CN106918572B - 马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，包括：步骤一，基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食中是否含有马铃薯全粉或薯泥，若含有则进入步骤二；步骤二、基于近红外光谱技术测定待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量：2.1)取马铃薯全粉或薯泥含量已知的多个样品，利用近红外光谱仪扫描每个样品，处理得到每个样品的近红外光谱特征峰；2.2)利用建模软件将多个样品的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量之间进行分析，建立马铃薯的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量的定标方程；2.3)利用近红外扫描仪扫描待测马铃薯复配主食，处理得到待测马铃薯复配主食的近红外光谱特征峰，基于定标方程计算待检测马铃薯复配主食中马铃薯全粉或薯泥的含量。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，涉及一种马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法。
背景技术
目前，马铃薯已成为我国第四大主粮，国家马铃薯主食化项目进程正在推进，一大批丰富多样的马铃薯主食应运而生，而马铃薯主食用复配粉是制作许多马铃薯主食产品必不可少的原料。由于马铃薯复配主食原料中常用的马铃薯全粉或薯泥包含了马铃薯除薯皮以外的全部干物质，营养丰富，且加工成本远高于马铃薯淀粉和小麦粉，因此市售的马铃薯复配原料或马铃薯主食中的马铃薯全粉或薯泥百分含量是否与产品标签所注一致，是否存在掺假、以少称多等情况。比如以马铃薯淀粉或者其他淀粉代替马铃薯全粉或薯泥，成为消费者和监管部门共同关注的问题。因此，马铃薯主食产品中马铃薯全粉或薯泥含量的检测方法的建立刻不容缓。目前，马铃薯全粉或薯泥含量的测定没有成熟的方法，且由于马铃薯全粉或薯泥的主成分物质与其他粮食相近，特征物质难以确定。为此，亟需建立一种准确测定马铃薯全粉或薯泥百分含量的方法，规范马铃薯复配粉的生产与市场流通，进而保证消费者的合法权益。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，包括：
步骤一，基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ IDNO：1所示的特异碱基序列中的部分序列，若含有，则判定所述待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥，若该待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉，则进入步骤二；
步骤二，基于近红外光谱技术测定待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量：
2.1)取多个样品，该多个样品中的马铃薯全粉或薯泥含量已知，利用近红外光谱仪于扫描范围890～1100nm内扫描每个样品，经过处理得到每个样品的近红外光谱特征峰；
2.2)利用建模软件将该多个样品的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量之间进行分析，经过多元散射校正进行近红外光程的校正以消除光程差异，同时采用卷积平滑一阶导数对光谱进行平滑预处理，在全光谱850-1100nm范围内，采用偏最小二乘法合并交互验证的方法，建立马铃薯的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉含量的定标方程；
2.3)利用近红外扫描仪于扫描范围890～1100nm内扫描待测马铃薯复配主食，经过处理得到待测马铃薯复配主食的近红外光谱特征峰，基于所述定标方程计算得到待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥的含量。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，所述马铃薯全粉包括马铃薯熟全粉和马玲薯生全粉。该发明中马铃薯含量包括马铃薯熟全粉、马铃薯生全粉和马铃薯薯泥的折干物质的量。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)中，所述多个样品的马铃薯全粉或薯泥含量从0％至100％，且每个样品中的马铃薯全粉或薯泥的含量均不相同，其中任意两个样品的马铃薯全粉或薯泥的含量的差值不小于1％。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)和2.3)中，利用近红外扫描仪扫描后得到某一样品的原始光谱，采用MSC和S-G-1st平滑处理分别对原始光谱进行预处理得到所述近红外光谱特征峰。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)中，每个样品利用近红外光谱仪重复扫描3次。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.2)中，所述建模软件为Grams，所述定标方程中，马铃薯全粉或薯泥的最佳主因子数为9。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，在所述步骤二中，基于近红外光谱技术测定待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量之前，首先将马铃薯复配主食根据主成份和加工工艺的不同而分成若干类，基于所述近红外光谱技术测定待测同一类马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列中的部分序列时，采用的荧光定量PCR的引物为如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列中的部分序列的具体步骤包括：
