞12小时后，FilipinIII染色检测活化前后野生型和Acat1CKO CD8T细胞游离胆固醇的分布；细胞质膜上胆固醇的相对定量结果通过Leica LAS AF软件处理获取；
c-d.基于胆固醇氧化的胆固醇定量方法用于定量野生型和Acat1CKO CD8T细胞活化前后的总游离胆固醇、细胞质膜游离胆固醇水平；
e-p.α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(5μg/ml)铺板刺激活化野生型和Acat1CKO CD8T细胞，实时定量PCR用于检测胆固醇代谢相关基因的mRNA水平。
图4.Avasimibe处理上调CD8T细胞质膜上胆固醇水平，促进TCR微簇和免疫突触形成，增强TCR信号通路的活化。
a-b.Avasimibe处理CD8T细胞(37℃，6小时)，Filipin III染色检测CD8T细胞游离胆固醇的分布；细胞质膜胆固醇的相对定量结果通过Leica LAS AF软件处理获取；
c.Avasimibe处理CD8T细胞后，通过STORM对CD8T细胞质膜表面TCR的分布进行分析；
d-e.对图c获得的成像信息进行Ripley’K function分析，r代表TCR微簇的大小，L(r)-r代表TCR微簇形成的程度；
f-g.Avasimibe处理CD8T细胞后，通过TIRFM检测CD8T细胞免疫突触的形成；
h.Avasimibe处理OT-I CTL细胞后,用2μg/mlα-CD3和2μg/mlα-CD28激活CTL，然后Western-blotting检测TCR近端信号通路和下游信号通路的活化情况；
i-k.STORM对肿瘤浸润的CD8T细胞质膜上TCR进行成像以及Ripley’K function分析。
图5.ACAT1敲除促进CD8T细胞增殖以及减少CD8T细胞凋亡。
a.活细胞荧光染料CFSE标记野生型(WT)和ACAT1基因敲除(CKO)CD8T细胞，然后铺板抗体刺激细胞(1-2μg/mlα-CD3+1-2μg/mlα-CD28)，通过流式检测CFSE荧光强度检测细胞的分裂情况；
b.小鼠脾脏分离得到的CD8T细胞培养24小时后，Annexin V和PI(Propidium idiode)染色，检测细胞的凋亡情况。
c.铺板抗体(5μg/mlα-CD3+5μg/mlα-CD28)刺激野生型和Acat1CKO CD8T细胞24小时，然后Annexin V和PI(Propidium idiode)染色，检测细胞的凋亡情况。
图6.ACAT1敲除增强CD8T细胞抗肿瘤活性。
a-b.野生型小鼠和Acat1CKO小鼠中黑色素瘤生长速度以及小鼠的生存曲线分析。肿瘤生长曲线用two-way ANOVA统计方法分析，小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析；
c-d.野生型和Acat1CKO小鼠在注射B16F10黑色素瘤细胞后，在第16天将肿瘤取出，通过流式分析CD8T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达，同时对肿瘤浸润的CD8T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4T细胞比率以及CD8T细胞增殖标志物Ki-67的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
e.流式检测肿瘤浸润CD8T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达；
Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
f.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
g-h.流式检测引流淋巴结中CD8T细胞中CD44、IFNγ的表达，同时对CD8T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4T细胞比比率；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
i-k.黑色素瘤肺转移模型，在注射黑色素瘤细胞后第20天，检测肺脏中肿瘤数量，同时继续记录剩余小鼠的生存率和生存时间，小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析；
l.黑色素瘤肺转移模型中，苏木精-伊红染色观察肿瘤细胞在肺脏中的浸润情况；
m.黑色素瘤肺转移模型中，流式检测肺脏中CD8T细胞CD44、颗粒酶B(GzmB)、IFNγ和TNFα的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
n-p.将体外诱导分化成熟的野生型和Acat1CKOOT-I CTL尾静脉注射到荷瘤B16F10-OVA(B16F10黑色素瘤细胞中表达Ovalbumin)的C57BL/6野生型小鼠中，检测肿瘤的生长以及小鼠的生存率。
图7.ACAT1敲除促进CD8T细胞TCR微簇形成并增强TCR信号通路活化。
a.野生型和Acat1CKO CD8T细胞用4μg/mlα-CD3+4μg/mlα-CD28刺激，然后Western blot检测TCR近端信号通路和下游信号通路的活化情况；
b.流式检测野生型和Acat1CKOCD8T细胞表面TCR(CD3)和CD8水平；
c.STORM对野生型和Acat1CKOCD8T细胞活化前后膜表面TCR的分布进行成像；
d-e.对图c获得的成像结果进行Ripley’s K function分析，r代表TCR微簇的大小，L(r)-r代表TCR微簇形成的程度。
图8.ACAT1敲除促进CD8T细胞免疫突触的形成。
a-b.TIRFM对CD8T细胞的TCR进行活细胞动态成像，检测野生型和Acat1CKOCD8T细胞免疫突触的形成；Two-way ANOVA方法用于分析组间差异显著性。
c-e.对免疫突触中TCR微簇的动态行为进行分析；追踪了来自19个野生型CD8T细胞和20个Acat1CKOCD8T细胞中超过1400个TCR微簇的运动，分析其平均平方位移MSD(mean square displacement),扩散系数的累计概率分布CPD(Cumulative probabilitydistribution)和扩散系数Diffusion coefficient。
图9.ACAT抑制剂Avasimibe处理增强CD8T细胞抗肿瘤能力。
a.野生型CD8T细胞用Avasimibe处理(37℃，6小时，即于RPMI 1640完全培养基中加药后，37℃CO2培养箱中培养处理6小时，处理完之后用培养基或PBS离心清洗3次)，随后通过铺板抗体α-CD3(5μg/ml)+α-CD28(5μg/ml)刺激24小时，然后胞内染色和流式检测颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达；
b.Avasimibe处理OT-I CTL(37℃，6小时)处理方式同a,通过检测LDH的释放分析OT-ICTL对靶细胞EL-4的杀伤效率；
