CN106916887B

CN106916887B - Erh基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用

Info

Publication number: CN106916887B
Application number: CN201710076979.4A
Authority: CN
Inventors: 韩从辉; 吕茜; 庞昆; 郝琳; 刘颖
Original assignee: Xuzhou Central Hospital
Current assignee: Xuzhou Central Hospital
Priority date: 2017-02-13
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2037-02-13
Also published as: US20220065859A1; US11885804B2; WO2018145371A1; CN106916887A; US20190339276A1

Abstract

本发明涉及ERH基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用。发明人通过检测膀胱癌组织及癌旁组织，发现ERH与膀胱癌具有很好的相关性，可用于制备膀胱癌辅助诊疗制剂，此外，通过构建RNA干扰载体进行细胞功能实验，研究ERH对膀胱癌细胞增殖、克隆能力的影响，本发明为临床膀胱癌的诊疗提供研究基础，具有很好的应用前景。

Description

ERH基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及癌症治疗和诊断领域，更具体的涉及与ERH基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用，ERH基因或其表达产物作为分子标志物在检测膀胱癌中应用，以及作为抗肿瘤药物开发的靶标分子，减弱膀胱癌细胞的生长。

背景技术

膀胱癌是泌尿外科临床工作中常见的疾病，也是泌尿系统中常见的肿瘤，具有较高的发病率和致死率。膀胱癌的传统的诊断方法有尿液常规化验、尿液脱落细胞学检查，膀胱镜检，KUB平片、CT、MR等影像学检查的异常表达与疾病的发生发展、侵袭转移有关。近年来针对膀胱癌的分子靶向诊治作为肿瘤综合诊治的一个重要手段和新兴的治疗模式在临床中受到越来越多的关注，MKI67、EGFR、ERBB2、TP53、PCNA、ETS-2等多个肿瘤标志物均被报道与膀胱癌密切相关，鉴于膀胱癌带来的危害性，尤其是非浸润性膀胱癌的高复发率，使得早期诊断，复发监测和大范围的常规筛查很有必要，寻找敏感性及特异性高的膀胱癌的分子诊治靶点具有十分重要的意义。

发明检测了病人膀胱癌组织及癌旁组织，发现ERH与膀胱癌具有很好的相关性，可用于制备膀胱癌辅助诊疗制剂，此外，还进行了RNA干扰等细胞功能实验，研究ERH对膀胱癌细胞增殖的影响，本发明为临床膀胱癌的诊疗提供研究基础。

发明内容

一种诊断膀胱癌或发展为膀胱癌倾向性的方法，包括以下步骤：

(1)检测ERH在生物学样品中的表达水平；

(2)ERH表达水平的升高与膀胱癌相关。

进一步，检测ERH在生物学样品中的表达水平是通过检测与ERH部分或全部mRNA和/或与编码ERH蛋白的部分或全部氨基酸序列至少80％同源性的氨基酸序列。优选的，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。

进一步，检测ERH在生物学样品中的表达水平是通过检测ERH部分或全部mRNA和/或检测编码ERH蛋白的部分或全部氨基酸序列进行。

进一步，用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测生物学样品中ERH基因的表达或用免疫方法检测生物学样品中ERH蛋白的表达。优选的，免疫方法检测ERH蛋白表达为western blot或ELISA或胶体金检测方法。

其中，罹患膀胱癌或发展为膀胱癌倾向性的生物学样品中ERH的表达水平与正常对照组织或者癌旁组织相比，表达水平升高。

检测ERH基因或蛋白的表达在制备膀胱癌诊断制剂中的应用。

进一步，膀胱癌的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测样本中ERH基因的表达水平。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。

用于荧光定量PCR方法检测膀胱癌中ERH基因的产品含有一对特异性扩增ERH基因的引物；基因芯片包括与ERH基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，膀胱癌的诊断制剂包括用免疫方法检测膀胱癌中ERH蛋白的表达水平。优选的，免疫方法检测膀胱癌中ERH蛋白表达的为western blot或ELISA或胶体金检测方法。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。

进一步，检测ERH蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的ERH单克隆抗体。进一步，试剂盒包括：包被ERH单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，检测ERH蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的ERH单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗ERH单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

一种膀胱癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测基因ERH，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。

进一步，该PCR试剂盒适用于目前市场上各种类型荧光定量基因扩增仪。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQ IDNO.13，下游引物序列为SEQ ID NO.14。