1.1)取标准阳性样品，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制标准阳性样品的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct值之间的标准曲线和溶解曲线；
1.2)取待检测马铃薯复配主食，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制待测马铃薯复配主食的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct之间的扩增曲线和溶解曲线；
1.3)比较待测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性，若待测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且待检测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同，则判定所述待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，在步骤1.3)中，比较待测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性时，若待测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且Ct≤34.5，同时，待检测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同，且Tm值介于78.19℃～78.59℃之间，则判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥；
在判定所述待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉之后，还包括将待测马铃薯复配主食的循环阈值Ct值带入所述标准阳性样品的标准曲线中，计算得到待测马铃薯复配主食中马铃薯全粉或薯泥的质量百分比。
优选的是，所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，其特征在于，荧光定量PCR反应以样品的DNA作为模板，采用天恩泽植物DNA提取试剂盒柱式植物DNAout(20mL，50t，货号60602-50，北京天恩泽生物技术有限公司，下同)提取方法提取样品DNA，直至加入吸附柱前一步，用4/5体积异丙醇或2倍体积无水乙醇代替1.5倍体积试剂盒溶液LP3，与前一步得到上清液混合，然后于温度-20℃冷冻30min，再于12000rpm离心15min，取沉淀，清洗后，用洗脱液2.0溶解，得到样品DNA。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过提供一对特异性引物，并利用所述特异性引物对待测样品及标准品中的DNA进行扩增，得到扩增曲线和溶解曲线，通过对扩增曲线和溶解曲线的分析，通过比较待检测样品及标准品的Ct和Tm值，能够方便、快捷、准确地检测马铃薯复配粉中是否含有马铃薯成分，克服了传统检测方法耗时长、操作步骤复杂、结果不够精确的缺点，使得检测方法更加快速、简单、高效、精准。本发明的结果表明，采用近红外法测定马铃薯复配粉中的马铃薯全粉或薯泥含量是可行的，所得模型相关性高，标准偏差较小，重复性高。利用近红外技术进行样品的无损分析，方法可靠、准确，对样品无需进行任何预处理，是一种环保、快速的分析测定方法。但发明可为马铃薯复配粉中的马铃薯全粉或薯泥分含量快速测定提供一定的理论依据，有利于马铃薯主食产品市场的规范。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法的流程示意图；
图2为本发明其中一个实施例中小麦粉、大米粉、玉米粉、大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯DNA的荧光反应曲线；
图3为本发明其中一个实施例中夏波蒂生全粉-面粉的荧光反应曲线；
图4为本发明其中一个实施例中夏波蒂马铃薯熟全粉-面粉的荧光反应曲线；
图5为本发明其中一个实施例中小麦粉、大米粉、玉米粉、大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯DNA的溶解曲线；
图6为本发明其中一个实施例中夏波蒂马铃薯生全粉-面粉标准曲线；
图7为本发明其中一个实施例中夏波蒂马铃薯熟全粉-面粉标准曲线；
图8为本发明其中一个实施例中马铃薯全粉-小麦复配粉近红外光谱图；
图9为本发明其中一个实施例中马铃薯全粉-小麦复配粉中马铃薯全粉百分含量实际值和预测值相关图；
图10为本发明其中一个实施例中验证样品的马铃薯全粉百分含量实际值和近红外预测值相关图。
图11为本发明其中一个实施例中马铃薯(夏波蒂)薯泥-小麦粉复配原料中马铃薯泥(折干物质)百分含量实际值和预测值相关图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的含有或添加。
如图1所示，本发明提供一种马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，包括：
步骤一，基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ IDNO：1所示的特异碱基序列中的部分序列，若含有，则判定所述待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥，若该待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥，则进入步骤二；
步骤二，基于近红外光谱技术测定待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量：
2.1)取多个样品，该多个样品中的马铃薯全粉或薯泥含量已知，利用近红外光谱仪于扫描范围890～1100nm内扫描每个样品，经过处理得到每个样品的近红外光谱特征峰；
