CN106943624A - 一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，步骤包括：采用溶胶‑凝胶技术和静电纺丝技术相结合的方法制备CaO‑P2O5‑SiO2体系介孔生物玻璃微纳米纤维，以其作为无机基相；利用基因重组技术制备载有骨细胞调节因子Osterix目的基因的质粒DNA，并以壳聚糖包埋质粒DNA制成微球，作为添加相。配制由生物玻璃微纳米纤维、基因载体微球和PCL等材料构成的乳液体系，利用热致相分离法制备复合Osterix质粒DNA的生物玻璃/PCL仿生骨组织工程支架，由此获得具有基因调控功能的硬组织工程支架。所得硬组织工程支架能够在分子水平上刺激细胞并产生特殊应答反应，可实现对细胞生长基因的精确调控。

Description

一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程支架材料领域，涉及一种硬组织工程支架的制备方法，具体涉及一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法。
背景技术
骨缺损是指由先天性或后天性疾病、外伤及人口老龄化等原因而造成的骨骼缺失，是威胁人类健康和生命的严重病症，骨缺损的修复研究是长期以来人们深入关注的重点课题之一。治疗骨缺损的有效方法是自体骨移植、异体骨移植和人造骨移植。传统的自体骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金标准”，但受到许多限制，如骨来源受限、供区损伤、植骨量不足、不能制备特殊形状等。异体骨的移植则存在疾病传播、生物组织相容性差和免疫排斥等诸多问题。现有的人工骨移植材料主要是金属和陶瓷材料，如羟基磷灰石和磷酸三钙等，这类骨移植材料虽然材料来源不受限制但是无法提供与真实骨骼相似的力学性能，并且缺乏生物响应特性，容易造成手术失败或二次手术。现有的骨组织工程支架无论是在材料的组成、表面物理化学性质还是微观-宏观结构方面均存在一定的不足。一方面，缺乏从基因层面上对细胞在材料表面生长调控的研究；另一方面，现有的支架成型方法往往不能同时在微观和宏观层次上精确调控支架的结构，严重限制了骨组织工程支架材料的研究。
20世纪70年代初，美国佛罗里达大学的Hench教授研制成功用于骨修复的生物活性玻璃(Bioactive Glass,BG，简称生物玻璃Bioglass)，并于90年代初将其成功应用于骨科临床修复骨缺损，取得良好的临床治疗效果，现在已被骨科临床广泛采用。与其它生物活性材料(如羟基磷灰石)相比，生物玻璃被认为具有较高的生物活性和骨结合强度，主要是由于生物玻璃在人体生理环境中可以迅速通过玻璃表面的Na+、Ca2+元素溶出、水中H+进入玻璃表面首先在玻璃表面形成带有负电的硅酸凝胶层，进一步通过诱导沉析和矿化作用在硅酸凝胶层上形成类骨碳酸羟基磷灰石层(Hydroxyl-Carbonate-Apatite,HCA)。研究表明生物玻璃表面的HCA层的形成，可选择性的吸附诸如纤维蛋白等血清蛋白，有利于细胞粘附及成骨细胞表型的表达，并且能直接促使骨祖细胞转化为成骨细胞，具有骨生成作用。目前，骨修复材料中所采用的生物玻璃主要以粉体为主，有学者开始研究静电纺丝法制备无机材料的微纳米纤维结构，并在此基础上进一步研究制备无机-有机复合的微纳米纤维方法，这方面的研究正处于起步阶段，例如在支架的三维结构控制和纤维的微观形貌控制中仍有很多需要解决的问题。
调整改善支架材料和细胞之间的作用对于骨组织工程支架的优化设计具有重要意义。为了使细胞在材料表面有效的粘附、生长与分化，一般通过各种物理、化学和生物改性的方法使支架材料表面的亲水性、粘附细胞的能力发生变化，或者通过加入生长因子(如骨形态发生蛋白BMP-2、转化生长因子TGF及转录因子Osterix等)的方法促进细胞的增殖与分化。单纯通过加入生长因子的方法已经很难满足支架材料的设计需要，更无法实现对细胞生长基因的精确调控，需要开发新型的细胞生长调控方法。由于骨的快速修复依赖于成骨细胞的增殖和分化，只有先活化成骨细胞中的一个基因序列，细胞才能够发生分裂并合成出具有矿化成骨能力的细胞外基质，在成骨细胞对生物材料的细胞应答中存在着一种基因控制，借助基因调控手段，能够在分子水平上刺激细胞并产生特殊应答反应，有望设计出一种新型组织工程支架材料。
