CN106908422B - 一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，在非共线光参量放大过程中，基于泵浦光、荧光路和闲频光光路满足能量守恒和动量守恒，荧光路与闲频光光路强度具有高度相关性，通过分别采集能量放大后的待测荧光信号和闲频光信号，并将两者取样的结果做相关运算，得到待测荧光与闲频光在零延迟时的互相关结果，并以其正平方根结果表示待测荧光在动力学曲线上不同时间延迟的信号值。本发明可以更加有效地消除非共线光参量放大荧光光谱仪系统的噪声，提高所得荧光动力学曲线的信噪比，实现更高时间分辨率的荧光光谱仪，减少测量所需时间，保证活性样品测量结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种超快时间分辨荧光光谱测量技术，具体地说是一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法。
背景技术
非共线光参量放大荧光光谱技术的时间分辨率可以达到10飞秒量级，用于分析体系内的能量传递、电子转移，以及结构变化等过程。非共线光参量放大荧光光谱技术的工作原理如图1(Journal Of The Optical Society Of American B,2009,26,8,1627)所示。图1中“Signal”表示待测量荧光，“Pump”表示飞秒脉冲激光，即泵浦光。通常待测荧光(Signal)的持续时间远大于飞秒脉冲激光(Pump)的持续时间。在非线性光学晶体(通常BBO晶体)内，待测荧光(Signal)与飞秒脉冲激光(Pump)发生非共线光参量放大过程，使得与飞秒脉冲激光(Pump)同时通过非线性光学晶体的待测荧光的能量得到放大。飞秒脉冲激光(Pump)对待测荧光(Signal)的能量放大作用可以实现对待测荧光(Signal)的门选择。通过调节飞秒脉冲激光(Pump)与待测荧光(Signal)的光程差，实现门选择的时间延迟调节，从而获得待测荧光(Signal)的动力学曲线。对于非共线光参量放大荧光光谱技术，门选择的时间宽度主要由飞秒激光脉冲(Pump)的脉冲宽度决定，因此非共线光参量放大荧光光谱技术的时间分辨率可以达到10飞秒量级。另一方面，门选择获取的荧光光子数量直接影响非共线光参量放大荧光光谱技术测量结果的信噪比。设单脉冲激光激发样品产生的光子数为N，样品的荧光寿命为τ0，而门选择的宽度为Δτ，则非共线光参量放大荧光光谱技术所得信噪比SNR可以表示为：
由(1)式可知信噪比SNR与非共线光参量放大荧光光谱技术的时间分辨率存在相互制约关系。时间分辨率越高，即Δτ越小，非共线光参量放大荧光光谱技术所得信号的信噪比SNR越小。因此对于非共线光参量放大荧光光谱技术，信号采集过程中的噪声消除非常关键。而现有的非共线光参量放大荧光光谱技术，只对能量放大的待测荧光(Signal)信号进行采集，并依靠多次累加测量结果，达到消除噪声的目的，进而提高所得荧光动力学曲线的信噪比。对于非共线光参量放大荧光光谱技术，单纯测量能量放大的待测荧光(Signal)信号的数据采集方法，具有以下两个方面的缺陷。第一，为了实现累加测量结果，消除噪声，需要进行多次数据测量，延长数据采集时间。但对于需要短时间内完成测量的样品，延长数据采集时间并不适合。如生物样品，长时间测量后其活性消失，则会影响测量结果的准确性。第二，当待测荧光(Signal)信号幅度小于噪声幅度时，多次累加测量结果并不能有效消除噪声。