一种膀胱癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测ERH蛋白。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。

一种检测膀胱癌的基因芯片，基因芯片包括与ERH基因的核酸序列杂交的探针。

本发明所述的受试者膀胱癌诊断或检测主要是通过测量来源于患者的生物样品，包括细胞、组织等，可以是血液或者尿液等。

用于治疗或预防膀胱癌的化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)包含与ERH氨基酸序列至少80％同源性序列的多肽；

(2)检测受试化合物与上述多肽之间的结合活性；

(3)选择与上述多肽结合的化合物。

优选的，多肽与ERH氨基酸序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。

(1)使化合物与细胞接触，所述细胞表达与ERH核苷酸序列至少有80％同源性的序列；

(2)选择使上述细胞表达的与ERH核苷酸序列至少有80％同源性的序列表达水平降低的化合物。

优选的，细胞表达与ERH核苷酸序列至少有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上同源性序列。

进一步，细胞为膀胱癌细胞。

(1)使化合物与导入载体的细胞接触，所述载体包含ERH基因的转录调控区和在该转录调控区的调控下表达的报道基因；

(2)测定所述报道基因的表达水平或活性；

(3)选择使报道基因表达水平或活性降低的化合物。

一种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法能降低受试者ERH表达量。

进一步的，使用ERH的反义寡核苷酸或干扰RNA降低ERH表达量。

RNA干扰是指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默。一般有19-25个碱基的单链或双链RNA，即小分子干扰RNA(siRNAs)，又称干扰RNA。可以通过RNA干扰，高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

反义寡核苷酸(asON)是指那些能与特定的DNA、RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录与翻译的短核苷酸片段。

优选的，干扰RNA包括碱基互补的正义链和反义链，所述正义链为ERH mRNA上19-25个连续的核苷酸，优选的，干扰RNA针对靶点为SEQ ID NO.15；更优选的，干扰RNA的序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。

一种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法包括给受试者使用药物有效量的抗体或者其免疫学活性片段的步骤，其中所述抗体或者免疫学活性片段与ERH的蛋白结合或抑制ERH蛋白活性。

用于治疗或预防膀胱癌的组合物，包含药学有效量的针对ERH的反义寡核苷酸或干扰RNA作为活性成分，还包含药剂学上能接受的载体。

用于治疗或预防膀胱癌的组合物，包含药学有效量的与ERH蛋白结合的抗体或者免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。

包含在本发明的药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本发明的组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上能接受的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

ERH基因或蛋白抑制剂在制备抗膀胱癌制剂中的应用。

进一步，抗膀胱癌制剂是指可以抑制膀胱癌细胞中ERH基因的表达的制剂。本领域人员熟知抗膀胱癌制剂可以采用下述方法中的一种和/或几种抑制膀胱癌细胞中ERH的表达水平：通过激活ERH基因的抑制基因、激活抑制ERH基因表达的蛋白、导入抑制ERH表达的siRNA、导入抑制ERH表达的反义寡核苷酸、导入抑制ERH表达的载体、激活促进ERH mRNA降解的microRNA、导入促进ERH蛋白降解的分子、抑制促进ERH基因表达的因子及蛋白的表达、抑制ERH基因的启动子或增强子活性、增强ERH基因沉默子活性、导入与ERH蛋白结合的抗体或者免疫学活性片段。

优选的，ERH基因或ERH蛋白的抑制剂是采用前述用于治疗或预防膀胱癌的化合物的筛选方法筛选得到的化合物。

本发明的目的在于提供一种抗膀胱癌制剂，抗膀胱癌制剂抑制膀胱癌细胞中ERH基因的表达。

进一步，抗膀胱癌制剂抑制膀胱癌细胞的增殖或转移。

进一步，抗膀胱癌制剂抑制膀胱癌细胞肿瘤的形成。

一种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括使用有ERH编码的多肽、ERH多核苷酸或含有ERH多核苷酸的载体与抗原呈递细胞接触。

一种膀胱癌诊断试剂，包含特异性扩增ERH基因的引物，优选的，引物序列为SEQID NO.11和SEQ ID NO.12。

进一步，膀胱癌诊断试剂，还包含特异性扩增MKI67、EGFR、ERBB2、TP53、PCNA基因的引物，优选的，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