c.MTS方法检测Avasimibe处理对黑色素瘤细胞B16F10细胞活率的影响；One-wayANOVA用于统计分析，P>0.25。
d-f.Avasimibe处理B16F10黑色素瘤荷瘤C57BL/6野生型小鼠，检测肿瘤生长曲线和小鼠生存率；
g-h.在注射肿瘤后第18天将肿瘤取出，通过流式分析肿瘤浸润的CD8T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达，同时对肿瘤浸润的CD8T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4T细胞比比率以及CD8T细胞增殖标志物Ki-67的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
i.流式检测肿瘤浸润CD8T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达；
Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
j.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
k.流式检测肿瘤组织中MDSC细胞(Gr1+CD11b+CD45+)的比例；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
图10.ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
具体实施方式
本发明在研究中发现，通过调控T细胞的胆固醇代谢，可以提高CD8T细胞的效应功能。通过对该现象的机制研究发现：这种功能增强表型的获得来自于CD8T细胞质膜表面胆固醇水平的上升。进一步的，本发明又经试验证明，单纯提高T细胞质膜表面胆固醇水平同样可以增强CD8T细胞的效应功能。在此基础上，本发明认为采用直接或间接的手段最终达到提高T细胞质膜表面胆固醇水平的效果，则均可增强T细胞的效应功能，从而上调T细胞的活性。
胆固醇合成促进剂
是指对于胆固醇合成具有促进效果，从而增加质膜胆固醇水平的化合物。对于胆固醇合成具有促进效果包括但不限于：提高上调胆固醇合成的多肽、蛋白或酶的活性，抑制下调胆固醇合成的多肽、蛋白或酶的活性，或者使促进胆固醇合成的多肽、蛋白或酶的基因过表达，或者抑制下调胆固醇合成的多肽、蛋白或酶基因的表达。胆固醇合成相关基因如：Srebp1,Srebp2,Acaca,Fasn,Hmgcs,Hmgcr和Sqle等。
胆固醇转运促进剂
是指对于胆固醇转运(包括细胞从胞外吸收胆固醇，并转运到其他相应细胞器整个过程)具有促进效果，从而增加质膜胆固醇水平的化合物。对于胆固醇转运具有促进效果包括但不限于：提高上调胆固醇转运的多肽、蛋白或酶的活性，抑制下调胆固醇转运的多肽、蛋白或酶的活性，或者使促进胆固醇转运的多肽、蛋白或酶的基因过表达，或者抑制下调胆固醇转运的多肽、蛋白或酶基因的表达。胆固醇转运相关基因如Ldlr(LDL receptor)、Idol(inducible-degredator of LDL receptor)等。
胆固醇储存抑制剂
是指对于胆固醇储存具有抑制效果，从而增加质膜胆固醇水平的化合物。游离胆固醇在细胞内经酯酰化修饰转化成胆固醇酯(cholesteryl ester)进而在细胞内进行储存，而抑制胆固醇的酯酰化修饰或者减少胆固醇在细胞内的储存则可促进未经修饰的游离胆固醇向细胞质膜上转运。对于胆固醇储存具有促进效果包括但不限于：抑制上调胆固醇储存的多肽、蛋白或酶的活性，促进下调胆固醇储存的多肽、蛋白或酶的活性，或者使抑制胆固醇储存的多肽、蛋白或酶的基因过表达，或者促进下调胆固醇储存的多肽、蛋白或酶基因的表达，或者促进胆固醇酯水解相关多肽、蛋白和酶的表达。
胆固醇外排抑制剂
是指对于胆固醇外排具有抑制效果，从而增加质膜胆固醇水平的化合物。对于胆固醇外排具有抑制效果包括但不限于：提高下调胆固醇外排的多肽、蛋白或酶的活性，抑制上调胆固醇外排的多肽、蛋白或酶的活性，或者使下调胆固醇外排的多肽、蛋白或酶的基因过表达，或者抑制上调胆固醇外排的多肽、蛋白或酶基因的表达。胆固醇外排相关基因如Abca1和Abcg1等。
所述的胆固醇合成促进剂、胆固醇转运促进剂、胆固醇储存促进剂、胆固醇降解抑制剂、胆固醇转化抑制剂或胆固醇外排抑制剂包括但不限于为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物、转基因载体等。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT是调控细胞内胆固醇代谢的平衡的一种酶，在生物体内催化胆固醇与长链脂肪酸形成胆固醇酯。在哺乳动物细胞中发现两种同工异构酶ACAT1和ACAT2。ACAT1选择性地在组织与细胞中表达，与细胞内胆固醇代谢平衡有关；而ACAT2则广泛存在于肝脏、胃肠道等细胞中，主要参与饮食中胆固醇的吸收和载脂蛋白的装配。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂
是指对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性，或者抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
所述的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂包括但不限于为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
所述酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂可以是对ACAT1与ACAT2没有选择性的ACAT抑制剂，已知的例如purpactins，manassantin A,diphenylpyridazine derivatives,glisoprenin A，CP113,818、Avasimibe、Pactimibe等，也可以是对ACAT1具有选择性抑制的抑制剂，已知的例如K604等。还可以选自CI 976、TMP-153、YM 750、GERI-BP002-A、Sandoz58-035、VULM 1457、CL-283,546、CI-999、E5324、YM17E,FR182980、PD132301-2、F-1394、HL-004、F-12511(eflucimibe)、cinnamic acid derivatives、Dup 128、RP-73163、pyripyropene C、FO-1289、AS-183、SPC-15549、BeauI、BeauIII、FO-6979、Angelica、ginseng、Decursin、terpendoleC、beauvericin、spylidone、pentacecilides、CL-283,546、cinnamic derivatives、betulinic acid、shikonin derivatives、esculeogenin A和Wu-V-23等。
抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性是指使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力下降。优选的，相比抑制前，酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达是指：使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不转录，或降低酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的转录活性，或者使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不表达，或降低酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的表达活性。
优选地，与野生型相比，ACAT1基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地ACAT1基因完全没有表达。
本领域技术人员可以使用常规方法对基因表达进行调节，如采用基因敲除、同源重组，干扰RNA等下调基因的表达，采用转基因的方法上调基因的表达等。。
基因表达的增强或抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
T细胞活性促进剂
指对T细胞活性具有促进作用的化合物。优选的，本发明所指的T细胞活性促进剂至少能促进CD8T细胞的效应功能，或者所述T细胞活性促进剂至少能促进CD8T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
Avasimibe(CI-1011)
化学名称：2,6-diisopropylphenyl 2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate
分子式：C29H43NO4S
IC50:ACAT,3.3μM；CYP2C9,2.9μM；CYP1A2,13.9μM；CYP2C19,26.5μM
Cas No.166518-60-1
结构式如下
K604
化学名称：
2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-N-[2,4-bis(methyllthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide
IC50:ACAT1,0.45μM；ACAT2,102.85μM
结构式：
在文献Ikenoya,M.et al.A selective ACAT-1inhibitor,K-604,suppresses fatty streak lesions infat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels..Atherosclerosis191,290-297,doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公开。
CP113,818
化学名称：(-)-N-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoicamide
IC50:17-75nM
结构式：
在文献Hutter-Paier,B.etal.The ACAT inhibitor CP-113,818markedlly reduces amyloidpathology in a mouse model of Alzheimer's disease.Neuron44,227-238,doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公开
U18666A
Cas No.3039-71-2
CI 976
化学名称：2,2-Dimethyl-N-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide
分子式：C23H39NO4
Cas No.114289-47-3；
IC50:SOAT1:IC50＝73nM(human)；Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1:IC50＝73nM(rat)；Sterol O-acyltransferase,Soat:IC50＝110nM(rat)；Foam cell formation:IC50＝3.8μM(rat peritoneal macrophages)；Golgi-associated LPAT activity:IC50＝15μM
结构式
TMP-153
分子式：C24H18CIF2N3O
Cas No.128831-46-9
IC50:cholesterol acyltransferase(ACAT):IC50＝5-10nM；Acyl coenzyme A:cholesterolacyltransferase 1:IC50＝5.8nM(Rattus norvegicus)
YM 750
分子式：C31H36N2O
Cas No.138046-43-2
IC50:0.18μM
GERI-BP002-A
化学名称：2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol)；
分子式C23H32O2
Cas No.119-47-1
Sandoz 58-035
化学名称：
3-[Decyldimethylsilyl]-N-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiideSA 58-035
分子式：C30H47NOSi
Cas No.78934-83-5
IC50:ACAT1,0.3μM(Rat)
VULM 1457
化学名称：
N-[2,6-bis(1-Methylethyl)phenyl]-N'-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea；
分子式：C25H27N3O3S
Cas No.228544-65-8
Lovastatin，
结构式如下：
U18666A
Cas No.3039-71-2
CTL细胞
CTL细胞即为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)，是一种终末分化的CD8T细胞，可以通过其TCR识别相应抗原并对表达相应抗原的肿瘤细胞或者受感染的细胞进行杀伤。
CD8T细胞
CD8T细胞即为CD8阳性T细胞。CD8(群集分化8)是作为协同受体的T细胞受体(TCR)的跨膜糖蛋白。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
1.材料和试剂