综上所述，现有非共线光参量放大荧光光谱技术的数据采集方法需要进一步改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，以解决现有技术中噪声无法有效消除以及数据采集时间过长而难以保证样品测量结果准确性问题。
本发明是这样实现的：一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，在非共线光参量放大过程中，基于泵浦光、荧光光路和闲频光光路满足能量守恒和动量守恒，荧光光路与闲频光光路的信号强度具有高度相关性，通过分别采集能量放大后的待测荧光信号和闲频光信号，并将两者取样结果做相关运算，得到待测荧光与闲频光在零延迟时刻的互相关值，并以其正平方根结果表示待测荧光在动力学曲线上不同时间延迟时刻的信号值。
所述相关运算的具体推导如下：在非共线光参量放大过程中，飞秒激光脉冲(Pump)、待测荧光(Signal)、闲频光(Idler)需要满足能量守恒和动量守恒(如图1所示)。待测荧光(Signal)能量被放大的同时，还将产生闲频光(Idler)。
ωpump＝ωsignal+ωidler (2)
其中，ωpump是泵浦光(Pump)的角频率，ωsignal是待测荧光(Signal)的角频率，ωidler是闲频光(Idler)的角频率。待测荧光(Signal)与闲频光(Idler)的能量均来自泵浦光(Pump)，因此待测荧光(Signal)与闲频光(Idler)两者具有良好的相关性，强度抖动同步。除了对待测荧光(Signal)的能量放大作用,光参量过程中还产生超荧光。待测荧光(Signal)光斑、闲频光(Idler)光斑、泵浦光(Pump)光斑以及超荧光环的空间几何关系，如图2所示。由图2可知，待测荧光(Signal)光斑、闲频光(Idler)光斑均叠加在超荧光背景上(闲频光(Idler)的超荧光背景在红外光区域，不可见，因此图2中未展示)，因此待测荧光(Signal)、闲频光(Idler)的信号采集需要扣除超荧光背景。
在非共线光参量放大过程中，待测荧光(Signal)存在时,设待测荧光信号为s(t),相应闲频光信号为i(t)。同时考虑到噪声以及超荧光背景的影响，荧光光路信号x1(t)可以表示为：
x1(t)＝s(t)+Bs(t)+n1(t) (4)
其中，n1(t)为噪声项，Bs(t)为荧光光路超荧光背景。闲频光光路信号可以表示为：
x2(t)＝i(t)+Bi(t)+n2(t) (5)
其中，n2(t)为噪声项，Bi(t)为闲频光光路超荧光背景。
对荧光光路与闲频光光路信号做相关运算，互相关函数可以表示为
其中，噪声项n1(t)、n2(t)与待测荧光s(t)、闲频光i(t)、荧光光路超荧光背景BS(t)以及闲频光光路超荧光背景Bi(t)的相关性很小，超荧光背景BS(t)和Bi(t)与待测荧光s(t)、闲频光i(t)的相关性很小，待测荧光s(t)与闲频光i(t)具有高度的相关性，超荧光背景BS(t)与Bi(t)具有高度相关性，因此上式计算结果(理想情况)为：
在非共线光参量过程中待测荧光(Signal)不存在时，考虑系统噪声的影响，荧光光路信号可以表示为：
x3(t)＝Bs(t)+n1(t) (8)
其中，n1(t)为噪声，Bs(t)为荧光光路超荧光背景。闲频光光路信号可以表示为：
x4(t)＝Bi(t)+n2(t) (9)
其中，n2(t)为噪声，Bi(t)为闲频光超荧光背景。对荧光光路与闲频光光路信号做相关运算，互相关函数可以表示为：
由于噪声项n1(t)、n2(t)与超荧光背景BS(t)和Bi(t)的相关性很小，超荧光背景BS(t)与Bi(t)具有高度相关性，因此(理想情况)，
计算有待测荧光(Signal)条件下与无待测荧光(Signal)条件下，荧光光路与闲频光光路相关运算的差值，即：