2.2)利用建模软件将该多个样品的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉含量之间进行分析，经过多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)进行近红外光程的校正以消除光程差异，同时采用卷积平滑一阶导数(Savitzky-Golay smoothing first-order derivative，S-G-1st)对光谱进行平滑预处理，在全光谱(850-1100nm)范围内，采用偏最小二乘法(partial least squares，PLS)合并交互验证(cross-validation，CV)的方法，建立马铃薯的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量的定标方程；
2.3)利用近红外扫描仪于扫描范围890～1100nm内扫描待测马铃薯复配主食，经过处理得到待测马铃薯复配主食的近红外光谱特征峰，基于所述定标方程计算得到待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉的含量。
由于单纯的近红外光谱技术适合定量检测马铃薯全粉或薯泥的含量的特异性不强，容易出现误判结果，只有在确定定性前提下方可进行定性分析，而荧光定量PCR技术检测马铃薯特异性非常强，因此本发明将基于荧光定量PCR技术检测待测马铃薯复配主食是否含有马铃薯全粉或薯泥和近红外光谱技术测定马铃薯全粉或薯泥含量相结合，以实现对马铃薯的特异性检测和含量的精确检测。
在本发明中，所述马铃薯全粉包括马铃薯熟全粉和马玲薯生全粉。该发明中马铃薯含量包括马铃薯熟全粉、马铃薯生全粉和马铃薯薯泥的折干物质的量。
在上述方案中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)中，所述多个样品的马铃薯全粉或薯泥含量从0％至100％，且每个样品中的马铃薯全粉或薯泥的含量均不相同，其中任意两个样品的马铃薯全粉或薯泥的含量的差值不小于1％。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)和2.3)中，利用近红外扫描仪扫描后得到某一样品的原始光谱，采用MSC和S-G-1st平滑处理分别对原始光谱进行预处理得到所述近红外光谱特征峰。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.1)中，每个样品利用近红外光谱仪重复扫描3次。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，步骤2.2)中，所述建模软件为Grams，所述定标方程中，马铃薯全粉或薯泥的最佳主因子数为9。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，在所述步骤二中，基于近红外光谱技术测定待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量之前，首先将马铃薯复配主食根据主成份和加工工艺的不同而分成若干类，基于所述近红外光谱技术测定待检测同一类马铃薯复配主食中的马铃薯全粉含量。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，基于荧光定量PCR技术检测待检测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列中的部分序列时，采用的荧光定量PCR的引物为如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，基于荧光定量PCR技术检测待检测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列中的部分序列的具体步骤包括：
1.1)取标准阳性样品，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制标准阳性样品的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct值之间的标准曲线和溶解曲线；
1.2)取待检测马铃薯复配主食，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制待检测马铃薯复配主食的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct值之间的扩增曲线和溶解曲线；
1.3)比较待检测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性，若待检测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且待检测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同，则判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥。SEQ ID NO：1所示的碱基序列为马铃薯龙葵素鼠李糖基转移酶基因的cds序列(Solanum tuberosum rhamnose:beta-solanine/beta-chaconine rhamnosyltransferase(Sgt3)gene)。
在上述方案中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，在步骤1.3)中，比较待检测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性时，若待检测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且Ct≤34.5，同时，待检测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同，且Tm值介于78.19℃～78.59℃之间，则判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥；