细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Life Technologies；Filipin III,Lovastatin,MβCD,MβCD-Cholesterol购自Sigma；α-CD3和α-CD28购自Biolegend；流式分析抗体α-mCD4(RM4-5),α-mCD8(53-6.7),α-mCD3ε(145-2C11),α-IFN-γ(XMG1.2),α-TNF-α(MP6-XT22),α-Granzyme B(NGZB),α-CD44(IM7),α-CD69(H1.2F3),α-PD-1(J43),α-CTLA-4(UC10-4B9),α-Ki67(16A8),α-Foxp3(FJK-16s),α-Gr1(RB6-8C5),α-CD11b(M1/70)和α-CD45(30-F11)购自eBioscience；Western-blotting抗体α-pCD3ζ购自Abcam,α-CD3ζ购自Santa Cruze,α-pZAP70,α-ZAP70,α-pLAT,α-LAT,α-pErk1/2和α-Erk1/2购自Cell Signaling；MTS检测试剂盒购自Promega；U18666A购自Merck；Avasimibe购自Selleck；K604由中科院上海药物研究所合成；CP113,818由Pierre Fabre提供；EL-4,B16F10细胞系和LLC(Lewis Lung Carcinoma)细胞系最初来源于ATCC,由中国科学院细胞库提供。
2.实验动物
C57BL/6小鼠购自SLAC；OT-I TCR转基因小鼠来自Jackson实验室；CD4cre转基因小鼠由中国科学院生物化学与细胞生物研究所刘小龙研究组提供(最初来源于Jax mice)；Acat1flox/flox来自InGeneious Labs，该试验动物在Acat1基因的14号外显子毗邻的两个内含子上分别有一个LoxP位点，该外显子编码有His460位点，该位点是ACAT1的酶活所必需的，Acat1flox/flox可采用现有常规技术构建。实验中所有的动物都饲养在SPF设施中。
3.T细胞分离，培养和流式检测
T细胞来自小鼠脾脏和淋巴结，通过CD8或者CD4阴性筛选磁珠(Stem Cell)进行分离得到。对于肿瘤浸润T细胞的分离，小鼠在注射肿瘤后14-18天，将肿瘤取出，剪成1-2mm碎片，胶原酶IV(Sigma)消化1小时，然后通过40–70％Percoll(GE)密度梯度离心得到肿瘤浸润白细胞群。为进一步得到肿瘤浸润的CD8T细胞，进一步用CD8阳性磁珠分选试剂盒(Stem Cell)进行分离。
分离得到的细胞用含50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640完全培养基在37℃CO2培养箱培养。为进一步分析T细胞的功能表型，针对细胞表面标志物如CD8,CD44,CD69，细胞离心后直接用PERCP-α-CD8，FITC-α-CD44，PE-α-CD69进行染色，然后流式检测；而针对胞内颗粒酶和细胞因子的检测，分离到的细胞继续用1μM ionomycin和50ng/ml PMA刺激培养4个小时，在培养过程中加入5μg/ml Brefieldin A(BFA)，以阻断颗粒酶和细胞因子向胞外分泌。刺激结束后，4％多聚甲醛(PFA)室温固定10分钟，然后胞内染色检测胞内颗粒酶和细胞因子的水平。
4.胆固醇定量
a.Filipin染色和激光共聚焦成像技术对细胞质膜胆固醇进行相对定量
Filipin III溶于甲醇中至5mg/ml。T细胞用4％PFA固定，然后用50μg/ml Filipin III于4℃染色30分钟，然后PBS洗5次以去除游离Filipin。成像图片由Leica SP8激光共聚焦显微成像系统获取，相对定量结果由Leica LAS AF软件分析得到。
b.基于胆固醇氧化的胆固醇定量方法
细胞经0.1％戊二醛固定15分钟后，PBS洗3次，然后用2U/ml胆固醇氧化酶室温处理15分钟以氧化细胞质膜上游离胆固醇；氧化反应结束后PBS洗3次以去除残留的胆固醇氧化酶，细胞内未被氧化的游离胆固醇用甲醇/氯仿(V:V＝1:2)提取，然后用Amplex RedCholesterol检测试剂盒(Life technology)对游离胆固醇进行定量。细胞质膜胆固醇的含量由未被氧化酶处理的样品胆固醇含量减去氧化酶处理过的样品胆固醇含量得到。
5.MβCD和MβCD-Cholesterol处理改变细胞质膜胆固醇水平
为降低细胞质膜胆固醇水平，0.1–1mM MβCD 37℃处理CD8T细胞5分钟，然后PBS洗三次。为提高细胞质膜胆固醇水平，1-10μg/ml MbCD-Cholesterol 37℃处理CD8T细胞15分钟，然后PBS洗三次。
6.OVA抗原激活OT-I CD8T细胞
将C57BL/6小鼠脾脏细胞中的T细胞用T细胞阳性磁珠分选试剂盒(Miltenyibiotech)去除，然后分别递呈OVA抗原OVA257-264(SIINFEKL，简称N4)，及突变体SAINFEKL(简称A2)，SIITFEKL(简称T4)，SIIGFEKL(简称G4)以及自身抗原RTYTYEKL(简称Catnb)和阳性选择抗原SIIRFEKL(简称R4)作为抗原递呈细胞(APC)。具体的，为分别将OVA抗原OVA257-264，A2，T4，G4，R4和自身抗原Catnb与前述处理后的小鼠脾脏细胞一起在37℃孵育以得到抗原呈递细胞，同时；将阴性磁珠分选得到的OT-I CD8T细胞与抗原递呈细胞共同培养(1：5)24小时，在培养的最后4小时加入5μg/ml BFA(是布雷菲德菌素A)，以阻止细胞因子向胞外分泌，最后通过胞内染色和流式检测细胞因子的表达。
7.检测CD8T细胞(CTL)的细胞杀伤能力。
分离OT-I转基因小鼠的脾脏，红细胞裂解液去除红细胞后用5nM OVA257-264(N4)刺激，并在培养基中加入10ng/ml IL-2，3天后换液补加IL-2并继续培养2天得到分化成熟的杀伤性CD8T细胞(CTL)。将EL-4小鼠淋巴瘤细胞分别与2nM抗原肽OVA257-264及其突变体A2，T4，G4，R4和自身抗原Catnb在37℃孵育30分钟以递呈相关抗原，PBS洗3次后将递呈抗原的EL-4细胞和CTL重悬在无酚红RPMI1640培养基(含2％FBS)中，然后以1：1，1：2，1：5比例混合(EL-4细胞数量为1×105)加入96孔板中，200g离心2分钟。37℃CO2培养箱培养4小时，200g离心5分钟，取培养上清液，通过CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity试剂盒(Promega)检测培养基中乳酸脱氢酶LDH的释放以计算CTL对靶细胞的杀伤效率。
8.小鼠B16黑色素瘤模型
B16F10黑色素瘤细胞用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至2×106/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl体积)，从第10天开始，游标卡尺测量肿瘤大小，每两天测一次，肿瘤大小＝长度×宽度。当肿瘤其最长轴超过20mm时，将小鼠安乐死，并记录死亡时间点。
10.小鼠黑色素瘤T细胞过继治疗