且当荧光光路信号与闲频光光路信号的时间延迟τ＝0时，Rsi取最大值。由于待测荧光(Signal)与相应闲频光(Idler)具有高度的相关性，因此可以用近似表示荧光动力学曲线上不同时刻t的荧光信号值。
而s(t)随时间变化可以用来描绘待测样品的荧光动力学曲线。
基于相关检测的非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集步骤如下：
a、飞秒激光脉冲经光分束片后分为两路，一路是用于产生样品激发光的透射路，另一路是用于产生光参量放大过程的泵浦光的反射路；
b、透射路所产生的样品激发光，经第一聚焦透镜会聚后激发样品，样品置于激发光焦点附近的偏聚焦透镜的一侧；
c、样品受激发产生的荧光经荧光收集和会聚系统成像在光参量晶体上，激发光的瑞利散射光被长波通滤光片阻挡；
d、反射路所反射的激光脉冲，首先经光程延迟系统的延迟，再经光参量放大泵浦光产生系统，产生345～425nm范围内的泵浦光；
e、泵浦光经第二聚焦透镜的会聚，将光参量晶体置于泵浦光焦点前2～3cm，微调光参量晶体的位置，在光参量晶体的后面产生稳定明亮的超荧光环；优选泵浦光为400nm；
f、会聚的待测荧光在泵浦光的入射平面内，相对泵浦光以一定的夹角入射，并与泵浦光在光参量晶体上重合，调节待测荧光的入射角度及其在光参量晶体上光斑位置，使待测荧光、泵浦光、闲频光三者满足一类相位匹配关系；
g、通过调整光程延迟系统，改变泵浦光的光程，使泵浦光与样品受激后不同时刻辐射的待测荧光同时到达光参量晶体，对不同时刻的待测荧光进行能量放大；
h、利用数据采集系统分别采集荧光光路的光信号和闲频光光路的光信号，并对数据采集结果进行处理。
进一步地，上述步骤a中，所述激光脉冲中心波长690-850nm、脉宽50-300fs，经分束片透射的脉冲激光可直接用于样品激发，也可利用倍频过程产生345-425nm或利用光参量过程产生440-750nm脉冲激光后，再对样品进行激发，激光波长由样品性质决定。
进一步地，步骤h中，信号采集处理的具体步骤为：
h-1、利用第一分光系统和第一光电二极管探测器采集荧光光路的光信号，利用第二分光系统和第二光电二极管探测器采集闲频光光路的光信号；
h-2、控制第一分光系统和第二分光系统，使得选择的荧光光路的中心频率ωsignal与闲频光光路的中心频率ωidler之和等于泵浦光的中心频率ωpump；
h-3、泵浦光的带宽为Δωp，其值由泵浦光的脉冲宽度决定，通过单色仪狭缝控制荧光光路的带宽Δωs为3×1013～5×1013rad/s，闲频光光路的带宽Δωi满足Δωi＝(Δωs+Δωp)/2；
h-4、选择来自同一个泵浦光脉冲的荧光光路和闲频光光路的光信号，对两者经转换后的电信号进行取样，且取样门的位置位于两电信号的峰值附近，取样门的宽度为电信号峰的半高全宽；
h-5、对样品激发光进行斩波调制，斩波频率为飞秒脉冲激光器重复频率的1/2，则荧光光路取样的两个相邻信号分别对应于超荧光背景+待测荧光+噪声和超荧光背景+噪声，闲频光光路取样的两个相邻信号分别对应于超荧光背景+闲频光+噪声和超荧光背景+噪声；
选择超荧光背景+待测荧光+噪声与超荧光背景+闲频光+噪声做相关运算，选择荧光超荧光背景+噪声与闲频光光路超荧光背景+噪声做相关运算，由于待测荧光与闲频光的高相关性，荧光光路超荧光背景与闲频光光路超荧光背景的高相关性，噪声的随机性特点，上述两个相关运算结果分别为待测荧光与闲频光的相关+荧光光路超荧光背景与闲频光光路超荧光背景的相关，荧光光路超荧光背景与闲频光光路超荧光背景的相关，而两者之差则为待测荧光与闲频光的相关；基于待测荧光与闲频光的高度相关性，可以取两者相关运算值的正平方根作为门选择在一定时间延迟条件下待测荧光的信号值；改变门选择的时间延迟，得到不同时间延迟条件下待测荧光的信号值，从而得到待测荧光的动力学曲线。