为此，有必要开发一种基因调控功能的硬组织工程支架，使其能用于快速的骨修复。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种生物相容性好、微纳米形貌、表面结构及介孔尺寸大小可控的、高生物活性、具有基因调控功能的硬组织工程支架及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种生物相容性好，微纳米形貌、表面结构及介孔尺寸大小可控的，高生物活性，具有基因调控功能的硬组织工程支架及其制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)在CaO-P2O5-SiO2体系中加入表面活性剂水溶性三嵌段聚合物p123，采用静电纺丝工艺制备生物玻璃微/纳米级纤维，控制纤维的定向排列，获得规则排列的纤维；将纤维在300～400℃的温度下，烧结120～180min，得到介孔生物玻璃微/纳米纤维；
(2)提取成骨细胞特异性转录因子(Osterix)靶向基因片段，构建目的基因质粒，利用基因重组技术获得质粒DNA重组体；将壳聚糖溶液和质粒DNA重组体按照质量比2:1～5:1的比例混合，在50～100rpm的转速下快速搅拌的条件下形成质粒纳米微球；
(3)将步骤(1)所得的生物玻璃微纳米纤维和步骤(2)所得的质粒微球按照质量比10:1～20:1的比例混合均匀，然后加入到聚己内酯(PCL)的有机溶液中制成乳液，将乳液加入模具中，然后冷冻成型，脱模后将成型的支架再冷冻干燥12h，最终得到复合的硬组织工程支架。
本发明的原理是：制备生物玻璃微/纳米纤维后，通过高温烧结，使纤维上的表面活性剂剧烈蒸发，从而在纤维表面形成孔洞结构，孔洞结构的介孔生物玻璃微/纳米纤维，是具有良好吸附功能的工程支架基质；将DNA重组体与壳聚糖混合，利用壳聚糖分子和DNA之间的吸附力，可制备得包裹有DNA粒子的壳聚糖微球，微球的表面及内部均含有DNA粒子；最后将介孔生物玻璃微/纳米纤维和含有DNA粒子的微球混合，微球进入到生物玻璃微/纳米纤维的介孔中，定型，制成具有基因调控功能的硬组织工程支架。
进一步地，步骤(1)所述的静电纺丝工艺参数为：静电电压10～25Kv，接收距离5～25cm，纺丝速率0.5～5ml/h，相对湿度20％-80％。
进一步地，步骤(1)所述的静电纺丝工艺中，要控制纤维的定向排列，可以通过采用转速<500rpm的高速旋转滚筒作为接收装置而实现，或者通过采用两块水平放置的平行板电极作为接收装置而实现，或者通过采用近场静电纺丝机作为接收装置而实现。
进一步地，步骤(1)所述的介孔生物玻璃微纳米纤维，其表面形成有若干孔洞；所述孔洞的孔径尺寸范围为10～50nm。
进一步地，步骤(3)所述的冷冻成型，是将盛装有所述乳液的模具先置于4℃冰箱中冷藏24h，然后再置于0℃冰箱中冷冻1h。
进一步地，步骤(3)所述的模具优选为中空圆柱形的模具。
由以上方法制得的所得的硬组织工程支架，具有基因调控功能，用于作为骨骼修复等硬组织修复的应用。
以上所述的硬组织工程支架作为骨骼修复等硬组织修复的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明所述的硬组织工程支架能够在分子水平上刺激细胞并产生特殊应答反应；
(2)本发明所述的硬组织工程支架可实现对细胞生长基因的精确调控。
附图说明
图1是本发明所述的硬组织工程支架的技术路线框图；
图2是本发明所述的硬组织工程支架材料对细胞生长调控机制的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定，本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)在CaO-P2O5-SiO2体系中加入p123，静电纺丝工艺参数为：静电电压10Kv，接受距离10cm，纺丝速率1ml/h，相对湿度25％。高速旋转的滚筒转速为200rpm，获得规则排列的微纳米纤维；将纤维在300℃的温度下，烧结120min，使纤维上的表面活性剂剧烈蒸发，从而在纤维表面形成孔洞结构，得到介孔生物玻璃微纳米纤维。
(2)提取Osterix靶向基因片段，构建目的基因质粒，利用基因重组技术获得质粒DNA重组体。将壳聚糖溶液和质粒DNA重组体混合，混合质量比例范围为2:1，利用壳聚糖分子和DNA之间的吸引力，在50转/分的快速搅拌的条件下形成质粒纳米微球。
(3)将步骤(1)所得的生物玻璃微纳米纤维和步骤(2)所得的质粒微球按照质量比10:1的比例混合均匀，然后加入到聚己内酯(PCL)的有机溶液中制成乳液，将乳液加入圆柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低温冰箱中冷冻1h脱模，冷冻干燥12h，得到圆柱型复合组织工程支架。
实施例2
(1)在CaO-P2O5-SiO2体系中加入p123，静电纺丝工艺参数为：静电电压15Kv，接受距离15cm，纺丝速率2ml/h，相对湿度30％。高速旋转的滚筒转速为300rpm，获得规则排列的微纳米纤维；将纤维在300℃的温度下，烧结120min，使纤维上的表面活性剂剧烈蒸发，从而在纤维表面形成孔洞结构，得到介孔生物玻璃微纳米纤维。