一种膀胱癌诊断试剂，包含与ERH基因的核酸序列杂交的探针。

一种膀胱癌诊断试剂，包含与ERH蛋白结合的抗体或免疫学活性片段。

一种干扰RNA，包括碱基互补的正义链和反义链，所述正义链为ERH mRNA上19-25个连续的核苷酸。优选的，干扰RNA针对靶点为SEQ ID NO.15；更优选的，干扰RNA的序列为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。

一种载体，含有编码上述干扰RNA的序列，优选的，载体为慢病毒载体。更优选的，载体为psc2903。

一种细胞，所述细胞包含上述载体，优选的，包含载体psc2903。

应用与本发明的背景下的术语膀胱癌“倾向性”涵盖受试者易感于膀胱癌，具有膀胱癌趋势、发病性、倾向或敏感性的状态。该术语也涵盖受试者有获得膀胱癌的风险。

本发明正常对照组织是指健康个体或已知未患有膀胱癌个体，以该群体中检测ERH基因表达水平为对照。

除非另有定义，本发明中所有的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的含义。

附图说明

图1是GV115载体示意图

图2是RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图

图3是GV112载体示意图

图4是慢病毒感染后显微镜下荧光图

图5是慢病毒感染后mRNA水平ERH基因消减效率图

图6是Celigo检测ERH基因消减对细胞增殖的影响图

图7是BRDU检测ERH基因消减对细胞增殖的影响图

图8是检测ERH基因消减对细胞克隆形成能力的影响图

图9是MTT检测ERH基因消减对细胞增殖的影响图

图10是WB检测靶点降低ERH基因蛋白水平表达图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1组织样本RNA提取及荧光定量PCR

准备32对膀胱癌及癌旁组织样本，病例样本均是经过病理学检查确认的，使用TRIzol法提取样本RNA，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，其中12对样本癌组织及癌旁组织均提取合格，具体见表1，进行后续荧光定量检测实验。

表1 RNA检测结果

实施例2荧光定量PCR

1.反转录获得cDNA

使用Promega M-MLV试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。

2.引物设计

表2荧光定量PCR检测引物

3.Real-time PCR检测

采用TAKARA荧光定量试剂(cat.No.DRR041B)，配置12μl反应体系：每管加入SYBRpremix ex taq 6μl；引物mix(5μM)0.3μl；反转录cDNA 0.6μl；RNase-free水5.1μl。两步法进行Real-time PCR：预变性95℃30s；40个循环(变性95℃5s；退火及延伸60℃30s)。并制作溶解曲线。

4.数据分析

结果显示实时定量PCR扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；RT-PCR的相对定量公式：ΔCt＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值；-ΔΔCt＝同一序号癌旁组织ΔCt-同一序号各样品ΔCt；2^-ΔΔCt反映同一序号癌组织样本相对癌旁组织样本目的基因相对表达水平，计算ERH、MKI67、EGFR、ERBB2、TP53、PCNA基因在12对膀胱癌组织及癌旁组织的相对表达水平。

表3荧光定量检测基因在膀胱癌及癌旁组织的表达水平

进一步，以MKI67、EGFR、ERBB2、TP53、PCNA作为marker基因，校正样本对基因表达的影响。

表4

Marker基因的√代表该基因在此样本表达水平与已知报道相符，弱参考是指marker基因阳性数＝2的样本，强参考是指marker基因阳性数≥3的样本，否是指marker基因阳性数<2的样本，不作为参考。

根据12对样本候选基因的表达检测，有7对样本为强参考样本。ERH基因在6对强参考样本，2对弱参考样本中上调，反映ERH基因与膀胱癌具有很好的相关性。将ERH基因与MKI67、EGFR、ERBB2、TP53、PCNA联合检测，将进一步提高膀胱癌检测准确率。

实施例3 ERH基因RNA干扰慢病毒载体制备

1.RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备

ERH(NM_004450Homo sapiens Homo sapiens enhancer of rudimentaryhomolog(Drosophila)(ERH)，mRNA)，根据RNA干扰序列设计原则，以ERH基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点：

靶点序列：CTGGTTTACCGAGCTGATA(SEQ ID NO.15)

根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。

表5

注：CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。

将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度100M)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。

2.GV115载体线性化制备

按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体(载体图谱见图1)使其线性化(GV115载体由上海吉凯基因化学技术有限公司提供)。37℃(最适温度)反应1h，之后切胶回收目的片段。