与现有技术相比本发明具有以下技术效果：
1.相对于只测量荧光光路信号，并通过多次累加测量结果去除噪声的方法，同时采集荧光光路和闲频光光路信号做相关运算，可以更加有效地消除非共线光参量放大荧光光谱仪的系统噪声，提高所得荧光动力学曲线的信噪比，实现更高时间分辨率的荧光光谱仪。
2.同时采集荧光光路和闲频光光路信号做相关运算去除测量系统噪声，可以减少实验测量次数，减少实验测量所需时间，保证了测量结果的准确性。
附图说明
图1是非共线光参量放大荧光光谱仪原理图。
图2是荧光光斑、闲频光光斑、泵浦光光斑以及超荧光环的空间几何关系示意图。
图3是非共线光参量放大荧光光谱仪的装置示意图。
图4是本发明非共线光参量放大荧光光谱仪数据采集系统组成示意图。
图5是若丹明6G的荧光动力学曲线对比图。
图中：3-1、激光光源，3-2、光分束片，3-3、样品激发光部分，3-4、第一聚焦透镜，3-5、样品池，3-6、荧光收集和会聚系统，3-7、光延迟系统，3-8、泵浦光产生部分，3-9、第二聚焦透镜，3-10、光参量晶体，3-11数据采集系统，4-1、第一石英透镜，4-2、第二石英透镜，4-3、第一分光系统，4-4、第二分光系统，4-5、第一光电二极管，4-6、第二光电二极管，4-7、第一取样器，4-8、第二取样器，4-9、乘法器，4-10、模数转换器，4-11、触发信号，4-12、斩波器，4-13、计算机。
具体实施方式
本发明非共线光参量放大荧光光谱仪数据采集方法，包括以下步骤：
1)中心波长800nm脉冲激光经光分束片3-2分光后分为两束，透射束用来产生样品激发光，反射路用来产生光参量过程泵浦光；
2)透射基频光800nm经样品激发光部分3-3后转换成532nm脉冲激光，再经聚焦透镜一3-4会聚后对置于样品池3-5内的若丹明6G溶液进行激发。样品池一般置于激发光焦点附近，靠近第一聚焦透镜3-4一侧，使激发光焦点尽量小，但避免能量密度过高损坏样品。
3)若丹明6G溶液受激发产生的荧光经荧光收集和会聚系统3-6成像在光参量晶体3-10(BBO晶体)上。透射样品的激发光及其瑞利散射光被荧光收集和会聚系统3-6中的545nm长波通滤光片消除。
4)光分束片3-2的反射光束经光延迟系统3-7后，再经泵浦光产生部分3-8产生泵浦光，具体为首先经过凸透镜和凹透镜组成的缩束系统，再经过倍频晶体(BBO，切割角29.2°，厚度2mm)产生400nm泵浦光。光束经过倍频晶体后包含400nm激光与800nm激光，其中800nm激光经过两块400nm高反镜后被消除。400nm泵浦光经第二聚焦透镜3-9后(f＝200mm)成为会聚光束。
5)光参量晶体3-10(BBO晶体)一般位于400nm泵浦光焦点前2-3cm处。由于自发参量下转换作用，当400nm泵浦光位于光参量晶体3-10(BBO晶体)上的能量密度达到一定阈值时，光参量晶体3-10后出现以400nm泵浦光为中心的超荧光环。调节光参量晶体3-10的位置、俯仰角度使得超荧光环明亮、稳定。
6)在400nm泵浦光的入射平面内，会聚的待测荧光相对400nm泵浦光以相应的夹角入射，并与400nm泵浦光在光参量晶体3-10上重合，调节待测荧光的入射角度以及在光参量晶体3-10上光斑的位置，使待测荧光、400nm泵浦光、闲频光三者满足一类相位匹配关系。