(2)提取Osterix靶向基因片段，构建目的基因质粒，利用基因重组技术获得质粒DNA重组体。将壳聚糖溶液和质粒DNA重组体混合，混合质量比例范围为3:1，利用壳聚糖分子和DNA之间的吸引力，在80转/分的快速搅拌的条件下形成质粒纳米微球。
(3)将步骤(1)所得的生物玻璃微纳米纤维和步骤(2)所得的质粒微球按照质量比15:1的比例混合均匀，然后加入到聚己内酯(PCL)的有机溶液中制成乳液，将乳液加入圆柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低温冰箱中冷冻1h脱模，冷冻干燥12h，得到圆柱型复合组织工程支架。
实施例3
(1)在CaO-P2O5-SiO2体系中加入p123，静电纺丝工艺参数为：静电电压20Kv，接受距离20cm，纺丝速率5ml/h，相对湿度50％。高速旋转的滚筒转速为400rpm，获得规则排列的微纳米纤维；将纤维在380℃的温度下，烧结150min，使纤维上的表面活性剂剧烈蒸发，从而在纤维表面形成孔洞结构，得到介孔生物玻璃微纳米纤维。
(2)提取Osterix靶向基因片段，构建目的基因质粒，利用基因重组技术获得质粒DNA重组体。将壳聚糖溶液和质粒DNA重组体混合，混合质量比例范围为3:1，利用壳聚糖分子和DNA之间的吸引力，在80转/分的快速搅拌的条件下形成质粒纳米微球。
(3)将步骤(1)所得的生物玻璃微纳米纤维和步骤(2)所得的质粒微球按照质量比20:1的比例混合均匀，然后加入到聚己内酯(PCL)的有机溶液中制成乳液，将乳液加入圆柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低温冰箱中冷冻1h脱模，冷冻干燥12h，得到圆柱型复合组织工程支架。

Claims (9)

1.一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在CaO-P2O5-SiO2体系中加入表面活性剂水溶性三嵌段聚合物p123，采用静电纺丝工艺制备生物玻璃微/纳米级纤维，控制纤维的定向排列，获得规则排列的纤维；将纤维在300～400℃的温度下，烧结120～180min，得到介孔生物玻璃微/纳米纤维；
(2)提取成骨细胞特异性转录因子(Osterix)靶向基因片段，构建目的基因质粒，利用基因重组技术获得质粒DNA重组体；将壳聚糖溶液和质粒DNA重组体按照质量比2:1～5:1的比例混合，在50～100rpm的转速下快速搅拌的条件下形成质粒纳米微球；
(3)将步骤(1)所得的生物玻璃微纳米纤维和步骤(2)所得的质粒微球按照质量比10:1～20:1的比例混合均匀，然后加入到聚己内酯(PCL)的有机溶液中制成乳液，将乳液加入模具中，然后冷冻成型，脱模后将成型的支架再冷冻干燥12h，最终得到复合的硬组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的静电纺丝工艺参数为：静电电压10～25Kv，接收距离5～25cm，纺丝速率0.5～5ml/h，相对湿度20％-80％。
3.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的静电纺丝工艺，是通过采用转速<500rpm的高速旋转滚筒作为接收装置而实现控制纤维的定向排列。
4.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的静电纺丝工艺，是通过采用两块水平放置的平行板电极作为接收装置而实现控制纤维的定向排列。
5.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的静电纺丝工艺，是通过采用近场静电纺丝机作为接收装置而实现控制纤维的定向排列。
6.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的介孔生物玻璃微纳米纤维，其表面形成有若干孔洞；所述孔洞的孔径尺寸范围为10～50nm。
7.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的冷冻成型，是将盛装有所述乳液的模具先置于4℃冰箱中冷藏24h，然后再置于0℃冰箱中冷冻1h。
8.根据权利要求1所述的一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的模具为中空圆柱形的模具。
9.根据权利要求1～8任一项所述一种具有基因调控功能的硬组织工程支架的制备方法，其特征在于，所得的硬组织工程支架，具有基因调控功能，用于作为骨骼修复等硬组织修复的应用。
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