表达鸡卵清蛋白Ovalbumin的B16F10-OVA黑色素瘤细胞(可参考文献：Yang J et al.,Kuper-type immunological synapse characteristics do not predict anti-brain tumor cytolytic T-cellfunction in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2010.197(10):4716-21；或Zhou P et al.,In vivodiscovery of immunotherapy targets in the tumour microenvironment.Nature.2014,506(7486):52-7获得)用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至2×106/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl)。在注射肿瘤细胞后第10天，将成瘤且肿瘤大小一致的小鼠随机分成3组，以尾静脉注射(i.v.)的方式分别注射200μl PBS，野生型OT-I CTL和ACAT1基因敲除的OT-I CTL(1.5×106)，3天后开始测量肿瘤大小，每两天测一次。当肿瘤其最长轴超过20mm时，将小鼠安乐死，并记录死亡时间点。
ACAT1基因敲除的OT-I小鼠的获得：CD4Cre小鼠与Acat1flox/flox小鼠交配获得CD4Cre-Acat1flox/flox,然后与OT ITCR转基因小鼠交配，最终获得OT-I-CD4Cre-Acat1flox/flox小鼠和相应的对照小鼠OT-I-e-Acat1flox/flox小鼠。
CTL的诱导方法是：取野生型或ACAT1基因敲除的OT I小鼠脾脏，分别用10nM的OVA257-264(N4)肽段刺激，并提供10ng/ml IL-2，刺激2天后，在第3天换无N4肽段的培养基(含10ng/ml IL-2)继续培养2天即可获得成熟的CTL。
11.小鼠LLC肺癌模型
LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌细胞用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至107/ml，然后尾静脉注射(i.v.)到8-10周雄鼠体内(200μl体积)。在注射肿瘤细胞后第11天，将荷瘤小鼠随机分成2组，以腹腔注射(i.p.)的方式给小鼠注射Avasimibe，剂量为15mg/kg，3天注射一次，连续给药9次。在注射肿瘤细胞后7周，取部分小鼠的肺脏，对肿瘤斑点进行计数，以评估肿瘤治疗效果，同时记录剩余小鼠的死亡时间点。
12.超高分辨率随机光学重构显微镜STORM(Super-resolution Stochastical OpticalReconstruction Microscopy)检测细胞质膜上TCR(抗原受体)的分布。
超高分辨率随机光学重构显微镜STORM成像在Nikon N-STORM成像系统上进行，该系统配有ECLIPSE Ti-E电动相差显微镜，Apochromat 100倍TIRF油镜和EMCCD。荧光染料选用Alexa647，通过647nm连续可见光激光器(200mW)和450nm二极管激光器激发荧光染料。成像时TIRF角度参数在3900-4000，以保证样品成像深度在1μm左右。CD8T细胞和激活的CD8T细胞(10μg/mlα-CD3抗体37℃刺激10分钟)通过多聚赖氨酸贴在Ibidi 35mmμ-Dish上，然后4％PFA固定；PBS洗3次后用2μg/ml Alexa647-α-CD34℃标记2小时。成像前，将PBS替换成成像缓冲液(TBS，含100mm MEA)。成像速度保持在90-95帧/秒，重构的图像用NIS Elements AR获取，图像信息由20,000-25,000帧图片组成。
为了分析TCR在质膜上的成簇情况，对图片中TCR微簇的位置信息用Ripley’s K function和Matlab分析，L(r)-r值代表在一定半径(r)内分子聚集的概率，而L(r)-r最大值对应的r即分析选定区域内TCR微簇的半径。
13.全内反射荧光显微成像TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，)方法动态检测T细胞免疫突触形成过程。
DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)与生物素标记的DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩尔比混合，超声形成脂质体。使用No.1.5H厚度玻璃底的细胞培养皿，食人鱼酸液处理玻璃底表面并用双蒸水清洗干净。用浓度0.1mM的生物素标记的脂质体孵育玻片20分钟。PBS充分清洗后，用链霉亲和素(streptavidin)孵育30分钟。PBS充分清洗后，用生物素标记的小鼠CD3ε抗体(bionylatedα-mCD3ε,145-2C11)孵育30分钟。PBS充分清洗后，用1％酪蛋白封闭20分钟。PBS充分清洗，平面脂双分子层准备完毕。
α-mTCRβ抗体(Biolegend)进行荧光染料标记(Alexa Fluor 568NHS Ester，LifeTechnologies),经脱盐柱脱盐后使用Papain蛋白酶酶切(Pierce Fab Micro Preparation Kit,Thermo Scientific),最后经Protein A柱分离(Protein A Plus Spin Column,Thermo Scientific)得到Alexa 568-α-mTCRβ-Fab。
新鲜分离的小鼠脾脏淋巴细胞用Alexa568-α-mTCRβ-Fab和FITC-α-mCD8a(eBioscience)冰上染色，PBS清洗2次。重悬的细胞加入如上所述的铺有平面脂双分子层的培养皿，置于37℃加热台，以3秒每帧的速度拍摄，进行活细胞全内反射荧光显微镜成像。或者重悬的细胞加入上文所述铺有平面脂双分子层的培养皿，置于37℃培养箱，刺激一定时间后用4％PFA固定，全内反射荧光显微镜成像。FITC阳性的CD8T细胞用Image Pro Plus software(Media Cybernetics)、ImageJ(NIH)和MATLAB(MathWorks)软件经行数据分析。
14.MTS方法检测肿瘤细胞活率。
B16F10细胞(5×103)重悬于100μl含有1μM Avasimibe或DMSO对照的培养基中。37℃培养24、48、或72小时。加入20μl MTS试剂(Promega)，孵育1-3小时后，测量490nm吸光度。490nm处的吸光值与培养中的活细胞数成正比。Avasimibe对细胞活性的影响通过以DMSO处理的细胞为对照组进行归一化处理得到，设定DMSO处理组的细胞活性为1。
15.数据统计分析
除在图释中特别注明外，本文所有数据统计都是用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)进行统计分析，分析方法采用two-tailed unpaired Student’s t-test；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns：无显著差异(no significant difference)。