7)通过调整光延迟3-7系统，改变400nm泵浦光光程，使泵浦光与样品受激后不同时刻自发辐射的待测荧光同时到达光参量晶体3-10，实现对样品受激后不同时刻辐射待测荧光的能量放大。
8)非共线光参量放大荧光光谱仪数据采集系统3-11的结构组成如图4，可以对荧光光路信号和闲频光光路信号分别采集。具体步骤如下。
图3为基于相关检测的非共线光参量放大荧光光谱仪的结构图。包括激光光源3-1，光分束片3-2，样品激发光部分3-3，第一聚焦透镜3-4，样品池3-5，荧光收集和会聚系统3-6，光延迟系统3-7，泵浦光产生部分3-8，第二聚焦透镜3-9，光参量晶体3-10，数据采集系统3-11。其中，激光光源3-1为掺钛蓝宝石飞秒再生放大系统(中心波长800nm，脉冲重复频率1kHz，单脉冲能量700uJ,脉冲宽度120fs)，分束片3-2对于800nm光束透射反射比为1:1。样品激发光部分3-3提供基频(800nm)、二倍频(400nm)以及基于光参量过程产生的440-750nm范围激发光三种选择，第一聚焦透镜3-4为熔石英材料，直径25.4mm，焦距50mm，样品池3-5的窗片为石英材料。荧光收集和会聚系统3-6用于待测样品发射荧光的收集、会聚以及样品激发光的消除，光延迟系统3-7由精密电动平移台和中空角镜组成，光参量放大过程泵浦光产生部分3-8利用倍频晶体将基频光(800nm)转换为倍频光(400nm)，能量约为30-50uJ。第二聚焦透镜3-9为熔石英材料，直径25.4mm，焦距200mm，光参量晶体3-10可为β相偏硼酸钡晶体(BBO)。
数据采集系统3-11提供单波长测量工作方式，其结构如图4所示，主要包括斩波器4-12、第一石英透镜4-1、第二石英透镜4-2、第一分光系统4-3、第二分光系统4-4、第一光电二极管4-5、第二光电二极管4-6、第一取样器4-7、第二取样器4-8、乘法器4-9、模数转换器4-10、触发信号4-11以及计算机4-13等组成。其中，第一分光系统4-3和第二分光系统4-4主要通过单色仪实现，第一光电二极管4-5为Si光电二极管，第二光电二极管4-6为InGaAs光电二极管。
触发信号4-11来自飞秒激光放大器的同步输出1000Hz，并作为取样器4-7、4-8，模数转换器4-10的外触发信号源。荧光光路光子经第一石英透镜4-1(f＝150mm)会聚到第一分光系统4-3中产生580nm附近，带宽Δωs＝3.63×1013rad/s的荧光光子，再经Si光电二极管(thorlabs PDA36-A)转换为荧光光路电信号后输入至第一取样器4-7(StanfordResearch Systems，SR250)，调节第一取样器4-7的取样门的位置落在荧光光路电信号的峰值附近，取样门宽度为荧光光路电信号峰的半高全宽，再将取样结果输入乘法器4-9(Stanford Research Systems，SR235)的一个输入端。
闲频路光子经第二石英透镜4-2(f＝150mm)会聚进入第二分光系统4-4产生1289nm附近Δωi＝2.97×1013rad/s的光子，再经过InGaAs光电二极管(thorlabs PDA20-CS)转换为闲频光光路电信号后输入至第二取样器4-8(Stanford Research Systems，SR250)，调节第二取样器4-8的取样门的位置落在闲频光光路电信号的峰值附近，取样门宽度为闲频光电信号峰的半高全宽，再将取样结果输入乘法器4-9(Stanford ResearchSystems，SR235)的另一个输入端。乘法器4-9产生的运算结果经模数转换器4-10(StanfordResearch Systems，SR245)转换为数字信号，并通过计算机采集。