在判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉之后，还包括将待检测马铃薯复配主食的循环阈值Ct值带入所述标准阳性样品的标准曲线中，计算得到待检测马铃薯复配主食中马铃薯全粉的质量百分比。荧光定量PCR技术在一定精度范围内也可以进行的定量分析，该结果与近红外检测的结果有机结合方可准确确定绝对定量检测结果。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法中，荧光定量PCR反应以样品的DNA作为模板，采用天恩泽植物DNA提取方法提取样品DNA，直至加入吸附柱前一步，用4/5体积异丙醇或2倍体积无水乙醇代替1.5倍体积试剂盒溶液LP3，与前一步得到上清液混合，然后于温度-20℃冷冻30min，再于12000rpm离心15min，取沉淀，清洗后，用洗脱液2.0溶解，得到样品DNA。
为使本发明领域技术人员更好地理解本发明，现提供如下的实施例进行说明。
(1)引物合成
参照GenBank已发表的马铃薯基因序列，设计一对特异性引物：
上游引物F：5'-GGCGATGGAACAGAATGAAG-3'(SEQ ID NO：2)
下游引物R：5'-TGCTGAGGGGCAATGATAGT-3'(SEQ ID NO：3)。
预期扩增片段大小144bp。
(2)DNA提取
将含水样品冷冻干燥，打粉，过80目筛；粉状样品过筛后混合均匀，参照天恩泽植物DNA提取试剂盒柱式植物DNAout说明书提取总DNA。并且在此试剂盒方法进行改进，解决了部分样品利用试剂盒提取DNA浓度过低的问题，扩大了此方法的适用范围。
改进方法：按照天恩泽植物DNA提取试剂盒说明书操作，直至加入吸附柱前一步，用4/5体积异丙醇或2倍体积无水乙醇代替1.5倍体积试剂盒溶液LP3，与前一步得到上清液混合，-20℃冷冻30min，12000rpm离心15min，留沉淀，用75％乙醇清洗2遍，开盖放置5-10min直至乙醇挥发干净，用洗脱液2.0溶解，-20℃保存。
复配粉基因组DNA模板组成；所述系列马铃薯质量占复配粉质量百分比2％，5％，10％，20％，40％，60％，80％，100％的复配粉样品。
提取的DNA样品用紫外可见分光光度计核酸蛋白测定仪浓度与纯度，OD260/OD280值在1.8-2.0之间DNA样品纯度可用。浓度稀释到10-30ng/μL。琼脂糖凝胶电泳检测，降解DNA片段大小不得低于200bp。
(3)SYBR Green I荧光定量PCR
以标准阳性样品待测样品分别为模板，F和R为引物，进行SYBR Green I荧光定量PCR反应。SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2X的SYBR Green PCR Master Mix10.0μL，10pmol/L的上游引物F、下游引物R各4.0μL，DNA模板20ng，用灭菌超纯水补足至20.0μL；反应程序为：预变性95℃，5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40循环；设定延伸阶段收集荧光信号；溶解曲线从60℃开始，每步上升0.5℃，停留10s，共70循环，升至95℃。
(4)绘制标准曲线和溶解曲线
根据标准品中马铃薯质量百分比对应的循环阈值Ct马铃薯，得到马铃薯质量百分比的对数值与Ct的线性关系，绘制成马铃薯质量百分比的对数值与Ct值之间的标准曲线；根据标准阳性样品进行SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，采用软件自动分析绘制溶解曲线。
将复配粉基因扩增曲线和熔解曲线与马铃薯特异性基因扩增曲线和熔解曲线比较相似性，基本相同说明待测复配粉中有马铃薯成分；将待测样品的Ct值带入已建立的标准曲线，计算待测样品中马铃薯成分的质量百分比：
其中，Ctx表示试样某马铃薯样品特异性检测体系扩增Ct值；
k表示标准曲线的斜率；
b表示标准曲线的截距。
(5)结果判定
待测样品SYBR Green I荧光定量PCR反应曲线呈“S”型(见图1～3)，而且结合标准曲线和溶解曲线得出：Ct值≤34.5，且Tm值介于为78.19℃～78.59℃之间，所以判定待测样品中含有马铃薯成分。
(6)SYBR Green I荧光定量PCR的敏感性和特异性验证实施例
1)敏感性试验
取200ng纯马铃薯DNA样品稀释9个梯度，取1μL为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR和普通PCR，测定SYBR Green I荧光定量PCR的敏感性，并与普通PCR进行对比。结果发现该方法能检出0.02ng的标准阳性样品，而常规PCR只能检出4ng的标准阳性样品，即SYBRGreen I荧光定量PCR的敏感性是常规PCR的200倍。复配原料样品本方法可以检测出1％的马铃薯。
2)特异性实施例
用小麦粉、大米粉、玉米粉和大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯的DNA做为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR。如图1～6中，结果显示：大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯样品的反应曲线呈“S”型，Ct值为19～22之间；而小麦粉、大米粉、黄米粉、玉米粉、莜面粉DNA的反应曲线为一条直线，为阴性结果。重复实施例Ct值变异系数小于5％，表明SYBR Green I荧光定量PCR的特异性强。
在本发明的其中几个实施例中，如图1所示，提取马铃薯熟粉质量百分比为100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％以及2％的复配粉中的DNA，利用SEQ ID NO：2和3所示的引物序列进行荧光定量PCR，并进行后续分析。
如图2所示，为本发明其中一个实施例中，以小麦粉、大米粉、玉米粉、大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯DNA为模板，利用SEQ ID NO：2和3所示的引物序列进行荧光定量PCR获得的荧光反应曲线图，图中线Ⅰ为大西洋马铃薯DNA的荧光反应曲线，线Ⅱ为夏波蒂马铃薯DNA的荧光反应曲线，线Ⅲ为小麦粉DNA的荧光反应曲线，线Ⅳ为玉米粉DNA的荧光反应曲线图，线Ⅴ为大米粉DNA的荧光反应曲线。从图中可以看出，当样品中含有马铃薯时，能够扩增出S型的曲线，而未含有马铃薯的样品，扩增不出连续曲线，为断断续续的曲线。