16.T细胞特异性敲除ACAT1小鼠的构建及Acat1CKO CD8T、Acat1CKO CD4T细胞的获得
将Acat1flox/flox小鼠与CD4Cre小鼠交配，获得的小鼠经PCR及Western Blot检测表达量验证为T细胞特异性敲除ACAT1小鼠(CD4Cre-Acat1flox/flox,简称Acat1CKO)。
Acat1CKO CD8T细胞的获得：采用CD8磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
Acat1CKO CD4T细胞的获得：采用CD4磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
17.CD8T细胞活化方法
通过磁珠分选得到的新鲜T细胞，重悬于RPMI 1640完全培养基中，α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(μg/ml)铺板刺激,37℃CO2培养箱中培养刺激24小时,为进一步用胞内染色-流式细胞术检测细胞因子的表达，在最后4小时补加5μg/ml Brefeldin A以阻断细胞因子向细胞外分泌。
实施例1 细胞质膜胆固醇水平影响CD8T细胞的效应功能
本实施例用环糊精MβCD处理Acat1CKOCD8T细胞，然后检测CD8T细胞颗粒酶B和细胞因子的表达，以及杀伤性CD8T细胞(CTLs)的靶细胞杀伤能力。实验发现通过MβCD处理下调CD8T细胞质膜胆固醇水平后，其颗粒酶B和细胞因子IFNγ，TNFα的表达显著下降，且呈一定的剂量效应。相应地，CTL对靶细胞的杀伤能力也明显减弱(图1.a-b)。实验又进一步通过MβCD包被的胆固醇(Chol)处理野生型CD8T细胞，上调其细胞质膜胆固醇水平。结果显示，野生型CD8T细胞被上调质膜胆固醇水平后，其颗粒酶B和细胞因子IFNγ，TNFα的表达明显上升，且呈剂量效应，相应地，CTL对靶细胞的杀伤能力也明显增强(图1.c-d)。这些证据表明CD8T细胞质膜胆固醇对其效应功能的实现是必需的，而Acat1CKOCD8T细胞是通过其质膜胆固醇水平上调获得更强的免疫应答效应。
实施例2 抑制胆固醇酯化可以增强CD8T细胞的效应功能
试验方法：磁珠分选得到的细胞重悬于RPMI 1640完全培养基中，加入相应浓度的抑制剂，37度CO2培养箱中培养处理6小时，然后RPMI 1640完全培养基清洗3次，最后重悬于RPMI 1640完全培养基中并转移到铺有激活抗体α-CD3和α-CD28的孔板中，37度CO2培养箱中培养刺激20小时，然后加入Brefeldin A(5μg/ml)继续培养4小时，抑制细胞因子的分泌。培养结束后收集细胞，进行CD8抗体表面标记，然后用4％多聚甲醛室温固定10分钟，0.1％Triton-X100对细胞膜打孔后加抗Granzyme B,IFNγ,TNFα抗体标记细胞内相应蛋白，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中相应蛋白如Granzyme B,IFNγ和TNFα的表达水平。
本实施例的目的是研究胆固醇代谢与CD8T细胞功能的相关性。实验通过一系列抑制剂抑制胆固醇代谢相关通路，然后检测CD8T细胞的功能是否发生相应的改变。实验结果表明，细胞胆固醇合成抑制剂Lovastatin和细胞胆固醇的转运抑制剂U18666A都显著抑制CD8T细胞颗粒酶B(Granzyme B,GzmB)的释放以及细胞因子如IFNγ和TNFα的表达，且抑制效果呈剂量效应(图2.a,b)。通过CP113,818抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1和ACAT2的活性，则明显促进CD8T细胞的效应功能(图2.c)。在CD8T细胞中ACAT1的转录水平约是ACAT2的20倍，选取ACAT1的特异性抑制剂K604处理CD8T细胞，实验结果表明，K604处理同样增强CD8T相比的效应功能(图2.d)。表明通过抑制ACAT1的功能则增强CD8T细胞的效应功能。
实施例3 ACAT1敲除上调CD8T细胞质膜胆固醇水平
本实施例进一步研究ACAT1基因敲除后CD8T细胞抗肿瘤活性增强的具体分子机理。首先，检测了CD8T细胞活化前后，胆固醇代谢相关途径是否受ACAT1敲除的影响。通过实时定量PCR检测了胆固醇代谢的主要通路包括胆固醇合成、吸收和外排，实验发现Acat1CKO CD8T细胞在活化后其胆固醇合成通路明显增强，表现为固醇合成通路相关基因如Srebp1,Srebp2,Acaca,Fasn,Hmgcs,Hmgcr以及Sqle的mRNA水平明显升高，而胆固醇的吸收和外排途径相关基因mRNA水平只有轻微改变(图3.e-p)。进一步通过filipinIII成像和基于胆固醇氧化的定量实验检测了细胞胆固醇水平是否受ACAT1敲除的影响，结果表明Acat1CKO CD8T细胞在活化前后，其总游离胆固醇水平及质膜胆固醇水平较野生型CD8T细胞显著升高(图3.a-d)。这些证据表明ACAT1基因敲除改变了CD8T细胞的胆固醇稳态，使得胆固醇合成增加，胆固醇酯化减少，从而使得细胞质膜上胆固醇水平增加。
实施例4 Avasimibe通过抑制ACAT1促进CD8T细胞的抗肿瘤活性。
本实施例的目的是验证Avasimibe是否是通过抑制ACAT1发挥其肿瘤免疫能力。为了验证这一点，在体外用Avasimibe对CD8T细胞进行处理，检测其细胞质膜胆固醇水平的变化。通过Filipin III对细胞进行染色，发现Avasimibe处理后，CD8T细胞质膜游离胆固醇水平明显上升(图4.a,b)。通过STORM对CD8T细胞表面TCR的定位进行分析发现，Avasimibe处理促进TCR微簇的形成(图4.c-e)；通过TIRFM对T细胞活化过程中免疫突触的形成进行分析，也表明Avasimibe处理促进CD8T细胞免疫突触的形成(图4.f,g)。进一步通过western-blotting方法检测Avasimibe处理后TCR信号通路的活化情况，结果也表明Avasimibe处理增强TCR信号通路的活化(图4.h)。这些结果与ACAT1敲除的CD8T细胞的表现一致。同时，为进一步在动物体内验证该机制，实验从Avasimibe给药的荷瘤小鼠的肿瘤中分离肿瘤浸润的CD8T细胞，通过STORM对肿瘤浸润的CD8T细胞上TCR的分布进行成像分析，发现Avasimibe处理(于RPMI 1640完全培养基中加药后，37℃CO2培养箱中培养处理6小时，处理完之后用培养基或PBS离心清洗3次)后，肿瘤浸润的CD8T细胞表面TCR微簇更大(图4.i-k)。这些证据表明Avasimibe确实是通过抑制ACAT1促进CD8T细胞的活化，从而增强其抗肿瘤活性。
实施例5 ACAT1基因敲除促进CD8T细胞的增殖并减少凋亡
本实施例的目的是为了检测ACAT1对CD8T细胞增殖的影响。通过CFSE标记实验，用α-CD3+α-CD28抗体刺激CD8细胞，进一步检测ACAT1对CD8T细胞增殖的影响，发现与野生型CD8T细胞相比，Acat1CKO CD8T细胞的增殖能力增强(图5.a)。同时通过AnnexinV和PI染色检测CD8T细胞激活后的凋亡，结果显示Acat1CKO CD8T细胞Annexin V-PI-的活细胞所占比例相比较与野生型细胞的明显增多，而处于凋亡状态的细胞(AnnexinV+PI-和AnnexinV+PI+)所占比例则显著减少(图5.b,c)。