3.RNA干扰慢病毒载体构建

按照Fermentas T4DNA Ligase说明书配制20μl反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc2903，之后进行转化实验。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。通过PCR鉴定阳性克隆，鉴定引物如下：

上游引物：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO.16)

下游引物：GTAATACGGTTATCCACGCG(SEQ ID NO.17)

以鉴定引物进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆进行质粒抽提，RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图见图2。

实施例4 RT-PCR检测目的细胞中目的基因的表达

使用TRIzol法提取人膀胱癌细胞5637和T24的RNA，使用RT-PCR的方法检测ERH基因在人膀胱癌细胞5637和T24中mRNA的表达丰度，具体步骤参考实施例2。结果见表6，2株膀胱癌细胞均高丰度表达ERH基因。。

表6

样本	ΔCt	STDEV
			5637	2.61	0.040
T24	4.57	0.170

备注：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值；当ΔCt值≤12时，该细胞中基因表达丰度为高；当12<ΔCt值<16时，该细胞中基因表达丰度为中；当ΔCt值≥16时，该细胞中基因表达丰度为低。

实施例5 RNAi慢病毒载体构建和包装

1.载体酶切

用限制性内切酶(AgeI、EcoRI酶)消化载体GV112(由上海吉凯基因化学技术有限公司提供，载体图谱见图3)，酶切体系：10×buffer 5μl；AgeI、EcoRI酶(10U/μl)各1μl；纯化的载体质粒2μg；去离子水补平至50μl。37℃反应3小时或过夜，获得线性化载体，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

2.目的片段的合成

合成单链引物

GV112-ERH-1：5’-CCGGGCCTGGTTTACCGAGCTGATACTCGAGTATCAGCTCGGTAAACCAGGCTTTTTG-3’(SEQ ID NO.18)

GV112-ERH-2：5’-AATTCAAAAAGCCTGGTTTACCGAGCTGATACTCGAGTATCAGCTCGGTAAACCAGGC-3’(SEQ ID NO.19)

引物退火形成双链DNA，合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温，GV112-ERH-1和GV112-ERH-2配对。

3.退火产物与载体进行连接

以线性化载体和退火产物配制反应体系，通过T4DNA ligase将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，16℃连接1-3h，或连接过夜。

4.转化

反应产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

5.菌落PCR鉴定

鉴定引物：

上游引物：5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’(SEQ ID NO.20)

下游引物：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO.21)

挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，鉴定引物为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

实施例6慢病毒感染目的细胞及基因敲出效率

1.准备目的细胞

从液氮罐中取出人膀胱癌细胞T24冻存管，迅速放入37℃水浴中，并摇动使其尽快解冻；完全解冻后，1300rpm，离心3min，75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；吸去冻存液上清，加入1mL新鲜的完全培养基(1640+10％FBS)重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO₂培养箱；24h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80％左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2.细胞慢病毒感染

处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×10⁴个/mL细胞悬液，接种适量的细胞数到培养板中(推荐6孔板2毫升接种面积，1毫升换液体积)，继续培养保证感染时铺板量达到15-30％左右；更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染(对照组病毒滴度5×10⁸TU/ml，感染用量4μl；实验组病毒滴度1×10⁹TU/ml，感染用量2μl)；选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养(一般为感染后8-12h左右)。

观察感染后细胞状态及感染效率

细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证对照组(正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组，shCtrl)与实验组(正常目的细胞、加ERH基因shRNA病毒感染的细胞组，shERH)细胞状态相当；荧光标记的慢病毒感染，感染后72h左右，荧光显微镜观察报告基因表达情况，荧光率即为阳性感染率。

3.基因敲减效率

提取对照组和实验组细胞总RNA，反转录后进行RT-PCR检测，具体步骤参照前述实施例。

4.实验结果

对照组及实验组慢病毒感染目的细胞后72小时于显微镜下荧光观察，观察结果显示细胞感染效率达到80％以上，细胞状态正常，结果见图4。

定量PCR结果显示，经shRNA慢病毒感染后，实验组T24细胞中ERH基因mRNA水平的表达量受到抑制(p<0.05)，敲减效率达到92.1％，具体见图5。

实施例7 celigo细胞计数检测生长

1.实验步骤：

1)将处于对数生长期的对照组和实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；

2)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2000cell/well)。每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，37℃、5％CO₂培养箱培养；