如图3中所示，以马铃薯含量不同的马铃薯生全粉DNA为模板，利用SEQ ID NO：2和3所示的引物序列进行荧光定量PCR获得的荧光反应曲线图，取ΔRn＝0.1的值处观察，多条“S”型的曲线于此处是分开的，从左到右依次马铃薯含量为100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％的马铃薯生全粉的荧光扩增曲线，非“S”型的曲线为马铃薯含量为0％的样品的荧光扩增曲线，为阴性反应。
如图4中所示，以马铃薯含量不同的马铃薯熟全粉DNA为模板，利用SEQ ID NO：2和3所示的引物序列进行荧光定量PCR获得的荧光反应曲线图，取ΔRn＝0.1的值处观察，多条“S”型的曲线于此处是分开的，从左到右依次马铃薯含量为100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％的马铃薯熟全粉的荧光扩增曲线，非“S”型的曲线为马铃薯含量为0％的样品的荧光扩增曲线，为阴性反应。
图5为小麦粉、大米粉、玉米粉、大西洋马铃薯、夏波蒂马铃薯DNA的溶解曲线，图中线Ⅰ为大西洋马铃薯DNA的溶解曲线，对应Tm值为78.59℃，线Ⅱ为夏波蒂马铃薯DNA的溶解曲线，对应Tm值为78.19℃，线Ⅲ为小麦粉DNA的溶解曲线，线Ⅳ为玉米粉DNA的溶解曲线，线Ⅴ为大米粉DNA的溶解曲线。
图6为根据图3中每条扩增曲线的循环阈值和其对应的马铃薯熟粉质量百分比得到的标准曲线；
图7为根据图4中每条扩增曲线的循环阈值和其对应的马铃薯生粉质量百分比得到图6中的标准曲线。由图7曲线可看出，当样品中马铃薯含量为2.5％，Ct值最大，为31.52，且由图7曲线可看出，若样品中待测马铃薯含量为0.5％，计算可知此时Ct值为34.33，近似计为34.5。
故此，利用荧光定量PCR的方法，比较待检测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性，若待检测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同或一致，且待检测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同或一致，则判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉。
进一步更加准确地判定方法是，若待检测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且Ct≤34.5(如图7中说明)，同时，待测样品溶解曲线与标准阳性样品溶解曲线相似，有且只有一个峰，Tm值介于78.19℃～78.59℃之间(如图5中所示)，则判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉。
在判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉之后，还包括将待检测马铃薯复配主食的循环阈值Ct值带入所述标准阳性样品的标准曲线中，初级计算得到待检测马铃薯复配主食中马铃薯全粉的质量百分比，以可以与后期基于近红外光谱技术获得的主食中马铃薯全粉的质量百分比做出比较。
通过上述方法判定到主食中确实含有马铃薯全粉后，基于近红外光谱技术测定待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉含量。基于近红外光谱技术测定待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉含量如下介绍：
1.材料与方法
1.1材料
小麦粉、内蒙古恒丰河套雪花粉；夏波蒂马铃薯雪花粉、内蒙古凌志马铃薯科技股份有限公司。
1.2仪器设备
Infraneo Junior型近红外光谱分析仪、Chopin(法国)技术公司
MR2L混样仪Chopin(法国)技术公司
电子天平上海英衡称重有限公司
1.3方法
1.3.1样品准备
将马铃薯全粉按照0％、1％、2％....100％的比例分别于相应比例的面粉进行混合，共获得101个待测马铃薯复配粉样品，样品编号以马铃薯全粉比例为依据，分别为0、1、2…100。其中随机抽取8、23、44、46、77和93号样品，分成2份，一份留作建模样品，另一份为验证样品。再选取编号为10、20、30…90的9个样品直接作为验证样品。故用于建模的样品共有92个，用于验证模型表现的样品共有15个。
为保证马铃薯粉与小麦粉充分混合均匀，本实施例采用Chopin(法国)公司的MR2L混样仪进行样品的混合，每个样品混合5min。
1.3.2建模样品的扫描
将混合均匀的样品装入圆形黑色样品盒内，用刮板刮去多余的粉末使样品表面平整，然后旋紧样品盒盖，将样品盒放入近红外光谱仪的样品室内，开始扫描。扫描范围890～1100nm，每个样品重复扫描3次。
1.3.3近红外光谱处理
近红外光谱采集时，会夹入许多高频随机噪声、基线漂移和光散射等噪声信息，从而干扰光谱信息与样本内有效成分，因此建立模型前必须对原始光谱进行预处理。常用的预处理方法有：S-G平滑、导数处理、MSC、变量标准化等。S-G平滑针对光谱曲线进行低通滤波，保留有用低频信息，提高信噪比。导数处理可以消除基线漂移或平缓背景干扰的影响，强化谱带特征、克服谱带重叠。MSC可以有效地消除散射影响，增强了与成分含量相关的光谱吸收信息。
本实施例采用MSC进行近红外光程的校正以消除光程差异。同时采用1阶导数或2阶导数对光谱进行平滑预处理，以减少光谱中噪音等因素影响。
1.3.4近红外定标模型的建立
定标过程是将近红外光谱特征峰与复配粉中马铃薯全粉百分含量之间建立起相关关系。将从近红外仪器中导出的光谱导入到建模Grams软件中，并将每个光谱对应的目标值(实际马铃薯全粉比例)录入到软件中，通过各种计算方法，如偏最小二乘法PLS，以及交互验证，已经光谱范围的筛选等，将光谱特征吸收峰与目标值之间进行回归分析，建立定标方程。
1.3.5模型的验证
将建立的定标模型导入近红外光谱仪中，并对15个验证样品进行扫描，每个样品扫描5次，得到验证样品的检测结果，和样品的实际百分含量对比，以此来验证定标方程的准确性和可靠性。通过验证相关系数(R2 P)、验证标准偏差(SEP)、重复性标准差(SDr)为0.246，重复性变异系数(CVr)等参数对模型进行内部验证，最后通过外部验证考察模型的准确性和适应性。