实施例6 利用三种黑色素瘤模型研究ACAT1基因敲除促进CD8T细胞的抗肿瘤活性
免疫治疗是当前治疗肿瘤的热点，而CD8T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力直接关系到肿瘤免疫治疗的效果。为了验证ACAT1敲除对CD8T细胞的抗肿瘤能力的影响，本实施例首先建立了皮下黑色素瘤模型，在Acat1CKO小鼠和野生型小鼠中皮下注射B16F10黑色素瘤细胞诱导黑色素瘤，实验发现Acat1CKO小鼠黑色素瘤的进程被显著延缓，表现为肿瘤生长更慢，小鼠的生存率和生存期更长(图6.a,b)。对荷瘤小鼠的T细胞的表型进行分析，发现在Acat1CKO小鼠中，肿瘤浸润的CD8T细胞活性更强，表现为Acat1CKO小鼠肿瘤浸润CD8T细胞中，CD44高表达的效应细胞更多，表达颗粒酶B和细胞因子IFNγ和TNFα的比例也更高；而且Acat1CKO小鼠肿瘤浸润CD8T细胞的数量、CD8/CD4细胞的比例也要高于野生型、细胞增殖的标志物Ki-67的表达水平也更高(图6.c,d)。免疫检测点受体如PD-1和CTLA-4目前是肿瘤免疫治疗的热门靶点，实验也检测了肿瘤浸润的CD8T细胞表面PD-1和CTLA-4的表达水平，发现其在Acat1CKO和野生型小鼠中没有明显差异(图6.e)；同时实验也检测了肿瘤中CD4T细胞中Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例,发现ACAT1敲除并不改变Treg细胞在CD4T细胞中的比例(图6.f)。以上结果表明ACAT1敲除使CD8T细胞的抗肿瘤效应功能增强。
为了进一步验证CD8T细胞在该肿瘤模型中的应答反应受ACAT1的调控，实验在皮下注射B16F10黑色素瘤细胞后第7天，将Acat1CKO和野生型小鼠的引流淋巴结(draining lymphnode)取出，分析其中T细胞的表型。实验发现Acat1CKO小鼠引流淋巴结中的CD8T细胞CD44水平和细胞因子IFNγ的表达上升(图6.g)，而且CD8T细胞的数量以及CD8/CD4的比率也显著升高(图6.h)，表明ACAT1缺陷促进CD8T细胞的初始免疫应答反应。
相比较与皮下实体瘤，转移型肿瘤的进程更为复杂，其治疗更为艰难。为进一步检测ACAT1缺陷是否影响CD8T细胞对转移瘤的免疫应答反应，实验建立了黑色素瘤肺转移小鼠模型，向Acat1CKO和野生型小鼠尾静脉注射B16F10黑色素瘤细胞，然后检测肺脏中黑色素瘤的发展进程。实验发现在Acat1CKO小鼠中，与野生型对照小鼠相比，其肺脏肿瘤数量明显减少，而且小鼠的生存率和生存期更长(图6.i-k)。通过苏木精-伊红(H&E)对肺脏组织进行染色，发现ACAT1基因敲除后，黑色素瘤在肺脏中的浸润明显减弱(图6.l)。对肺脏T细胞的表型进行分析，也发现Acat1CKO小鼠CD8T细胞中CD44高表达的效应细胞更多，表达颗粒酶B和细胞因子IFNγ和TNFα的比例也更高(图6.m)。这些结果表明ACAT1缺陷增强CD8T细胞在非转移和转移型肿瘤中的抗肿瘤免疫应答效应。
由于Acat1CKO中所有的T细胞都缺失ACAT1，为了验证ACAT1基因敲除是对肿瘤浸润的CD8T细胞而非CD4T细胞的功能的影响而获得更强抗肿瘤作用，在野生型C57小鼠皮下注射B16F10-OVA黑色素瘤细胞，该细胞表达Ovalbumin，可以被黑色素瘤细胞的H2Kb递呈在细胞表面，从而被OT-I CD8T细胞识别。在野生型小鼠成功诱导黑色素瘤后，在注射肿瘤后第10天以尾静脉注射的方式，将来自Acat1CKO小鼠和野生型小鼠的OT-I CTL注射到荷瘤野生型小鼠体内，然后监测肿瘤生长并记录小鼠的生存情况(图6.n)，结果表明，注射了Acat1CKO OT-I CTL的实验组肿瘤生长比注射了野生型OT-I CTL的对照组更慢，而且小鼠的生存时间更长(图6.o,p)，进一步表明ACAT1特异性敲除的CD8T细胞有更好的抗肿瘤作用。
实施例7 ACAT1基因敲除促进CD8T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体TCR的微簇形成并增强TCR信号通路的活化。
本实施例研究了ACAT1敲除对TCR的信号转导的影响。实验通过α-CD3加α-CD28抗体激活Acat1CKO CD8T细胞，检测TCR和其下游信号分子的活化情况。实验发现，ACAT1敲除明显促进TCR磷酸化和TCR近端活化信号的增强，表现为CD3ζ、ZAP70和LAT的磷酸化明显增强。同时TCR的下游通路信号分子如Erk1/2的磷酸化也显著升高(图7.a)。实验采用了超高分辨率随机光学重构显微成像技术(Super-resolution Stochastical OpticalReconstruction Microscopy,STORM)对CD8T细胞质膜表面的TCR微簇进行分析。结果显示，ACAT1基因敲除不改变CD8T细胞质膜上TCR的表达水平(图7.b)，但是能明显促进TCR微簇的形成：Acat1CKO CD8T细胞的TCR微簇比野生型CD8T细胞的更大。由于TCR微簇的形成受TCR活化信号的影响，T细胞活化后其TCR微簇会明显增大，因此实验进一步分析了活化后TCR微簇的形成情况。结果表明，CD8T细胞活化后其TCR微簇增大，而且活化的Acat1CKO CD8T细胞的TCR微簇比活化的野生型CD8T细胞的更大(图7.c-e)。这些结果表明ACAT1基因敲除后CD8T细胞TCR微簇的增大，从而使得TCR及其下游信号通路活化增强。
实施例8 ACAT1基因敲除促进CD8T细胞免疫突触(Immunological synapse,IS)的形成。
T细胞在识别抗原后，与靶细胞在细胞-细胞接触面形成免疫突触结构(immunologicalsynapse)，免疫突触的形成有助于维持信号体(signalsome)的稳定，以保证T细胞的充分活化并产生相应的免疫应答反应。对于起细胞杀伤作用的CD8T细胞，免疫突触的形成不仅有助于稳定signalsome，还能通过这个突触结构向靶细胞释放颗粒酶等，增强其对靶细胞的杀伤能力。本实验研究了ACAT1敲除的CD8T细胞对免疫突触形成的影响。实验进一步通过活细胞全内反射荧光显微镜技术(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)，实时跟踪检测免疫突触的形成过程，实验发现Acat1CKOCD8T细胞能更有效地形成免疫突触结构，表现为TCR所在的cSMAC结构形成更快，而且收敛更好(图8.a,b)。对免疫突触形成过程中TCR微簇的分子动态行为进行分析，结果表明Acat1CKO CD8T细胞的免疫突触中可运动的TCR微簇占全部的TCR微簇的比例更高，且向心移动速度更快，有助于免疫突触的进一步稳定(图8.c-e)。
实施例9 ACAT抑制剂Avasimibe增强CD8T细胞的抗肿瘤功能。