3)从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板3-5天；

4)通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。

2.数据分析及实验结果

根据细胞计数值和时间点，绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线，计算各组细胞各时间点细胞计数值与该组第1天的细胞计数值的比值，获得该组细胞各时间点的增殖倍数，根据该增殖倍数和时间点，绘制基于细胞增殖倍数的生长曲线，具体见图6。结果表明，shERH组细胞与shCtrl组相比，增殖抑制明显，表明敲减ERH对细胞增殖有影响。

实施例8 Brdu检测

溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)可竞争性掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，利用抗体连接酶或荧光素作为指示系统标记Brdu，当处于旺盛分裂的细胞掺入Brdu后，即可检测出含有Brdu的细胞，并以此判断细胞的数目。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过OD值的高低，反映正在合成DNA细胞数的多少，从而反映正处于增殖状态的细胞量。

根据实施例6进行对照组及实验组慢病毒感染目的细胞，进行Brdu检测，具体实验步骤参照Roche Brdu kit(货号11647229001)说明书。实验结果显示，相比shCtrl对照组，shERH实验组细胞增殖减缓(第1天，P<0.05)，具体见图7(OD450/倍数为各实验组第1天、第3天相对第1天的OD450倍数，表示各天的增殖倍数)。

实施例9细胞凋亡检测

根据实施例6进行对照组及实验组慢病毒感染目的细胞，细胞慢病毒感染后第4天传代，第5天检测，细胞融合度达85％。具体操作步骤参考eBioscience凋亡试剂盒(货号：88-8007)说明书。

结果显示，shRNA慢病毒感染T24细胞，培养5天后，对照组(shCtrl)和实验组(shERH)平均凋亡百分比分别为4.21％和11.03％，相比对照组，shERH组凋亡数增多(P<0.05)。

实施例10克隆形成检测

1.实验步骤

(1)准备感染后细胞：根据实施例6进行对照组及实验组慢病毒感染目的细胞，将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。

(2)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定)，每个实验组设3个复孔。

(3)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。

(4)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涤细胞1次。

(5)每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，PBS洗涤细胞1次。

(6)每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞10-20min。

(7)ddH2O洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。

2.实验结果

通过感染后细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来显示慢病毒感染后细胞的成瘤能力，shRNA慢病毒感染T24细胞后，ERH基因敲减组(shERH)与对照组(shCtrl)相比，shERH组克隆数明显减少(P<0.05)，具体见图8。

实施例11 MTT检测

根据实施例6进行对照组及实验组慢病毒感染目的细胞，分板后24至120小时进行检测，具体步骤参照Genview的MTT试剂盒(货号：JT343)说明书。

OD490/倍数为各实验组第1天到第5天相对第1天的OD490倍数，表示各天的增殖倍数，图9显示shERH组与对照组(shCtrl)在酶标仪对波长490nm的光的吸收率变化倍数随时间变化的对比。OD490在这里反映了具有活力的细胞的数量。结果表明：相比shCtrl组，shERH组细胞增殖减缓。

实施例12 Western Blot检测靶点降低目的基因蛋白水平表达

1.总蛋白抽提

进行对照组及实验组慢病毒感染，收集慢病毒感染后生长状态良好的目的细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度(碧云天BCA Protein Assay Kit，货号P0010S)。调整每个样品蛋白浓度为2μg/μL，-80℃保存备用。

2.SDS-PAGE

根据蛋白分子量大小，配制了浓度为10％分离胶和5％浓缩胶。胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h。

3.免疫印迹

电泳结束后，使用转移电泳装置(Bio-Rad,Richmoad,CA)，在4℃，300mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上。

4.免疫显色

1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜；

2)一抗孵育：封闭液稀释抗体(一抗Sigma Mouse Anti-Flag，货号F1804，1:2000，一抗Santa-Cruz Mouse anti-GAPDH货号sc-32233，1:2000)，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜；

3)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

4)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗(二抗Santa-Cruz Goat Anti-Mouse IgG货号sc-2005，1:2000)，室温下孵育PVDF膜2h；

5)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

6)X光显影：采用Thermo公司Pierce^TM ECL Western Blotting Substrate试剂盒。

(1)将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合A液和B液，将混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应3-5min。