2.结果分析
2.1马铃薯全粉-小麦复配粉近红外光谱图
马铃薯复配粉样品的原始光谱图如图8所示，由图可知所有样品的近红外光谱均在890-960nm范围内有一吸收峰，在960-1100nm范围内有一强吸收峰，图8中，Ⅰ所示的线为小麦粉的光谱图，Ⅱ所示的线为含马铃薯全粉的样品的光谱图，如图中所示，小麦粉(马铃薯含量为0)的近红外光谱图和含马铃薯全粉的样品光谱图具有相同位置的吸收峰，但吸收峰值大小不同，因此近红外光谱可以区分小麦粉和添加了马铃薯的样品。且样品所含马铃薯全粉的百分含量不同吸收峰的大小不同，说明近红外定量马铃薯全粉含量理论上可行。
2.2定标模型的建立
按1.3.3所述方法对原始光谱进行处理后，经过多种计算方法的尝试，最终确定采用MSC和S-G-1st分别对原始光谱进行预处理得到最佳预测模型。在全光谱(850-1100nm)范围内，采用PLS合并CV的方法，并根据最佳的定标集交互验证的标准差SECV值和模型决定系数R2c的大小，确定预测混合粉中马铃薯全粉的最佳主因子数为9。用此定标方程计算出样品的近红外预测值。混合粉中的马铃薯全粉比例的实际值及近红外预测值相关图如图8所示。
分析建模的92个马铃薯全粉-麦粉混合粉样品中的马铃薯全粉百分含量从0％-100％，且跨度为1％，涵盖范围较广。从结果可知，预测模型的定标决定系数R2c为0.9997，交互定标标准误差SECV＝0.51相对于1％的跨度也较小，表明预测模型具有较好的相关性。
2.3模型的验证结果
15个验证样品的近红外预测平均值与验证样品的实际马铃薯百分含量，以及平均预测值与实际值的预测标准误SEP和每个样品5次扫描结果的SDr和CVr，如表1所示，其中近红外预测值为去除掉系统偏差的结果(系统偏差为-0.527)。验证样品集的马铃薯全粉百分含量实际值和近红外预测值相关图见图9。
表1.验证样品马铃薯全粉的实际值与预测值及重复性评价参数
Table1 repeatability evaluation for actual values and predictedvalues of potato mixed powder
由表1和图3可以看到，15个验证样品的SDr平均值和CVr平均值分别是0.246和0.967，数值较小，表明近红外测定混合粉中马铃薯比例具有较好的重复性。
用所建近红外模型来预测混合粉中的马铃薯全粉比例，近红外法预测结果与实际值的SEP为0.69，验证集的决定系数R2v为0.9995，且15个样品除一个马铃薯全粉高含量的90号样品的偏差为1.62％，大于1％外，其余14个样品的预测值与实际值偏差均小于1％。证明测定混合粉中马铃薯全粉比例的近红外法定标模型具有较好的准确性和稳定性，且预测误差符合预期。且本实施例选择的验证样品集的分布较广，有很强的代表性，可以比较全面的检验仪器的实测效果。
近红外光谱图主要反应物质的组成成分和成分含量，因为受多种因素(光照、粒度、密度、表面纹理等物理因素)的干扰，原始光谱曲线会产生基线漂移，并且含有噪声。由于光谱曲线中部分波段受噪声影响严重，因此研究范围以850-1100nm为主。本实施例中马铃薯复配粉样品在890-960nm和960-1100nm各有一个特征吸收峰，吸收峰强度和马铃薯百分含量相关。研究表明O-H伸缩振动的三级和二级倍频发生在谱区的910nm和980nm；C-H伸缩振动的三级和二级倍频分别发生在谱区的910nm和1100nm。这些特征吸收峰可能是O-H和C-H伸缩振动引起的。
S-G卷积平滑法是通过多项式来对移动窗口内的数据进行了多项式最小二乘拟合，是一种加权平均的方法，常用于光谱的平滑预处理中。在平滑的基础上求导，放大了波谱中的特征波段，同时有效地消除了其他背景的干扰，提高了分辨率。
MSC主要是消除由于样品颗粒大小及密度不均匀产生的光散射影响，在固体颗粒样本光谱中应用的比较广泛。因此，本实施例采用MSC结合S-G-1st对光谱进行处理，消除散射影响。PLS是NIRS定量分析中应用最多的建模方法。PLS不仅可以对光谱矩阵进行分解，同时也可以对浓度矩阵进行分解。
衡量定标方程优劣的主要参数包括交互定标标准误差(SECV)，定标的决定系数(R2c)。R2c越好，SECV越小，模型预测效果越好。本实施例中R2c为0.9997，SECV为0.51。R2c值较高，十分接近1；SECV值相对于样品中1％的马铃薯百分含量的跨度来说，可以满足预测需求，模型预测的准确性能较好。模型的可重复性也是检验模型的重要指标，从本实施例验证集的结果来看，样品实际百分含量和预测值之间整体偏差较小，重复性也较好。
本实施例研究结果表明，采用近红外法测定马铃薯复配粉中的马铃薯全粉含量是可行的，所得模型相关性高，标准偏差较小，重复性高。利用近红外技术进行样品的无损分析，方法可靠、准确，对样品无需进行任何预处理，是一种环保、快速的分析测定方法。本发明是基于一种面粉和马铃薯全粉不同梯度混合得到的，因而其应用于其他种类马铃薯复配粉中马铃薯全粉含量的测定有待于进一步的研究确认。但本发明结果可为马铃薯复配粉中的马铃薯粉百分含量快速测定提供一定的理论依据。
如上所述，生物检测方法利用某些生物材料(如酶、抗体、组织、细胞、DNA等)对一定的化学物质具有的特异性识别能力或灵敏响应能力。近红外光谱技术是近年来应用于某种物质含量测定、中药掺假、水果粮食品质检测等较多的一种物理检测手段，具有检测速度快、样品需要量少、可实现无损检测等特点。本发明采用荧光定量PCR技术对马铃薯进行特异性测定，采用近红外光谱技术对马铃薯含量进行精确测定，将近红外光谱技术和荧光定量PCR技术相结合，两种技术相互弥补不足，建立了一种快速准确的马铃薯全粉含量的测定方法。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工所
<120> 马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2539
<212> DNA
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）
<400> 1
gttgtatgga ccttttggtt tggatatata tgagataatg tacataacaa tttgttcaat 60