本实施例目的是进一步验证ACAT1抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用。ACAT1作为用作治疗动脉粥样硬化的靶点，目前已有一系列小分子药物在进行动物和临床实验。Avasimibe是其中一种，目前多次临床实验已经验证了Avasimibe在的安全性。因此选用Avasimibe，验证ACAT1作为肿瘤免疫治疗靶点的可能性。体外实验表明，Avasimibe与其他ACAT抑制剂如CP113,818和K604一样，可以促进CD8T细胞颗粒酶B的释放和细胞因子IFNγ和TNFα的表达(图9.a)。体外杀伤实验也表明Avasimibe增强CTL的靶细胞杀伤能力，且呈剂量效应(图9.b)。实验进一步在小鼠黑色素瘤模型中验证Avasimibe的作用，通过对黑色素瘤荷瘤野生型小鼠进行腹腔注射给药(15mg/kg)处理，与对照小鼠相比，Avasimibe给药的小鼠肿瘤生长减慢，小鼠的生存时间也显著延长(图9.d-f)。为了验证Avasimibe不是通过直接抑制肿瘤细胞的生长，在体外实验中用Avasimibe处理B16F10黑色素瘤细胞，发现Avasimibe处理不影响B16F10细胞的活性(图9.c)。对小鼠肿瘤浸润的免疫细胞进行分析发现，Avasimibe给药的小鼠中：其肿瘤浸润的CD8T细胞活性更高，表现为CD8T细胞表面活化标记CD44的表达比例更高，而且表达颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的细胞比例也更高。对小鼠肿瘤浸润的T细胞进行计数，发现Avasimibe给药组的肿瘤浸润CD8T细胞数量更多，且CD8/CD4比率更高。另外Avasimibe给药组肿瘤浸润CD8T细胞中的细胞增殖标记物Ki-67的表达水平也更高(图9.g-h)。考虑到肿瘤微环境的免疫抑制效应，实验也检测了CD8T细胞上的免疫抑制受体PD-1和CTLA-4的表达水平，发现Avasimibe给药并未改变这些免疫检测点受体的表达(图9.i)。
肿瘤微环境中还存在有一些抑制型的免疫细胞如Treg(regulatory T cell)和MDSC(Myeloid-derived suppressor cell)，这些细胞通过抑制CD8T细胞等肿瘤杀伤细胞的活性，在肿瘤的发展进程中起着关键的作用。因此实验进一步检测了肿瘤组织中Treg和MDSC的比例，Avasimibe给药后，Treg(CD4+FoxP3+)细胞在CD4T细胞中的比例没有明显改变，而MDSC(Gr1+CD11b+CD45+)在CD45+免疫细胞中的比例有较轻微的降低(图9.j，k)，考虑到Avasimibe给药组的肿瘤组织中CD8T细胞的数量明显上升，MDSC在CD45+细胞中的比例降低可能是由于CD8T细胞在CD45+细胞中的比例上升所致(图9.h)。这些证据表明，ACAT抑制剂Avasimibe可以通过上调CD8T细胞杀伤性效应而在肿瘤治疗中起作用。
实施例10 ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
本试验的目的是验证ACAT1作为药物靶点在临床上使用的潜在价值，在人CD8T细胞中分别用ACAT抑制剂Avasimibe和CP113,818抑制ACAT的活性，然后通过抗体交联的方式激活CD8T细胞，通过流式细胞术检测CD8T细胞细胞因子IFNγ和TNFα的表达。
试验方法：通过Ficoll从健康志愿者体内获得的外周血中分离PBMC，然后用5μg/ml PHA刺激获得CD8+杀伤性T细胞。3天后换成不含PHA的培养液继续培养24小时，以降低本底信号。再使用相应浓度的Avasimibe或CP113,818孵育处理12小时，细胞换液并通过铺板刺激的方式用5μg/mlα-CD3+5μg/mlα-CD28抗体刺激24小时，在最后4小时加入5μg/mlBrefeldin A以阻断细胞因子的分泌，最后通过胞内染色和流式细胞术检测CD8+T细胞中细胞因子IFNγ和TNFα的表达。双尾非配对t-test用于差异显著性分析。
试验结果：ACAT抑制剂CP113,818和Avasimibe均能促进人CD8T细胞细胞因子的表达，且具剂量效应，表明ACAT1作为增强CD8T细胞效应功能的靶点同样适用于人的CD8T细胞(图10)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (14)

1.一种提高T细胞活性的方法，为提高T细胞质膜胆固醇水平从而提高T细胞活性。
2.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述提高T细胞活性包括提高T细胞的效应功能和/或肿瘤杀伤功能。
3.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述T细胞为CD8T细胞。
4.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述T细胞为CD8T细胞，所述方法通过上调CD8T细胞质膜胆固醇水平，提高了CD8T细胞的效应功能。
5.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述T细胞为CD8T细胞，所述方法通过上调CD8T细胞质膜胆固醇水平，提高了CD8T细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
6.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述方法选自以下任一：
1)调节胆固醇代谢通路以提高T细胞质膜胆固醇水平；
2)于T细胞上直接增加质膜上胆固醇的量。
7.如权利要求6所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述方法1)中，调节胆固醇代谢通路的方法为：在胆固醇合成促进剂、胆固醇转运促进剂、胆固醇储存抑制剂和胆固醇外排抑制剂中的一种或多种存在下培养T细胞。
8.如权利要求6所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述方法2)中，所述于T细胞上直接增加质膜上胆固醇的量的方法为：将胆固醇结合或依附于T细胞表面以增加质膜上胆固醇的量。
9.如权利要求1所述提高T细胞活性的方法，其特征在于，所述的提高T细胞活性的方法为体外提高T细胞活性的方法。
10.质膜胆固醇水平促进剂在制备T细胞活性促进剂中的用途。
11.如权利要求10所述的质膜胆固醇水平促进剂的用途，其特征在于，所述质膜胆固醇水平促进剂选自：胆固醇合成促进剂、胆固醇转运促进剂、胆固醇储存抑制剂或胆固醇外排抑制剂中的一种或多种。
12.如权利要求10所述的质膜胆固醇水平促进剂的用途，其特征在于，所述质膜胆固醇水平促进剂为siRNA、shRNA、抗体或小分子化合物。
13.如权利要求10所述的质膜胆固醇水平促进剂的用途，其特征在于，所述T细胞活性促进剂能提高CD8T细胞的效应功能。
14.如权利要求10所述的质膜胆固醇水平促进剂的用途，其特征在于，所述T细胞活性促进剂能提高CD8T细胞肿瘤细胞杀伤能力。
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