又根据图2可知，能量放大后的待测荧光(Signal)与荧光光路部分超荧光(Bs)混合在一起，闲频光(Idler)与闲频光光路部分超荧光(Bi)混合在一起。Bs与Bi同样具有高的相关性。因此数据采集需要扣除超荧光Bs与Bi的影响。将斩波器4-12的工作频率设为触发信号4-11频率的1/2，即500Hz，并对样品激发光进行调制，则第一取样器4-7所得相邻的两个取样结果分别对应于超荧光背景(Bs)+待测荧光(Signal)+噪声和超荧光背景(Bs)+噪声，第二取样器4-8所得相邻的两个取样结果分别对应于超荧光背景(Bi)+闲频光(Idler)+噪声和超荧光背景(Bi)+噪声。利用计算机4-13将模数转换器4-10输出的数据序列按照数据排位的奇数、偶数分成两部分(对应于Bs+Signal+噪声与Bi+Idler+噪声的乘积，Bs+噪声与Bi+噪声的乘积)后，分别计算两者的平均值。对两个平均值做差、取绝对值后再做平方根运算且取正值部分，并用该结果代表门选择在一定时间延迟条件下待测荧光(Signal)信号值。改变门选择的时间延迟，得到不同时间延迟条件下待测荧光(Signall)的信号值，则可以获得样品的荧光的动力学曲线。
图5示出了本发明的一个优选实例。方块表示测量20次累加测量结果去除噪声所得若丹明6G在580nm处荧光动力学曲线，实心圆圈表示测量20次累加测量结果去除噪声所得闲频光在1289nm处动力学曲线。空心圆圈表示采用相关运算(测量次数10次)所得荧光动力学曲线。由图5可见采用相关运算(10次取样)所得荧光动力学曲线的信噪比与采用简单累加平均去噪方法(20次取样)所得荧光动力学曲线的信噪比相当。这说明采用荧光光路和闲频光光路相关运算可以更加有效地去除系统噪声，减少测量时间。以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内的所作任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明创造的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，其特征是，在非共线光参量放大过程中，基于泵浦光、荧光路和闲频光路满足能量守恒和动量守恒，荧光路与闲频光路强度具有高度相关性，通过分别采集能量放大后的待测荧光信号和闲频光信号，并将两者取样的结果做相关运算，得到待测荧光与闲频光在零延迟时刻的互相关结果，并以其正平方根结果表示待测荧光在动力学曲线上不同时间延迟时刻的信号值；所述数据采集方法具体包括以下步骤：
a、飞秒激光脉冲经光分束片后分为两路，一路是用于产生样品激发光的透射路，另一路是用于产生光参量放大过程的泵浦光的反射路；
b、透射路所产生的样品激发光，经第一聚焦透镜会聚后激发样品，样品置于激发光焦点附近的偏聚焦透镜的一侧；
c、样品受激产生的荧光经荧光收集和会聚系统后，成像在光参量晶体上；
d、反射路所反射的激光脉冲，首先经光程延迟系统的延迟，再经光参量放大泵浦光产生系统，产生345～425nm范围内的泵浦光；
e、泵浦光经第二聚焦透镜会聚，将光参量晶体置于泵浦光焦点前2～3cm，微调光参量晶体的位置，在光参量晶体的后面产生稳定明亮的超荧光环；
f、调节待测荧光在光参量晶体上的光斑位置和相对于泵浦光的入射角度，使待测荧光、泵浦光、闲频光三者满足一类相位匹配关系；
g、通过调整光程延迟系统，改变泵浦光的光程，使泵浦光与样品受激后不同时刻辐射的待测荧光同时到达光参量晶体，对样品不同时刻辐射的待测荧光进行能量放大；
h、利用数据采集系统分别采集荧光光路的光信号和闲频光光路的光信号，并对数据采集结果进行处理；其中，数据采集结果的处理方式为：