ctgaaaatag tagaacaagt tgatttggta tacatgatat atacatcaga ctcaaatggc 120
agaaaaaaat ttgtatatca atctgaaatt aattatgtat ataacctaaa aataatcttg 180
tacaccaatc taatattaat tatgtataca attttaaaat taatcaacat atacacacaa 240
aatatgtaat gcaaaattca aacagttata tacattataa tagctataca ttcaattata 300
tgtattatgt ataactagac aaactttttg agatataata ttgtgaaaaa accgatgtcg 360
atacaattat cttcatttat gtatataaat tataagaatg tatacatata gaatatacac 420
tgagtaagtc gatttgaaat acacatatat attatagaac tatatgtata cattcaattt 480
aatatggata gttttgtgat atacatgtag tttatttttt gaccagtaaa cagtatttcc 540
cccgtccata tttaattgtc atggttttct tttttagaat taaactataa gaactttgac 600
taacatttta tgatgtattt ttacatcata ttgatatgta aaaagttgca atttattgta 660
ctttttgtat agtttttaat gtctgtcaaa gtcatatttt caagactaat aactctcaaa 720
ggtaaaatag gaaaaataat gttatttatg tacgtgttgg ttttgtttaa atggcaagta 780
ctattaaaga ttatctattt ttaataagga tagcatacaa aagaacgtag gaagtattta 840
aagccacaca tatagtttga ttaagaaaat ttaactttat tgaatttatc acagaaaaat 900
gtaaatgaga gcaaaaatga aaaaaagttc aaacatttaa cataatactc ttatgggata 960
attgtacata atagcaaact attaattcaa cttaaatgct ataaatatac tttgatttaa1020
ttgtacccta tagcaaacta ttgctatttt cgccactctc ccaggtggaa tctcgctcgc1080
cactctcgtt tggtggcagt ctcgctcgcc tctctcgctt ttatacaaac acaaatgtat1140
aaaatgcgtt tgtgtttgta taaagcaaga gaaaattgta tatatacata tattttcgtt1200
cccctctctc ccctctccca gatctcgctc gccactctcc caaatctcgc tcgccaccct1260
cgcctctctc gcttatacaa acagaaacga aatgtatata ttgtgcttct gtttgtataa1320
agcgagagaa aattgtatat acagatacaa atacatatat cttcatccta tacacttata1380
attatacaat acaaatattt ccatgtccag cttccttttg cctttctctc tttctcgttt1440
tatacataca caaattatat aattgatctt ttgtatacaa ctactttctt ttgtatatgt1500
atagtgaatt atacaactgc tttctttgta tatgtatagc gaattataca actgtttttt1560
ttgtatatgt atagcgaatt atacatatat atgtttgata tggagtgcaa ttatgcaaac1620
tttgctatag catacaaata tgaattttgt gtttgctata tgtgaaagtt gctctactct1680
tatatcaaat tttaacataa catacataaa tataattttt ttacaaagga aaaggtaagt1740
tcataacttt atttaacaat gaattctact ttaatcttaa aattagaata ctaacaaaat1800
tatacgaacg tattttttta gatttgtaac gacctgattc tgtccttagg aaaaagcctt1860
ggcctctctc atctcaagag ggaaaaatat atcaagaaaa agtaaagtgt tggtcgcaag1920
ataaaattta atctccacac taaaaatgtt caattttaat ctcacttaga acaatattgg1980
agattatact aaaaatgttc aaaatttgaa tcaaaaaaaa tatttatcat tcattaaaaa2040
tgacttgcga agcagaatgg gcgatgactt tttaaatgat tgtttagttt gttatataga2100
agatgaatta tttttaaatt gtacctaatg atgtgatcat tgattgtttt caaaatatga2160
caactcgtcg agtgcaattg aatgataatg cttatatata tataatgttt aagtatttcg2220
tcctttttag tgaattaaat acttgtattt gttcgttaat ttgatgattg ttactttaga2280
ttaagatcgt tgttcttttt aaaaatttag aacccactga catgaaattt tggctccgcc2340
tctctctata tatatatata cgagtcaact gaagtgaagg aacaacttgt taatggcgat2400