(2)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min。

(3)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。

(4)取出X光片，晾干，分析。

5.实验结果

Western Blot结果显示，针对靶点的干扰载体shERH对目的基因的表达有明显抑制作用，因而本发明针对的靶点为有效靶点，具体结果见图10。

SEQUENCE LISTING

<110> 徐州市中心医院

<120> ERH基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcttctcttc tgaccctgat g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgatggttg aggctgttcc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgaccgtt tgggagtt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctgaatgac aaggtagcg 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaggttggct ctgactgtac c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccgtcccag tagattacca c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaaggtgaa ggtgcttgga tc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagggcataa gctgtgtcac cag 23

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaagcacca aaccaggag 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaggcatct ttactacaca gc 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctgctgtag cgaagaga 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggctggtatg tctgggtat 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caccctgttg ctgtagccaa a 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctggtttacc gagctgata 19

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctatttccc atgattcctt cata 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtaatacggt tatccacgcg 20

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccgggcctgg tttaccgagc tgatactcga gtatcagctc ggtaaaccag gctttttg 58

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aattcaaaaa gcctggttta ccgagctgat actcgagtat cagctcggta aaccaggc 58

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccatgattcc ttcatatttg c 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtaatacggt tatccacgcg 20

Claims

1.检测ERH基因或蛋白表达水平的制剂在制备膀胱癌诊断制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，膀胱癌诊断制剂包括用荧光定量PCR方法或基因芯片方法检测生物学样品中ERH基因表达水平，或用免疫方法检测生物学样品中ERH蛋白表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用荧光定量PCR方法检测生物学样品中ERH基因表达水平产品含有一对特异性扩增ERH基因的引物；基因芯片包括与ERH基因的核酸序列杂交的探针；免疫方法指用ELISA或胶体金方法检测ERH蛋白表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用ELISA或胶体金方法检测采用市售的ERH单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测ERH基因或蛋白表达水平的方法包括：(1)检测ERH在生物学样品中的表达水平；(2)ERH表达水平的升高与膀胱癌相关。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测ERH在生物学样品中的表达水平是通过检测ERH部分或全部mRNA，和/或编码ERH蛋白的部分或全部氨基酸序列。

7.用于治疗或预防膀胱癌的化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)ERH多肽；

(2)检测受试化合物与上述多肽之间的结合活性；

(3)选择与上述多肽结合的化合物。

8.用于治疗或预防膀胱癌的化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)使化合物与细胞接触，所述细胞表达ERH核苷酸序列；

(2)选择使上述细胞表达的ERH核苷酸序列表达水平降低的化合物。

9.用于治疗或预防膀胱癌的化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(2)测定所述报道基因的表达水平或活性；

(3)选择使报道基因表达水平或活性降低的化合物。

10.在膀胱癌细胞中抑制ERH基因或ERH蛋白表达的抑制剂在制备抗膀胱癌制剂中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，抗膀胱癌制剂采用导入抑制ERH的RNAi慢病毒载体的方法抑制膀胱癌细胞中ERH的表达水平。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，抗膀胱癌制剂采用抑制ERH基因的启动子或增强子活性或导入与ERH蛋白结合的抗体抑制膀胱癌细胞中ERH的表达水平。

13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，ERH基因或ERH蛋白的抑制剂为干扰RNA，其正义链为ERH mRNA上19-25个连续的核苷酸。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，干扰RNA序列为SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，干扰RNA的靶序列为SEQ ID NO.15。

16.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，ERH基因或ERH蛋白的抑制剂为采用权利要求7-9任意一种方法筛选得到的化合物。

17.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，抑制剂抑制膀胱癌细胞的增殖或转移或肿瘤的形成。

18.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，抑制剂为一种预防或治疗膀胱癌的组合物，包含药学有效量的针对ERH的干扰RNA作为活性成分或包含药学有效量的与ERH蛋白结合的免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。

19.根据权利要求18所述应用，其特征在于，免疫学活性片段为抗体。

20.一种膀胱癌诊断试剂，其特征在于，包含一对特异性扩增ERH基因的引物；或与ERH基因的核酸序列杂交的探针；或与ERH蛋白结合的免疫学活性片段。

21.根据权利要求20所述的膀胱癌诊断试剂，其特征在于，引物序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

22.权利要求20所述的膀胱癌诊断试剂，其特征在于，免疫学活性片段为抗体。