h-1、利用第一分光系统和第一光电二极管探测器采集荧光光路的光信号，利用第二分光系统和第二光电二极管探测器采集闲频光光路的光信号；
h-2、控制第一分光系统和第二分光系统，使得选择的荧光光路的中心频率ωsignal与闲频光光路的中心频率ωidler之和等于泵浦光的中心频率ωpump；
h-3、泵浦光的带宽为Δωp，通过单色仪狭缝控制荧光光路的带宽Δωs为3×1013～5×1013rad/s，闲频光光路的带宽Δωi满足Δωi＝(Δωs+Δωp)/2；
h-4、选择来自同一个泵浦光脉冲的荧光光路和闲频光光路的光信号，对两者的电信号进行取样，且取样门的位置位于两电信号的峰值附近，取样门的宽度为电信号峰的半高全宽；
h-5、对样品激发光进行斩波调制，斩波频率为飞秒脉冲激光器重复频率的1/2，将荧光光路和闲频光光路两个相邻取样的结果对应做相关运算，取两个相关运算的差值的绝对值，将此绝对值的正平方根作为不同时间延迟时刻下待测荧光的信号强度，从而得到待测荧光的动力学曲线。
2.根据权利要求1所述的非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，其特征是，步骤a中的飞秒激光脉冲的中心波长取值范围为690～850nm、脉宽取值范围为50～300fs，经透射的脉冲激光可直接用于样品激发，也可利用倍频过程产生345～425nm范围内的脉冲激光，或是利用非共线光参量放大过程产生440～750nm范围内的脉冲激光，进行样品激发，激光波长由样品性质决定。
3.根据权利要求1所述的非共线光参量放大荧光光谱仪的数据采集方法，其特征是，所述相关运算的运算步骤如下：
在非共线光参量放大过程中存在待测荧光时，并考虑噪声的影响，荧光光路信号表示为：
x1(t)＝s(t)+Bs(t)+n1(t)
其中，s(t)表示待测荧光，BS(t)表示荧光光路超荧光背景，n1(t)为系统噪声；而闲频光光路信号表示为：
x2(t)＝i(t)+Bi(t)+n2(t)
其中，i(t)表示与待测荧光相对应的闲频光，Bi(t)表示闲频光光路超荧光背景，n2(t)为系统噪声；对荧光光路与闲频光光路两个信号做相关运算，互相关联函数可以表示为：
其中，τ为荧光光路信号与闲频光光路信号间的时间延迟，噪声项n1(t)、n2(t)之间的相关性很小，噪声项与待测荧光s(t),闲频光i(t)，荧光光路超荧光背景BS(t)以及闲频光光路超荧光背景Bi(t)的相关性很小，超荧光背景BS(t)和Bi(t)与待测荧光s(t)与闲频光i(t)的相关性很小，待测荧光s(t)与闲频光i(t)具有高度的相关性，超荧光背景BS(t)与Bi(t)具有高度相关性，因此上式计算结果等同于
非共线光参量过程中待测荧光不存在时，并考虑噪声的影响，荧光光路信号表示为：
x3(t)＝Bs(t)+n1(t)
闲频光光路信号表示为：
x4(t)＝Bi(t)+n2(t)
对荧光光路与闲频光光路两个信号做相关运算，互相关函数可以表示为：
其中，噪声项n1(t)、n2(t)之间的相关性很小，噪声项与超荧光背景BS(t)、Bi(t)的相关性很小，超荧光背景BS(t)与Bi(t)具有高度相关性，因此
计算有待测荧光条件下与无待测荧光条件下，荧光光路与闲频光光路相关运算的差值，即：
当荧光光路信号与闲频光路信号的时间延迟τ＝0时，Rsi取最大值；由于待测荧光与闲频光具有高度的相关性，因此可以用近似表示荧光动力学曲线上不同时间t的荧光信号强度。
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