ggaacagaat gaagaaactg caatgccgca tgttgtgttc ataccatacg ccatgacgag2460
tcatataact ccattggtac atattgctag actcttcgcc ctccatggcc tcaaagttac2520
tatcattgcc cctcagcat 2539
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcgatggaa cagaatgaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctgagggg caatgatagt 20
Claims (9)
1.一种马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，包括：
步骤一，基于荧光定量PCR技术检测待检测马铃薯复配主食中是否含有如SEQ ID NO：1所示的特异碱基序列中的部分序列，采用的荧光定量PCR的引物为SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列，其具体步骤包括：
1.1)取标准阳性样品，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制标准阳性样品的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct值之间的标准曲线和溶解曲线；
1.2)取待检测马铃薯复配主食，利用如SEQ ID NO：2和3所示的碱基序列进行荧光定量PCR反应，并绘制待检测马铃薯复配主食的马铃薯质量百分比的对数值与循环阈值Ct之间的扩增曲线和溶解曲线；
1.3)比较待测马铃薯复配主食的扩增曲线和溶解曲线各自分别与标准阳性样品的标准曲线和溶解曲线的相似性，若待测马铃薯复配主食的扩增曲线与标准阳性样品的标准曲线基本相同，且Ct≤34.5，同时，待测马铃薯复配主食的溶解曲线与标准阳性样品的溶解曲线基本相同，且Tm值介于78.19℃～78.59℃之间，则判定所述待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥；
若该待测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉或薯泥，则进入步骤二；
步骤二，基于近红外光谱技术测定待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量：
2.1)取多个样品，该多个样品中的马铃薯全粉或薯泥含量已知，利用近红外光谱仪于扫描范围890～1100nm内扫描每个样品，经过处理得到每个样品的近红外光谱特征峰；
2.2)利用建模软件将该多个样品的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量之间进行分析，经过多元散射校正进行近红外光程的校正以消除光程差异，同时采用卷积平滑一阶导数对光谱进行平滑预处理，在全光谱850-1100nm范围内，采用偏最小二乘法合并交互验证的方法，建立马铃薯的近红外光谱特征峰与马铃薯全粉或薯泥含量的定标方程；
2.3)利用近红外扫描仪于扫描范围890～1100nm内扫描待测马铃薯复配主食，经过处理得到待测马铃薯复配主食的近红外光谱特征峰，基于所述定标方程计算得到待测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥的含量。
2.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，所述马铃薯全粉包括马铃薯熟全粉和马铃薯生全粉。
3.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，步骤2.1)中，所述多个样品的马铃薯全粉或薯泥含量从0％至100％，且每个样品中的马铃薯全粉或薯泥的含量均不相同，其中任意两个样品的马铃薯全粉或薯泥的含量的差值不小于1％。
4.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，步骤2.1)和2.3)中，利用近红外扫描仪扫描后得到某一类样品的原始光谱，采用MSC和S-G-1st平滑处理分别对原始光谱进行预处理得到所述近红外光谱特征峰。
5.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，步骤2.1)中，每个样品利用近红外光谱仪重复扫描3次。
6.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，步骤2.2)中，所述建模软件为Grams，所述定标方程中，马铃薯全粉或薯泥的最佳主因子数为9。
7.如权利要求1至5任一所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，在所述步骤二中，基于近红外光谱技术测定待检测马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量之前，首先将马铃薯复配主食根据主成份和加工工艺的不同而分成若干类，基于所述近红外光谱技术测定待检测同一类马铃薯复配主食中的马铃薯全粉或薯泥含量。
8.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，在步骤1.3)中，
在判定所述待检测马铃薯复配主食中含有马铃薯全粉之后，还包括将待测马铃薯复配主食的循环阈值Ct值带入所述标准阳性样品的标准曲线中，计算得到待测马铃薯复配主食中马铃薯全粉或薯泥的质量百分比。
9.如权利要求1所述的马铃薯复配主食中马铃薯含量的测定方法，其特征在于，荧光定量PCR反应以样品的DNA作为模板，采用天恩泽植物DNA提取方法提取样品DNA，直至加入吸附柱前一步，用4/5体积异丙醇或2倍体积无水乙醇代替1.5倍体积试剂盒溶液LP3，与前一步得到上清液混合，然后于温度-20℃冷冻30min，再于12000rpm离心15min，取沉淀，清洗后，用洗脱液2.0溶解，得到样品DNA。
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